专利名称：：用于乳腺癌和卵巢癌诊断和治疗的癌性疾病调节抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)的分离和制备，以及CDMAB在诊断和治疗过程中的应用，任选地与一种或多种化学治疗剂联合使用。本发明还涉及利用本发明的CDMAB的结合分析。
背景技术：
：每个患有癌症的个体都是独特的，由于个体的差异，其患有的癌症也不同于其他人所患的癌症。尽管如此，目前的治疗釆用相同的方式治疗患有同期同类型肿瘤的所有患者。至少30%的这些患者的一线治疗是失败的，这样就造成更多轮次的治疗，增加了治疗失败、肿瘤转移及最终死亡的可能性。一种优越的治疗方式应该是针对特定个体的个体化治疗。目前唯一采用个体化治疗的方式是外科手术。化疗和放疗不能针对患者量身定做，而在大多数情况下，手术本身并不足以治愈癌症。随着单克隆抗体的问世，发展个体化治疗方法的可能性变得更为现实，因为每种抗体能对应单一的抗原决定簇。而且，制备针对多个抗原决定簇的集群(constellation)的抗体组合成为可能，该抗原决定簇集群唯一确定了某一特定个体的肿瘤。认识到癌细胞和正常细胞的显著差异在于癌细胞含有转化细胞特异別转化细胞的单克隆抗体；这样就产生了单克隆抗体能够作为"魔术子弹(MagicBullets)"消除癌细J包的7见点。依照本发明公开的方法分离出的单克隆抗体已经显示出能够以有利于患者的方式调节癌性疾病进程，如通过降低肿瘤负荷，并且在本文中这些单克隆抗体将分别被称为癌性疾病调节抗体(CDMAB)或"抗癌"抗体。目前，癌症患者通常可以选^^的治疗方式4艮少。目前的癌症治疗方法已经改善了总体存活率和发病率。然而，对特定的个体来说，这些改善的统计数据与他们个人情况的改善并无必然关系。因此，如果提出一种方法学，使医生能够在同组患者中，独立于其他患者治疗每例肿瘤，这就使根据个人进行量身定做的独特治疗成为可能。理论上，这样一种治疗过程可以增加治愈率，产生更好的效果，从而满足长期的需要。从历史上来看，多克隆抗体的应用在治疗人类癌症的方面取得的成功有限。一直用人类的血浆来治疗淋巴瘤和白血病，但极少有延长的好转或反应。而且，这种治疗方法重复性差，与化疗相比，没有更多的益处。像乳癌、黑色素瘤和肾细胞癌等实体肿瘤也用人类血液、黑猩猩的血清、人类血浆和马血清来治疗过，但相应的结果是不可预测和无效的。有很多用单克隆抗体治疗实体肿瘤的临床试验。在20世纪80年代，就有至少四项针对人类乳腺癌的临床试验，在使用了针对特定抗原或基于组织特异性的抗体的至少47例患者中，只产生了一名应答者。直到1998年，才有了成功的临床试验，该试验联合使用人源化的抗Her2抗体与顺铂。在这项试验中，对37个患者的反应进行了评估，大约有四分之一的患者有部分反应，另外一半有轻微的或稳定的病情发展。研究结肠直肠癌的临床试验涉及到针对糖蛋白和糖脂靶标的抗体。对腺癌有某些特异性的诸如17-lA等抗体已经进入了II期临床试验，其中60多例患者中，只有一例患者产生了部分反应。在其他的试验中，17-1A的使用在额外采用环磷酰胺实验方案的52例患者中，只产生了1例完全反应，2例轻微反应。其他涉及17-1A的临床试验得到与此相似的结果。最初被批准用来成像的人源化鼠单克隆抗体也没能使肿瘤消退。到目前为止，还没有对结肠直肠癌有效的抗体。同样地，对于肺癌、脑癌、子宫癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌的结果同样不好。用抗CD3单克隆抗体治疗黑色素瘤取得了一些有限的成功。因此，可以看到，尽管在作为人类临床试验的先决条件的小动物实验研究中获得成功，但所测试的抗体在极大程度上还是无效的。现有专利美国第5,750,102号专利公开了一种方法，其中用可以从患者的细胞或组织中克隆的MHC基因转染来自患者肺瘤的细胞。然后用这些转染的细胞给患者接种。美国专利4，861，581公开了一种方法，它包括的步骤有获取单克隆抗体，该抗体对哺乳动物肿瘤细胞和正常细胞的细胞内成分是特异的，对外部成分没有特异性；标记单克隆抗体；将该标记的抗体与哺乳动物的组织接触，该哺乳动物已接受杀灭肿瘤细胞的治疗；以及通过测量该标记抗体与退化的肺瘤细胞的细胞内成分的结合来确定治疗的效果。在制备针对人类细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认识到肺瘤细胞是这类抗原的一个方^^来源。美国专利5,171,665提供了一种新型抗体及其制备方法。具体地，该专利叙述了一种单克隆抗体的制备，该抗体有与人类肿瘤(例如肠癌和肺癌)相关的蛋白抗原牢固结合的特性，而与正常细胞的结合程度弱得多。美国专利5，484，596提供了一种癌症治疗的方法，所述方法包括手术去除人类癌症患者的肿瘤；处理肿瘤组织以获得肿瘤细胞；照射肺瘤细胞，使其能成活但不致瘤；用这些细胞来制备抑制原发性肺瘤复发、同时抑制肿瘤转移的患者疫苗。该专利讲述了能够与肺瘤细胞表面抗原反应的单克隆抗体的研制。如在第4栏，第45行等处提到的，专利权所有人在开发单克隆抗体中应用了自体肺瘤细胞，该单克隆抗体对人类肺瘤表现出活性特异的免疫治疗。美国专利5,693，763讲述了人类癌细胞的糖蛋白抗原特性，其不依赖于起源的上皮组织。美国专利5,783,186涉及诱导表达Her2的细胞发生凋亡的抗-Her2抗体、产生该抗体的杂交瘤细胞系、用该抗体和包括所述抗体在内的药物组合物治疗癌症的方法。美国专利5,849,876描述了产生单克隆抗体的新的杂交瘤细胞系，该抗体针对从肺瘤和非肿瘤组织来源中纯化的粘液素抗原。美国专利5,869,268涉及一种制备产生特异针对目标抗原的抗体的人类淋巴细胞的方法，制备单克隆抗体的方法及该方法制备的单克隆抗体。该专利特别涉及用于癌症诊断和治疗的抗-HD人类单克隆抗体的制备。美国专利5，869，045涉及与人类癌细胞反应的抗体、抗体片段、抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的作用机制是双重的，其中该分子可以与人类癌细胞表面的细胞膜抗原反应，而且该抗体能够进一步内化入癌细胞内，随后结合，这对形成抗体-药物，抗体-毒素的偶联物尤其有用。未经修饰的抗体在特定浓度下，也表现出细胞毒特性。美国专利5,780,033公开了用于胂瘤治疗和预防的自体抗体的用途。不过，这种抗体是来自老年哺乳动物的抗核自身抗体。这里，自身抗体是指一种存在于免疫系统的天然抗体。因为自身抗体来自"老年哺乳动物"，所以就不要求自身抗体真正来自受治患者。此外，该专利公开了来自老年哺乳动物的天然单克隆抗核自身抗体及产生单克隆抗核自身抗体的杂交瘤细胞系。发明概述本发明的发明人之前已经被授予发明名称为"个体化患者特异抗癌抗体"的美国专利6,180,357,该专利要求保护筛选用于癌性疾病治疗的个体化抗癌个性抗体的方法。本发明采用了美国专利6，180，357中讲述的生产患者特异性抗癌抗体的方法，用以分离编码癌性疾病调节单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些抗体可以针对一种肺瘤被专门制备，从而使癌症的个性化治疗成为可能。在本发明公开的内容中，具有杀灭细胞(细胞毒性的)或抑制细胞生长(细胞生长抑制的)特性的抗癌抗体将在下文中被称为细胞毒性的。这些抗体能够用于帮助癌症的分期和诊断，也可以用于治疗肿瘤转移。个性化抗癌治疗的前景将给患者的治疗方式带来变化。一种可能的临床情境是在肿瘤出现时就取样并入库。通过该样品，能够从预存在的癌性疾病调节抗体组对该肿瘤进行分型。患者将被常规分期，但可用的抗体可以对患者进一步分期。用现有的抗体可以直接对该患者进行治疗，展示库并结合本发明公开的筛选方法制备。制备的所有抗体都将被加入到抗癌抗体库中，因为其他肿瘤可能携带一些与被治疗肿瘤相同的抗原表位。根据本方法制备的抗体可以用于治疗许多患有与这些抗体结合的肿瘤的患者。除抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐治疗作为多模式治疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对于非癌细胞相对无毒性这一事实允许大剂量使用抗体组合，要么单独应用，要么与传统的治疗联合应用。