修饰的人源化的抗-干扰素-18抗体的制作方法

专利名称：：修饰的人源化的抗-干扰素-18抗体的制作方法修饰的人源化的抗-干扰素-18抗体1.发明领域本发明一般涉及免疫球蛋白领域，例如抗体，特別是人源化的抗体，可用于治疗和诊断由人干4尤素-18介导的适应症。2.
背景技术：
：人干扰素-18(IL-18)是作为无生物活性的193个氨基酸的前体蛋白质形式被合成的细胞因子(Ushio等人，J.Immunol.156:4274,1996)。通过例如半胱天冬酶一l或半胱天冬酶-4切割前体蛋白，释放156个氨基酸的成熟蛋白质(Gu等人，Science,275:206,1997;Ghayur等人，Nature386:619,1997),表现出生物学活性，包^fe辅助刺激T细^^增殖、增强NK细胞的细胞毒性、诱导T细胞和NK细胞生产IFN-y以及加强I型t辅助细胞(Thl)分化(Okamura等人，Nature378:88,1995;Ushio等人，J.Immunol.156:4274,1996;Micallef等人，Eur.J.Immunol.26:1647,1996;Koh加等人，J.Immunol.158:1541,1997;Zhang等人，Infect.Immunol.65:3594,1997;Robinson等人，Immunity7:571,1997)。此外，IL-18还是人单核细胞促炎症介质的有效的诱导剂，这些介质包括IL-8、胂瘤坏死因子-a(TNF-a)和前列腺素E2(PGE2)(Ushio,S.等人,J.Immunol.156:4274-4279,1996;Puren,A.J.等人，J.Clin.Invest.10:711-721,1997;Podolin等人，J.Immunol.submitted,1999)。经鉴别，以前克隆的IL-1受体相关蛋白(IL-lRrp)(Parnet等人，J.Biol.Chem.271:3967,1996)是IL-18受体的亚基(Kd=18nM)(Torigoe等人，J.Biol.Chem.272:25737,1997)。IL-18的第二个亚基表现出与IL-1受体附加蛋白的同源性，已命名为AcPL(得名于附加蛋白-样)。IL-1Rrp和AcPL都是IL-18诱导的NF-KB和JNK活化所必需的(Born等人，J.Biol.Chem.273:29445,1998)。除NF-kB和JNK以外，IL-18信号还通过IL-1受体相关激酶(IRAK)、p561ck(LCK)和有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)起作用(Micallef等人，Eur.J.Immunol.26:1647,1996;Matsumoto等人，BiophysBiochem.Res.Comm.234:454,1997;Tsuji画Takayama等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.237:126,1997)。TH1细月包生产促炎症细月包因子例如IFN-y、IL-2和TNF-P(Mosmann等人，J.Immunol.136:2348,1986),涉及介导多种自身免疫病，包括多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、炎性肠病(IBD)和牛皮癣(Mosmann和Sad,Immunol.Today17:138,1996)。因此，预期THl-促进性的细胞因子例如IL-18的拮抗剂将抑制疾病发展。IL-18特异性单克隆抗体(mAb)可用做拮抗剂。已经证实了IL-18在自身免疫疾病发展中的作用。相应地，已经证实了在疾病发生之前，IL-18的表达在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的胰脏和脾脏中显著增加(Rothe等人，J.Clin.Invest.99:469,1997)。相似地，已经显示了在类风湿性关节炎患者的滑液中，IL-18的水平显著升高了(Kawashima等人，ArthritisandRheumatism39:598,1996)。此夕卜，已经证实了IL-18增加了小鼠实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的临床严重程度。此外，还已经证实了在雌性路易斯大鼠中，中和抗-大鼠IL-18抗血清防止了EAE的发展(Wildbaum等人，J.Immunol.161:6368,1998)。因此，IL-18是发展新的治疗自身免疫的理想粑。Taniguchi等人，J.Immunol.Methods206:107描述了七种小鼠和六种大鼠的抗人IL-18单克隆抗体(mAb),其结合四种不同的抗原位点。一种小鼠mAb(#125-2H)和六种大鼠mAb抑制IL-18诱导的KG-1细胞的IFN-Y生产，大鼠mAb表现的中和活性比M25-2H的中和活性低10倍。蛋白质印迹检测证实，三种小鼠mAb,但是大鼠mAb中没有一种，与膜结合的人IL-18强烈反应。此外，还描述了利用M25-2H和大鼠mAb来检测人IL-18的酶联免疫吸附检测(ELISA)。该ELISA检测的极限是10pg/ml。欧洲专利申请EP0712931公开了两种小鼠抗人IL-18mAb、HI(IgGl)和H2(IgM)。蛋白质印迹检测证实，两种mAb都与膜结合的人IL-18反应，而不与膜结合的人IL-12反应。在免疫亲和色语实验规程中使用了HI来纯化人IL-18,并且用在ELISA中来测量人IL-18。H2被用于放射性免疫检测中来测量人IL-18。中和IL-18抗体可潜在地用于緩解自身免疫病和人的相关症状。因此，本领域需要高亲和力的IL-18拮抗剂，例如抗人白介素18的中和单克隆抗体，其可降低Thl细胞的分化和增殖，因而降低自身免疫病和相关症状。本说明书全文中提及的所有参考文献都通过引用明确和完整的整合到本文中。3.发明概述根据本发明，提供了人源化的抗白介素-18抗体，包含具有下列互补决定区(CDR)的重链和轻链CDRH1:SEQ,I.D.NO:lCDRH2:SEQ丄D.NO:2CDRH3:SEQ丄D.NO:3CDRL1:SEQ丄D.NO:4CDRL2:SEQ.I.D.NO:5CDRL3:SEQ丄D.NO:6根据本发明，提供了人源化的抗白介素-18抗体，包含具有下列互补决定区(CDR)的重链和轻链CDRH1:SEQ丄D.NO:lCDRH2:SEQ.I.D.NO:2CDRH3:SEQ丄D.NO:3CDRL1:SEQ.I.D.NO:4CDRL2:SEQ.I.D.NO:5CDRL3:SEQ丄D.NO:6其中，所述轻链的第71位残基^f皮衍生CDR的供体抗体中发现的相应残基取代了。对本领域技术人员是显而易见的，术语"衍生"不仅意在定义所述材致。因此，"从衍生CDR的供体抗体框架中发现的"相应的残基不是必须从供体抗体框架中纯化的。相似地，"从供体抗体衍生的"CDR也不是必须从供体抗体纯化的。除非另外提示，CDR和框架区(FR)和氨基酸计数，都遵从在Kabat等人"Sequencesofimmunologicalinterest",NIH中提出的Kabat定义。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，其包含移植到人受体框架区上的从供体抗体衍生的CDR,所述抗-白介素18抗体包含具有在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陈列的序列的CDR,其中所述抗-白介素18抗体的轻链的第71位残基与供体抗体框架中的相应位置中发现的残基相同。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，其包含具有在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陈列的序列的CDR,所述抗体在轻链的第71位包含酪氨酸。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，包含具有在SEQIDNO:l、2和3中陈列的CDR的重链和具有在SEQIDNO:4、5和6中陈列的CDR的轻链，其中所述轻链的CDR是从供体抗体衍生的，所述供体抗体在供体抗体轻链的第71位具有酪氨酸。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，包含来自供体抗体的CDR,并且在所述人源化抗体的轻链的第71位具有酪氨酸，其中所述供体抗体是2C10或其框架变体(即，所述人源化的抗体包含与2C10相同的CDR,但是不同的框架，参见US专利6,706,487)。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)重链，其具有含有移植到人重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列的CDR,和(b)轻链，其具有含有移植到人轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列的CDR,其中所述人轻链受体框架包含从SEQIDNO:38衍生的框架区，其中SEQIDNO:38的第71位是酪氨酸。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)重链，其具有允许与人IL-18特异性结合的CDR,和(b)轻链，其具有受体框架，并具有含有在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列的CDR，并在第71位具有酪氨酸残基。所述轻链的CDR优选地位于受体框架内的位置，这些位置对应于在SEQIDNO:35中陈列的序列中的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列的位置。所述轻链和/或重链优选地在人类患者中是非免疫原性的。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)重链，其包含具有在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列的CDR,和(b)轻链，其包含移植到人轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列的CDR,其中所述人源化的抗-白介素-18抗体的所述轻链受体框架区衍生自在SEQIDNO:38中陈列的序列的变体，其中所述变体在第71位包含酪氨酸，并且所述变体包含与在SEQIDNO:38中陈列的序列有75%或更高同一性的序列。优选地，所述变体包含与在12SEQIDNO:38中陈列的序列有80%或更高的例如81%、82%、83%、84%同一性，更优选地，85%或更高的，例如86%、87%、88%、89%的同一性，甚至更优选地，卯％或更高的，例如91%、92%、93%、94%的同一性，更优选地，95%或更高的，例如96%、97%、98%、99%的同一性。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，该抗体包含(a)从供体抗体衍生的在SEQIDN0:1、2、3、4、5和6中陈列的序列的CDR,所述供体抗体在供体抗体的第71位含有酪氨酸；(b)人受体框架，所述受体框架在人轻链的第71位含有苯丙氨酸；其中所述抗-白介素18抗体在轻链的第71位含有酪氨酸。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)从供体抗体衍生的在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陈列的CDR,所述供体抗体在供体抗体轻链的第71位含有芳香族氨基酸；(b)人受体框架，所述受体框架在轻链受体框架的笫71位含有与(a)部分中的芳香族氨基酸不同类型的芳香族氨基酸；其中所述抗-白介素18抗体包含从(a)部分的抗体衍生的轻链，其在第71位含有芳香族氨基酸。