专利名称：从废弃的卵壳中分离和稳定低分子量多糖的方法
技术领域：
本发明实施例涉及一种简单有效地从废弃的卵壳中分离和稳定超低分子
量多糖(aminoglycans)的方法。
背景技术：
本发明实施例涉及从废弃的卵壳中分离、稳定和形成超低分子量多糖的 方法。该多糖提取物对具有皮肤保湿和抗皱性的化妆用的面霜的制备是有帮 助的。
Nakano等(《PoultSci.》(1991)， 70(12)册，2524-8页)已经说明，来自 单鸡冠白莱航公鸡的鸡冠和肉垂中的粘多糖成分的化学成分由超大分子量粘 多糖组成，这些超大分子量粘多糖在软骨替换治疗中有应用。
Balazs等(US4141973 )已经描述了一种从动物组织中分离纯透明质酸 的方法，该纯透明质酸具有1MD-6MD范围内分子量，用于作为滑液和玻璃 体液的替换物。
Heaney等(《Biochim Biophys Acta》(1976), 18册，451 (1)， 133-42 页)已经说明，鸡的卵壳的有机部分由可能呈现为糖蛋白和粘多糖的多聚糖、 蛋白质和胶原质组成。他们进一步确定该有^L成分通过色镨产生具有30,000 道尔顿的小分子量的粘多糖。密度梯度中的沉积速率分析说明，多聚糖包括等摩尔凄t量的葡糖胺(36.3%s/w)和葡糖醛酸35.6%w/w。降解产物的鉴定 说明粘多4唐主要是透明质酸。
Stahl等(US6537795 )已经描述了一种从链球菌发酵的培育品种中产生 和分离多4唐的方法。这些多糖的特征在于6MD以上的超高分子量以及用于 软骨替换治疗。
从其它天然源和动物组织中分离和^t是炼粘多糖的相关方法也可以在美国 专利号5824658、美国专利号6660853和美国专利号6451326中找到。这些 专利中讨-论的参考文献通过引用结合于此。
发明内容
本发明实施例提供了 一种新颖的方法，从废弃卵壳的至今未知的天然源 中分离由交替的葡糖醛酸和N-醋酸基葡糖胺单元组成的分子式I的低分子量 多糖化合物，
其中M为一个或多个Na、 Ca、 K、 Mg样品，n为20和40之间的整数； 所述方法包括如下步骤
(a) 预先制备废弃的卵壳，用于使用水中的极性有机溶剂提取分子式I的胚 胎4氐分子量多糖化合物，
(b) 使用 一种水极性盐溶液来提取分子式I的所述低分子量多糖化合物作 为其水溶性盐，
(c) 通过^f吏用极性有机溶剂，从所述含水盐混合物中通过形成凝胶分离分 子式I的純低分子量多糖化合物，然后过滤或者离心过滤，
(d) 通过将有机油顺序引入半干的凝胶来稳定分离的多糖提取物以形成 分子式I的多糖化合物。本发明实施例尤其涉及步骤(b)，其中所述水极性盐溶液可以为柠檬酸
盐、谷氨酸盐、醋酸盐、吡咯烷酮碳酸盐、酒石酸盐、甘氨酸盐、硫酸盐、 亚石克酸盐、硝酸盐、碳酸盐或草酸盐的钠、钾、钙或镁盐以产生包括分子式I 的多糖化合物的溶液，适于选择性的凝胶化和分离。
在此描述的方法是一种从废弃的卵壳中选择性地、简单地产生分子式I 的低分子量多糖化合物的新颖方法。更具体地，与现有技术中公开的分离多
糖的步骤相比，本发明的方法被区别开来
(a) —种新颖的、至今未使用的资源，卵壳废弃物的发现，否则很难处理 并对环境造成重大的负面影响，
(b) 包含4艮低浓度的有害蛋白质和核苷，
(c) 不需要从卵壳废弃物中进行有机和无机物料的昂贵且低效的分离，
(d) 包括涉及不含有害物质的试剂和溶剂物料的简单的提取，以及
(e) 不需要乙酰化或其他的衍生化，比如，使用在US5679657中描述的乙
酸酐和碌u磺酸以实现所期望的化妆品应用所需要的粘度和螺紋状特性。
分子式I的多糖化合物为超低分子量，但是稳定没有衍生，从而提供非常 好的皮肤渗透性以减少皮肤表面皱紋并呈现出非常好的软化和保湿效果。
具体实施例方式