高治疗指数也允许短期内的重复治疗，从而降低了治疗抗性细胞出现的可能性。另外，本发明还包括将标准的化学治疗物质，例如放射性核素，与本发明的CDMAB偶联，从而使所述的化疗作用集中。如果患者的初期治疗产生耐药性或发生了转移，可以重复肿瘤特异性抗体的制备过程进行再次治疗。而且，该抗癌抗体可以与从该患者体内获得的红细胞偶联，重新输注到患者体内用于治疗转移肺瘤。目前几乎没有有效的治疗转移癌的方法，而转移通常预示着导致死亡的不良结果。然而，转移癌通常血供丰富，通过红细胞来运输抗癌抗体可以使抗体富集在肿瘤部位。即便在转移之前，大多数癌细胞也要依赖于宿主的血供来存活，与红细胞偶联的抗癌抗体对原位肿瘤同样有效。可选择地，所述抗体可以与其他的血细胞，比如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞等偶联。抗体有五类，每类都与其重链所赋予的功能相关。通常认为通过抗体依赖性细胞毒性作用或补体依赖性细胞毒性作用来介导棵抗体的癌细胞杀伤功能。例如，鼠IgM和lgG2a抗体能够通过结合补体系统的C-l组分来活化人类补体，从而活化导致胂瘤裂解的补体活化的经典途径。对于人类抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgGl。鼠IgG2a和IgG3同种型抗体可以有效地召集具有Fc受体的细胞毒细胞，其导致单核细胞、巨喧细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀伤作用。人的IgGl和IgG3同种型抗体介导ADCC。抗体介导的癌症杀伤功能的另一可能机制是使用能够催化细胞膜及其相关糖蛋白或糖脂中不同的化学键水解的抗体，即所谓的催化抗体。抗体介导癌细胞杀伤的还有另外两种被更广泛接受的机制。第一种是抗体做为疫苗诱导机体产生针对位于肺瘤细胞上的假定抗原的免疫反应。第二种是抗体用于靶向生长受体并干扰其功能或者下调该受体以使其功能有效丧失。因此，本发明的目的是采用特定个体来源的细胞制备癌性疾病调节抗体方法，该抗体对癌细胞有细胞毒性，而同时对非癌细胞相对无毒，该方法是为了分离杂交瘤细胞系和该杂交瘤细胞系编码的相应的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段。本发明的另外目的涉及癌性疾病调节抗体和其抗原结合片段。本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，其细胞毒性通过抗体依赖性细胞毒性作用介导。本发明的另一个目的是制备癌性疾病调节抗体，其细胞毒性通过补体依赖性细胞毒性作用介导。本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，其细胞毒性是其催化细胞的化学键的水解的能力的作用。本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，其用于癌症诊断、预后和监测的结合分析。本发明其它的目的和优点通过本发明下述的说明、举例和实施方案将变得显而易见。附图筒要i兌明图1包括1A245.6抗体、两种抗体的同种型对照抗体以及抗-EGFR抗体针对几种癌细胞系和非癌细胞系的代表性流式细胞术(FACS)直方图。图2包括7BD-33-11A抗体、1A245.6抗体的同种型对照抗体、抗EGFR抗体以及抗EGFR抗体的同种型对照抗体针对几种癌细胞系和非癌细胞系的代表性FACS直方图。图3包括11BD-2E11-2抗体、两种抗体的同种型对照抗体以及抗-EGFR抗体针对几种癌细胞系和非癌细胞系的代表性FACS直方图。图4是特定抗体治疗时，肿瘤体积随时间变化的图解分析。图5是抗体对MB231人类乳腺癌肿瘤体积的影响随时间变化的图解分析。9图6是定量抗体治疗的存活百分比随时间变化的图解分析。发明的详细描述下面用于概述、描述、实施例和权利要求书中的字词或短语通常都有其指定的含义。术语"抗体"使用其最宽泛的涵义，且特别包括，例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体，去免疫的、鼠的、嵌合的或人源化的抗体)、携带有多表位特异性的抗体组合物、单链抗体、抗体的免疫偶联物和抗体片段(见下文)。本发明中使用的术语"单克隆抗体"指从基本同质的抗体群中获得的抗体，即构成该群抗体的个别抗体是相同的，除了可以少量存在的可能自然发生的变异。单克隆抗体高度特异性的针对单一抗原位点。而且，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每一种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了特异性之外，单克隆抗体的优势还在于其合成可以不受其他抗体的污染。修饰语"单克隆的，，指从基本同质的抗体群中获得的抗体的特征，而不能解释为需要通过任何特定的方法来生产该抗体。例如，本发明中使用的单克隆抗体可以通过由Kohler"a/.,Mi^re，256:495(1975)首次描述的杂交瘤(鼠或人)方法制备或由重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利第4,816,567号)。还可以使用在例如Clacksonda/"淑脏，352:624-628(1991)和MarksWa/'JMo/说W,222:581-597(1991)中描述过的技术，从噬菌体抗体库中分离"单克隆抗体"。"抗体片段"包括完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区域或可变区。抗体片段的实例包括非全长的抗体、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体(diabodies);线性抗体；单链抗体分子；单《连抗体、单结构域抗体分子、融合蛋白、重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。"完整"抗体指包括抗原结合可变区，以及轻链恒定区(C。和重链恒定区Ch1，Ch2和Ch3的抗体。恒定区可以是天然序列的恒定区(例如，人天然序列恒定区)或其氨基酸序列的变体。优选地，该完整抗体有一个或多个效应器功能。依据其重链恒定区的氨基酸序列，完整抗体可以分为不同的"种类"。有五大类完整的抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中的几类可以进一步分为"亚类，，(同种型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。与不同种类抗体对应的重链恒定区分别被称为a,S,s,Y和li。不同种类的免疫球蛋白的三维空间构型和亚单位结构是公知的。抗体"效应器功能，，指那些由抗体Fc区引起的(天然序列的Fc区或氨基酸序列变异的Fc区)的生物活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性作用；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等。"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用"和"ADCC"指细胞介导的反应，在所述反应中表达Fc受体(FcRs)的非特异性的细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞，噬中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后导致耙细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcyRIII,而单核细胞表达FcyRLFcyRn和FcyRIII。Ravetch和Kinet，iev./mmw"o/9:457-92(1991)的第464页的表3总结了造血细胞的FcR表达。为了测定目标分子的ADCC活性，可以进行例如在美国专利5,500,362或5,821,337描述的体外ADCC活性分析。