Tem8用作佐剂及其应用的制作方法

专利名称：Tem8用作佐剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及免疫学领域。 一般地，本发明公开包括TM8、优选 人TEM8作为活性成分的组合物，并且施用所述组合物用于在动物中，包 括人中增强针对接种的免疫反应。更具体地，本发明涉及TEM8作为佐剂 的应用，所述TEM8具有可以作为疫苗起作用的免疫原性序列。
相关技术描述
疫苗在人和动物中预防疾病的应用是常见的应用，并且已经进行了并 正在进行巨大的努力来扩展这一应用，以使之覆盖这些患者遭受的更广泛 数量的疾病。例如，现在狂犬病疫苗在动物中的应用是普通的领域，正努 力获得适当的疫苗，以针对其他疾病免疫动物。更近地，疫苗治疗癌症的 应用正处于热烈的研究中，并且己经开始用于人类。
然而，在主动免疫过程中频繁遇到的一个问题是疫苗中所用的抗原免 疫原性不足，不足以诱导强细胞介导的免疫性。在这些弱动物疫苗中，由 灭活的大叶性月市炎嗜血菌(Haemophilus pleuropneumoniae) (Hpp)(其与 猪中的呼吸疾病相关)组成的那些疫苗是最差的。
为了获得更强的体液和/或细胞反应，通常施用在含有佐剂(免疫强 化剂)的制剂中的疫苗，所述佐剂是一种增强患者对所述疫苗的免疫反应 的物质。对于疫苗最常用的佐剂是油制剂和明矾。尚不明白所述佐剂通过 什么机制起作用，并且在给定的情形中特定的佐剂制剂是否足够有效是不
'TEM8是最近发现的与肿瘤-特异性血管生成相关的蛋白家族的一员。 TEM8 RNA最初从人结肠直肠肿瘤中分离，并且据报道其表达限于肿瘤 血管系统(Carson-Walter EB,等，2001; Nanda A，等，2004)。更近地，已经发现TEM8在血管内皮细胞和肿瘤基质中表达。
已知在癌症中TEM8在体内以某种方式作用能够增强并且增加成功 的免疫反应，并且提议这种反应与肿瘤血管系统中的TEM8的表达相关， 当与癌症特异性抗原联合给予时产生协同免疫反应。然而，当TEM8作为 DNA疫苗施用时没有产生对TEM8特异性的免疫反应表明TEM8必定以 不同的方式起作用(Fdicetti等，2007)。因此，在本领域中，TEM8调节 或加强/增强免疫反应的准确机制尚是未知的。
综上所述，存在对于适于加强用于动物包括人和其他哺乳动物的疫苗 的另外有效佐剂制剂的需求。另外，缺少对TEM8通过什么机制调节或加 强/增强免疫反应的理解。本发明实现了本领域中的这些长期存在的需求 和愿望。
发明概述
在本发明的一个实施方案中，存在一种组合物，其包括免疫原性序列 或其片段，TEM8序列或其片段，药用载体或它们的组合。
在本发明的另一个相关的实施方案中，存在在受试者中引发增强的免 疫反应的方法。这种方法包括对所述受试者施用免疫学有效量的如同前文 所述的组合物的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，存在一种组合物，其包括免疫原性序 列或其片段，与TEM8或其片段的氨基酸序列有至少90%同源性的氨基 酸序列，药用载体或它们的组合。
在本发明的另一个相关的实施方案中，存在在受试者中引发增强的免 疫反应的方法。这样的方法包括给所述受试者施用免疫学有效量的如同前 文所述的组合物的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，存在一种组合物，其包括免疫原性序 列或其片段，与TEM8或其片段的氨基酸序列有至少80%同源性的氨基 酸序列，药用载体或它们的组合。
在本发明的另一个相关的实施方案中，存在在受试者中引发增强的免 疫反应的方法。这样的方法包括给所述受试者施用免疫学有效量的如同前 文所述的组合物的步骤。在本发明的另一个实施方案中，存在一种组合物，其包括TEM8或其
片段以及药用载体。
在本发明的另一个相关的实施方案中，存在增强免疫原性组合物在受 试者中引发免疫反应的能力的方法。这样的方法包括给所述受试者施用包
括TEM8或其片段以及药用载体的组合物的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，存在一种组合物，其包括与TEM8 或其片段的氨基酸序列有至少90%同源性的氨基酸序列以及药用载体。在 本发明的另一个相关的实施方案中，存在增加免疫原性组合物在受试者中 引发免疫反应的能力的方法。这样的方法包括给所述受试者施用如前文所 述的包括与TEM8或其片段同源的序列以及药用载体的组合物的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，存在一种组合物，其包括与TEM8 或其片段的氨基酸序列有至少80%同源性的氨基酸序列以及药用载体。在
本发明的另一个相关的实施方案中，存在增加免疫原性组合物在受试者中 引发免疫反应的能力的方法。这样的方法包括给所述受试者施用如前文所 述的包括与TEM8或其片段同源的序列以及药用载体的组合物的步骤。
从下述本发明目前优选的实施方案的描述中，本发明的其他以及另外 的方面、特征和优点将显而易见。为了公开的目的给出这些实施方案。
附图简述


图1显示肿瘤特异性T细胞通过在肿瘤内体内扩展而富集。将用卵清 蛋白DNA疫苗免疫3次的小鼠用B16肿瘤(ova-)或M04肿瘤(表达 ova的B16)攻击。6天后，恢复引流(draining)淋巴结(左版)和基质胶 (matrigel)塞(右版)，并且通过IFN-g ICCA测量ova-特异性CD8 T细胞。
图2显示肿瘤-特异性T细胞在肿瘤中富集。将用HER2/neu DNA疫 苗免疫3x的小鼠用233-VSAG-1肿瘤攻击。10天后，通过ICCA从脾和 基质胶塞测量neu-特异性的CD8 T细胞。
图3显示TEM8注射增加neu-特异性T细胞的数目。如所示，小鼠 (5只/组)接受3次注射，TEM8、大鼠HER2/neu、或组合。在最后一次 注射后5天，将233-VSAG-1肿瘤植入胁部的基质胶中，并且10天后，将塞移开，并且通过ICCA测量TILS。
图4A-4C显示TEM8注射增加免疫小鼠的引流淋巴结中的抗原特异 性T细胞的数目。在图4A中，如所示，小鼠(3只/组)接受TEM8、大 鼠HER2/neu、或组合的5次注射。在最后一次注射后5天，从引流淋巴 结分离CD8T细胞，并且通过IFN-gELISpot测量。在图4B中，小鼠(3 只/组)用单独的hgp75或与TEM8组合免疫。在最后一次注射后5天， 将CD8T细胞从引流淋巴结分离，并且通过IFN-gELISpot测量，以识别 三种免疫显性gp75肽455、 451和522。在用hgp75免疫的小鼠中，TEM8 增强针对肽455的反应(481和522程度更低)。在图4C中，小鼠(3只 /组)用ova DNA+/-TEM8或pING接种3次，或用在Titermax中的SINFEKL (SEQ ID NO: 19)肽接种一次。在第5天，从引流LNs分离CD8 T细胞， 并且通过IFN-y ELISPOT测量。TEM8增加ova-特异性CD8+ T细胞的数 量大约2倍，这表明TEM8增加针对外源和自身抗原的CD8+T细胞反应 的能力。图4D和4E显示CD8+ T细胞有助于TEM8免疫性。在图4D中， FVB/neuNT转基因小鼠通过肌内注射100吗pCDNA3， TEM8或Her2/neu (左版)每两周一次，免疫3次(three times bi-weekly),并且用233-VSAG1 肿瘤细胞攻击。使用Kaplan-Meier分析报告没有肿瘤的存活。在肿瘤攻击 前3天开始，通过注射MAb (53-6.7.2)持续4周，而使另一组用HER2/neu 免疫的小鼠消耗CD8 T细胞。为清楚而言，关于来自同一实验的其它组 小鼠的没有肿瘤的存活数据，TEM8 + HER2/neu免疫的小鼠和消耗了 CD8 T细胞的TEM8 + HER2/neu免疫的小鼠表示在右版。在图4E中，C57BL/6 通过用4吗编码TEM8、 hTYRPl/hgp75的DNA或联合的两种疫苗每周 一次粒子轰击而免疫5次。在一组中，小鼠通过在肿瘤攻击之前3天开始 通过注射MAb (53-6.7.2)持续4周而消耗CD8+ T细胞。使用Kaplan-Meier 分析，报告在用B16F10黑素瘤皮内攻击后的无肿瘤存活。图4F显示TEM8 的佐剂作用增加CD4+ T细胞活化，并且CD8+ T细胞的增加需要CD4+ T 细胞。FVB小鼠接受3次大鼠HER2/neu+/-TEM8或pING的注射。在一 些组中，小鼠在整个免疫过程中消耗CD4+T细胞。在最后一次接种后5 天，通过《^，61^ 0丁测量纯化的€08+ (左)或CD4十(右)T细胞。