从卵处理工业产生的卵壳废弃物在用作垃圾填埋之前通常用溶剂清洗并 进行处理以消除难闻的气味。壳的碳酸钙只有在经过大量的分离和清洗步骤 后才能够净皮^使用，从而使得这个方法在商业上不经济。由于本发明的方法不 取决于如MacNeil (美国专利号6176376)描述的用复杂的方法和设备从卵壳中分离内膜以获取纯碳酸钙，因此没有特殊的需要将卵壳在一个狭窄的限定 范围内粉碎。
我们已经确定了从粉碎的卵壳中选择性地分离有价值的有机化合物，特 别是分子式I的多糖化合物的方法，而不需要有机和无机成分的昂贵分离。
斗分石f的卵壳可以用温水或者温的5%酒精溶液处理并过滤以从壳的表面 清除粘附的有机废物。有机质与碳酸4丐的比例可以在1。/。-15。/。w/w之间。有 机质的比例越大就表示在粉碎的卵壳里存在没有清洗掉的有机质，这种粉碎 的卵壳能够导致在多糖提取物中存在有害的蛋白质和核苷产物。需要注意的 是，与多净唐的其它来源比如现有技术中已知的动物组织和发酵液不同，在此 说明的卵壳废弃物的使用是独特的，因为在提取的中间物中不存在大量的抗 原蛋白质和核苷成分，导致提取分子式I的纯多糖化合物的更简单的方法。 卵壳可以用紫外线进行额外的预处理以消灭在液体清洗之后仍然存在的微生 物。
下一个步骤包括使上述卵壳质以其水溶性盐的形式进行碳水化合物成分 的高选择性的提取。这个方法涉及使卵壳质悬浮在1:2到1:10体积的含水盐 溶液中，该含水盐溶液包含按重量计算5%-40%的镁、钾、钙或钠的柠檬酸 盐、谷氨酸盐、醋酸盐、吡咯烷酮碳酸盐、酒石酸盐、甘氨酸盐、硫酸盐、 亚碌u酸盐、硝酸盐、石友酸盐和草酸盐，或者根据需要上述盐溶液的组合。更 具体地，优选有机酸的一价盐。悬浮持续1-24小时，优选6-12小时，在温 度为10。C-35。C之间的范围内进行周期性的剧烈摇动。悬浮后进行过滤或者 离心过滤以收集包含分子式I的多糖化合物的合适盐的水溶液。这样分离的 卵壳质显示出膜更宽松地粘附在卵壳上，因此使用现有技术中已知的方法可 以较简单地进行处理以将包含卵壳的纯碳酸钙从有机剩余物中分离。下一个步骤包括分子式I的多糖化合物以其合适的盐形式从水溶液中凝 胶析出。这个方法涉及通过后续添加任意与水易混的有机溶剂比如酒精、丙
酮、二曱基曱酰胺、N-曱基吡咯烷酮或1， 4 二氧杂环乙烷来降低水溶液的 极性，因此降低分子式I的多糖化合物的水溶性。伴随着轻微的搅拌和冷却 以保证反应的温度在20。C-25。C之间，加入大量的有机溶剂，以产生悬浮在 水层中的白色凝胶。使溶液保持2-24个小时直到凝胶形成完成。凝胶然后被 过滤或者离心过滤以产生分子式I的多糖化合物的半干提取物。重要的是不 让提取物完全干燥，因为在下一步执行的稳定过程中需要一定量的水相。
最后一个步骤包括通过在亲脂性的环境中使分子有序排列，稳定分子式 I的低分子量多糖化合物以防止交叉结合，交叉结合是现有技术(美国专利 号5，679，657)中描述的非乙酰化和低分子量多糖的特征。这个处理方法涉及 两种油的顺序添加。第一种油本质上是比较疏水的，可以从常见的植物坚果 的油中选取。具体地，优选杏仁油或者加州希蒙得木油作为第一种油。第二 种油本质上是亲水的，可以从来自于植物的生长部分的香料和草中典型地分 离出来的油中选取。具体地，优选鼠尾草油、迷迭香油或薰衣草油作为第二 种油。加入的全部油的数量占提取的多糖的重量的5%-50%之间，同时两种 油的比例在0.1:1至'j 1:0.1之间。
这样分离的分子式I的多糖化合物的分子量很难直接测量，因此分子式 I依靠固有粘度的测量以确定分子量(Lauren等，Biochimica et Biophysica Acta, 42册，476页(1960))。包含分子式I的多糖化合物的各种溶液的 固有粘度被发现位于4cm3/gm-7cm3/gm之间，当针对透明质酸盐(分子量约 为1.2MD)的标准溶液时，致使为分子式I的多糖化合物分配位于15,000道