用于这类分析的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选择地或附加地，可以在体内评价目标分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes"a/./WAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中。"效应器细胞"指表达一种或多种FcRs并执行效应器功能的白细胞。优选地，这些细胞至少表达FcyRIII，并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人类白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应器细胞可以从其天然来源中分离，例如从本文中描述的血液或PBMCs中分离。术语"Fc受体"或"FcR"用于描述结合于抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列的人类FcR。而且，优选的FcR是结合于IgG抗体(y受体)的受体，并包括FcyRI、FcyRII和Fc丫RIII亚类的受体，其包括这些受体的等位基因变体和选择性的剪切形式。FqRII受体包括FcyRIIA("激活性受体")和FcyRIIB("抑制性受体")，两者的氨基酸序列相似，区别主要在于其胞浆区。激活性受体FcyRIIA在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体FcyRIIB在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见DaSron,iev./wmw"o/.15:203-234(1997)中的综述M)。在Ravetch和Kinet,i朋w.iev.7mmwwo/9:457-92(1991);Capel"a/"/附扁"函函0^4:25-34(1994)和deHaase/1/丄a6.C7/".Med.126:330-41(1995)中对FcR进行了综述。其他FcR,包括将来要被确认的FcR,都包括在本发明中的术语"FcR"中。该术语也包括负责将母体的IgG转运到胎儿体内的新生受体，FcRn(Guyere/a/.,//wwwm/.117:587(1976)和Kim"a/"五w://薩,/.24:2429(1994))。"补体依赖性细胞毒性作用"或"CDC"指分子在补体存在下，裂解靶细胞的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(Clq)与和同类抗原形成复合物的分子(比如，抗体)的结合启动。为了评价补体激活，可以进行如在Gazzano-SantoroWa/"J/mmwwo/.TWeAc^fc202:163(1996)中4笛述的CDC分析。术语"可变的"指可变区某些部分的序列在抗体间高度不同，并用于每一种特定抗体与其特定抗原的结合及其特异性。然而，变异并不是均匀分布在抗体的可变区域内。它集中在轻链和重链可变区的三个所谓的高度可变区的片段内。可变区内保守性较高的部分被称为骨架区(FRs)。每个天然的重链和轻链可变区，包含主要采用(3-片层构型的四个FR，由三个高度可变区连接在一起，形成环状连接，在一些情况下形成部分>片层结构。每条链的高度可变区通过FRs以密切靠近的方式结合在一起，并与另一条链的高度可变区一起，促成抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabatetal，iSe^e"ces尸r她/m17mww"o/og7'ca//"/emst(免疫学目标蛋白的序列)，第5版.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.pp15-17;48-53(1991))。恒定区并不直接参与抗体与抗原的结合，而是呈现各种效应器功能，例如在抗体依赖性的细胞毒效应(ADCC)中抗体的参与。本发明中使用的术语"高度可变区"指抗体中负责与抗原结合的氨基酸残基。高度可变区通常包括"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如轻链可变区的氨基酸残基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区的氨基酸残基31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabatetal,tSegwe"c&so/尸rae/m1o/Tmwwwo/og/ca//"&mst(免疫学目才示蛋白的序歹寸)，5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.pp15-17;48-53(1991))和/或"高变环"区的氨基酸残基(例如轻链可变区的残基2632(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变区的26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLesk/M/肠/.196:901-917(1987》。"骨架区"或"FR"残基指除了本发明定义的高变区残基之外的那些可变区的残基。抗体经木瓜蛋白酶水解产生两个相同的被称为"Fab"片段的抗原结合片段和一个残余的"Fc"片段，每个"Fab"片段都有单一的抗原结合部位，"Fc，，片段的名称反映了其易结晶的能力。胃蛋白酶处理抗体产生一个F(ab')2片段，其有两个抗原结合部位，且仍能够与抗原交联。"Fv"是含有完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。该区域由以紧密、非共价结合的一条重链和一条轻链可变区的二聚体构成。以这种每个可变区的三个高变区相互作用的构型决定Vh-VL二聚体表面的抗原结合部位。六个高变区域共同赋予了抗体的抗原结合特异性。然而，即便单一的可变区(或只含有三个抗原特异性高变区的Fv的一半)仍能够识别和结合抗原，尽管比完整结合位点的亲和性低。Fab片段也含有轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab'片段不同于Fab片段之处在于其重链CHI区的羧基末端多了几个氨基酸残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本发明中指代Fab',其中恒定区的半胱氨酸残基至少携带一个游离的巯基。最初的F(ab')2抗体片段以Fab'片段对产生，之间有铰链的半胱氨酸。其他的抗体片段的化学偶联也是公知的。来自任一脊推动物的抗体的"轻链"基于其恒定区的氨基酸序列，都可以归于两种截然不同的所谓kappa(k)和lambda(X)链中的一种。"单链Fv"或"scFv"抗体片段包含抗体的Vh和VL区，其中这些区域存在于单一的多肽链上。优选地，Fv多肽进一步包含VH和Vt区之间的多肽连接子，其使scFv形成适于抗原结合的结构。关于scFv的综述参见13PKickthunin7TzeP/i"r丽cofogyo/Mo"oc/o"a/J""Z)oc/fes(单克隆抗体药理学),vol.113，RosenburgandMooreeds.，Springer-Verlag，NewYork,pp.269-315(1994)。术语"双体(Diabodies)"指带有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一多肽链上(VH-VJ含有与轻链可变区(VJ结合的重链可变区(VH)。通过使用因过短而不能使同一条链上的两个区域配对的连接子，使这些区域被迫与另一条链上的互补区域配对，由此产生了两个抗原结合位点。例如在EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等人，7Va,/爿c^/.5W.90:6444-6448(1993)中对双体作了更详细的描述。"分离的"抗体是指从其天然环境的组分中鉴别、分离和/或回收的抗体。其天然环境下的污染成分是指干扰抗体诊断或治疗作用的物质，可以包括酶、激素和其它的蛋白质或非蛋白质溶解物。