图5A-5B显示TEM8突变的注射降低它的佐剂效果。在图5A中，小鼠接受3次大鼠HER2/neu (左)或hgp75 (右)，+/- pING, TEM8或突变的 TEM8 (Opt2TEM8) DNA的注射。在第5天，通过ELISPOT测量来自淋 巴结的CD8T细胞。在图5B中，COS7细胞转染(FLAG-标记的)Opt-2或 TEM8 DNA。在20小时后，细胞用粘液菌素A脉冲1小时，用PBS洗涤 4次，并且如所示在完全培养基中继续培养0-24小时。
图6显示小鼠前列腺肿瘤中的个体细胞表达TEM8。在阉割后两天， 将在PteiW- p53-A小鼠中产生的自发性肿瘤用商购的对TEM8特异性的抗 体(ABR， Santa Cruz)染色。
图7A-70显示TEM8在乳腺瘤和黑素瘤、人前列腺肿瘤的细胞中和 在单核细胞/巨噬细胞以及树突细胞中表达。图7A-7I显示TEM8在小鼠 乳腺瘤和黑素瘤中的表达。原位杂交检测在可移植的肿瘤B16F10 (图 7A-7D)和233-VSGA1 (图7E-7H)的基质中的TEM8 RNA。暗视野图像在 (图7A, 7C，7E和7G)中，亮视野图像在(图7B， 7D， 7F禾卩7H)中。 用ATR/TEM8-特异性Ab N19显色的蛋白质印迹检测在相同肿瘤类型中 的TEM8蛋白(图71)。从乳腺瘤和黑素瘤细胞系制备裂解产物(30 [ig 总蛋白)。泳道l， 233-VSGA1乳腺瘤；泳道2， 233-VSGA1体外培养物； 泳道3,B16F10肿瘤；泳道4, B16F10体外培养物；泳道5，FVB正常的肾。 星号表示在233-VSGA1和B16F10肿瘤样品和正常肾中存在80-kDa的条 带，而在培养的233-VSGA1或B16F10细胞中不存在(箭头显示与TEM8 反义探针杂交的区域)。图7J-7N显示抗原呈递细胞(APC)在体外和在 体内表达TEM8，并且图70显示在LPS刺激后TEM8的表达增加。在图 7J中，在人前列腺癌的石蜡切片中，免疫组织化学分析显示TEM8(左版) 和CD68 (右版)的表达。在图7K-7L中，流式细胞术显示首次用于实验 的小鼠和携带B16的小鼠(TDLN)的肿 瘤(图7K)和淋巴结(图7L)内 的APCs中的TEM8表达(红线)。在不同的培养天数后，通过蛋白质印 迹(图7M)和在第15天进行流式细胞术(图7N)分析骨髓来源的树突细 胞(DCs)中的TEM8表达。在图70中，小鼠骨髓在GM-CSF中培养10 天以制备DCs，或者在G-CSF中培养5天以制备巨噬细胞(上部)。在第 11天，将DCs用LPS处理3， 6， 9，或12小时(底部)。在第5天，将 巨噬细胞用LPS处理24小时。在两种情形中，通过定量RTPCR分析测量TNFa和TEM8 RNA。
图8A-8C显示共同注射HER2/neu和TEM8 DNA赋予肿瘤保护作用。 在图8A中，FVB/NT转基因小鼠通过用100昭编码TEM8、 HER2/neu 的DNA或联合的两种疫苗每两周一次(bi-weekly)肌内注射进行免疫。对 照小鼠组接受空载体pCDNA3。使用Kaplan-Meier分析显示在用 233-VSGA1肿瘤攻击后的无肿瘤存活。在图8B中，FVB/N母体、非转 基因小鼠通过用4昭编码TEM8、 HER2/neu的DNA或联合的两种疫苗每 周一次粒子轰击而进行免疫5次。在TEM8 + HER2/neu组中，在第1天， 将小鼠用TEM8疫苗免疫，并且在第+3天，用HER2/neu免疫。对照小鼠 组不接受免疫(首次用于实验)。使用Kaplan- Meier分析显示在用 233-VSGA1肿瘤攻击后随时间的无肿瘤存活。在图8C中，生长曲线针对 在图8B所述的实验中所用的个体小鼠而绘制。在用TEM8+HER2/neu免 疫的15只小鼠中有4只在初始肿瘤生长之后表现出肿瘤排斥作用(虚线)。
图9A-9B显示施用编码TEM8、 hTYRPl/hgp75, HER2.neu的DNA或 它们的组合的作用。图9A显示结合的TEM8和bTYRPl/hgp75 DNA疫苗 增加针对B16F10黑素瘤的攻击的保护作用。C57B16小鼠通过用4吗编 码TEM8、hTYRPl/hgp75的DNA或联合的两种疫苗每周一次粒子轰击而 进行免疫5次。对照小鼠组不接受免疫(首次用于实验)。使用Kaplan-Meier 分析显示在用B16F10黑素瘤皮内攻击后的无肿瘤存活。图9B显示 在免疫后没有检测到针对TEM8的抗体。小鼠用指定的疫苗通过每周一次 粒子轰击进行免疫5次。在最后一次接种后5天收集血清，合并并且利用 蛋白质印迹分析来分析对重组TEM8特异性的抗体。H140多克隆抗体用 作阳性对照。
图10显示TEM8施用增加树突细胞从皮肤到淋巴结的迁移。小鼠接 受TEM8DNA或空载体(模拟)基因枪的单次施用。在指定的天数，小 鼠用FITC致敏，以追踪DC迁移。24小时后，通过流式细胞术测量在淋 巴结DCs中的FITC含量。上部分析在CD3-CD19-DAPI-细胞中CDllcint MHCII类高DC群体(左)的FITC含量(右)。底部报告淋巴结中的 CDllc+FITC+细胞的百分数。每个符号代表一只小鼠。
图11显示在转染了所选择的TEM8 siRNA的COS7细胞中TEM8RNA减少了。 COS7细胞转染siRNA弁l,弁2，弁3或弁AM。在24小时后， TEM8 DNA通过qRT-PCR定量，针对未处理的细胞和18S RNA标准化。
图12A-12B显示TEM81oxP敲入耙向策略。图12A显示TEM8基因， 其为200Kb长，并且包含22个外显子。靶向载体包含由两个翻转酶重组 位点(Frt)侧连的新霉素盒(NEO)、外显子2和3 (外显子)、两个LoxP位 点以及5' (5臂)和3' (3臂)DNA序列，以允许同源重组。图12B显示DNA 印迹分析，其中探针X和y在EcoR V消化的C57B6 DNA上检测。
图13A-13C显示人TEM8的序列。图13A-13B显示人TEM8的核苷 酸序列(SEQ ID NO: 1)。图13C显示人TEM8的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。
图14A-14C显示小鼠TEM8的序列。图14A-14B显示小鼠TEM8的 核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)。图14C显示小鼠TEM8的氨基酸序列(SEQ ID NO: 4)。
发明详述
定义