8尔顿-28，000道尔顿范围之间的一种独特的天然的超低分子量。在现有技术 中，先前还没有描述过来自于天然源的分子式I的超低分子量多糖化合物。
实验结果 例1
带有约10。/。有^/L质含量的预处理的卵壳废弃物500g被添加到一个带有 螺紋盖的广口玻璃容器中。添加柠檬酸钠的5%水溶液750ml,容器被密封并 以中速在一个振动器上放置24小时。24小时后，全部混合剂被转移到过滤 漏斗中，固体的卵壳废弃物与水悬浮液被分开。固体用柠檬酸钠5%水溶液 lx250ml清洗，混杂的氷层被亚曱基氯化物250ml清洗一次以去除潜在的蛋 白质物质，水层然后^C转移到一个2L的大口杯中。该大口杯净皮;改置在冷水 浴中，伴随着緩慢的搅拌，开始緩慢添加纯曱醇。大约200ml的曱醇添加完 成后，浑浊的白色沉淀物开始形成并停止搅拌。慢慢再添加等量的曱醇，大 口杯可以保持12个小时以保证凝胶形成是完全的。全部物质被转移到过滤漏 斗中并过滤以产生分子式I的多糖化合物的奶油色凝胶。使沉淀物变干直到 测量到5-7%的水分含量。分子式I的多糖化合物的凝胶的最终重量为42g。
例2
包含来自于例1的分子式I的多糖化合物的凝胶物料与4g加州希蒙得木 油在15。C-20。C之间混合并剧烈搅拌20分钟。合成的凝胶被加热到25°C并 轻轻搅拌1小时。在这种物质中添加lg鼠尾草油，合成的凝胶被进一步轻轻 搅拌10分钟。然后该凝胶经过4个小时被緩慢冷却到10°C以得到分子式I 的多糖化合物，在没有空气流通的室温下可以稳定至少3个月。例3
采用酒石酸钾的10%水溶液重复上述的例1以产生分子式I的多糖化合 物的凝力吏46g。
例4
采用乙酸钠的20%溶液重复上述例1以产生分子式I的多糖化合物的凝 胶43g。
例5
为了完全形成凝胶，采用乙醇替代曱醇重复上述例1以产生分子式I的 多糖化合物的凝胶47g。
例6
为了完全形成凝胶，采用丙醇代替曱醇以产生分子式I的多糖化合物的 凝胶41g。
例7
釆用石產酸钠的10°/。溶液重复上述例1以产生分子式I的多糖化合物的凝 胶24g。
例8
采用碳酸4丐的25°/。溶液重复例1以产生分子式I的多糖化合物的凝胶14g。 例9
按照例2说明的过程制作的上述被稳定的凝胶10g被添加到包含丙三醇 3ml的蒸馏水50ml中并搅拌成均匀的悬浮液。悬浮液被添加到一种融化物中， 该融化物包含乳化蜡10g、固体石腊10g、白蜂蜡4g和美容上有用的植物油 比如杏仁、薰衣草、檀香和胡桃油的混合物13g,混合剂被剧烈搅拌以产生 具有卓越物理特征和抗皱性的均匀面霜。
关于上述分子式I的多糖化合物的被分离和稳定的凝胶，进行下面的分 析和有效性测试。
不存在硫酸软骨素
由现有技术可知，多糖的所有商业源通常与其它的组织成分比如硫酸软 骨素(Arkins和Sheehan， Structure of Hyaluronic Acid，《Nature New Biol》 235， 253， 1972以及Bettelheim禾口 Philpott, Electron Microscopic Studies of Hyaluronic Acid-Protein Gels, Biochim Biophys Acta 34, 124, 1959)紧密締 合。按照上述描述的方法分离的凝胶提取物包含少于2%的硫酸软骨素，这 或:^午由于与在此分离的分子式I的多糖化合物的特别小的尺寸之间的低締合 可能性。
不存在蛋白质
由于蛋白质是潜在抗原的，因此为化妆品分离任何在本质上没有蛋白质的多糖凝胶是必要的。为了检测Lowry ( J. Biol. Chem, 193， 265-275, 1951 ) 等描述的蛋白质的存在，来自于例1的凝胶提取物经过了高灵敏的比色试验。 没有获得只按重量计算低于1%的表示蛋白质存在的阳性结果。