因为缺乏抗体的天然环境中的至少一种组分，分离抗体包括重组细胞内部的原位抗体。但是，通常分离抗体会经过至少一步的纯化步骤来制备。"结合"目的抗原的抗体是指对该抗原有充分亲和力的抗体，以致该抗体在靶定表达该抗原的细胞时，可以作为治疗或诊断试剂。如果抗体能结合抗原性部分，它通常会优先结合其抗原性部分，而不是其它受体，这不包括诸如非特异性的Fc接触的偶然结合或与其他抗原共有的翻译后修饰成分结合，该抗体不会与其他蛋白有明显的相互作用。检测与目的抗原结合的抗体的方法在本领域中是公知的，可以包括但并不局限于例如FACS、细胞ELISA和Western印迹等分析。正如本发明中使用的，"细胞"、"细胞系"、"细胞培养物，，的表述可以交替使用，所有这些用法都包括其子代。也可以理解为由于人为的或非人为的突变，所有的子代在DNA组成上不可能完全相同。在原始转化细胞内筛选的有相同功能或生物学活性的突变子代包括在内。根据有意使用的不同指代的上下文，指代是清楚的。"治疗"既指治疗性处理，也指预防性或防止性的措施，其目的就是预防或减緩(减轻)目标病理状态或病症。需要治疗的个体包括那些已经存在所述病症的个体，还包括那些将发展为该病症的或欲对其病症进行预防的个体。因此，本文中欲;故治疗的哺乳动物已经被诊断为患有该病症或倾向于或易感于该病症。术语"癌症"和"癌性(的)"是指或描述哺乳动物的生理状态，其典型特征是细胞生长或死亡不受调控。癌症的实例包括zf旦不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌症更多具体的例子包括鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌在内的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠道癌在内的胃癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝脏癌症，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，曱状腺癌，肝癌，肛癌，阴茎癌，还有头颈部癌。"化疗剂"是用于癌症治疗的化合物。化疗剂的实例包括诸如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化剂；例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、艰泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯类；如苯佐替派(benzodopa)、卡;皮酉昆、美妥^齐"底(meturedopa)、乌5岛^,〉泉(uredopa)的氮丙啶类；包括六曱蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三曱基奥罗蜜胺(trimethylolomelamine)在内的乙烯亚胺类(ethylenimines)和曱基蜜胺类(methylamelamine);如瘤可宁(chlorambucil)、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸曱氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮齐(novembichin)、苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀(uracilmustard)等氮芥类药物；如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司丁、雷莫司汀等硝脲类(nitrosureas);如阿克拉霉素类、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加里刹霉素、洋红霉素、碳霉素(camomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托咪定、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、灰霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星类抗生素；曱氨碟呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)类抗代谢类药；如二曱叶酸、氨曱喋呤、蝶罗呤、三曱曲沙等叶酸类似物;如氟达拉滨、6-巯噤呤、硫米噤呤、硫鸟。票呤类噤呤类似物；如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU等嘧啶类似物；如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯酮等男性激素类药物；如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦等抗肾上腺类药物；如亚叶酸等叶酸补充物；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil;比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖咬；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足叶草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK;雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2'，2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴漆；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");环磷酰胺；塞替派；如紫杉醇(TAXOL⑧,Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ.)和多西他赛(TAXOTERE⑧:Aventis,Rhone-PoulencRorer,Antony,France)等紫杉烷类；苯丁酸氮齐；吉西他滨；6-硫鸟噤呤；巯噤呤；曱氨蝶呤；如顺铂和卡铂等铂类似物；长春碱；柏；依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C;米托蒽醌；长春新i威；长春瑞滨；去曱长春石威；诺消灵(novantrone);替尼泊苷；柔红霉素；氨蝶呤钠；希罗达；伊班膦酸钠；CPT-11;拓朴异构酶抑制剂RFS2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；以及上述任一种药物在药学上可以接受的盐、酸或衍生物。调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素类药物也包括在本定义内，像抗雌激素药物，包括例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪哇、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷诺昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；以及抗雄激素物质，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一种药物在药学上可以接受的盐、酸或衍生物。用于治疗目的的"哺乳动物"指任何一种可以归于哺乳类的动物，包括人类、小鼠、免疫缺陷鼠(SCID)或棵鼠或品系小鼠、家畜和农场动物及动物园内的动物、体育动物或宠物，比如绵羊、狗、马、猫、母牛等。优选地，本发明中的哺乳动物指人类。"寡核苷酸"指短长度、单链或双链多聚脱氧核苷酸，其通过已知的方法(例如磷酸三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺化学)，利用例如发表于1988年5月4日的EP266,032中描述的固相技术，或利用Froehleretal,Nucl.AcidsRes.