当用于本文时，术语"一个(a)"或"一种(an)"可以意指一个或多个。 当用于本文的权利要求中时，当与词语"包括"联合使用时，词语"一个" 或"一种"可以意指一个或多于一个。当用于本文时，"另一个"或"其它"意 指至少第二个或更多个相同的或不同的主张要素或其成分。
当用于本文时，术语"佐剂"具有它的常规意思，即，增强针对特定 的抗原的免疫反应的能力。这样的能力通过免疫介导的保护作用的显著增 加而显现。体液免疫性的增强典型地通过针对所述抗原产生的抗体的滴度 的显著增加(通常〉10%)而显现。类似地，细胞免疫性的增强典型地通 过相对应的CD8+或CD4+T细胞数量的显著增加(通常>10%)而显现。
当用于本文时，"TEM8"是指从组织培养物或通过重组技术获得的多 肽，其表现出这种蛋白特有的活性谱。该词语不但包括人TEM8 (hTEM8)， 而且包括其它哺乳动物的TEM8，诸如例如，狗、猫、小鼠、大鼠、兔、 灵长类、马、猪和牛TEM8。天然人TEM8的核苷酸序列和氨基酸序列显 示在图13A-13C中。这种一级氨基酸和核苷酸序列可以作为天然的蛋白/DNA从天然来源获得或者可以重组衍生获得。
当用于本文时，术语"DNA疫苗"定义为质粒DNA的纯化的制剂， 所述质粒DNA设计成包含一种或多种基因或这些基因的片段以及调节遗 传元件，以使得能够在细菌宿主系统中生产。典型地，这些质粒具有用于 在细菌中选择和复制所必需的DNA序列。另外，它们包含真核启动子和 增强子以及转录终止/多腺苷酸序列，以促进基因在疫苗受体中的表达， 并且可以包含免疫调节元件。
通用方法
技术领域：
本发明的目的是提供一种制剂，其包括编码肿瘤相关的或病原体相关 的抗原的核酸分子，或它们的免疫原性或它们的蛋白产物，全长或片段或 衍生物，以及TEM8基因或蛋白产物，全长或片段，它们可以同时、分开 或顺序地用于癌症或传染病的预防性或治疗性治疗。
本发明提供新型疫苗组合物和将佐剂添加到疫苗中的方法，所述方法 使用佐剂TEM8，意欲在接种的宿主哺乳动物中提供针对特定的病原体或 针对特定的癌症的保护性细胞介导的免疫反应。最理想地，本发明涉及这 样的疫苗，所述疫苗依赖于增强接种的宿主的细胞介导的免疫性，即激发 辅助和细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和激活的吞噬细胞，以提供针对由所选 择的病原体的感染或在肿瘤免疫性的情形中针对肿瘤发展的保护。
在这方面，本发明表明在动物中注射TEM8增加树突细胞迁移和与之 一致的针对疫苗的T细胞反应。先前表明TEM8注射以CD8 T细胞-依赖 性方式增加肿瘤免疫性，而不管针对TEM8的特异性免疫反应的明显的缺 少。本发明表明在TEM8注射之后观察到的增加的肿瘤免疫性是由于 TEM8 DNA的佐剂作用引起的，并且TEM8 DNA注射增加树突细胞从皮 肤向引流淋巴结的迁移，并且还增加了 CD4+和CD8+T细胞反应。
与早先关于TEM8表达的研究相反，在其中据报道它的定位限于肿瘤 血管系统，在小鼠和人中发现TEM8在邻近所述肿瘤的激活的抗原呈递细 胞(APC)中表达。本发明表明在刚分离的小鼠骨髓中没有检测到TEM8， 但是在GM-CSF中体外培养后TEM8在树突细胞中表达，并且所述表达 通过用LPS刺激这些细胞的成熟而进一步增加。TEM8还在LPS-活化的巨噬细胞中和在存在于小鼠乳腺瘤中的CDllb+巨噬细胞中表达，并且
TEM8细胞与CD68+细胞(巨噬细胞)共同定位在人乳腺瘤和前列腺瘤中。 从TEM8的结构，表达位点和在血管内皮细胞中参与细胞迁移，并且 TEM8增加引流淋巴结(dLN)中的抗原呈递细胞的数目或移动的事实， 在本文推论TEM8增加抗原呈递。CD8 T细胞的增加可能反映在细胞因子 周围的变化或者促进巨噬细胞成熟为Ml细胞而不是M2也是可能的。
TEM8/ATR在树突细胞和巨噬细胞上表达，并且炭疽感染引起针对感 染的功能性反应的深刻的减少。TEM8在进化上非常保守，并且必定具有 与其作为炭疽受体的作用不相关的重要的生物学功能。除了它们作为抗原 呈递细胞和吞噬细胞的作用外，巨噬细胞在乳房发育、乳房芽塑形和胎盘 发育中起作用。正常乳房和胎盘中的TEM8+细胞可能是巨噬细胞。TEM8 与胶原蛋白相互作用，并且它在细胞迁移中很重要，并且己经参与肿瘤的 血管生成。
本文描述的数据提供对TEM8在抗原呈递中的作用的支持。对于增加 T细胞反应，需要TEM8的完整的细胞外结构域，并且从这些初始结果来 看，似乎TEM8蛋白在增加抗原呈递中具有活性作用，并且对于所述活性 需要在vWf结构域中的突变。可以检测这些相同的突变，检测它们抑制 细胞迁移和炭疽结合的能力，以仔细研究这些生物学活性。
关于TEM8影响抗原呈递的机制存在两种假设。在抗原呈递细胞上的 TEM8可以与另一种蛋白相互作用以增加运动性、吞噬作用或成熟是可能 的。在这种情形中，注射TEM8DNA可以增加TEM8在抗原呈递细胞中 的表达并且扩大这种作用。备选地，如果TEM8正常作用抑制抗原呈递细 胞活化，那么TEM8 DNA可以提供可溶的TEM8，其可以干扰这种相互 作用，诸如sTEM8干扰炭疽结合一样。所述数据支持第一种假说，原因 在于更长的TEM8构建体，包含跨膜结构域，仍然有作为佐剂的活性。清 楚地，由于TEM8已经被描述为通用的免疫佐剂，在肿瘤免疫学领域和病 原体疫苗领域都将是有用的。换言之，本文所述的免疫原性组合物将有效 用于肿瘤免疫治疗和传染病的减轻或预防性治疗。最重要地，这些组合物 不但用于流行病时期，而且在士兵和平民暴露于或怀疑暴露于生物武器时 同样地用于他们。这些组合物还可以用于相伴的动物。本发明还考虑设计TEM8的小分子抑制剂，并且确定它们是否取代TEM8 DNA注射。
在本发明的一个实施方案中，TEM8可以作为全长TEM8或作为 TEM8片段施用。 一种可能的片段是包括TEM8的氨基酸28-278的片段， 或编码图14A-14C的小鼠TEM8序列的28-278氨基酸的相对应的核酸序 列。另外，普通技术人员将容易地认识到TEM8氨基酸序列或核酸序列可 以进行操作，以产生与图14的蛋白或核酸序列不是100%相同的有用的 TEM8。例如，普通技术人员将找到与图14的序列有80%或90%同源性 的蛋白或核酸是有效的。氨基酸序列的基本相同性意指所述序列是相同的 或者有一个或多个氨基酸改变(添加、取代)的不同，所述氨基酸改变不 引起合成的蛋白和天然人TEM8之间的不利的功能不相似性。
本发明涉及一种组合物，其包括免疫原性序列或其片段，TEM8或其 片段，药用载体或它们的组合。所述免疫原性序列或其片段和TEM8或其 片段通常可以是重组蛋白或肽。所述重组蛋白或肽可以包括修饰的氨基 酸、未修饰的氨基酸或二者。组合物中的TEM8或其片段可以具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。
备选地，可以将编码免疫原性序列或其片段的核苷酸序列和编码 TEM8或其片段的核苷酸序列插入到载体中。在这种情形中的载体可以是 质粒、病毒载体或细菌载体。另外，编码TEM8或其片段的核苷酸序列可 以包括至少60个核苷酸。此外，组合物中编码TEM8或其片段的核苷酸 序列可以具有SEQIDNOS: 1或3所示的序列。所述免疫原性序列或其片 段可以是肿瘤相关抗原或病原体相关抗原的免疫原性序列或其片段。肿瘤 相关抗原的实例可以包括但不限于，Her2/neu， gp75， Her2/NEU， gp75/TYRP-l， PSMA, TRYP-2, NY-ESO-l, MAGE-1， MAGE-3, CEA， PSA, 酪氨酸酶，突变体p53，突变体p21,突变体cdk4，突变体L9， BCR-ABL 或HPV16的E6/E7，并且病原体相关抗原的那些可以包括但不限于细菌 脂多糖，炭疽致死因子，炭疽水肿因子，HlVgpl20或疟疾抗原诸如CSP, TRAP/SSP2, LSA1， MSP1和AMA1 。