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，当在37。C用表面等离子体共振(例如，BiacoreTM,优选的使用Biacore3000仪器和在下文7.4.1中给出的条件)测量时，所述抗体针对结合人IL-18具有300pM的平衡常数。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，所述抗体包含在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陈列的CDR,并且当在37。C用表面等离子体共振(例如，Biacore,优选的使用Biacore3000仪器和在下文7.4.1中给出的条件)测量时，所述抗体对于结合人IL-18具有300pM的平衡常数。优选地，有关抗体结合人IL-18的平衡常数在37。C用表面等离子体共振(例如，Biacore,优选的使用Biacore3000仪器和在下文7.4.1中给出的条件)测量时少于90pM。更优选地，平tf常数是70pM或更少，更优选3也是65pM、60pM、55pM或50pM或更少。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，所述抗体在37。C用表面等离子体共振(例如，Biacore,优选的使用Biacore13T100仪器和在下文7.4.2中给出的条件)测量时，对于人IL-18表现出0.00021/s或更高的解离常数或解离速率(kd)。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，该抗体包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架包含从在SEQIDNO:37中陈列的序列衍生的框架区，其中所述重链的第27、28、29、93、39、40、36、71、89、91位的一个或多个残基与供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体书1"生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架包含从SEQIDNO:38中陈列的序列衍生的框架区，其中所述轻链的第71位和任选的第45、83、84、85位的一个或多个残基与供体抗体轻链中的相应残基相同。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到人重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架包含从SEQIDNO:37中陈列序列衍生的框架区，其中所述重链的第27、28、29、93位的残基与供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体4汙生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架包含从在SEQIDNO:38中陈列的序列衍生的框架区，其中所述抗-白介素-18抗体的轻链的第71位的残基与供体抗体轻链中的相应残基相同。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到人重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架包含从在SEQIDNO:37中陈列的序列衍生的框架区，其中所述重链的第27、28、29、39、40、93位的残基与供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体衍生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架包含从在SEQIDNO:38中陈列的序列衍生的框架区，其中所述轻链的第71位的残基与供体抗体轻链中的相应残基相同。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到人重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架包含从在SEQIDNO:37中陈列的序列书卞生的框架区，其中所述重链的第27、28、29、36、39、40、71、89、91、93位的残基与供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体衍生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架包含从在SEQIDNO:38中陈列的序列衍生的框架区，其中所述轻链的第71位的残基与供体抗体轻链中的相应残基相同。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到人重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架包含从在SEQIDNO:37中陈列的序列衍生的框架区，其中所述重链的第27、28、29、93位的残基与供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体书f生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架包含从在SEQIDNO:38中陈列的序列衍生的框架区，其中所述轻链的第71、45、83、84、85位的残基与供体抗体轻链中的相应残基相同。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)包含从供体抗体书f生的CDR的重链，所述CDR具有移植到人重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架包含从在SEQIDNO:37中陈列的序列衍生的框架区，其中所述重链的第27、28、29、93、39、40位的残基与供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体书f生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架包含从在SEQIDNO:38中陈列的序列衍生的框架区，其中所述轻链的第71、45、83、84、85位的残基与供体抗体轻链中的相应残基相同。在本发明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到人重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架包含从在SEQIDNO:37中陈列的序列衍生的框架区，其中所述重链的第27、28、29、93、39、40、36、71、89、91位的残基与供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体衍生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架包含从在SEQIDNO:38中陈列的序列衍生的框架区，其中所述轻链的第71、45、83、84、85位的残基与供体抗体轻链中的相应残基相同。在本发明的另一方面，提供了包含重链和轻链的人源化抗-白介素-18抗体，其中所述抗体在25。C时和结合的人IL-18的解离速率(kd)与所述抗体在37。C时和结合的人IL-18的解离速率(kd)之间的比值是1:5或更少，其中所述抗体包含从供体抗体衍生的CDR和人受体框架，其中所述人受体框架的轻链的第71位的残基被来自供体抗体的相应残基取代。优选地使用BiacoreTMT100仪器和在下文7.4.2中给出的条件来测量解离速率。在本发明的另一方面，提供了人源化抗-白介素-18抗体，其包含选自SEQIDNO:9、SEQIDNO:17、SEQIDNO:21的重链和选自SEQIDNO:13、SEQIDNO:29的轻链。在本发明的另一方面，提供了人源化抗-白介素-18抗体，其包含SEQIDNO:9的重链和SEQIDNO:13的轻链，或者SEQIDNO:9的重链和SEQIDNO:29的轻链。在本发明的另一方面，提供了人源化抗-白介素-18抗体，其包含SEQIDNO:17的重链和SEQIDNO:13的轻链，或者SEQIDNO:17的重链和SEQIDNO:29的轻链。在本发明的另一方面，提供了人源化抗-白介素-18抗体，其包含SEQIDNO:21的重链和SEQIDNO:13的轻链，或者SEQIDNO:21的重链和SEQIDNO:29的轻链。16在本发明的另一方面，提供了包含本文中描述的抗-白介素-18抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。在本发明的另一方面，提供了筛选用于治疗用途的抗体(特别是抑制配体和受体之间相互作用的抗体，例如抗-白介素-18抗体)的方法，所述方法包括(a)在30至45°C(优选的37°C)测量抗体对抗体特异性结合的抗原的结合亲和力(使用例如BiacoreTM表面等离子体共振)；(b)在20至25°C(优选的25°C)测量抗体对抗体特异性结合的抗原的结合亲和力(使用例如BiacoreTM表面等离子体共振)；(c)如果(a)的亲和力大于(b)的亲和力，优选地，如果(a)的亲和力比(b)的亲和力大2倍或更多，更优选地，4倍或更多，选择所述抗体用于治疗用途。在本发明的另一方面，提供了选择用于治疗用途的抗体(特别是抑制配体和受体之间相互作用的抗体，例如抗-白介素-18抗体)的方法，所述方法包括(a)在30至45°C(优选的37°C)时测量抗体与抗体特异性结合的抗原之间的解离速率(使用例如BiacoreTM表面等离子体共振)；(b)在20至25°C(优选的25°C)测量抗体与抗体特异性结合的抗原之间的解离速率(使用例如BiacoreTM表面等离子体共振)；(c)如果(a)的解离速率低于(b)的解离速率，则选择所述抗体用于治疗用途。术语"抗-白介素-18抗体，，指代本发明的抗体时意指此类能够中和人白介素-18的生物学活性的抗体。它不排除此类抗体也可以中和非人灵长类(例如恒河猴和/或短尾猴)白介素-18的生物学活性的情况。附图的简要说明还将参照附图进一步描述发明，其中图1显示了温度对H1L1和H1L2的结合速率(ka)的影响；图2显示了温度对解离速率(kd)的影响；图3显示了温度对平衡常数(KD)的影响；图4A-4C显示了来自产生表7所示的EC50值的一个实验的代表性数据；17图5显示了四种选4奪的人源化变体结合人IL-18的EC50值；图6显示了选择的人源化变体结合人IL-18的EC50值；图7显示了在存在50%滑液时H1L2与人IL-18的结合；图8显示了在KG1检测中，对IL-18激发的IFN-y生产的抑制作用；图9A和9B显示了分别在10%和25%自体血清中，在人PBMCS供体中对LPS激发的IFN-y生产的抑制作用；图IO显示了2C10结合被WL18BP捕获的hlL18;图11显示了9种人源化的变体抑制IL-18激发的在KG1细胞中释方文IFN-y的能力；图12显示了Hl变体和2C10在KG1细胞中对IL-18激发的IFN-y生产的抑制作用；图13显示了取95。/o置信区间时Hl变体的IC50数据；图14显示了在KG1细胞中对IL-18激发的IFN-y生产的抑制作用；图15显示了在KG1细^^中对恒河猴IL-18激发的IFN-y生产的抑制作用；图16显示了使用嵌合2C10的人IL-18结合ELISA的结果；图17显示了使用嵌合2C10的恒河猴IL-18结合ELISA的结果；图18A和18B显示了分别使用H1L2和2C10,结合人IL-18结合的IL-19BP的结合ELISA的结果。4.人源化的抗体利用完整的非人类抗体治疗人类疾病或障碍，其本身就具有目前已被普遍证实的潜在免疫原性问题，特别是基于抗体的重复给药。即，患者的免疫系统将非人类的完整抗体识别为异己并且发起中和反应。除了发展完全的人抗体(参见上文)以外，多年来已经发展了各种技术来克服这些问题，这些技术一般涉及到减少完整抗体中的非人类氨基酸序列成分，但保留从接种动物(例如小鼠、大鼠或兔)获得非人类抗体的相对简易性。