，14:5399-5407,1986描述的脱氧核芬H-磷酸盐中间物化学合成。然后将其用聚丙烯酰胺凝胶纯化。"嵌合"抗体指免疫球蛋白，其部分重链和/或轻链与来源于特定种属或属于特定抗体种类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，同时链上的其余序列与来源于另一种属或属于另一种类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，此外还指这些抗体的片段，只要它们能够表现出所需的生物活性(美国专利4,816,567和Morrison等人。尸rac.A^/.」cac/.f/&4，81:6851-6855(1984》。非人类(例如鼠科)抗体的"人源化"形式指特殊的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv，Fab,Fab'，F(ab)2或抗体的其他抗原结合序列)，其包含来自非人类免疫球蛋白的最小序列。在绝大多数情况下，人源化抗体是人的免疫球蛋白(受者抗体)，其中，来自受者抗体的互补决定区(CDRs)的残基被诸如具有所需的特异性、亲和力、能力的小鼠、大鼠或兔等非人类抗体(供者抗体)的CDRs的残基所替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人类FR残基所替代。此夕卜，人源化抗体可以包含既不在受者抗体也不在引入的CDR或FR序列的残基。这些修饰进一步改善和优化了抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个，通常是两个可变区的几乎所有的部分，其中所有或几乎所有的CDR区对应非人类免疫球蛋白的CDR区，且所有或几乎所有的FR残基是人类免疫球蛋白共有序列的FR残基。最优地，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)序列的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的序列。"去免疫化"抗体是针对给定的物种没有免疫原性或免疫原性较差的免疫球蛋白。通过改造抗体的结构可以实现去免疫化。可以使用任何本领域技术人员公知的去免疫化技术。例如，在于2000年6月15日公布的WO00/34317中，描述了一项使抗体去免疫原性的适当的技术。"同源性"被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。在本说明书中，杂交瘤细胞系及其产生的分离的单克隆抗体可以选择用其内部分类号7BD隱33-11A，1A245.6和11BD-2E11-2或其各自的保藏号PTA-48卯，PTA-4889和PTA-5643来表示。本发明中使用的"配体"包含针对靶抗原呈现结合特异性的部分，其可以是完整的抗体分子或是至少有一个抗原结合区或其部分(即抗体分子的可变部分)的任一分子，例如，Fv分子，Fab分子，Fab，分子，F(ab，)2分子，双特异性抗体，融合蛋白或任一基因工程分子，其特异性识别和结合抗原，所述抗原一皮命名为ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643杂交瘤细胞系所产生的分离的单克隆抗体所结合(ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗原)。本发明中使用的"抗原结合区"指识别靶抗原的分子的部分。本发明中使用的"竟争性抑制"是指通过常规的抗体相互竟争分析(BelangerL.，SylvestreC.和DufourD.(1973)，Enzymelinkedimmunoassayforalphafetoproteinbycompetitiveandsandwichprocedures(竟争和夹心法的曱胎蛋白的酶耳关免疫测定).C//m'caC/n'm/caJcto48，15)，能够识别和结合由ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗体)针对的抗原决定表位。本发明中使用的"靶抗原"指ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗原或其部分。本发明中使用的"免疫偶联剂"指以化学或生物学方式连接到细胞毒素、放射物质、酶、毒素、抗肺瘤药或治疗剂的诸如抗体的任一分子或配体。只要能够与其靶标结合，该抗体可以在其分子的任一部位与细胞毒素、放射物质、抗肿瘤药或治疗剂连接。免疫偶联剂的实例包括抗体毒素化学偶联剂和抗体-毒素融合蛋白。本发明中使用的"融合蛋白"指任一嵌合蛋白，其抗原结合区与例如毒素、酶或蛋白药物的生物活性分子连接。为了更充分理解本文中描述的发明，进行下述说明。本发明提供特异识别并结合ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗原的配体(即ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643配体)。本发明的配体可以以任一形式存在，只要其具有一个抗原结合区域，所述配体能竟争性抑制由杂交瘤细胞ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643产生的单克隆抗体与其靶抗原的免疫特异性结合。因此，任一具有与ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643相同的结合特异性的重组蛋白(例如，其中抗体与另一种如淋巴因子或肺瘤抑制生长因子的蛋白结合所形成的融合蛋白)都在本发明的范围内。在本发明的一个实施方案中，所述配体是ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗体。在其他实施方案中，所述配体是抗原结合片段，其可以是具有ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗体的抗原结合区的Fv分子(例如单链Fv分子)、Fab分子、Fab'分子、F(ab')2分子、融合蛋白、双特异性抗体、异种抗体或任一重组分子。本发明中的配体针对的抗原决定簇是ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643单克隆抗体针对的决定簇。本发明中的配体可以被修饰，即通过分子内的氨基酸修饰，产生出衍生分子。也可以是化学修饰。衍生分子要保留多肽的功能特性，也就是说，具有这类取代的分子仍能够使该多肽与ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗原或其部分结合。这些氨基酸取代包括但不限于在本领域中公知的"保守"氨基酸取代。举例来说，被称为"保守氨基酸取代"的某些氨基酸取代能够在蛋白质中频繁出现，但不改变该蛋白质的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。这些改变包括用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)中的任一种取代这些疏水氨基酸的任何其它一种；天门冬氨酸(D)取代谷氨酸(E),反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；以及丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然。其他的取代也可以被认为是保守的，取决于特定氨基19酸的环境和其在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可以经常互换，丙氨酸和缬氨酸(V)也是。相对疏水的蛋氨酸(M)可以经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常互换，其发生部位氨基酸的明显特征是其带电特性，这两种氨基酸残基的不同pK的差别并不明显。在特定情境下，仍有其他的一些变化可以被认为是"保守的"。