本发明还涉及在受试者中引发免疫反应的方法，所述方法包括给所述 受试者施用免疫学有效量的如前文所述的组合物的步骤。组合物中的 TEM8或其片段可以增加组合物中的免疫原性序列或其片段在受试者中引发针对与肿瘤相关的抗原或针对病原体的抗体反应、CD4 T细胞反应、
CD8 T细胞反应或它们的组合的能力。与癌症和病原体相关的抗原的代表 性实例与前文所述相同。另外，受益于所述方法的受试者可以包括但不限 于，患有乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、结肠癌、慢性髓性白血病或宫颈癌 的受试者，或者已经暴露于或怀疑暴露于疟疾、炭疽、HIV或生物武器的
受试者。
本发明还涉及一种组合物，其包含免疫原性序列或其片段，与TEM8 或其片段的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列，药用载体或其 组合。TEM8或其片段的氨基酸序列可以具有在SEQIDNO: 2或SEQ ID NO: 4中显示的序列。另外，免疫原性序列或其片段和与TEM8或其片 段同源的序列可以是重组蛋白或肽。重组蛋白或肽可以包括修饰的氨基 酸，未修饰的氨基酸或两者。
备选地，编码所述免疫原性序列或其片段的核苷酸序列和编码与 TEM8或其片段同源的序列的核苷酸序列可以被插入到载体中。在这种情 形中的载体可以是质粒、病毒载体或细菌载体。另外，编码与TEM8或其 片段同源的序列的核苷酸序列可以包括至少60个核苷酸。此外，组合物 中编码TEM8或其片段的核苷酸序列可以具有SEQ ID NOS: 1或3的序 列。另外，所述免疫原性序列或其片段的类型的实例与前文所述的相同。
本发明还进一步涉及在受试者中引发免疫反应的方法，所述方法包括 给所述受试者施用免疫学有效量的如前文所述的组合物的步骤。所述组合 物中与TEM8或其片段同源的序列可以增加所述免疫原性序列或其片段 在受试者中引发针对与肿瘤相关的抗原或针对病原体的抗体反应、CD4T 细胞反应、CD8T细胞反应或它们的组合的能力。与癌症和病原体相关的 抗原的代表性实例以及受益于所述方法的受试者的类型与前文所述相同。
本发明还涉及一种组合物，其包括免疫原性序列或其片段，与TEM8 或其片段的氨基酸序列有至少80%同源性的氨基酸序列，药用载体或它们 的组合。TEM8的氨基酸序列或其片段可以具有SEQIDNO: 2或SEQ ID NO:4所示的序列。另外，所述免疫原性序列或其片段以及与TEM8或其 片段同源的序列可以是重组蛋白或肽。所述重组蛋白或肽可以包括修饰的 氨基酸、未修饰的氨基酸或二者。备选地，可以将编码所述免疫原性序列或其片段的核苷酸序列和编码
与TEM8或其片段同源的序列的核苷酸序列插入到载体中。在这种情形中 的载体可以是质粒、病毒载体或细菌载体。另外，编码与TEM8或其片段 同源的序列的核苷酸序列可以包括至少60个核苷酸。此外，组合物中编 码TEM8或其片段的核苷酸序列可以具有SEQ ID NOS: 1或3的序列。另 外，所述免疫原性序列或其片段的类型的实例与前文所述的相同。
本发明还涉及在受试者中引发免疫反应的方法，所述方法包括给所述 受试者施用免疫学有效量的前文所述的组合物的步骤。组合物中与TEM8 或其片段同源的序列可以增加在所述组合物中的免疫原性序列或其片段 在所述受试者中引发针对与肿瘤相关的抗原或针对病原体的抗体反应、 CD4T细胞反应、CD8T细胞反应或它们的组合的能力。与癌症和病原体 相关的抗原的代表性实例以及受益于所述方法的受试者的类型与前文所 述相同。
本发明还涉及一种组合物，其包括TEM8或其片段和药用载体。所述 TEM8或其片段可以是重组蛋白或肽。所述重组蛋白或肽可以包括修饰的 氨基酸、未修饰的氨基酸或二者。组合物中的TEM8或其片段可以具有 SEQIDNO:2或SEQ IDNO: 4中所示的氨基酸序列。
备选地，可以将编码所述免疫原性序列或其片段的核苷酸序列和编码 TEM8或其片段的核苷酸序列插入到载体中。在这种情形中的载体可以是 质粒、病毒载体或细菌载体。另外，编码TEM8或其片段的核苷酸序列可 以包括至少60个核苷酸。此外，组合物中编码TEM8或其片段的核苷酸 序列可以具有SEQ ID NOS: 1或3的序列。
本发明还涉及增加免疫原性组合物在受试者中引发免疫反应的能力 的方法，所述方法包括给所述受试者施用包括TEM8或其片段以及药用载 体的组合物的步骤。这种方法可以进一步包括给所述受试者施用免疫原性 序列或其片段。所述免疫原性序列或其片段可以在包括TEM8或其片段的 组合物施用之前、同时或随后施用。所施用的免疫原性序列或其片段可以 是肿瘤相关抗原或病原体相关抗原的免疫原性序列或其片段。关于肿瘤相 关抗原的类型、病原体相关抗原的类型和增加的免疫反应的受试者的所有 其他方面都与前文所述相同。本发明还涉及一种组合物，其包括与TEM8或其片段有至少90%同源 性的氨基酸序列以及药用载体。TEMS的氨基酸序列或其片段可以具有 SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。此外，与TEM8同源
的序列或其片段可以是重组蛋白或肽。所述重组蛋白或肽可以包括修饰的 氨基酸、未修饰的氨基酸或二者。
备选地，编码与TEM8或其片段同源的序列的核苷酸序列可以插入到 载体中。在这种情形中的载体可以是质粒、病毒载体或细菌载体。另外， 编码与TEM8或其片段同源的序列的核苷酸序列可以包括至少60个核苷 酸。此外，组合物中编码TEM8或其片段的核苷酸序列可以具有SEQID NOS: 1或3的序列。
本发明进一步涉及增加免疫原性组合物在受试者中引发免疫反应的 能力的方法，所述方法包括给所述受试者施用包括与TEM8或其片段有至 少90%同源性的序列和药用载体的组合物的步骤。这种方法可以进一步包 括给所述受试者施用免疫原性序列或其片段。关于施用所述免疫原性序列 或其片段的方式、免疫原性序列或其片段的类型以及增加免疫反应的受试 者的所有其他方面都与前文所述相同。
本发明还涉及一种组合物，其包括与TEM8或其片段有至少80%的同 源性的氨基酸序列以及药用载体。TEM8或其片段的氨基酸序列可以具有 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。此外，与TEM8或其 片段同源的序列可以是重组蛋白或肽。所述重组蛋白或肽可以包括修饰的 氨基酸、未修饰的氨基酸或二者。
备选地，编码与TEM8或其片段同源的序列的核苷酸序列可以插入到 载体中。在这种情形中的载体可以是质粒、病毒载体或细菌载体。另外， 编码与TEM8或其片段同源的序列的核苷酸序列可以包括至少60个核苷 酸。此外，组合物中编码TEM8或其片段的核苷酸序列可以具有SEQID NOS:l或3的序列。
本发明进一步涉及增加免疫原性组合物在受试者中引发免疫反应的 能力的方法，所述方法包括给所述受试者施用包括与TEM8或其片段有至 少80%同源性的序列以及药用载体的组合物的步骤。这种方法可以进一步 包括给所述受试者施用免疫原性序列或其片段。关于施用所述免疫原性序列或其片段的方式、免疫原性序列或其片段的类型以及增加免疫反应的受 试者的所有其他方面都与前文所述相同。
当用于本文时，"与TEM8或其片段有至少90。/。同源性的序列"可以 包括与TEM8或其片段有99%， 98%, 97%， 96%, 95%, 94%, 93%, 92%， 91% 或90%的同源性的序列。类似地，当用于本文时，"与TEM8或其片段有 至少80%同源性的序列"可以包括与TEM8或其片段有99。/。， 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%或80%的同源性的序列。