概括地说，已有两种方法可以达到这个目的。第一种方法是嵌合抗体，一般包含与人恒定区融合的非人类(例如啮齿类例如小鼠)的可变区。因为抗体的抗原结合位点位于可变区内，嵌合抗体仍然保留了它对抗原的结合亲和力，但获得了人恒定区的效应子功能，因此能够发挥上文描述过的效应子功能。一般利用重组DNA方法来制备嵌合抗体。分离编码抗体的DNA(例如cDNA),用常规方法测序(例如4吏用能与编码本发明抗体的H和L链的基因(例如编码上述SEQIDNO:l、2、3、4、5和6的DNA)特异性地结合的寡核苷酸探针)。将杂交瘤细胞用作此类DNA的常见来源。如果需要表达嵌合载体，分离编码轻链和重链的完整的成熟可变区的cDNA,将其框内插入到合适的表达载体中，此外，所述载体还含有一般是人类来源的合适的免疫球蛋白恒定区以及信号序列、终止密码子、启动子、终止子和其它获得抗体表达所需的元件。然后，将此类载体转染到如不经转染则不会产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如E.Coli、COS细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞)中来获得抗体的合成。可以通过用人L和H链的编码序列来取代相应的非人类(例如小鼠)的H和L恒定区来对DNA进行修饰，参见Morrison,PNAS81,6851(1984)。第二种方法涉及制备人源化抗体，其中，通过人源化可变区减少了抗体的非人类组分。有两种常用的人源化技术。第一种是通过CDR移植实现人源化。CDR在接近抗体的N末端形成环，在框架区提供的支架上形成表面。抗体的抗原结合特异性主要是由该CDR表面的拓朴学和化学特征决定的。这些特征反过来又是由各个CDR的构象、CDR的相对分布以及包含CDR的残基侧链的性质和分布决定的。4又通过将非人类(例如小鼠)抗体(供体抗体)的CDR移植到人框架区(受体框架)和恒定区上，就可以大大降低免疫原性(参见Jones等人，(1986)Nature321:522-525和VerhoeyenM等人,(1988)Science239:1534-1536)。但是CDR移植本身可能不会获得完全保留的抗原结合特性，人们经常发现如果要恢复主要的抗原结合亲和力，就需要保留供体抗体中的一些框架残基(有时称为"回复突变")(参见，QueenC等人，(1989)PNAS86,10,029-10,033，Co,M等人，(1991)Nature351,501-502)。在此情况下，为了提供人框架区(FR),可以从数据库中选择与非人类供体抗体序列同源性最高(一般60%或更高)的人V区。可以从人共有序列或者各人的抗体中挑选人FR。必要时，可以将供体抗体的关键残基置换到人受体框架区内，从而保留CDR构象。抗体的计算机才莫型可用于协助鉴定这些结构上重要的残基，参见W099/48523。可选地，还可以通过"表面修饰(veneermg)，，的过程实现人源化。人和鼠独特的免疫球蛋白重链和轻链可变区的统计学分析揭示，在人和鼠的抗体中，暴露残基的精确模式是不同的，多数单个的表面位置对很少几个不同的残基有强烈的偏好(参见，PadlanE.A.等人，(1991)Mol.Immunol.28,489-498和PedersenJ.T.等人,(1994)J.Mol,Bio.235;959-973)。因此，通过取代框架区中与通常在人抗体中发现的残基不同的暴露残基，就可能降低非人Fv的免疫原性。因为蛋白质的抗原性可能与其表面的可接近性相关，替换表面残基可能足以使人免疫系统"无视，，小鼠可变区(还参见MarkGE.等人，(1994)HandbookofExperimentalPharmacology第113期ThepharmacologyofmonoclonalAntibodies,Springer-Verlag,105-134页)。该人源化过程被称为"表面修饰化"，因为只改变了抗体的表面而没有干扰支持残基。其它可选的方法包括WO04/006955中4是出的方法和Humaneering(Kalobios)的方法，其利用细菌的表达系统生产序列上接近人类种系的抗体(Alfenito-MAdvancingProteinTherapeutics,January2007,SanDiego,California)。jt匕外，目前的人源化方法涉及在人CDR区与供体小鼠抗体CDR区的结构相似性的基础上，而非基于抗体其它区域例如框架区的同源性，来选择人受体框架。该方法也被称为Superhumanization(EvogenixInc.;Hwang等人，(2005)Methods36:35-42)。因此，本发明涉及上文第3节提出的人源化抗体。此类抗体优选地含有IgG同种型(例如IgGl或IgG4)在替代实施方案中，可以让上文第3节提出的人源化抗体与非人恒定区("反相嵌合")融合，例如非人灵长类、大鼠、小鼠或兔子。当然对本领域技术人员是显而易见的是，在SEQIDNO:37和38中陈列的受体框架构成了分别由VH和Vk基因编码的免疫球蛋白氨基酸。如此，它们同时包含了框架区和受体抗体的CDR。用在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陈列的供体CDR取代受体抗体CDR以及将获得的序列与合适的框架4序歹'j(例如SEQIDNO:39和SEQIDNO:40陈列的序列)结合，从而生产完整的免疫球蛋白可变区(例如，SEQIDNO:ll和SEQIDNO:15陈列的)，完全属于本领域技术人员的能力范畴。4.1其它》务饰认为抗体的Fc区和各Fc受体(FcYR)之间的相互作用介导抗体的效应子功能，包括抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)、补体的固定、细胞吞噬作用和抗体的半衰期/消除。可以根据理想的效应子特性对本发明抗体的Fc区进行各种修饰。例如EP0629240Bl和EP0307434B2中详细描述的，在Fc区进行特定突变，使本来裂解性的抗体成为非裂解性的；或者可以在抗体中掺入补救受体结合表位，提高其血清半衰期(见US5739277)。目前识别的5种人Fcy受体是FcyR(I)、FcyRIIa、FcyRIIb、FcyRIIIa和新生的FcRn。Shields等人，(2001)J.Biol.Chem276,6591-6604)证实了一组公用IgGl残基参与和所有FcyR的结合，同时FcyRII和FcyRIII还利用这组公用残基之外的一些不同位点。将以下一组IgGl残基改变为丙氨酸时，降低与所有FcyR的结合Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297和Pro-239。所述残基全部位于IgG的CH2区，簇集在连接CHI和CH2的铰链附近。FcyRl只利用公用IgGl残基组进行结合，而FcyRII和FcyRIII除了公用残基组外还与一些独特残基相互作用。一些残基的改变只减弱与FqRII的结合(例如Arg-292)或与FcyRIII的结合(例如Glu-293)。一些变体表现出与FcyRII或FcyRIII的改善的结合，但不影响与其他受体的结合(例如，Ser-267Ala改善与FcyRII的结合，但不影响与FcyRIII的结合)。其它变体则表现出与FcyyRII或FcyRIII的改良的结合，但与其他受体的结合下降(例如，Ser-298Ala提高了与FcyRin的结合，但与FcyRII的结合下降)。对于FcyRIIIa,结合最好的IgGl变体综合了在Ser-298、Glu-333和Lys-334处的丙氨酸取代。认为新生儿FcRn受体参与了抗体清除和跨组织的胞吞转运作用(参见，JunghansR.P(1997)Immunol.Res16.29-57和Ghetie等人，(2000)Annu.Rev.Immunol.18,739-766)。决定与人FcRn直接相互作用的人IgGl残基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。因此，本发明涉及具有任一项上文详细描述的残基改变的发明的抗体，所述改变可修饰半衰期/清除和/或改变效应子功能(例如ADCC和/或补体裂解)。其他修饰包括本发明抗体的糖基化变体。已知在抗体恒定区的保守位点处抗体的糖基化对抗体功能，特别是对例如上文描述的效应子功能有深刻的影响，参见例如Boyd等人，(1996),Mol.Immunol.32,体，其中增加、取代、删除或者修饰了一或多个碳水化合物部分。引入天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-x-苏氨酸基序，产生了用于碳水化合物部分的酶促附连的潜在位点，因此可用于操纵抗体糖基化。在Raju等人，(2001)Biochemistry40,8868-8876中，利用卩-l,4-半乳糖基转移酶和/或a-2,3-唾液酸转移酶通过再半乳糖糖基化和/或再唾液酸化，提高了TNFR-IgG免疫粘附素的末端唾液酸化。认为增加末端唾液酸化能够延长免疫球蛋白的半衰期。与多数糖蛋白一样，抗体通常是以糖型混合物的形式产生的。在真核细胞，特别是在哺乳动物细胞中生产抗体时，这种混合物尤其明显。已经开发了多种方法来制备指定的糖型，参见Zhang等人，Science(2004),303,371,Sears等人，Science,(2001)291,2344,Wacker等人，(2002)Science,29817卯，Davis等人，(2002)Chem.Rev.102579,Hang等人，(2001)Acc.Chem.Res34,727。因此，本发明考虑了涉及多种如本文所述的治疗性(单克隆)抗体(可以是IgG同种型，例如IgGl),所述抗体包含指定数量(例如7或以下，例如5或以下，例如2或1个)的所述抗体或抗原结合片段的糖型。本发明其它的实施方案包括与非蛋白性多聚体(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化亚烷基(polyoxyalkylene))偶联的本发明的治疗用抗体或其抗原结合片段。使蛋白质与PEG偶联是已有技术，可用于提高蛋白质半衰期、降低蛋白质的抗原性和免疫原性。已经采用完整抗体以及Fab，片段研究了不同分子量和形式(线形或分支)的PEG修饰的用途，参见KoumenisI.L.等人，(2000)IntJ.Pharmaceut198:83-95。5.制备方法可以在转基因生物中生产本发明的抗体，这些转基因生物例如是山羊(参见Pollock等人，(1999),J.Immunol.Methods231:147-157)、鸡(参见MorrowKJJ(2000)GenetEng.News20:1-55)、小鼠(见Pollock等人，同上)或植物(见DoranPM,(2000)Curr.OpinionBiotechnol.11,199-204，MaJK-C(1998),Nat.Med.4;601-606,BaezJ等人，BioPharm(2000)13:50-54,StogerE等人；(2000)PlantMol.Biol.42:583-590),。也可以通过化学合成来生产抗体。但是本发明的抗体通常是利用本领域技术人员熟知的重组细胞培养技术制备的。分离编码抗体的多核苷酸，将其插入可复制载体(例如质粒)用于进一步克隆(扩增)或在宿主细胞中表达。一个有效的表达系统是谷氨酸合成酶系统(例如LonzaBiologies出售的)，尤其是当宿主细胞是CHO或NSO的时候(见下文)。利用传统程序(例如寡核苷探针)可以方便地对编码抗体的多核苦酸进行分离和测序。可用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微染色体，其中质粒是代表性的实施方案。一般来说，此类载体还包括与轻链和/或重链多核苷酸可操纵地连接的信号序列、复制起点、一或多个标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，从而有利于表达。