给定一种抗体，本领域的技术人员可以生产出竟争性抑制的配体，例如竟争性抗体，其可以识别相同的抗原决定簇(Belanger等人，1973)。一种方法是用表达该抗体识别抗原的免疫原产生免疫。该样本可以包括组织、分离的蛋白或细胞系，但并不局限于这些。利用诸如ELISA、FACS或免疫沉淀的竟争性分析筛选产生的杂交瘤，所述竟争分析能鉴别抑制所检测抗体结合的抗体。另一种方法是利用噬菌体展示抗体库，淘选识别所述抗原的抗体(Rubinstein等人，2003)。在任一情况下，杂交瘤的筛选都是基于其与靶抗原的结合能力竟争超出原标记抗体。因此，这些杂交瘤的特征是可以与原始抗体识别相同的抗原，更具体地，可以识别同样的抗原决定簇。实施例1杂交瘤制备-杂交瘤细胞系7BD-33-11A,1A245.6,11BD-2E11-2杂交瘤才艮据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系7BD-33-11A和1A245.6于2003年1月8日保藏于美国典型培养物保藏中心，位于美国弗吉尼亚州20110-2209马纳萨斯大学路10801，保藏号分别为PTA-4890和PTA-4889。依据37CFR1.808的规定，保藏者保证在专利授权时将不可撤销地取消对公众获取该保藏材料的所有限制。才艮据布达佩斯条约，杂交瘤细胞抹11BD-2E11-2于2003年11月11日保藏于美国典型培养物保存中心，位于美国弗吉尼亚州20110-2209马纳萨斯大学路10801,保藏号为PTA-5643。依据37CFR1.808的规定，有限制。为了制备产生7BD-33-11A抗癌抗体的杂交瘤，在冷PBS中制备抗原，即人类乳腺癌细胞的单细胞悬液。通过以分次剂量皮下和腹腔注射含有0.2-2.5xl()S个细胞的100微升抗原-佐剂和弗氏完全佐剂免疫8到9周龄的BALB/c小鼠。初次免疫三周后，用新鲜制备的含有0.2-2.5xl06个细胞的抗原-佐剂以同样的方式加强免疫小鼠，并在上次加强后两周再加强一次。在最后一次免疫后至少两天，取出脾脏用于融合。将分离的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤伴侣融合以制备杂交瘤。检测杂交瘤亚克隆的融合上清。为了制备产生1A245.6抗癌抗体的杂交瘤，在冷PBS中制备抗原，即人类乳腺癌细胞的单细胞悬液。通过以分次剂量皮下和腹腔注射含有2.5xl(^个细胞的100微升抗原-佐剂和弗氏完全佐剂免疫8到9周龄的BALB/c小鼠。初次免疫后三周，用新鲜制备的含有2.5><106个的抗原-佐剂以同样的方式加强免疫小鼠，两周后、五周后以及上一次加强三周后再加强免疫小鼠。在最后一次免疫后至少三天，取出脾脏用于融合。将分离的脾细胞与NSO-l骨髓瘤伴侣融合以制备杂交瘤。检测所述杂交瘤亚克隆融合的上清。为了制备产生11BD-2Ell-2抗癌抗体的杂交瘤，在冷PBS中制备抗原，即人类乳腺癌细胞的单细胞悬液。通过以分次剂量皮下和腹腔注射含有0.2-2.5xl(^个细胞的100微升抗原-佐剂和弗氏完全佐剂免疫8到9周龄的BALB/c小鼠。初次免疫后两周至三周，用新鲜制备的0.2-2.5xl06个细胞的抗原-佐剂以同样的方式加强免疫小鼠，并在上次加强后两周再加强一次。在最后一次免疫后至少两天，取出脾脏用于融合。将分离的脾细胞与NSO-l骨髓瘤伴侣融合以制备杂交瘤。检测所述杂交瘤亚克隆融合的上清。为了检测杂交瘤分泌的抗体是IgG,还是IgM同种型，进行ELISA分析。将4。C包被緩沖液(0.1M碳酸盐/碳酸氢盐緩沖液，pH9.2-9.6)中的浓度为2.4jig/ml的山羊抗小鼠的IgG+IgM(H+L),按100(al/孔加入ELISA板过夜。该ELISA板用洗涤緩沖液(PBS+0.05%Tween)洗三次。按100ial/孔加入封闭緩沖液(5%奶洗涤緩沖液)，室温1小时，随后用洗涤緩冲液洗三次。按100ial/孔加入杂交瘤上清，将该板室温孵育1小时。该板用洗涤緩沖液洗三次，按100pl/孔加入山羊抗小鼠的IgG或IgM辣根过氧化物酶偶联物的1/5,000稀释液(用含1%牛血清白蛋白的PBS稀释)。室温孵育1小时后，该板用洗涤緩冲液洗三次。按100(il/孔加入TMB溶液，室温孵育1-3分钟。按100lal/孔加入2MH2S04，终止颜色反应，用Perkin-ElmerHTS7000酶标仪在450nm波长处读板。如表1所示，7BD-33-llA、1A245.6、11BD-2E11-2杂交瘤主要分泌IgG同种型抗体。经过一至四轮有限稀释，在细胞ELISA分析中，检测杂交瘤上清中与靶细胞结合的抗体。检测了三种乳腺癌细胞系MDA-MB-231(也被称为MB-231)、MDA-MB-468(也被称为MB-468)和SKBR-3。板内的细胞在使用前先固定。室温下，该板用含MgCl2和CaCb的PBS洗三次。每孔加PBS稀释的2%的多聚甲醛100|il，室温10分钟，然后弃掉多聚曱醛。再用含MgCl2和CaCl2的PBS在室温下洗涤该板三次。每孔加100jLil5。/()牛奶洗涤液(PBS+0.05。/()Tween)进行封闭，室温1小时。该板用洗涤液洗三次，按100iil/孔加入杂交瘤上清，室温孵育1小时。用洗涤緩沖液将该板洗三次，按100(al/孔加入辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠的IgG或IgM的1/5,000稀释液(用含1%牛血清白蛋白的PBS稀释)。室温孵育l小时后，该板用洗涤緩沖液洗三次，每孔加入100plTMB底物，室温孵育1-3分钟。每孔加入100(il2M辟u酸终止反应，用Perkin-ElmerHTS7000酶标仪在450nm波长处读板。结果在表1中列出，表示为与IgG同种型对照(3BD-27)相比高出背景的倍数。7BD-33-llA和1A245.6杂交瘤细胞系产生的抗体与检测的所有三种乳腺癌细胞系都强烈结合，至少比背景高出6倍。两种抗体与MDA-MB-231细胞系的结合最强。杂交瘤细胞系11BD-2Ell-2产生的抗体也与MDA-MB-231强烈结合，但是与另外两种细胞系的结合并没显示出比背景强。这些结果表明该抗体识别的表位在MDA-MB-468或SKBR-3细胞上不存在，并且与7BD-33-11A和1A245.6识别的表位明显不同。进行抗体结合试验的同时，在相同的乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468和SKBR-3上，#:测了杂交瘤上清的细胞毒性作用。活/死细胞毒性分析试剂盒购自MolecularProbes公司(Eu,OR)。根据厂商的说明书并作下述的改动后进行分析。在分析前，将细胞根据预先确定的适当密度进行铺板。两天后，将100pl来自杂交瘤微孔板的上清转移到细胞培养^1中，在5%C02孵箱中孵育5天。将阳性对照孔吸净，加入100pl叠氮钠和/或》文线菌酮。因为已知3BD-27单克隆抗体不与检测的三种乳腺癌细胞系结合，所以该抗体也被加入作为同种型对照。抗-EGFR抗体(C225)也被用于该分析，以作比较。经过5天的处理后，倒空反应板的液体并吸干。通过多通道塑料挤瓶，将含MgCl2和CaCl2的室温DPBS分到每孔中，叩打三次，倒出液体并吸干。每孔加入50pl用含MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的荧光活/死(Live/Dead)染料，在37。C含5%C02的孵箱内孵育30分钟。该板置于Perkin-ElmerHTS7000荧光读板仪内读数，数据用MicrosoftExcel进行分析，结果在表1中列出。观察到三种抗体的细胞毒性有所差异。11BD-2E11-2显示39-73%的杀伤作用，在SKBR-2细胞上观察到的细胞毒性最高。1A245.6和7BD-33-11A在MDA-MB-231细胞中呈现相似的细胞毒性，但1A245.6对于MDA-MB-468细胞也具有细胞毒性，而7BD-33-11A则没有。这表明来源于杂交瘤细胞的抗体能在癌细胞中产生细胞毒性作用。在抗体的结合程度和杂交瘤上清产生的细胞毒性作用之间存在普遍的联系。