包括肿瘤相关抗原或病原体相关抗原的免疫原性序列或其片段的免 疫原性组合物可以与TEM8或其片段、或者与TEM8或其片段有至少90% 或至少80%的同源性的序列一起包含在同一组合物中，或者可以包含在不 同的组合物中。另外，所述免疫原性序列可以包括一种抗原或多种不同的 抗原。同样地，所述免疫原性组合物可以在施用TEM8或其片段、或者与 TEM8或其片段有至少90%或至少80%的同源性的序列之前、同时或随后 施用。无论何种方式，这样的共同施用的组合作用增强所述免疫原性组合 物对免疫反应的引发。
本文所述的一种或多种组合物可以系统或局部施用，施用通过本领域 任何方法标准进行，例如，皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、皮内、肌内、 局部地、肠、直肠、鼻、颊、阴道、或通过吸入喷雾剂、通过药物泵或包 含在透皮贴片内或植入物内。本文所述的组合物的剂量制剂可以包括适合 施用方法的常规无毒的、生理的或药用载体或赋形剂，并且对于本领域内 的普通技术人员是公知的。
本文所述的组合物可以独立地一次或多次进行给药，以实现、维持或 提高治疗效果。确定剂量或者本文所述的组合物的适当剂量是否可以包括 单次施用剂量或多次施用剂量对于技术人员来说是容易地。适当的剂量取 决于受试者的健康、免疫反应的引发和/或癌症或病原体相关疾病的治疗、 施用途径和所用的制剂。
提供下述实施例是为了举例说明本发明的多个实施方案的目的，并不 意欲以任何方式限制本发明。所述实施例以及本文所述的方法、步骤、治 疗、分子和特异性化合物目前是优选实施方案的代表。本领域的技术人员应该容易理解本发明很好地适合实施目的并且获得所提及的目标和优点， 以及本文固有的那些目的、目标和优点。本发明的技术人员应该找到包含 在由权利要求的范围所定义的本发明的精神内的其中的改变以及其他应 用。
小鼠
关于活化的大鼠neu癌基因的转基因MMTV-FVB/neuNT小鼠(品系 233) (Muller等，1988)购自Charles River (Calco，意大利)。通过PCR对4 周龄的雌鼠进行关于转基因的常规筛选，如前所述。FVB/N小鼠购自 Taconic Farms，公司(White Plains,纽约)，并且C57BL/6小鼠购自杰克逊 实验室(The Jackson Laboratory) (Bar Harbor, ME)。所有小鼠都依据由 Memorial Sloan-Kettering癌症中心(Memorial Sloan-Kettering of Cancer Center) (MSKCC)机构动物护理和使用委员会评论和核准的流程下的机构 指南笼养在无病原体的饲养室中。所有的雌性小鼠在6-8周龄进入研究中。
细胞系和组织培养物
233-VSGA1乳腺瘤细胞系来源于在关于活化的大鼠neu转基因的 FVB/neuNT小鼠中产生的小鼠乳腺癌。这种细胞系如前述那样维持(Nanni 等，2000)，并且是由Pier-LuigiLollini博士 (博洛尼亚大学(University of Bologna),博洛尼亚，意大利)馈赠的。B16F10是C57BL/6来源的自发 性小鼠黑素瘤，并且是由Isaiah Fidler博士 (安德森博士癌症中心(MD Anderson Cancer Center), Houston, TX)馈赠的。这种肿瘤细胞系如前述那 样维持(Hara等，1995)。
实施例3
DNA构建体
大鼠HER2/neu的细胞外结构域通过聚合酶链式反应从pCMVneuNT 质粒扩增(Amici等，1998)，反应使用高保真性Platinum TAq DNA聚合酶 (Invitrogen， carlsbad, CA， 美国)禾Q 引物 FW 5'-CGAAGCTTACCATGGAGCTGGCGGCCTGG-3， (SEQ ID NO: 5)与 REV 5'画CGGAATTCTTATGTCACCGGGCTGGC-3， (SEQ ID NO: 6)进行。 将HindIII-EcoRI片段克隆在pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)中。作为 编码TEM8的cDNA来源，从分离自FVB/neuNT转基因小鼠的乳房瘤提 取总RNA。使用下述引物通过PCR扩增TEM8的细胞外结构域的片段(aa 13-357): 5'- GGACTCTGCGTGGCTGCACTCGTGC-3' (SEQ ID NO: 7)和 5'- AGAGCAGCGCCAGGGCCAGCAGCAG-3' (SEQ ID NO: 8)。
PCR进行35个循环，每个循环在95。C l分钟、64°C 1分钟、72°C 2分钟，而后在72。C IO分钟。纯化PCR产物，并且利用标准技术克隆到 pGEM T easy载体中(普洛麦格(Promega), Madison, WI)，以产生质粒 pGEMTEM8。对于TEM8在真核细胞中和在体内的表达，从pGEMTEM8 扩增编码细胞外结构域的部分(aa28-279)的TEM8基因的片段，并且亚 克 隆 至U pcDNA3.1 (Invitrogen) 中。 引 物 为 5'-GGGGGTACCGCAATGGGCCGCCGCGAGGATGGGGGA陽3' (SEQ ID NO: 9)和5'-GGTGGAATTCCTAGCACAGCAAATAAGTGTCTTC-3' (SEQ ID. NO: 10)。 PCR按上述进行。
然后将PCR产物用Kpnl禾P EcoRI消化，并且克隆到pcDNA3.1 (Invitrogen)中，以产生pcDNATEM8。大规模的质粒制备通过使用Qiagen 质粒Giga或Maxi试剂盒(Qiagen， Venlo， The Netherlands)碱裂解进行。 hTYRPl/hgp75先前克隆在WRG/BEN质粒(Weber等，1998)中。
实施例4
原位杂交
使用下述引物5'- GAAGACGATGATGGTTTGCCA-3' (SEQ ID NO: ll)和5'- GTGGTAGGTGTTGTTCAGGGG-3' (SEQ ID NO: 12)，通过PCR
扩增小鼠TEM8的细胞内结构域，并且克隆到pGEM T easy载体(普洛 麦格(Promega))中。对克隆的产物进行测序，并且针对GENEBANK数 据库(NCBI)进行筛选，以验证小鼠TEM8的特性和在所述载体内部的方 向。然后，在用NcoI或SalI分别消化后，利用T7和SP6聚合酶(罗氏应用科学(Roche Applied Science), Indianapolis, IN)产生反义和有义探针。 对来自233-VSGA1乳腺瘤的福尔马林固定的、石蜡包埋的块进行切 片(8mm厚度)、去除石蜡、再水合并且预处理，用于原位杂交。杂交用 3￥-标记的RNA在65'C过夜进行。在去除未结合的核糖核酸探针后，对 切片进行清洗和脱水。载玻片浸在放射自显影乳液中(NTB-2; Kodak, Rochester,纽约)并且在干燥箱中在4匸温育。在暴露2周后进行放射自显 影检测。载玻片在Gill苏木精中染色，脱水，然后用Permoimt (西格玛，St. Loius, MO)封固。
实施例5
TEM8重组蛋白