可以将编码轻4连和重链的多核苷酸插入分离的载体，并同时或先后引入(例如通过转化、转染、电穿孔或转导)同一宿主细胞，或者如果需要，可以在上述转导前将重链和轻链插入相同的载体。对本领域技术人员显而易见的是由于遗传密码的冗余性，文中公开的多核苦酸的替代多核苷酸序列也可以编码本发明的多肽。5.1信号序列可以以带有异源信号序列的融合蛋白形式来生产本发明的抗体，所述信号序列在成熟蛋白质的N末端具有特异性切割位点。宿主细胞可以识别和加工信号序列。对于原核宿主细胞，信号序列可以是碱性磷酸酶、青霉素酶或者热稳定的肠毒素II前导序列。对于酵母菌分泌，信号序列可以是酵母转化酶前导序列、a因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列(见如W090/13646)。在哺乳动物细胞系统中，可获得的是病毒分泌前导序列(例如单纯疱渗病毒gD信号)和天然免疫球蛋白信号序列(例如人的Ig重链)。通常，信号序列与编码本发明抗体的多核苷酸连接在同一读码框内。5.2复制起点本领域熟知的复制起点含有适合多数革兰氏阴性细菌的pBR322、适合多数酵母菌的质粒以及适合多数哺乳动物细胞的各种病毒复制起点，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或者BPV。通常，整合的哺乳动物表达载体不需要复制起点成分，除非需要在E.Coli中载体增殖。但是SV40ori含有早期启动子，所以可以纟皮使用。5.3选择标记典型的选择基因编码这样的蛋白质(a)赋予对抗生素(例如氨卡青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素)或其他毒素的抗性，或者(b)互补营23养缺陷型或提供复合培养基中没有的营养物，或者(C)两者的结合。选择的原理可涉及使不含有载体的宿主细胞停止生长。那些成功地转化了编码本发明治疗用抗体的基因的细胞，由于共同递送的选择标记所赋予的例如药物抗性而存活。一个实例是DHFR-选择系统，其中，转化子是从DHFR阴性的宿主菌株中产生的(例如参见，Page和Sydenham1991Biotechnology9:64-68)。在该系统中，DHFR基因与本发明的抗体多核苷酸序列被共同递送，然后通过撤除核苷酸来选择DHFR阳性细胞。如果需要，还可以使用DHFR的抑制剂氨甲蝶呤来选择DHFR基因扩增的转化子。通过将DHFR基因可操作地连接到本发明的抗体编码序列或其功能性衍生物，DHFR基因的扩增可获得所需要的目标抗体序列的共同扩增。CHO细胞特别适合该DHFR/氨曱喋呤选择，使用DHFR系统扩增和选择宿主细胞的方法也是本领域普遍已知的，参见KaufmanR丄等人，J.Mol.Biol.(1982)159,601-621,关于综述，参见WernerRG,NoeW,KoppK,SchluterM,"Appropriatemammalianexpressionsystemsforbiopharmaceuticals",Arzneimittel誦Forschung.48(8):870-80,1998Aug。其它的实例是谷氨酸合成酶表达系统(LonzaBiologies)。适于在酵母中使用的选择基因是trpl基因，参见Stinchcomb等人，Nature282,38,1979。5.4启动子操作地连接在一起。用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、P-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性^畴酸酶、色氨酸和杂合启动子，例如Tac。适于在酵母细胞中进行表达的启动子包括3-磷酸甘油激酶或者其他糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氬酶、己糖激酶、丙酮酸脱歡酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油变位酶和葡萄糖激酶。可诱导的酵母启动子包括醇脱氢酶2、同型细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或者麦芽糖/半乳糖利用的酶。用于在哺乳动物细胞系统中表达的启动子包括RNA聚合酶II启动子，包括病毒启动子，例如多瘤病毒、禽痘病毒和腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(特别是立即早期基因启动子)、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、肌动蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和早期或晚期猴病毒40;以及非病毒启动子例如EF-la(Mizushima24和NagataNucleicAddsRes199018(17):5322)。启动子的选择可以基于与用于表达的宿主细胞的相容性。5.5增强子元件合适时(例如用于在高等真核细胞中表达时)，可以使用与启动子元件可操纵地相连在载体中的增强子元件。合适的哺乳动物增强子序列包括来自球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、胎蛋白和胰岛素的增强子元件。可选地，可以使用来自真核细胞病毒的增强子元件，例如SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子、杆状病毒增强子或者小鼠IgG2a座位(参见W004/009823)。一^:此类增强子在载体上位于启动子上游的位置，-f旦也可以位于任何位置，例如在非翻译区或多聚腺苷酸信号的下游。增强子的选择和放置可以基于与用于表达的宿主细胞的相容性。5.6多聚腺苷化/终止在真核系统中，多聚腺苷化信号可操作地与编码本发明抗体的多聚核苷酸连接。此类信号一般位于开放阅读框的3，端。在哺乳动物系统中，非限制性的信号实例包括从生长激素、延伸因子-1a和病毒(例如SV40)基因或逆转录病毒长末端重复衍生的信号。在酵母系统中，多聚腺苷化/终止信号包括自磷酸甘油激酶(PGK)和乙醇脱氬酶1(ADH)基因衍生的信号。在原核系统中一般不需要多聚腺苷化信号，取而代之一般使用更短和更清晰的终止子序列。多聚腺普化/终止信号的选择可以基于与用于表达的宿主细胞的相容性。5.7用于提高产量的其它方法/元件除了上述内容，还可以使用其它特征来提高产量，包括染色体重建元件、内含子和宿主细胞特异性密码子修饰。可以适应宿主细胞的密码子偏爱来修饰本发明抗体的密码子用法，从而提高转录和/或产品产量(例如:HoekemaA等人，MolCellBiol19877(8):2914陽24)。密码子的选择可以基于与用于表达的宿主细胞的相容性。5.8宿主细月包用于克隆或表达编码本发明抗体的载体的合适的宿主细胞是原核、酵母或高等真核细胞。合适的原核细胞包括真细菌，例如肠杆菌科，如埃希氏菌属(例如E.coli(例如:ATCC31446;31537;27325))、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、变形菌属、沙门氏菌属如鼠伤寒沙、门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙、雷氏菌属长口津占质沙、雷氏菌(Serratiamarcescans)和志贺氏菌属，以及芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.lichemformis)(参见，DD266710)、假单胞杆菌如铜绿假单胞杆菌(P.aemginosa)和链霉菌。酵母宿主细胞有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)(例如ATCC16045、12424、24178、56500)、耶氏酵母(yarrowm)(EP402226)、巴斯德毕赤酵母(Pichmpastons)(EP183070;还参见Peng等人，J.Biotechnol.108(2004)185-192)、念珠菌(Candida)、里氏木霉(Trichode腿reesia)(EP244234)、青霉菌(Penicillin)、弯颈霉(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus),例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.mger)。虽然本发明特别考虑真核和酵母宿主细胞，但一般地，本发明的宿主细胞是脊推动物细胞。合适的脊推动物宿主细胞包括哺乳动物细胞，例如COS-l(ATCCNo.CRL1650)、COS-7(ATCCCRL1651)、人胚胎肾细胞系293、幼仓鼠肾细胞(BHK)(ATCCCRL.1632)、BHK570(ATCCNO:CRL10314)、293(ATCCNO.CRL1573)、中国仓鼠卵巢细胞CHO(例如CHO-Kl,ATCCNO:CCL61)、DHFR-CHO细胞系(例如DG44,参见Urlaub等人，(1986)同上)，特别是那些适合悬浮培养的CHO细胞系、小鼠支持细胞(Sertolicell)、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞(ATCCCRL-1587)、HELA细胞、犬肾细胞(ATCCCCL34)、人肺细胞(ATCCCCL75)、HepG2和骨髓瘤或淋巴瘤细胞，如NSO(参见US5807715)、Sp2/0、Y0。因此,本发明一个实施方案提供了稳定转化的宿主细胞，其包含编码本文所述治疗用抗体的重链和/或轻链的载体。一般此类宿主细胞包含编码轻链的第一载体和编码重链的第二载体。还可以进一步改造或调试此类宿主细胞，从而修饰本发明抗体的质量、功能和/或产量。非限制性的实例包括表达特定修饰(例如糖基化)的酶和蛋白质折叠伴倡。265.9细力包培养方法可以通过本领域技术人员已知的任何方法培养用编码本发明治疗用抗体的载体转化的宿主细胞。可以将宿主细胞培养在旋转角瓶、摇瓶、滚瓶或中空纤维系统中，但是对于大规模生产，优选搅拌罐反应器或袋式反应器(例如WaveBiotech,Somerset,NewJerseyUSA)进4亍悬浮培养。一般利用例如分散器、挡板或低剪切搅拌翼将搅拌罐改造成适应通气。对于鼓泡塔和气升式反应器，可以用空气或氧气泡直接通气。当宿主细胞培养在无血清培养基中时，优选在培养基中补充细胞保护剂(例如PluronicF-68),保护细胞免受通气过程造成的损伤。根据宿主细胞的特点，贴壁依赖性细胞系可使用微载体作为生长基质，或者使细胞适应悬浮培养(常见情况)。宿主细胞，特别是脊推动物宿主细胞的培养，可以运用多种操作模式，例如补料分批、重复分批培养(参见Drapeau等人，(1994)cytotechnology15:103-109)、持续单批培养或者灌流培养。虽然可以在含有血清(如胎牛血清(FCS))的培养基中培养重组转化的哺乳动物宿主细胞，但是，优选地在合成的无血清培养基(例如Keen等人，(1995)Cytotechnology17:153-163中公开的)或可商购的培养基(例如ProCHO誦CDM或UltraCHO(CambrexNJ,USA),)中培养此类宿主细胞，如果需要，还可以补充必要的能量源如葡萄糖和合成生长因子如重组胰岛素。宿主细胞的无血清培养要求这些细胞适应在无血清的条件下生长。一种适应方法是在含有血清的培养基中培养此类宿主细胞，然后重复地将80%的培养基换成无血清培养基，使宿主细胞学习适应无血清条件(参见例如ScharfenbergK等人，(1995)inAnimalCelltechnology:Developmentstowardsthe21stcentury(BeuveryE.C.等人编著)，619-623页，KluwerAcademicpublishers)。可以利用各种技术从培养基中回收和纯化分泌到培养基中的本发明抗体，从而提供适合所需用途的纯化程度。例如，本发明的治疗用抗体用于治疗人类患者的用途通常要求，与含有治疗性抗体的培养基相比，用还原性SDS-PAGE测定时具有至少95%的纯度，更常见的要求98%或99%的纯度。