任何可估计的蛋白质浓度的不存在是与从其它天然源比如公鸡鸡冠和发 酵液中分离的其他糖胺聚糖化合物之间的本质区别。据报道(Kludas,美国 专利号5055298 )，这些多糖通常与蛋白质以共价键连接以形成蛋白多糖。所 有这些不是人类皮肤成分的蛋白质的临床相关去除被证明是困难的和不容易 实现的。在各种其它多糖提取物中存在的这些蛋白质已经被证明作为皮肤表 面上显著的炎症反应的一个原因，使得它们在化妆品中的应用受到挑战。
不存在核苦
紫外线波语学已经被使用以说明在此提取的分子式I的多糖化合物中不 存在潜在的抗原DNA和RNA核苷。在10°/。氯化钠溶液中来自于例1的多糖 提取物的1%的溶液被制备。该溶液经历257nm的紫外线光i普分析以测量溶 液中的核苷的程度。在这个波长的任何吸收的不存在净皮认为在来自于例1的 多糖提取物中不存在核苷。
粘度
该凝月交的少量样本被冻干以产生具有緩慢溶解于水中的类似螺紋状结构 的白色固体。在PH值为7的磷酸盐緩沖溶液1000ml中组成该4分末lmg的 溶液。使用奥斯特华德氏粘度计在25°C的温度下确定粘度。该溶液的相对 粘度被测量为0.76-0.80。与已知高分子量的多糖相比时，这个粘度测量致使 分子式I的多糖化合物的分子量在15,000道尔顿-28,000道尔顿之间。葡糖胺的存在
在分子式I的多糖化合物中，葡糖胺的存在通过Elson和Morgan( Biochem J， 27册，(1933)， 1894页)的方法在用5N盐酸在100。C水解6小时并蒸发 到干燥的物料上确定。分子式I的多糖化合物的葡糖胺含量在38%-41%之间， 与期望的计算值相符。
糖醛酸的存在
在分子式I的多糖化合物中，糖醛酸的存在通过采用透明质酸酶蒸煮确 定。提耳又的分子式I的多糖化合物用蒸馏水清洗，并采用10ml的lOmM CaCl2/50mM-Tris/HCl、 PH值为7.6的缓冲溶液中的链霉菌透明质酸(多糖酶 lmg/g)在37°C水解48小时。蛋白酶抑制剂也就是苯曱基磺酰氟(2mM) 和N-乙基马来酰亚胺被添加到样本中以抑制并发的蛋白质水解。通过添加尿 素到6M的最终浓度来停止该水解。该水解产物在4000g时被离心分离，并 且上层清液(透明质酸酶蒸煮)被移除并通过高性能液体色镨HPLS (High Performance Liquid Chromatography )分析与标准糖醛酸比较。
螺紋形成能力
在现有技术充分的文献记录中，螺紋形成能力越高，多糖的效果越保湿。 较高分子量和中等分子量多糖比如乙酰化和共聚合(US5679657)的衍生物 已经用于增加从动物和细菌来源中分离的多糖的固有螺紋值。出乎意料地观 察到在此分离的分子式I的超低分子量多糖化合物显示了卓越的螺紋成形能 力，并可以证明观察到的部分高抗皱效果。在一个温度为25。C、相对湿度为50%的潮湿箱内，lcm玻璃棒被浸泡在来自于例1的多糖提取物的1%水溶液 中，并且以10cm/min的速度降低大口杯获取的螺紋长度被观测到。本发明 的分子式I的多糖化合物的螺紋长度被观测到为2.8cm-3.5cm之间，大大长 于对商业上可用的透明质酸钠观测到的0.8cm-1.3cm,甚至好于对衍生多糖 观测到的长度。
抗铍性
按照例9中描述的方法生产的面霜的抗皱性使用三维成像系统进行测试 以观'J量表面缺纹的深度。S. Jaspers ( "Microtopometry Measurement of Human Skin in vivo by a new Digital Optical Projection System", Preprints 5th Congress of the International Society for Skin Imaging,维也纳1997 )等描述的方法用于 说明每天使用的四周后皱紋深度减少25%-38%。