利用Gateway克隆技术试剂盒(Invitrogen)中提供的载体和方法，在细 菌中过量生产TEM8重组蛋白。使用引物attBlbis-5'GGATGGGGGA-3' (SEQ ID NO: 13)和attB2bis-5'- GGGGACCACTTT GTACAAGAAAGCTGGGTCGCACAGCAAATAAGTGTCTTC -3' (SEQ ID NO: 14)，从pGEMTEM8扩增TEM8 DNA。将重组构建体引入到大肠杆 菌(E. coli) BL21 Star(DE3)感受态细胞中。
将阳性转化体在LB培养基中培养，直到它们达到对数中期阶段 (OD600 = 0.4-0.6)，并且蛋白用0.5 M异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。 HiTrap螯合HP亲和柱(安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences), Piscataway， NJ)用来从细胞裂解物富集TEM8蛋白。对于获得在考马斯染 色后具有单一条带的TEM8制备物，利用单Q阴离子交换柱(安玛西亚 (Amersham))通过FPLC进一步纯化是必要的。纯化的蛋白用NaCl梯度 从单Q树脂上洗脱下来。TEM8蛋白在0.1 MNaCl时被洗脱下来。
实施例6
蛋白质印迹分析
制备蛋白样品，全裂解物或重组TEM8蛋白。对于裂解物，将107个 细胞在裂解缓冲液中在冰上温育30分钟，所述裂解缓冲液为25 mMTris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl， 1% NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS, 100mg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF)， 1 mMNa3V04， 2 mg/ml牛胰蛋白酶抑制 剂，1 mg/ml亮抑蛋白酶肽和1 mg/ml胃蛋白酶抑制剂(西格玛)。通过在4 。C以12,000 xg离心IO分钟而清除裂解物，并且每个泳道上样30mg。样 品在7.5% Tris-甘氨酸PAGE预制凝胶(Cambrex生物科学公司(Cambrex Bio Science, Inc.) East Rutherford, NJ)上分离。在电转移后，将硝基纤维 素膜(PROTRAN, Schleicher &Schuell,伦敦，英国)用在具有0.05%的吐温 的PBS中的5。/。脱脂干奶粉(Bio-Rad实验室，Hercules, CA)封闭1小时。
在室温下用1:500稀释的两种多克隆抗-ATR/TEM8抗体中的一种； 在5%脱脂干奶粉PBS/T中的N19 (图1B)或H140 (图81)或H140(图9B) (Santa Cruz生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), Santa Cruz, CA)，或者用1:100稀释的收集的小鼠血清探测膜1小时。使用兔抗-山羊、 山羊抗-兔或山羊抗-小鼠IgG-HRP缀合物(Jackson免疫研究实验室公司 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), West Grove, PA)检观lj结合的 抗体，在适当时，用ECL试剂盒(安玛西亚)显现。
实施例7
DNA和肽免疫
如报道(Ross等，1997)，通过氦气推动的金粒子轰击免疫FVB/N和 C57BL/6雌鼠。简言之，在免疫之前，将小鼠的腹部皮肤剃毛，并且用 Nair (Church禾卩Dwight，公司，Princeton, NJ)去毛，并且利用氦气推动的 基因枪(PowderMed,公司，牛津，英国)在400 psi的压力下，将携带DNA 的金粒子注射到麻醉的小鼠腹部皮肤中。
递送4次注射，每一次注射到腹部的4个分区之一，每只小鼠总共4 pg质粒DNA。免疫每周重复，持续3-5周。用两种不同DNA质粒的组 合处理的小鼠每周注射两次(在第-3天和第0天)。
对于在基质胶凝胶中的肿瘤细胞的注射和细胞内细胞因子染色 (ICCA)， FVB/N小鼠(3只/组)通过粒子轰击用neu或FL-neu DNA每周注 射一次持续3周，或者保持未处理作为阴性对照(首次用于实验的)。在 最后一次接种后5天，将用基质胶(百克顿迪克森(Becton Dickinson) ，SanJose， CA)混合的HER2/neu+乳房瘤细胞系(233-VSGAl)皮下注射到每只 小鼠的右胁(250 ml基质胶中106个肿瘤细胞/小鼠)。在IO天后收集基 质胶塞和脾，并且进行ICCA(细胞内细胞因子染色)。效应器细胞在体外 用T2Dq靶细胞(E:T比例为10:1)再刺激，所述T2Dq靶细胞用免疫显性的 HER2/neu肽(RNeu 420)脉冲。加入Golgi Stop (BD Pharmingen, San Diego, CA)，以促进分泌的细胞因子在内质网中的积累。在过夜再剌激时期后收 集细胞，用荧光团-缀合的抗体染色，并且通过流式细胞术分析IFN-Y的 产生。对于肽免疫，将50 mg肽与TiterMax (西格玛奥尔德里奇，St. Louis, MO)混合(l:l比例)，并且注射到每个爪垫中(100 mg肽/小鼠)。在单一 肽注射后7天，处死小鼠，并且收集胭LNs。如上文所述进行Elispot检
肿瘤攻击和体内CD8+T细胞消耗
将如上文所述免疫的FVB/N和C57BL/6小鼠在胁部分别用5xl04 233-VSGA1或用B16F1025K肿瘤细胞进行皮内攻击。通过每周用卡钳确 定两个垂直直径3次而测量肿瘤，并且在它们在任何直径达到2 mm并继 续生长时，计分为阳性。当肿瘤溃烂或在任何直径达到1 cm时，将小鼠 处死。对于体内CD8+消耗，在相对肿瘤攻击的第-2,+5,+12和+19天，将 来自大鼠抗-小鼠CD8杂交瘤53-6.7.2 (Guevara-Patino等，2006)的生物反 应器培养物上清腹膜内注射到小鼠中。前两次注射由250吗53-6.7.2组成， 并且对于第三次和第四次注射由500吗53-6.7.2组成。在它用于免疫的小 鼠之前，关于CD8+T细胞的消耗，检测每一批次的抗体。
制备骨髓-来源的树突细胞
从FVB/N非转基因小鼠的股骨收集骨髓，用PBS洗涤，在ACK裂 角率缓冲液(Cambrex生物科学(Cambrex Bio Science), Walkersville, MD，美 国)中消耗RBC，并且在24孔板中以lX10"ml培养在RPMI 10% FCS, NEAAP/S L-Glu—bme, HEPES和20 ng/mL重组小鼠GM-CSF (R&D系统,Minneapolis,,,美国)中。在2、 4和5天给养培养物。在第6天加入重 组TEM8蛋白(50 mg/lXl()6树突细胞(DC))。对照DC培养物不包含 TEM8蛋白。在第7天分离未黏附的细胞(不成熟的DC)，以lX106/2mL 重新接种在含有GM-CSF的完全培养基中，并且用另外50 mg重组TEM8 蛋白脉冲。在第8天，将细胞的整分试样用对B7.1和CDUc特异的Ab 染色，并且93%的细胞表达两种标记。其余的细胞用作细胞内细胞因子分 泌测定的呈递物(presenters)。
实施例10
细胞内细胞因子分泌测定