在第一个例子中，通常利用离心去除培养基中的细胞残片，随后利用例如微滤、超滤和/或深层过滤进行上清液的澄清化步骤。可选地，可以在不离心的条件下，利用微滤、超滤或深层过滤收获27抗体。还可使用多种其他技术，例如透析、凝胶电泳和层析技术(例如羟基磷灰石层析(HA)、亲和层析(任选地涉及亲和标记体系如多聚组氨酸)和/或疏水相互作用层析(HIC,参见US5429746)。在一个实施方案中，在多个澄清化步骤之后，利用蛋白A或G亲和层析捕获本发明抗体，随后是进一步的层析步骤如离子交换和/或HA层析、阴离子或阳离子交换、大小排阻层析以及疏酸铵沉淀。通常，还使用各种去除病毒的步骤(例如用DV-20滤膜进行纳米过滤等)。经过这些步骤，提供了纯化的(通常是单克隆的)制品，其包含至少10mg/ml或更多(例如100mg/ml或更多)的本发明抗体，从而构成了发明的一个实施方案。通过超速离心可以产生100mg/ml或更高的浓度。适合的此类制品基本上不含有聚集形式的本发明抗体。细菌体系特别适合表达抗体片段。这些片段位于胞内或周间质。根据本领域技术人员已知的方法，可以提取不溶性周间质蛋白，并重新折叠成活性蛋白质，参见Sanchez等人，(1999)J.Biotechnol.72,13-20和CupitPM等人，(1999)LettApplMicrobiol,29,273-277。6.药物组合物上文描述的本发明抗体的纯化制剂(特别是单克隆制剂)，可以被掺入到药物组合物中，用于治疗上文概述过的人类疾病和紊乱。通常此类组合物还包含药学上可接受的(即，惰性的)载体，所述载体是可接受的药学实践已知且要求的，参见例如RemingtonsPharmaceuticalScience,第16版，(1980)Mack出版公司。此类载体的实例包括用适宜緩冲液緩冲到pH5-8的灭菌载体，例如盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。注射(例如通过静脉内、腹腔内、皮内、皮下、肌肉内或门静脉内)或持续flr注的药物组合物合适地不含可见颗粒物，并可包含0.1ng-100mg抗体，通常5mg-25mg抗体。制备这类药物组合物的方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，药物组合物的每单位剂量形式含有0.1ng-100mg本发明的治疗用抗体，任选地还具有4吏用说明。可以冻干(冷冻干燥)本发明的药物组合物，用于在给药前根据本领域技术人员已知的或显而易见的方法进行重建。当发明实施方案包含本发明抗体的IgGl同种型时，可以向药物组合物中加入铜鳌合剂，如柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)或EDTA或组氨酸，从而降低铜介导的该同种型抗体的降解程度，参见EP0612251。一般根据经验决定本发明抗体给药的有效剂量和治疗方案，依赖于患者的年龄、体重和健康状况以及治疗的疾病或障碍。这些影响因素在主治医生的考虑内。在例如Smith等人，(1977)Antibodiesinhumandiagnosisandtherapy,RavenPress,NewYork中可发现对选择合适剂量的指导，但一般在lmg至1000mg之间。在一个实施方案中，治疗患有RA的人类患者的剂量方案是每周或每两周皮下给予100mg左右(例如，在50mg至200mg之间)的本发明抗体(或其抗原结合片段)。本发明的组合物还可以用于预防性用途。根据所治疗的疾病和障碍，可以将包含治疗有效量的本发明抗体的药物组合物与有效量的另一种药剂同时、分别或先后使用，所述药剂是例如抗炎剂如NSAID、氨曱蝶呤、布西拉明(bucillamine)、乙硫羟酸钠，或者一种或多种抗-TNFa治疗，例如Enbrel(依那西普)、RemicadeTM(英夫利昔单抗)、Humim(阿达木单抗)和/或CDP870。本发明的抗体可以与有效量的抗-TNFa受体抗体联合使用，参见DavisMW等人，(2000)AnnRheumDis59(Suppl1):41-43。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以与有效量的针对以下物质的试剂联合使用IL-1/IL-lR(例如KmeretTM)、CTLA4曙lg、IL曙6(参见Choy等人，(2002)Ann.Rheum.Dis61(suppl1):54)、IL-8、IL-15、VEGF、IL-17、IL-18(参见Taylor等人，(2001)Curr.Opin.Immunol.13:611-616)、抗-ICAM和/或抗-CD4抗体，针对MMP家族的成员(如MMP-l、2、3和/或13)的试剂。发明的抗体还可以与摘除已知在炎症过程涉及的细胞的试剂联合使用，例如CD20阳性的B细胞，使用Mabthera(利妥昔单抗)。其它与本发明抗体结合的治疗还包括血管生成抑制疗法，例如整合素(xVJ33的拮抗剂、Kringle1-5(参见S謹ariwallaP等人，(2003),ArthritisResTher5:R32-R39)、可溶性Flt-l(参见Miotla等人，(2000)Lab.Invest.80:1195-1205)、抗-COX-2试剂或抗-OSM试剂(如抗-OSM抗体)，参见WO2005/095457,其完整内容通过引用^皮整合到本文中，并可神皮读者查阅。按照惯例，本发明还应考虑这样的药物组合物，其包含本发明抗体或其抗原结合片段和其它药品，并且任选地与使用说明一起构成的试剂盒。这些组合在治疗关节疾病/病症例如类风湿性关节炎中或许是特别有用的。7.临床用途本发明的抗体可用于治疗IL-18介导的疾病，例如自身免疫病。特别提及的是多发性硬化、关节炎疾病如类风湿性关节炎、I型糖尿病、炎性肠病(IBD)和牛皮癣。因此，本发明还包括治疗患有应答hIL-18中和作用的疾病(例如多发性硬化、类风湿性关节炎、I型糖尿病、IBD、牛皮癣)的人类患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的本发明抗体，特别是具有在SEQIDNO:9中陈列的序列的重链和在SEQIDNO:13中陈列的序列的轻链的抗体。还提供了本发明抗体在生产用于治疗一种(或多种)上述疾病/障碍的药物中的用途。表A<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>7.举例说明下列实施例例举了本发明的各个方面。所有一般的克隆、连接和其它重组DNA技术都根据Maniatis等人，Molecularcloning(Alaboratorymanual),ColdSpringHarborLaboratory,或Sambrook等人，MolecularCloning(Alaboratorymanual),ColdSpringHarborLaboratory中的一般教导实施。本文中使用的载体系统和其它分子生物学方法都被公开在WO2005/095457中，其完整内容通过引用被整合到本文中，并且读者可专门查阅。7.1克隆杂交瘤可变区亲代大鼠抗体2C10是在US专利6706487中陈列的。读者可以专门查阅该文件。在上述7>开的大鼠V区的基础上，连接人IgGl或kC区，设计嵌合抗体2C10c。在重链和轻链构建体上引入通用的免疫球蛋白信号序列和翻译起始密码子ATG。设计HindIII和BsiWI限制性内切酶位点来框出VL结构域，并且允许将其克隆到已经含有人Qc区(SEQIDNO:36)的哺乳动物表达载体中。设计HindIII和Spel限制性内切酶位点来框出VH结构域，并且允许将其克隆到已经含有人ylC区(SEQIDNO:34)的哺乳动物表达载体中。这导致在2C10Vh区的框架4(Kabat残基107和108)与已公开的序列有2个氨基酸的改变，如在SEQIDNO:33中所示的。通过PCR使用重叠的寡核苷酸来构建整个编码序列，并克隆到上文概述的表达载体中。经过序列验证后，在CHO细胞中表达嵌合抗体。通过在rProteinA琼脂糖上亲和层析来从细胞培养上清液中纯化所生产的抗体。在体外结合检测中评估2C10的嵌合抗体，证实其与亲代大鼠2C10具有可比较的效价。通过在ELISA中测定结合人或恒河猴IL-18的EC50值(图16和17),或在KG-1生物检测中测定对IFN-y释放的抑制作用(参见图15),来实现上述评估。7.2人源化7.2.1轻链的人源化策略对于2C10大鼠可变轻链序列，选择与大鼠2C10可变轻链序列具有64%同一性(包括CDR)的人种系受体框架(FJGV1D-12-1,SEQIDNO:38)。种系V区在电脑模拟中与合适的FR4结合，在此情况下，J区k2小基因(KabatVol.II)基于序列相似性(SEQIDNO:40)。基于序列比较和对抗体功能的可能的影响，产生了三种人源化变体。构建体Ll是大鼠CDR(使用Kabat定义)直接移植到上文选定的人受体框架上。构建体L2在Ll的基础上具有第71位残基的一处额外回复突变。构建体L3在L2的基础上在第45、83、84和85位残基处具有4处额外32的回复突变。参见表l。表l:产生的人源化VL变体的概述构建体受体/模板框架4立于aa弁处的回回复突人受体原始大鼠复突变(Kabat)变总数框架序列LlF一IGV1D-12-1/J2无——SEQ.I.D.NO:38L2Ll711FYL245KQ83FE84AG85TD7.2.2重链的人源化对策对于2C10大鼠可变重链序列，选择与大鼠2C10可变重链序列具有59%同一性(包括CDR)的人种系受体框架(Fp_IGHVl-f_2,SEQIDNO:37)。种系V区在电脑才莫拟中与合适的FR4结合，在此情况下，JH6小基因(KabatVol.il)基于序列相似性(SEQIDNO:39)。基于该框架产生了三种人源化变体。H1是大鼠CDR(使用Kabat定义)的移植物，在第27、28、29和93位残基处具有4个额外的回复突变。这允许在紧挨亲代(即，供体)抗体的CDR1上游罕见的氨基酸序列，其可以构成部分CDR(参见C"othia的定义)。H2在Hl的基础上具有第39和40位残基的2处额外回复突变。H3在H2的基础上在第36、71、89和91位残基处具有另外4处额外的回复突变。参见表2。表2:产生的人源化Vh变体的概述构建体受体/模板框架4立于aa^处的回回复突人受体原始大鼠复突变(Kabat)变总数框架序列HIFp—lGHVl-f—2274YESEQ丄DNO:3728TI29S93ATH2m396QR40ARH3H23610WF71EA89VT91YF7.32C10C的人源化通过PCR扩增和重叠的寡核苦酸重新构建人源化的V区。引物包含用于克隆到哺乳动物表达载体的限制性酶切位点和用于分泌的人免疫球蛋白信号序列。使用HmdIII和Spel将人源化的V区作为Hl、H2和H3克隆到含有人y1恒定区的哺乳动物表达载体中，使用HindIII和BsiWI作为LI、L2和L3克隆到含有人k恒定区的哺乳动物表达载体中。其产生了人源化重链变体的人IgG同种型和人源化轻链变体的人k同种型。7.3.1表达人源化的重链和轻《连抗体组合以一式四份瞬时地转染CHOKl细胞。检测上清液的抗体浓度，然后通过比较2C10大鼠-人嵌合体，用于体外结合检测。按如下方式实施所有9种变体的大规才莫瞬时表达每个培养瓶，在8ml培养基(OptiMEM/glutamax/5%FBS)中混合51.4叱轻链质粒和8.6^g重链质粒以及240]Lig转染液体(在WO2006/053783,实施例13中描述了该液体，其通过引用全文整合到本文中)，并将该混合物施用于两瓶T175培养瓶的几乎汇合的CHOKl细胞上，在典型的组织培养条34件下维持72小时。还在多克隆CHO细胞系统中，以mg量级表达所述抗体，使用摇瓶并使用FPLC和蛋白A进行纯化。7.4体外结合才全测7.4.1Biacore分析利用蛋白A捕获HBS-EP缓冲液(BiacoreTM)中的抗体，在BiacoreTM3000仪器上进行人源化2C10抗体的BiacoreTM动力学分析。简而言之，通过伯胺偶联将蛋白A固定在CM5芯片上，利用生产商推荐的实验规程，达到密度约2000-4000共振单位(RU，s)。