这种趋向有一些例外，比如尽管11BD-2Ell-2对MB-468和SKBR-3细胞结合孩i弱，但11BD-2E11-2在MB-468和SKBR-3癌细胞中仍有细测到的调节活性，或者测定由于分析本身的限制(例如细胞的固定)而检测不到其结合。最后，另一个可能性是所述分析在该特定情况下对;险测足以介导细胞毒性作用的结合不是足够的敏感。另一个例外是尽管7BD-33-11A对MB-468细胞的结合与同种型对照相比高出背景六倍，但该抗体对MB-468细胞的细胞毒性较弱。这提出了一种可能性，即结合不见得必然预测抗体与其相关抗原连接的结果。已知的非特异性细胞毒性物质放线菌酮产生了预期的细胞毒性作用。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>实施例2抗体制备通过在CL-1000瓶(BDBiosciences,Oakville,ON)中培养杂交瘤7BD-33-llA、1A245.6、11BD-2E11-2来制备单克隆抗体，每星期进行两次收集和再接种。然后用蛋白G琼脂糖4快流(ProteinGSepharose4FastFlow)(AmershamBiosciences,Baied'Urf6，QC)进行标准的抗体纯化过程。本发明的范围包括利用人源化的、嵌合的或鼠单克隆抗体。在细胞毒性分析中，7BD-33-llA、1A245.6、11BD-2E11-2与许多阳性对照(抗Fas(EOS9.1,IgM，k，20樣i克/毫升，eBioscience,SanDiego，CA)，抗醫Her2/neu(IgGl，k，10樣i克/毫升，InterMedico,Markham,ON)，抗-EGFR(C225,IgGl,k,5微克/毫升，Cedarlane,Hornby,ON),放线菌酮(100微摩尔，Sigma,Oakville，ON)，NaN3(0.1%,Sigma,Oakville,ON))以及阴性对照(107.3(抗-TNP,IgGl，k，20孩i克/毫升，BDBiosciences,Oakville,ON),G155-178(抗-TNP,IgG2a，k,20孩i克/毫升，BDBiosciences,Oakville,ON),MPC-11(抗原特异性未知，IgG2b，k,20孩i克/毫升)，J606(抗-果聚糖，IgG3，k，20微克/毫升)，IgG緩冲液(2。/。))比较(表2)。检测了乳腺癌(MB-231,MB-468,MCF陽7)、结肠癌(HT-29,SW1116,SW620)、肺癌(NCIH460)、卵巢癌(OVCAR)、前列腺癌(PC-3)以及非-癌(CCD27sk，Hs888Lu)细胞系(所有这些细胞系都来自ATCC,Manassas,VA)。活/死细胞毒性检测试剂盒购自MolecularProbes7>司(Eugene,OR)。才艮据厂商的i兌明书并作下述的改动后进行分析。在检测前细胞以预确定的合适密度铺板。2天以后，将100微升纯化抗体稀释到培养基中，然后转移入细胞板中，在8%(302的孵箱中孵育5天。然后倒空培养板并吸干。通过多通道塑料挤瓶，将含MgC12和CaC12的室温DPBS分到每孔中，叩打三次，倒出液体并吸干。每孔加入50|il用含MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的荧光活/死染料，在37°C含5%C02的孵箱内孵育30分钟。该板置于Perkin-ElmerHTS7000荧光读板仪内读数，数据用MicrosoftExcel进行分析，结果在表2中列出。数据是四次试验的平均值，每次三个重复，并以如下方式定性四次试验中四次高于阈细胞毒性记为(+++),四次试验中三次高于阈细胞毒性记为(++),四次试一睑中两次高于阈细胞毒性记为(+)。表2中未标记的细胞24表示几次结果不一致或低于阈细胞毒性的作用。抗体7BD-33-11A和1A245.6在乳腺癌以及前列腺癌胂瘤细胞系中显示出选择性的细胞毒性，而对非转化的正常细胞没有影响。两种抗体都显示比阳性对照抗-Fas抗体高25-50%的杀伤作用。11BD-2E11-2在乳腺癌和卵巢癌细胞中具有特异的细胞毒性，并且对正常细胞没有影响。化学细胞毒性试剂诱导预期的细胞毒性，而用于对比的许多其他的抗体的表现也与预期相同，尽管生物的细胞分子有局限性。总之，三种抗体均显示出对许多类型的癌细胞都有细胞毒性活性。由于并不是所有的癌细胞都是敏感的，抗体在其活性上有选择性。此外，所述抗体显示出功能性特异性，因为其在非-癌细胞类型中并不产生细胞毒性，这在治疗性情况下是一个很重要的因素。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>用于FACS的细胞的制备如下首先用DPBS(无4丐离子和镁离子)冲洗单层细胞，然后在37。C用细胞解离緩冲液(INVITROGEN)使细胞脱离培养板。离心之后，在4。C用含MgCl2、CaCl2以及25%胎牛血清的Dulbecco's磷酸盐緩沖液重悬细胞(洗涤培养基)并计数，分至适当的细胞密度，离心以沉淀细胞并重悬于含20微克/毫升7BD-33-llA、1A245.6、11BD-2E11-2或对照抗体(同种型对照或抗-EGFR)染色培养基(含MgCl2和CaCl2的DPBS),冰上放置30分钟。加入AlexaFluor488-偶联的二抗之前，用洗涤培养基洗细胞一次。加入溶于染色培养基的AlexaFluor488-偶联抗体，放置20分钟。用含l微克/mL碘化丙啶的染色培养基最后洗一次细胞。通过在使用CellQuest软件的FACScan(BDBiosciences)上运行样品来评估流式细胞计数的细胞获取结果。细胞的前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)通过调整FSC和SSC检测器的电压和振幅设定。三个荧光通道(FLl,、FL2和FL3)的检测器通过运行用纯化的同种型对照抗体染色，继而用AlexaFluor488-偶联的二抗染色的细胞来调整，以使细胞有一个统一的荧光强度大约l-5个单位的波峰。通过FSC设门和碘化丙啶排除来获取活细胞。对于每一份样品，获取大约10,000个活细胞进行分析，结果列于表3中。表3列出高于同种型对照的平均荧光密度的倍增。并如下定性小于5为(-);5至50为(+);50至100为(++);高于100为(+++),括号中为染色细胞的百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>7BD-33-11A抗体的代表性直方图汇编至图1，1A245.6抗体的代表性直方图汇编至图2,11BD-2Ell-2抗体的代表性直方图汇编至图3并显示结合特征，在某些情况下包含示例的双峰。11BD-2Ell-2呈现出对于乳腺癌细胞系MDA-MB-231的特异性肺瘤结合。7BD-33-11A和1A245.6显示出对于乳腺(MDA-MB-231和MCF-7)、结肠、肺、卵巢和前列腺来源的癌细胞系具有类似的结合，但对一种(MDA-MB-468)乳腺癌细胞系的结合有所不同。这三种抗体全都与非-癌细胞结合，但所述结合并不产生细胞毒性作用。这是结合并不必然地预示着抗体与其相关抗原连接的结果的进一步证据，并且是非显而易见的发现。这提示在不同细胞中细胞毒性作用取决于抗体连接的情形，而并不仅仅取决于抗体结合。实施例3体内试验参见图5和图6显示的数据，在四至八周龄的雌性SCID小鼠颈背部皮下注射100微升以植入五百万个MDA-MB-231人乳腺癌细胞。小鼠随才几分成四个处理组，每组10只。才直入前一天，将300樣i升体积的待测抗体11BD2E-ll-2、7BD-33-llA、1A245.6或3BD-27同种型对照抗体(已知不与MDA-MB-231细胞结合)以20mg/kg的量经腹腔给药，，所述液体由含2.7mMKC1，1mMKH2P04,137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀释液将储存液稀释后得到。所述抗体以同样方式每周给药一次，一共7周。大约每7天用测径器测量肺瘤生长，观察达10周，或直至动物个体达到加拿大动物保护协会(CCAC)终点。在研究期间记录动物的体重。研究结束时所有动物都^4居CCAC的指导原则纟皮施以安乐死。整个研究中没有出现临床毒性症状。每周测量一次的体重可以作为健康或发育停滞的替代指标。