从用空载体、TEM8、 HER2/neu或HER2/neu+/TEM8免疫的小鼠的 引流淋巴结制备单细胞悬浮液。来自首次用于实验的小鼠的淋巴结作为另 外的对照。DC (未脉冲或用TEM8蛋白脉冲)用完全RPMI培养基洗涤。 将细胞接种(1Xl(^LN细胞+ 0.33 105 DC，在lnL最终体积中)在完全 培养基中，2小时，并且加入10 |iL IX BFA (BD Pharmingen,圣地亚哥, CA，美国)。在16-20小时后，利用由供应商(BDPharmingen)提供的试 剂和流程，关于表面CD3、 CD4、 CD8和细胞内IFNg对细胞进行染色。 在FACSCAN (BD生物科学，Franklin Lakes, NJ，美国)获得事件(IOO 000)， 并且利用FloJo (FloJo LLC,阿什兰,OR，美国)6.3软件评价数据。
ELISpot测定
通过标准ELISpot测定(Hawkins等，2000)确定TEM8-特异性INF-y生 产。在三次DNA注射的最后一次后5天，从TEM8-免疫的或对照C57BL/6 小鼠收集引流淋巴结(DLN)。将DLN在完全RPMI中机械分解，并且通 过用磁性抗-CD8珠子(Miltenyi生物技术公司(Miltenyi Biotec Inc), Aubum: CA，美国)培养而阳性选择CD8+T细胞。CD8+T细胞(1x10v孔)与用 10 mg/mL的4种TEM8肽中的一种脉冲的H2-b靶细胞(EL-4， 1x10v孔) 一起培养20小时。这些TEM8肽，艮卩ACYGGFDL (SEQ ID NO: 15), SVL朋額EI (SEQ ID NO: 16), IYYFVEQL (SEQ ID NO: 17)和NSQGYRTA(SEQIDNO: 18)，预计与H2-Kb或H2 Db结合。作为阴性对 照，靶细胞未进行脉冲或者用不相关的卵清蛋白肽SIINFEKL (SEQ ID NO: 19)脉冲。斑点显色如其它地方所述(Herr等，1996)进行，并且利用立体显 微镜和自动化计算机(Carl Zeiss公司，Munchen-Hellbergmoos,德国)计数 斑点，在40倍放大倍数进行计数。
另外，在最后一次DNA注射后5天从免疫的和对照FVB/N小鼠收集 腹股沟和腋窝淋巴结(LNs)。将LNs在完全RPMI中机械分解。通过用磁 性抗-CD8珠子(Milteny生物技术(Milteny Biotec)， Auburn, CA)温育而 阳性选择CD8+ T细胞。在将CD8+ T细胞(1X10V孔)与用RNEU420-429 肽(10mg/ml)脉冲的T2Dq靶细胞(1X10V孔)温育20小时后，通过标准 ELISPOT测定确定HER2/neu-特异性IFN-g生产。RNEU420-429表位已 经表现出对于H2-Dq单倍型是免疫显性的，并且它定位在HER2/neu的细 胞外区域(Ercolini等，2003)。作为阴性对照，靶细胞未进行脉冲。
实施例12
增殖测定方法和试剂由细胞增殖ELISA试剂盒(Cell Proliferation ELIS A kit) (罗氏(Roche),米兰，意大利)提供。从用pcDNA3.1、 TEM8、 HER2/neu 和HER2/neu加TEM8质粒免疫的个体FVB/NT 233小鼠收集脾和淋巴结。 粉碎后，收集脾细胞和淋巴细胞，接种在96孔板(200 000细胞/孔)中， 并且在378C禾n 5% C02用两剂量的TEM8重组蛋白之一 (25或100 mg/mL)或用ConA(安玛西亚，米兰，意大利)(1或3 mg/mL)刺激5天。 然后，将10 mm BrdU (罗氏)(终浓度)加入到所述细胞中持续5-6小时。 在显色后，使用ELISA平板读数仪(实验室系统(Lab Systems), M-Medical Srl，米兰，意大利)在450nm测量吸光度。
实施例13
统计学分析
进行对数等级分析，以基于Kaplan-Meier图评估无肿瘤存活中的差
巳
升°实施例14
T细胞反应在肿瘤层得到扩增
先前观察到，当与第二、肿瘤-限制的DNA疫苗一起施加时，注射
TEM8 DNA增加抗肿瘤免疫性，并且这一作用在很大程度上取决于CD8 T 细胞。这些观察是使用两种疫苗，即在FVB小鼠中的HER2/neu，在 C57BL/6小鼠中的hgp75而获得的，这两种疫苗自身引发初级抗体反应。
进行了一系列实验，以在免疫的小鼠中鉴定对TEM8特异的CD8 T 细胞。为了放大弱的T细胞反应，使用基质胶测定，用来扩大并检测肿瘤 附近的渗透性T细胞(TILS)。卵清蛋白和HER2/neu用作模型抗原。将用 编码卵清蛋白肽的cDNA免疫的小鼠用在基质胶中的ova+肿瘤攻击，并 且6天后，比较在引流淋巴结中和在含有肿瘤的基质胶塞中的卵清蛋白-特异性CD8 T细胞的百分数(图1)。对照包括首次用于实验的小鼠和用 不表达卵清蛋白的肿瘤攻击的小鼠(B16)。
在细胞内细胞因子分泌测定中，在所有用ova免疫的小鼠的引流淋巴 结中约1%的CD3+CD8+T细胞识另lj ova肽，而不管肿瘤是否表达卵清蛋 白。然而，在ova+肿瘤的肿瘤层中，存在ova-特异性CD8+T细胞的基本 扩增，以致在基质胶塞中60。/。的CD3+CD8+T细胞是ova-特异性的，而 相比对照cwa-肿瘤为5%。在首次用于实验的小鼠中不存在ova-特异性T 细胞。
另外，小鼠还用与Flt3-配体(FL-neu)融合的rHER2/neucDNA免疫， 并用在基质胶中的233-VSAG1肿瘤攻击。在4、 6或10天后，使用从脾、 引流淋巴结和基质胶塞分离的细胞，通过ICCA测量neu-特异性反应。从 第4天开始，观察到neu-特异性反应(l。/。的CD3+CD8+T细胞)，并且这 在第6天增加到2%，和在第10天是11% (结果未显示)。在引流淋巴结 或脾中的反应任何时刻都不超过0.3%。为了证实这一结果，将用HER 2/neu或FL-neu免疫的小鼠进行相同的分析，并且当在脾中没有检测到响 应的细胞的时刻，在肿瘤层中观察到neu-特异性CD8+T细胞的明显扩增 (图2)。
利用计算机算法来预测具有对小鼠I类MHC Kd和Db的高亲和性的TEM8肽，并且在ELIspot和细胞内细胞因子流式细胞术(ICC)测定中， 将用4种这样的肽脉冲的脾细胞用来刺激来自TEM8免疫的小鼠的T细 胞。尽管使用基质胶测定或标准IFN-gELISPOT，不能证明在免疫的小鼠 中对TEM8特异性的CD8 T细胞。此外，当将来自免疫的小鼠的血清用 于探测用重组TEM8蛋白上载的蛋白质印迹时，没有观察到抗体。
在肿瘤位置和在肿瘤首次用于实验的小鼠的引流淋巴结中，TEM8 DNA 增加针对HER2/neu和hTRP-l DNA疫苗二者的CD8T细胞反应
面对由联合疫苗引发的整体肿瘤免疫性部分取决于CD8+T细胞，并 且仍没有观察到TEM8-特异性CD8+T细胞的事实，利用基质胶测定，在 用单独的HER2/neu、单独的TEM8或联合的两种DNA免疫的小鼠中定 量针对HER2/neu的CD8 T细胞反应。当给与TEM8和HER2/neu两种疫 苗时，在携带肿瘤的小鼠中观察到针对存在于肿瘤位置的HER2/neu的 CD8 T细胞反应的两倍增加(图3)。空载体(pING)没有这样的辅助作 用。
在neu-特异性T细胞中的这种增加可能是由炎症在肿瘤内部引起的 对neii阳性细胞的提高的进入引起的，或是由针对在内皮细胞或基质中表 达的TEM8蛋白的局部免疫反应引起的。还考虑这样的可能性，即针对 TEM8的弱反应不能通过ICCA和ELISPOT测定检测到但是仍然足以增 加肿瘤内的炎症。备选地，TEM8可能通过某些未确定的机制改变淋巴结 中的免疫反应。
为了区分这些可能性，将小鼠用TEM8、 HER2/neu或两种疫苗联合 免疫。在这些实验中，不植入肿瘤，但是在最后一次疫苗后5天，收集引 流淋巴结，并且利用IFN-g ELISPOT测定针对免疫显性meu肽的CD8 T 细胞反应(图4A)。 TEM8，而不是空载体(pING)，将在免疫的、不携 带肿瘤的小鼠的引流LNs中的反应细胞的数目增加了 5倍。当TEM8与 黑素瘤分化抗原、人酪氨酸酶-相关蛋白1 (hgp75)结合时，也观察到CD8 T细胞的基本上相同的增加(图4B)。另夕卜，TEM8还增加针对外源抗原、 卵清蛋白的CD8+T细胞反应(图4C)。这表明TEM8作为免疫佐剂用于肿瘤免疫学和传染病的多种应用的通用用途。