权利要求
1、一种从废弃的卵壳中分离分子式I的低分子量多糖化合物的方法，其中M为一个或多个Na、Ca、K、Mg样品，n为20和40之间的整数；所述方法包括如下步骤(a)预先制备废弃的卵壳，用于使用水中的极性有机溶剂提取分子式I的胚胎低分子量多糖化合物，其中预处理的卵壳在温度为25℃到40℃之间的水中与所述极性有机溶剂充分混合1-4小时，然后倾析上层清液并提取所述卵壳；(b)提取分子式I的低分子量多糖化合物作为其水溶性盐，其中来自于步骤(a)的所述卵壳与温度为25℃到40℃之间的水极性盐溶液剧烈振动6-24小时，然后倾析、过滤或者离心过滤以收集包含分子式I的溶解的多糖化合物的水层；(c)通过使用极性有机溶剂，从含水盐混合物中通过形成凝胶分离分子式I的纯低分子量多糖化合物，其中来自于步骤(b)的所述溶液经过在1-2小时内顺序逐步地添加总量为温度在10℃和20℃之间的所述极性有机溶剂的75％和150％体积/体积之间的极性有机溶剂，使形成的凝胶保持4-12小时以完成沉淀，然后倾析、过滤或者离心作用以分离包含4％到8％含水量的分子式I的半干燥的多糖化合物；(d)通过向半干凝胶中顺序引入有机油来稳定来自于步骤(c)的分离出的分子式I的多糖化合物以形成分子式I的多糖化合物。
2、 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中使用的极性有机溶剂从 酒精、丙酮、曱乙酮或l， 4二氧杂环乙烷组成的组中选取。
3、 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中使用的水极性盐溶液从 柠檬酸盐、谷氨酸盐、醋酸盐、吡咯烷酮碳酸盐、酒石酸盐、甘氨酸盐、硫 酸盐、亚石危酸盐、硝酸盐、碳酸盐或草酸盐的钠、钾、钓或镁盐组成的组中 选取。
4、 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中使用的极性有机溶剂为 从甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中选取的低级醇，或从二乙醚、四氮呋喃、曱缩 醛或乙醛中选取的有机醚。
5、 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)中使用的有机油为从植物 来源中获取的油。
6、 根据权利要求5所述的方法，其中所述有机油从加州希蒙得木、杏仁、 鼠尾草、迷迭香、熏衣草、檀香或,荟油中选取。
7、 才艮据权利要求1所述的方法，其中还包括向从步骤(d)中获取的分子 式I的稳定的多糖化合物中添加至少一种药用上可接受的赋形剂以形成具有 抗皱性的合成物。
8、 一种根据权利要求1所述的方法生产的具有分子量范围为15,000道 尔顿到28,000道尔顿的分子式I的稳定多糖化合物。
全文摘要
一种从由交替的葡糖醛酸和N-醋酸基葡糖胺单元组成的废弃的卵壳的天然源中分离分子式I的低分子量多糖化合物的方法，其中M为一个或多个Na、Ca、K、Mg样品，n为20和40之间的整数；所述方法包括如下步骤(a)预先制备废弃的卵壳，用于使用水中的极性有机溶剂提取分子式I的胚胎低分子量多糖化合物，(b)使用一种水极性盐溶液来提取分子式I的所述低分子量多糖化合物作为其水溶性盐，(c)通过使用极性有机溶剂，从所述含水盐混合物中通过形成凝胶分离分子式I的纯低分子量多糖化合物，然后过滤或者离心过滤，(d)通过将有机油顺序引入半干的凝胶来稳定分离的多糖提取物以形成分子式I的多糖化合物。
文档编号C07D309/10GK101501014SQ200780010257
公开日2009年8月5日 申请日期2007年3月12日 优先权日2006年3月25日
发明者博曼·费拉姆罗泽·帕特尔 申请人:罗马诺发展有限公司