在用同种型对照、3BD-27以及7BD-33-llA、1A245.6或11BD-2E11-2治疗的各组之间，在体重上有最小的差异。在第60天(停止治疗后11天)，1A245.6治疗组的肺瘤体积是对照组的5.2%(p=0.0002)，显示抗体治疗在降低胂瘤负荷方面的有效性。那些用7BD-33-llA抗体治疗的携带癌细胞的小鼠没有得病，并且没有肿瘤负荷。11BD-2E11-2治疗组在第67天时肺瘤体积缩小(对照的45%)(p=0.08)。这也表明，细胞毒性抗体治疗与对照抗体相比，能减小肺瘤负荷。用7BD-33-llA、1A245.6和11BD-2E11-2细胞毒性抗体治疗还有相应的存活益处(图6)。用3BD-27抗体治疗的对照组在移植后第74天达到100%的死亡率。相反，7BD-33-llA治疗组没有得病并且1A245.6治疗的动物呈现100%的存活率，11BD-2E11-2治疗组存活率为24%。总之，相比对照抗体，细胞毒性抗体治疗在公认的人类癌症模型中使肺瘤负荷降低并增加了存活率，这提示这些抗体(7BD-33-llA、1A245.6和11BD-2Ell-2)在用于包括人类在内的其他哺乳动物的治疗中具有药理学和药物学益处。实施例4体内建立的肿瘤试验将颈背部皮下注射的100微升中的五百万个MDA-MB-231人乳腺癌细胞植入到五至六周龄的雌性SCID小鼠。每周用测径器测量肿瘤生长。植入后第34天，当该群小鼠的大多数的肿瘤体积达到100mm、范围从50至200mm"时，三个处理组的每组被随机分入8-10只小鼠。将150微升体积的7BD-33-llA、1A245.6待测抗体或3BD-27同种型对照抗体(已知不结合MDA-MB-231细胞)以15mg/kg的量经腹腔给药，所述液体由含2.7mMKC1,1mMKH2P04，137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀释液将储存液稀释后得到。然后所述抗体以同样方式每周给药三次，总共10次，直至植入后第56天。每7天用测径器测量肺瘤生长，直至植入后第59天或直到动物个体达到加拿大动物保护协会(CCAC)的终点。在研究期间记录动物的体重。研究结束时所有动物都根据CCAC的指导原则被施以安乐死。整个研究中没有出现临床毒性症状。每周测量一次体重。同种型对照和7BD-33-11A或1A245.6抗体治疗组之间在体重上没有显著差别。由图4可以看出，才直入后第59天(治疗结束后两天)，7BD-33-llA治疗组的肿瘤体积是对照组的29.5%(p=0.0003)。在该组，将第59天的数值与第52天比较(p咱.25)时，平均肿瘤体积还有衰退的趋势，同样，1A245.6抗体治疗也显著地抑制肺瘤生长，并降低肿瘤负荷。用这种抗体处理的携带建立的肺瘤的动物的肺瘤体积是用同种型对照抗体处理组的56.3%(p=0.017)。总之，相比对照抗体，7BD-33-llA或1A245.6抗体在公认的人类癌症模型中显著降低了建立的胂瘤的肺瘤负荷，表明这些抗体在用于包括人类在内的其他哺乳动物治疗中具有药理学和药物学益处。技术人员的水平。所有专利和公开出版物通过引用的方式并入本文，其引用程度如同每个出版物被特别单独地指明以引用的方式并入本文。应该明白，尽管本发明以某种形式被说明，但这不是要将本发明限定在本文所描述和显示的特定形式或布局。对本领域的^支术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可以做出各种变化，且不应当认为本发明限于本说明书中显示和描述的内容。本领域的技术人员很容易看出使本发明较好地适合实现所描述的目的并获得最终结果和益处，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相关化合物、方法、程序和技术都是优选实施方案中有代表性的，其目的在于示例，并不是限制本发明的范围。本领域的技术人员能够想到包括在本发明精神的范畴内的变化和其它用途，并由所附权利要求书的范围所限定。尽管借助特定的优选实施方案描述实施方案。事实上，所描述的实施本发明的方式的各种变化，对本领域的技术人员来说是显而易见的，均在所附权利要求书的范围内。弗吉尼亚州20110-2209马纳萨斯大学路10801电话703-365-2700传真703-365-2745为专利^呈序的f敫生物《呆藏耳又:得国卩示7"P:i人的布达f風其斤条纟勺国际表才、艮J居第7.3条发布的微生物《呆藏iiE明以及才、艮J居第10.2条发布的微生物存》、舌声明(译文)致(保藏人或代理人名称及地址)AriusResearchInc.(阿里乌斯研究公司)代理人LisaCechetto55YorkStreet,16thFloorToronto,ONM5J1R7(加拿大多伦多)代表AriusResearchInc.(阿里乌斯研究公司)而保藏保藏人标识号小鼠杂交瘤细胞系11BD-2E11-2所述保藏附冇以下说明的_科学性描述_建议的分类描述。本国际保藏机构于2003年11月11日收到所述保藏，并且所述保藏已被接受。应您的耍求L我们旌向您通知30年内对所述菌种的请求。如果布达佩斯条约成员国专利局证明某人有权收到该菌种，成者如果已出版引用该菌种的美国专利，且美国专利与商标局或本保藏人指示ATCC释放该菌种，那么将可获得该菌种。如果该培养物在所述保藏的有效期内死亡或被破坏，那么您将负有用相同的活培养物代替它的责任。在自保藏日起至少30年内，或者在最近的样品请求之后5年内，该菌种将被维持，所述时间以较长者为准。美国和其他很多国家都是布达佩斯条约成员国。丁-2003年11月17日检测以上所引用培养物的存活。在当大，所述培养物是存活的。国际保藏机构AmericanTypeCultureCollection(美国典型微生物保藏中心)，Manassas,VA20110-2209USA(美国弗吉尼亚)ATCC授权代表签字_日期2003年12月23日FerrisLander先生巻号2056.018专利保藏指定PTA-564权利要求1.单克隆抗体或诱导细胞毒性作用的配体，其特征在于具有竞争性抑制分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述分离的单克隆抗体由以PTA-5643保藏于ATCC的克隆编码。2.由权利要求1所述的抗体或配体，其是人源化的。3.由权利要求1所述的抗体或配体，其是嵌合的。4.引发抗体诱导的选自人乳腺或卯巢胂瘤的组织样本中癌细胞的细胞毒性作用的方法，所述方法包括提供如权利要求1、2或3中的任一项所述的单克隆抗体或诱导细胞毒性作用的配体，以及将所述单克隆抗体或诱导细胞毒性作用的配体与所述的组织样本接触。5.如权利要求1、2或3中的任一项所述的单克隆抗体或配体，其与选自细胞毒性部分、酶、放射活性化合物和造血细胞的成员偶联。6.治疗哺乳动物中对于抗体诱导的细胞毒性作用敏感的人类乳腺和卵巢肺瘤的方法，其中所述人类乳腺和前列腺肺瘤表达与由保藏在ATCC、保藏号为PTA-5643的克隆所编码的分离的单克隆抗体或其诱导细胞毒性作用的配体特异性结合的抗原，所述方法包括以有效诱导细胞毒性作用的量给予所述哺乳动物如权利要求1或2或3中的任一项所述的单克隆抗体或诱导细胞毒性作用的配体，从而降低所述哺乳动物的肿瘤负荷。7.如权利要求6所述的方法，其中所述单克隆抗体或配体与细胞毒性部分偶联。8.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。9.如权利要求6所述的方法，其中所述单克隆抗体或配体激活补体。10.如权利要求6所述的方法，其中所述单克隆抗体或配体介导抗体依赖的细胞毒性作用。全文摘要本发明涉及使用新型筛选模式制备患者癌性疾病调节抗体的方法。该方法利用癌细胞的细胞毒性作用作为指标来分离抗癌抗体，使制备诸如以保藏号PTA-5643保藏在ATCC的杂交瘤所产生的单克隆抗体的抗癌抗体成为可能。所述抗体可以用于辅助癌症分期和诊断，还可以用于治疗原发性肿瘤，例如乳腺癌或卵巢癌，以及治疗肿瘤转移。该抗癌抗体能够与毒素、酶、放射性化合物和造血细胞偶联。文档编号C07K16/30GK101454346SQ200780015954公开日2009年6月10日申请日期2007年3月5日优先权日2006年3月7日发明者大卫·S·F·杨,海伦·P·芬德利,苏姗·E·哈恩申请人:阿里乌斯研究公司