然后，让人源化抗体经过蛋白A表面，捕获水平为约200-500RU，s,经过一段时间的稳定后，将IL18(人的或恒河猴的)以确定的浓度通过捕获的抗体表面，获得结合的感应谱。利用酸性洗脱条件再生，从蛋白A表面完全去除捕获的抗体，而不会显著降低表面的结合容量。所有曲线都双倍参考了緩冲注射液以代替IL18,利用在BiaEva14.1中的全球普适的参数将数据拟合到1:1结合模型。解离速率评级实验也是利用相同的蛋白A捕获方法建立的，但是只使用了单个的IL18浓度(10nM)。同时也使用与动力学分析相同的结合^t型拟合数据，由于报告解离速率使用一种分析物浓度，该值更适合用于排序而不是给出确切的动力学测量，作为将选择何种抗体将;故进一步研究的方法。在25。C时的初始结果指示，所有的构建体具有与大鼠2C10亲代抗体相似的人IL18结合亲和力。然而，当在37。C进行解离速率评定实验时，Ll构建体比L2和L3表现差，可见增加的解离速率(表3a和3b)。表3a:人抗-IL18抗体的Biacore分析的动力学参数，在25。C时检观'J。抗体kaKdKD(pM)2C102.55e6(7e4)3.5e-5(4.2e-6)13.9(2.2)H1L11.4e64.7e-533.2H1L21.3e6(1.4e5)3.85e-5(1.5e隱5)30.3(8.7)H1L31.25e6(2.1e4)2.8e-5(5.7e-6)22.5(7.2)H2L11.03e6(1.0e5)3.35e-5(Ue-5)33.5(13.4)H2L21.4e6(1.4e5)2.8e陽5(0.0)20.1(1.8)35<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>数据两次实验的结果(标准偏差)。表3b:Biacore检测与蛋白A捕获的人源化抗-IL18抗体结合的人IL18的解离速率评级，在37。C时^r测。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>数据一次实验的结果。不仅在37X:时表现差，Ll构建体结合恒河猴IL18的亲和力在25°C时也同样不佳(表4a)。基于这些观察结果，在37。C详细研究选定抗体与人和恒河猴IL-18的结合。表4b中显示的人IL-18的数据是六次独立测定的平均值(和标准偏差)。恒河猴IL-18的数据显示了H1L2和H1L3的两次使用的平均值和标准偏差，而H3L2和H3L3的数据则来自单次实验。该数据相对较高的标准偏差可能是在37。C时进行该实^验的结果。Ll构建体表现相对较差的事实是令人惊讶的，考虑到Ll和L2构建体之间的差异仅在于用苯丙氨酸取代轻链第71位酪氨酸的回复突变。酪氨酸和苯丙氨酸都是芳香族氨基酸，因此在37°C(而非25°C)时，在Biacore系统中观察到框架结构中这一细微的改变产生明显的结果(对于结合亲和力)是预料之外的。表4a:Biacore检测与人源化抗体构建体结合的恒河猴IL-18的动力学参数，在25。C时检测。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>数据一次实验的结果。表4b:Biacore检测与人源化抗体构建体结合的恒河猴IL-18的动力学参数，在37"C时检测。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>选择变体HIL1、H1L2和H1L3用于下节7.4.2中的进一步分析。7.4.2Biacore分析T100数据使用T100BiacoreTM仪器进一步表征了一些变体抗体。由于使用了可以减小高温下緩冲液影响的内联脱气仪，该仪器在灵敏度、温度控制和基线在高温下的稳定性方面比BiacoreTM3000更有优势。它还提供了增强的软件，例如自动数据分析。方法基本上与上述7.4.1节使用的方法相同；将蛋白A通过伯胺偶联以2000-6000RU，s的密度固定在CM5芯片上。在HBS-EP(Biacore)中运行。捕获抗IL-18抗体的密度在100-500RUs之间，让人IL-18以16-0.0625nM的浓度通过该捕获表面，而双基准则使用0nM浓度(即，只注射捕获抗体的緩冲液)。每次注射IL18后，通过柔和的酸性洗脱液(10mM甘氨酸，pH1.5注射两次)来再生。该再生步骤/人蛋白A表面去除了捕获的抗体(以及因此去除了所有结合其上的IL18)。再生不会显著改变蛋白A表面结合以后的抗体峰的能力，允许另一次捕获事件的发生。使用T100仪器内置的分析软件，利用1:l结合模型分析获得的结合曲线。在所示温度下运行。在15。C、20°C、25°C、32。C和37。C下分析与H1L1和H1L2的结合在不同的温度下利用上述方法进行实验。图l显示了温度对结合速率(ka)的影响，同时图2显示了对解离速率(kd)的影响，图3显示了对平衡常数(KD)的影响。表5详细描述了用于绘制这些图使用的动力学值。表5:从温度变化实验获得的动力学参数<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>H1L23.37e64.22e-512.532H1L13.48e61.64e-447.2H1L24.51e68.57e國518.937H1L16.30e63.36e画453.3H1L25.89e61.31e-422.3数据来自单次实验。数据显示了测试的两种抗体的结合速率在测试的温度范围内相似，H1L2—般具有更快的结合速率，直到37。C的最终值之前，此时H1L1具有更快的结合速率。然而，解离速率显示出更大的差异，在15°C、20°C、25。C时两种抗体具有相似的解离速率，但是在32°。和37。C时开始背离，观察到H1L1更快的解离速率。总平衡常数(其是kd/ka的函数)反映了这些变化，并且提示H1L1和H1L2之间的差异主要在通过解离速率(kd)定义的抗体/IL18复合体的稳定性方面。在25。C和37。C下分析与H1L1、H1L2、H1L3和嵌合2C10的结合按上述进行实验。表6详细描述了获得的动力学参数。数据显示，根据由平衡常数KD定义的结合，在25。C和37。C时，H1L2都是比H1L1更好的抗体，但是，动力学参数显示，在25。C时，H1L2具有比H1L1更好的结合速率(ka)。而在37。C时，位置被颠倒了，指示在37。C时观察到的H1L2更好的结合是由于解离速率(kd)的原因，指示使L2区别于Ll的突变赋予了在更高温度下的IL18-抗体复合体增加的稳定性。39表6:在25。C和37。C下，与H1L1、H1L2、H1L3和嵌合2C10与人IL18结合的动力学在25t:时的人IL18在37。C时的人IL18<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>数据是多个独立数据集合的平均值，显示了平均值和标准偏差，标获得的、在25。C和37。C运行的H1L1和H1L2的值。7.4.3在IL18结合ELISA中评估2C10人源化变体利用不同批次的纯化抗体，进行了至少6次所有9种人源化变体的ELISA。图4A-4C显示了来自一次实验的典型数据，所述实验是表7中所示的产生EC50值排名的实验。使用2.5|ig/ml的16D10(非中和性小鼠单克隆抗体)将人IL-18固定在NuncMaxisorp96孔平板上，来捕获5ng/ml的重组人IL-18。将不同抗-IL-18人源化抗体添加到各种稀释液中。利用抗人IgGFc特异性过氧化物酶缀合物(SigmaA0170)检测结合的人源化抗体。表7:2C10人源化变体的增加的EC50值(以[昭/ml]表示)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>所有的标准误差都在0.001和0.002之间。所有变体的能力都表现得非常接近2C10嵌合体，提示人源化作用只产生了很少的能力丧失。虽然通过这些检测的若干次重复而产生的EC50值确实产生了变体的排序，但是，仅ELISA并不能产生这些变体之间的清楚的区别(参见表7和图4A-4C)。利用Biacore(参见7.4.1和7.4.2)获得了变体的一些区别，其导致在一些利用人和恒河猴IL18的独立重复的实验中4个被检查的变体更接近了(表8,图5[人]和6[恒河猴])。表8:4个选定的人源化变体与人IL-18结合的六次独立重复实一验的EC50值实验实验实验实验实验实验均值SE1/11/22/12/23/13/22C10c0.0150.0160.0130.0110.0200.0200.01580.004H1L20.0290.0300.0210.0250.0240.0270.02600.003H1L30.0270.0250.0290.0280.0290.0270.02750.002H3L20.0320.0300.0260.0180.0250.0220.02550.005H3L30.0350,0280.0180.0210.0250.0250.02530.0067.4.4在IL-18结合ELISA中评估2C10人源化H1变体用三种人源化H1变体H1L1、H1L2和H1L3进行ELISA,在室温和37。C时，评估其在人血清和封闭溶液(PBS0.05%TWEEN和1%BSA(w/v))中与人IL-18的结合。将人源化抗体变体以2.5pg/ml固定在NuncMaxisorp96孑L平板上。在室温和37。C时，在人血清和封闭溶液中，进行对5ng/ml的重组人IL-18的捕获。添加抗IL-18小鼠单克隆抗体16D10。利用抗小鼠k过氧化物酶缀合物(SerotecMCA1291P)检测结合的小鼠抗体。表9中显示了从研究数据产生的典型EC50值。表9:在室温和37。C下，2C10人源化H1变体的EC50值EC50(ng/ml)标准误差室温孵育存在血清时2C10嵌合体7.2960.358H1L110.1890.512H1L29.7910.471H1L38.9890.411在封闭緩冲液中2C10嵌合体3.8140.068H1L13.3150.136H1L23.5520.079H1L33.7900.133在37t:孵育存在血清时2C10嵌合体10.1401.254H1L112.0690.740H1L29.7910.471H1L311.4381.861在封闭緩冲液中2C10嵌合体3.7940.114H1L13.4300.104H1L23.4040.145H1L33.3340.222通过改变进行人IL-18结合步骤的温度，在该;险测中从室温到37°C，三种人源化H1变体的能力不受影响。当人血清中存在抗体时观察到较低的结合信号。7.4.5在37。C时评估人源化H1变体抗体的稳定性42测定三种人源化H1变体H1L1、H1L2和H1L3，在37。C下的人血清和磷酸盐緩冲盐水中为期14天的储存稳定性。将抗体稀释至50pg/ml，在37。C孵育0、1、4、6、8和14天的时间后，通过IL-18结合ELISA检测稳定性。对于IL-18结合ELISA,将16D10(非中和性小鼠单克隆抗体)固定在NuncMaxisorp96孔平板上，来捕获5ng/ml的重组人IL-18。在37。C孵育时程的不同时间点上添加抗-IL-18人源化抗体。利用抗-人IgGFc特异性过氧化物酶缀合物检测结合的人源化抗体。基于在该检测模式下所述抗体与人IL-18结合的能力，延长暴露在37。C温度下0、1、4、6、8和14天没有影响人源化H1抗体变体的结合能力。7.5存在滑液时H1L2与人IL18的结合将500ng/ml至0ng/ml范围的重组人IL18掺入到50%人滑液中，实施ELISA。然后将该溶液中含有的IL-18用于用H1L2抗体包^皮的Maxisorp96孔平板(Nunc)的孔中。然后，通过生物素化的抗IL-18抗体(D045-6，MBL)和抗生物素蛋白链菌素-HRP检测结合的IL-18。滴定50%滑液(SF)中的重组人IL18产生了与滴定緩沖液中的重组人IL18几乎相同的曲线，仅在半最大值上存在轻微的偏移。参见图7。这证实了即使存在50%人SF,抗体也具有结合hIL-18的能力，所述条件更接近地模拟了抗体在治疗性场景中将遇到的结合环境。7.5.1存在IL18结合蛋白(IL18bp)时与IL18的结合使用BiacoreTM技术(BiacoreTM3000)和ELISA确定当存在人IL18bp时，H1L2是否仍然能够结合人IL18。IL18bp具有与IL18的高亲和力，作为IL-18功能的天然抑制剂而起作用(图8、图9A和B、表10和表11)。Biacore检测简而言之，通过伯胺偶联将蛋白A以约4000共振单位(RU，s)的密度固定在CM5芯片表面上。然后，将浓度为3|xg/ml的重组Fc-IU8结合蛋白(R&DSystems)以10^1/分钟的流速通过1分钟；导致捕获约1400RU，s的IL-18结合蛋白。然后，将浓度为30nM的IL18以lOpl/分钟的流速通过捕获的IL18结合蛋白表面5分钟。此后，将浓度为10nM的大鼠2C10亲代抗体以30pl/分钟的流速通过IL18结合蛋白/IL18表面3分钟。IL18上被2C10抗体识别的表位将干扰与IL18结合蛋白相互作用的位点，则其后应该不可见任何结合信号。图IO证实了2C10结合已经被hlL-18BP捕获的hlL-18,指示2C10和hlL-18BP的结合位点是不重叠的。表10:IL-18BP对IFNy分泌类风湿性关节炎(RA)滑膜细胞的影响样品，IL國18BP状态对照IL-12IL國18IL-12+IL-18RA1-ND0.63ND1.63+ND0.29ND0.13RA2-ND0.85ND0.70+ND0.10ND0.10RA3-ND1.06ND1.62+ND0.32ND0.40ELISA检测在直接结合ELISA中测试了人源化H1L2或2C10大鼠MAb与结合在捕获IL18BP上的人IL18的结合，所述ELISA中重组人IL18bp-Fc融合蛋白(R&DSystems#119-BP)以0.5(ig/ml被包一皮在NuncMaxisorp平板上。将重组人IL18(内部试剂)以100ng/ml添加到封闭緩冲液(含有1%w/vBSA)中。添加浓度范围在0.5ng/ml至1]ig/ml的纯化抗体。用抗-人k轻链的特异性HRP缀合物(Sigma)或抗-大鼠IgGHRP检测结合的抗体。图18A和B举例说明了获得的结果。7.6体外生物测定7.6.1人源化构建体在中和KG-1细月包系IL18应激IFN-y释方文中的活性该检测测量了特异性地针对IL-18的抗体的中和活性，并且基于IL-18-介导的KG-1细胞中的IFNi释放。KG-1(ATCC#CCL-246)是组成型表达功能性IL-18受体的人骨髓单核细胞系，因而应答外源性IL-18激发。测定了全部九种人源化变体对KG-1细胞中人IL18激发的IFN-y幹放的抑制能力(表12和附图11)。表12:利用所有九种人源化变体在KG-1生物片企测中中和重组人IL18的IC50值抗体IC50H1L10.071H1L20.033H1L30.027H2L10.145H2L20.054H2L30.046H3L10.027H3L20.035H3L30.0342C10(1)0.0422C10(2)0.039对于4种优选的人源化变体还至少实施了6次重复实验，所述优选的变体在BiacoreTM检测中表现出与重组的人和恒河猴IL18的最佳亲和力。图8举例说明了四种优选的人源化变体和H1L1的代表性结果，表13概括了这些检测的结果，上述检测均使用从CHOela细胞衍生的相同蛋白质批次的材料。45表13:在使用4或5种选定的人源化变体的KG-1生物^r测中中和重组人IL18的IC50值<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>在比较H1L1和其它人源化变体的情况下，H1L1表现出比测试的其它四种人源化构建体以及2C10亲代MAb更低的效^介。用四种优选的单克隆抗体还实施了进一步的分析，比较了对人IL18激发的KG-1细胞释放IFN-y的抑制能力2C10和从2C10衍生的人源化变体(H1L1、H1L2和H1L3)。在96孔平板中实施KG-1生物测定，通过在37。C和5%C02中孵育50ng/ml的重组人IL-18和不同浓度的特异性IL18的抗体(从2昭/ml至7.8ng/ml，二倍稀释)或阴性的同种型对照(Synagis,抗-RSV抗体)，然后每孔添加3.105KG-1细胞。最终将平板在37t、5%C02中孵育20-24小时。收获上清液，利用商购的人IFNyELISA试剂盒(BiosourceAHC4432;AHC4539)测定IFNy产量。已经实施了三种实验。根据阴性对照将对IL-18激发的IFNy生产的抑制结果归一化。统计分析的目标是获得在针对任何Synagis应答调整后，对每种实验的每种mAb的IC50估计值。然后在统计学上分析IC50估计值，产生具有95%置信区间(即，统计学似然范围)的每种mAb的IC50综合估计值。最终使用邓奈特氏检验(Dunnett，stest)将每种人源化变体与2C10进行回顾比较。图12举例说明了代表性的实^r。表14和图13显示了在95%置信区间下对每种单克隆抗体的IC50的综合估计值，以及在p值和置信区间下与大鼠2C10的％变化。表14:在KG-1生物测定中IL18激发的IFNy生产的中和作用的IC50值单克隆抗平均IC50^g/ml%变化vs2C10Dunncttp体(95%CI)(95%CI)值2C100.095(0.071,0.127)--H1L10.352(0.264,0.470)269.4(117.2,528.2)0扁1H1L20.154(0.112,0.211)61.5(-7.6，182.0)0.0968H1L30.164(0.121,0.221)71.6(-0.4,195.8)0.0519H1L1的效价在统计学上显著地低于2C10(p<0.001)。其它人源化变体则未显著地区别于2C10,虽然H1L3与2C10的比较位于界限上。7.6.2H1L2在中和激发的人PBMC中IFN々释放的活性用重组人IL18和抗-CD3抗体激发来自三个供体的人PBMC,并添加所研究的四种选定的人源化抗体变体的稀释梯度。每个供体都包括了亲代2C10抗体和IL18bp作为比较。对于三个供体中的两个，IL18和抗-CD3的激发是失败的，没有检测到任何IFN-Y。在余下的供体中，低浓度时的结果差异很大，但是通过添加各种抗-IL18抗体，包括人源化变体，都可以实现对IL18诱导的IFN-Y生产的完全抑制。参见图14。还用LPS激发的人PBMC进行实验，所述激发也导致IL18的产生和相关的IFNy释放。LPS以浓度依赖性的方式诱导IFNy产生，以1吗/ml的固定浓度添加2C10亲代单克隆抗体完全抑制了该激发作用，指示所述效应是IL18介导的，并且可以中和内源性IL18(未显示数据)。在全血中也可以证实该效果，但是2C10的抑制效应虽然还是剂量依赖性的，但是却较不明显(数据未显示)。图9举例说明了3个独立供体和用亲代大鼠单克隆2C10、HlL2和IL18bp抑制的实验结果。供体1和3产生了相似的结果，而供体2对LPS激发没有表现出IFNy释放(未显示)。当存在添加了〉1pg/ml抗体或IL18bp的10%或25%的人血清时，可以完全抑制IL18介导的IFNy释放。在10ng/ml及以上就已经可以观察到抑制作用，表11显示了存在10%或25%的人血清时该抑制作用的IC50值。表ll:在存在人血清时，利用2C10、H1L2和IL18bp抑制LPS-激发的IFNy释放的IC50值，所述释放是由内源性IL18中和作用导致的<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>7.6.3与IL18直系同源物结合的才既述利用ELISA和Biacore以及KG-1细胞生物测定检验了抗体与来自其它物种的IL18的结合。这首先利用亲代2C10和嵌合2C10c对恒河猴/短尾猴进行，但是采用一些人源化变体重复。利用Biacore和ELISA测试了亲代2C10与猪、小鼠和大鼠IL18的结合，测试了4种最佳的人源化变体与恒河猴/短尾猴和狗IL18的结合。用恒河猴/短尾猴IL18和三种单克隆抗体、2C10嵌合体和代表性的人源化变体H3L3,实施KG-1生物测定。考虑到所有人源化变体的相似性，它也可能代表产生的其它变体，包括H1L2(参见表15,图8)。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>如预期，比较来自所有四种抗体的CD光谱的形状，显示了它们的结构是高度P折叠的，并且具有基本相同的构造。CD揭示了，在4°C-37°C的温度范围内，三种抗体(H1L1、H1L2、H1L3)的二级结构没有表现出任何显著的改变。但是，在该温度范围内，2C10抗体嵌合体在结构上确实表现出轻微的减少。这与下表16中给出的热稳定性趋势是一致的。表16:IL18抗体的热变性抗体H1L1H1L2H1L3嵌合体Tm73°C70。C67。C65°C丁111=变性/解链温度H1L1、H1L2和H1L3在远高于37°C的条件下也明显地是稳定的，在体温下没有任何变性的信号。因此，它们在热稳定性上的差异在正常体温和环境温度下不太可能赋予任何差异性优势。权利要求1、人源化的抗-白介素-18抗体，包含具有下列互补决定区(CDR)的重链和轻链CDRH1SEQ.I.D.NO1CDRH2SEQ.I.D.NO2CDRH3SEQ.I.D.NO3CDRL1SEQ.I.D.NO4CDRL2SEQ.I.D.NO5CDRL3SEQ.I.D.NO6。2、人源化的抗白介素-18抗体，包含具有下列CDR的重链和轻链CDRH1:SEQ丄D.NO:lCDRH2:SEQ丄D.NO:2CDRH3:SEQ.I.D.NO:3CDRL1:SEQ丄D.NO:4CDRL2:SEQI.D.NO:5CDRL3:SEQ丄D.NO:6其中用在衍生CDR的供体抗体中发现的相应残基取代了所述轻链的第71位残基。3、人源化的抗-白介素-18抗体，包含移植到人受体框架区上的从供体抗体衍生的CDR,所述抗-白介素18抗体包含具有在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陈列的序列的CDR,其中所述抗-白介素18抗体的轻链的第71位残基与在供体抗体框架中的相应位置中发现的残基相同。4、人源化的抗-白介素-18抗体，包含在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陈列的序列的CDR,所述抗体在所述轻链的第71位包含酪氨酸。5、人源化的抗-白介素-18抗体，包含具有在SEQIDNO:l、2和3中陈列的CDR的重链和具有在SEQIDNO:4、5和6中陈列的CDR的轻链，其中所述轻链的CDR是/人一种供体抗体衍生的，在该供体抗体的轻链的第71位具有酪氨酸。6、人源化的抗-白介素-18抗体，包含来自供体抗体的CDR并且在所述人源化抗体的轻链的第71位处包含酪氨酸，其中所述供体抗体是2C10或其框架变体(即，人源化抗体包含与2C10相同的CDR,但是不同的框架，参见US专利6,706,487)。7、人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)重链，其具有含有移植到人重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列的CDR,和(b)轻链，其具有含有移植到人轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列的CDR，其中所述人轻链受体框架包含SEQIDNO:38并且其中SEQIDNO:38的第71位是酪氨酸。8、人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)重链，其包含具有在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列的CDR,和(b)轻链，其包含具有在移植到人轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列的CDR,其中所述人源化的抗-白介素-18抗体的所述轻链受体框架是在SEQIDNO:38中陈列的序列的变体，其中所述变体在第71位包含酪氨酸，并且其中所述变体与具有在SEQIDNO:38中陈列的序列的框架具有75%或更高的同一性。9、人源化的抗-白介素-18抗体，所述抗体包含(a)从供体抗体衍生的在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陈列的序列的CDR,所述供体抗体在供体抗体第71位含有酪氨酸；(b)人受体框架，所述受体框架在人轻链第71位包含苯丙氨酸；其中，抗-白介素18抗体在轻链第71位包含酪氨酸。10、人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)从供体抗体衍生的在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陈列的CDR，所述供体抗体在供体抗体轻链第71位包含芳香族氨基酸；(b)人受体框架，所述受体框架在轻链受体框架第71位包含与(a)部分中的芳香族氨基酸不同类型的芳香族氨基酸；其中所述的抗-白介素18抗体包含从(a)部分的抗体衍生的轻链，该轻链在第71位具有芳香族氨基酸。11、人源化的抗-白介素-l8抗体，当在37。C用表面等离子体共振(例如，BmcoreTMT100)测量时，所述抗体针对人IL-18表现出90pM或更大的结合亲和力(KD)。12、人源化的抗-白介素-18抗体，所述抗体包含SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陈列的CDR,当在37。C用表面等离子体共振(例如，BmcoreTMT100)测量时，所述抗体针对人IL-18表现出90pM或更大的结合亲和力(KD)。13、人源化的抗-白介素-18抗体，当在37。C用表面等离子体共振(例如，BiacoreTMT100)测量时，针对与人IL-18的结合，所述抗体表现出0.0002(1/s)或更低的解离速率(kd)。14、人源化的抗-白介素-18抗体，该抗体包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架具有在SEQIDNO:37中陈列的序列，其中所述重链的第27、28、29、93、39、40、36、71、89、91位的一个或多个残基与所述供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体衍生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架具有在SEQIDNO:38中陈列的序列，其中所述轻链的第71位以及任选的第45、83、84、85位的一个或多个(例如，全部)残基与所述供体抗体轻链中的相应残基相同。15、人源化的抗-白介素-18抗体，该抗体包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架具有在SEQIDNO:37中陈列的序列，其中所述重链的第27、28、29、93位的一个或多个残基与所述供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体衍生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架具有在SEQIDNO:38中陈列的序列，其中，所述抗-白介素-18抗体的轻链的第71位的残基与所述供体抗体轻链中的相应残基相同。16、人源化的抗-白介素-18抗体，该抗体包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架具有在SEQIDNO:37中陈列的序列，其中所述重链的第27、28、29、39、40、93位的残基与所述供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体衍生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架具有在SEQIDNO:38中陈列的序列，其中所述轻链的第71位的残基与供体抗体轻链中的相应残基相同。17、人源化的抗-白介素-18抗体，该抗体包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架具有在SEQIDNO:37中陈列的序列，其中所述重《连的第27、28、29、36、39、40、71、89、91、93位的残基与所述供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体衍生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架具有在SEQIDNO:38中陈列的序列，其中所述轻链的第71位的残基与供体抗体轻链中的相应残基相同。18、人源化的抗-白介素-18抗体，该抗体包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到重链受体片匡架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架具有在SEQIDNO:37中陈列的序列，其中所述重链的第27、28、29、93位的一个或多个残基与所述供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体衍生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架具有在SEQIDNO:38中陈列的序列，其中所述抗-白介素-18抗体的轻《连的第71、45、83、84、85位的残基与供体抗体轻链中的相应残基相同。19、人源化的抗-白介素-18抗体，该抗体包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架具有在SEQIDNO:37中陈列的序列，其中所述重链的第27、28、29、93、39、40位的残基与所述供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体衍生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架具有在SEQIDNO:38中陈列的序列，其中所述抗-白介素-18抗体的轻链的第71、45、83、84、85位的残基与所述供体抗体轻链中的相应残基相同。20、人源化的抗-白介素-18抗体，该抗体包含(a)包含从供体抗体衍生的CDR的重链，所述CDR具有移植到重链受体框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陈列的序列，所述重链受体框架具有在SEQIDNO:37中陈列的序列，其中所述重链的第27、28、29、93、39、40、36、71、89、91位的残基与供体抗体重链中的相应残基相同；(b)包含从供体抗体书f生的CDR的轻链，所述CDR具有移植到轻链受体框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列，所述轻链受体框架具有在SEQIDNO:38中陈列的序列，其中所述抗-白介素-18抗体的轻链第71、45、83、84、85位的残基与供体抗体轻链中的相应残基相同。21、人源化的抗-白介素-18抗体，包含选自SEQIDNO:9、SEQIDNO:17、SEQIDNO:21的重链和选自SEQIDNO:13、SEQIDNO:29的轻链。22、人源化的抗-白介素-18抗体，包含SEQIDNO:9的重链和SEQIDNO:13的轻链，或者SEQIDNO:9的重链和SEQIDNO:29的轻链。23、人源化抗-白介素-18抗体，包含SEQIDNO:17的重链和SEQIDNO:13的轻链，或者SEQIDNO:17的重链和SEQIDNO:29的轻链。24、人源化抗-白介素-18抗体，包含SEQIDNO:21的重链和SEQIDN〇:13的轻链，或者SEQIDNO:21的重链和SEQIDNO:29的轻链。25、人源化的抗-白介素-18抗体，包含(a)重链，其具有允许与人IL-18特异性结合的CDR,和(b)轻链，其包含具有含有在SEQIDNO:4、5和6中陈列的序列的CDR的受体框架，并且在第71位具有酪氨酸残基。26、包含重链和轻链的人源化的抗-白介素-18抗体，其中，在25。C时所述抗体和人IL-18的结合的解离速率(kd)与在37。C时所述抗体和人IL-18的结合的解离速率(kd)之间的比值是1:5(或1:小于5),其中所述抗体包含从供体抗体衍生的CDR和人受体框架，并且其中所述人受体框架轻链的第71位的残基被所述供体抗体的相应残基取代了。27、根据权利要求26的人源化的抗体，其中CDR具有在SEQ丄D.NO:1、2、3、4、5和6中陈列的序列。28、根据权利要求26或27的人源化的抗体，其中所述人受体框架的轻链的第71位的残基是芳香族氨基酸，优选地是苯丙氨酸，并且在所述供体抗体中的相应残基是不同类型的芳香族氨基酸，优选酪氨酸。29、药物组合物，包含根据权利要求1至28中任一项的抗-白介素-18抗体和药学上可接受的载体。30、根据权利要求1至28中任一项的抗-白介素-18抗体在生产用于治疗自身免疫病例如多发性硬化、关节炎疾病如类风湿性关节炎、I型糖尿病、炎性肠病(IBD)和牛皮癣的药物中的用途。31、权利要求31在生产用于治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。32、权利要求1至28中任一项的抗体，用于治疗自身免疫病例如多发性硬化、关节炎疾病如类风湿性关节炎、I型糖尿病、炎性肠病(IBD)和牛皮癣。33、治疗患有自身免疫病例如多发性硬化、关节炎疾病如类风湿性关节炎、I型糖尿病、炎性肠病(IBD)和牛皮癬的人类患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的根据权利要求1至28中任一项的抗体。34、生产根据权利要求1至28中任一项的抗体的方法，所述方法包括在允许表达所述抗体的条件下，培养用包含编码所述抗体的多核苷酸的载体转化或转染的宿主细胞。35、权利要求34的方法，其中所述条件包括在无血清培养基中培养所述宿主细胞。36、权利要求34或35的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。37、权利要求36的方法，其中所述宿主细胞是CHO或NSO。38、权利要求37的方法，其中在用所述多核苷酸转染或转化前，所述CHO细胞是DHFR-CHO细胞。39、筛选用于治疗用途的抗体(特别是抑制配体和受体之间相互作用的抗体，例如抗-白介素-18抗体)的方法，所述方法包括(a)在'30至45°C(优选的37°C)的温度下测量抗体对抗体特异性结合的抗原的结合亲和力(使用例如BiacoreTM表面等离子体共振)；(b)在20至25°C(优选的25°C)的温度下测量抗体对抗体特异性结合的抗原的结合亲和力(使用例如BmcoreTM表面等离子体共振)；(c)如果(a)的亲和力大于(b)的亲和力，优选地，如果(a)的亲和力比(b)的亲和力大2倍或更多，更优选地，4倍或更多，则选择所述抗体用于治疗用途。40、筛选用于治疗用途的抗体(特别是抑制配体和受体之间相互作用的抗体，例如抗-白介素-18抗体)的方法，所述方法包括(a)在30至45°C(优选的37°C)的温度下测量抗体与抗体特异性结合的抗原的解离速率(使用例如BiacoreTM表面等离子体共振)；(b)在20至25°C(优选的25°C)的温度下测量抗体与抗体特异性结合的抗原的解离速率(使用例如BiacoreTM表面等离子体共振)；(c)如果(a)的解离速率低于(b)的解离速率，则选择所述抗体用于治疗用途。全文摘要本发明公开了人源化的抗-IL-18抗体、生产方法和用该抗体治疗的方法。还公开了使用例如样品表面等离子共振的筛选方法来鉴别具有治疗潜力的抗体。文档编号C07K16/24GK101454343SQ200780018859公开日2009年6月10日申请日期2007年5月23日优先权日2006年5月25日发明者I·柯比,J·H·艾利斯,P·A·汉布林,V·格尔马谢夫斯基申请人:葛兰素集团有限公司