为了评估CD8T细胞对TEM8-依赖型免疫性的贡献，恰恰在肿瘤攻 击之前，将这些细胞从小鼠中消耗掉，并且之后持续3周。CD8+T细胞 的体内消耗通过腹膜内注射大鼠MAb克隆53-6.7.2而进行。仅用 HER2/neu免疫的小鼠部分免于肿瘤攻击(P=0.0004]，并且相对于 HER2/neu，这种作用被CD8消耗减小，但没有消除(P^ 0.3)(图4C，左)。 用联合疫苗CTEM8+HER2/neu)免疫的小鼠也是部分免于受肿瘤攻击(P二 0.0009)。在这种情形中，当T细胞消耗(P二0.02)时，完全失去肿瘤保护， 尽管相对于对照组，存在肿瘤生长的延迟(图4C，右)。在黑素瘤模型中， hTYRPl/hgp75提供部分保护(P二O.l)，并且相对于单独的hTYRPl/hgp75， 联合疫苗增强了这种保护作用(P= O.(M)(图犯)。联合的 TEM8+hTYRPl/hgp75疫苗保护小鼠免受肿瘤攻击(PK).0008)，并且T细 胞消耗将肿瘤保护作用减小到与用单独的hTYRPl/hgp75疫苗观察到的水 平非常接近的水平(P二0.4)。
当将同系DCs通过电穿孔用HER2/neu RNA转染时，它们具有并且 呈递HER2/neu肽的完整补体，所述完整补体能够结合MHC I和MHC II 分子中的每一种。当这些细胞用作ELISPOT中的靶时，可以定量存在和 不存在TEM8时在接种之后在小鼠中针对所有免疫原性HER2/neu肽的整 体CD8+和CD4+T细胞反应。简言之，用mRNA对DC进行电穿孔操作
如下
鼠DCs来源于小鼠骨髓(BM)。所述BM从首次用于实验的小鼠的胫 骨和腿骨流出。将细胞在补充了 GM-CSF (32 ng/ml)的培养基中培养6-7 天。典型地，在第7天，将细胞用于电穿孔。将4 x 106 BM-来源的DCs 用PBS洗涤两次，并且重悬在100 ml溶液R (Amaxa, Gaithersburg, MD) 中；在加入20 mg HER2/neu mRNA后，细胞用AMAXA NUCLEOFECTOR II装置(程序U015)脉冲，并且迅速转移到含有预温热的培养基的培养皿 中。在转染后24小时，DCs用作ELISPOT测定中的靶。使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra试剂盒(Ambion, Austin, TX)并且按照供应商的指导， 进行编码HER2/neu的mRNA的体外转录。
使用这种方法，当在疫苗中包含TEM8时，在对HER2/neu特异性的整体CD8+ T细胞中观察到3倍的增加，但是当小鼠在免疫过程中耗尽
CD4+T细胞时，没有完全失去这种增加。这些小鼠通过腹膜内(i.p.)注 射抗-CD4单克隆抗体而消耗CD4 T细胞，所述抗-CD4单克隆抗体由从 MSKCC单克隆抗体机构(MSKCC Monoclonal Antibody facility)获得的 杂交瘤克隆GK1.5生产。在第一次DNA免疫前的1天幵始，和在整个免 疫阶段的持续过程中，所述抗体施用一周一次(250mg/小鼠)。使用从这 些相同的小鼠获得的细胞，测量整体CD4+T细胞反应，并且在TEM8处 理的小鼠中在HER2/neu-特异性CD4+ T细胞的数目中存在中等增加(图 4E)。这些数据表明TEM8部分通过增加CD4+ T细胞反应而起作用，并 且这又增加CD8+T细胞。
突变的TEM8不具有佐剂活性
作为确定TEM8蛋白是否具有免疫佐剂的生物学活性的第一步，将野 生型TEM8与两种构建体(Opt-l和Opt-2)进行比较，所述构建体每种 具有9个氨基酸变化。将这些突变引入到MHC I锚定残基中，并且设计 成增加肽与H2-Kb和H2-Db的结合。然而，预计这些变化不会在FVB小 鼠中增加CD8T细胞免疫性。
当Opt-2分别与模型抗原hgp75(hTRYP-l)或HER2/neu联合用于 C57BL/6或FVB小鼠中时，Opt-2构建体不具有佐剂活性(图5A)。为了 确定关于降低的活性的原因，COS 7细胞用(FLAG-标记的)Opt-2或TEM8 DNA转染。简言之，获得FLAG-标记的TEM8或opt-2质粒，其将 TEM8/opto2序列克隆在pcDNA3.1/标记载体(FLAG vector)(Invitrogen)中 FLAG的下游(3')。
在6孔簇板中，使用fugene6 (罗氏)按照供应商的用法说明，用1 pg DNA转染COS-7细胞。Munocomycin从密苏里州St. Louis的西格玛获得。 细胞裂解物在12。/。二-tris丙烯酰胺凝胶上分离，转移到PVDF膜上，并且 使用与HRP直接缀合的抗-FLAG抗体(西格玛，St. Louis, MO)和ECL显色 试剂(皮尔斯(Pierce))检测FLAG-标记的蛋白。由于TEM8和Opt2蛋白 在转染到COS 7细胞中以及随后粘液菌素A处理的24小时后是稳定的(图5B)，推测降低的活性不可能是由于减小的蛋白稳定性引起的。
这些数据进一步支持TEM8蛋白作用为免疫佐剂并且Opt-2中的突变 使TEM8失活的假说。在Opt-2中的两种变化位于TEM8与另一种vWF 结构域蛋白共享的vWF结构域中的保守残基。
实施例17
TEM8在单核细胞/巨噬细胞和树突细胞中表达
上述数据支持由TEM8 DNA "疫苗"产生的TEM8蛋白不是特异性 免疫反应的靶而是作用为佐剂的可能性。由于现有报道已经表明巨噬细胞 和树突细胞是炭疽感染的靶，并且由于还已知这些细胞存在于肿瘤中，一 些方法已经用来检查TEM8在APCs中的表达。
先前表明表达TEM8的细胞在小鼠乳腺瘤和黑素瘤的基质中发现。使 用IHC，表达TEM8的细胞在Pten/p53条件性裸鼠中的自发前列腺肿瘤中 显现(图6)。蛋白质印迹已经证实了这种观察(未显示)。预测这些TEM8+
细胞中的至少一些是巨噬细胞。
TEM8最初描述为这样的转录体，其表达限于肿瘤内皮细胞，在成年 人组织中具有非常有限的表达。更近来，使用免疫组织化学和蛋白质印迹 分析，在正常小鼠组织中检测到TEM8蛋白(Bonuccdli等，2005)。本发 明表明TEM8 mRNA在乳腺瘤(233-VSGAl)和黑素瘤(B16F10)的基质中表 达，而对照"有义"探针没有显现出杂交信号(图7A-7H)。在蛋白质印 迹中证实在乳腺瘤和黑素瘤中表达的反应性蛋白的大小为80kDa(图71)。 这表明，在这些肿瘤中表达的主导蛋白是TEM8，并不是ATR或是sTEM8。 TEM8还表达在正常小鼠的肾脏中，而不表达在培养的233-VSGA1或 B16F10肿瘤细胞中。
本发明还表明在小鼠和人肿瘤基质内的TEM8阳性细胞具有单核细 胞-巨噬细胞种系特有的形态，并且与用泛-巨噬细胞标记CD68染色的细 胞共同定位在同处(图7J)。使用流式细胞术，观察到肿瘤内表达TEM8 的细胞是CDllb+和/或Grl+，确证这些细胞是骨髓来源的假说(图7K)。 令人感兴趣地，在首次用于实验的LN中的相同骨髓群体中表达很少至不 表达TEM8，这表明肿瘤促进TEM8在骨髓细胞中的表达，或者支持肿瘤基质中的丁￡]^8+细胞的补充/增殖。
令人吃惊地，发现，尽管Cdllc+细胞不在肿瘤中表达TEM8 (未显 示)，但是在肿瘤引流淋巴结(TDLN)中而不是在首次用于实验的淋巴 结中表达TEM8的细胞主要是CDllc+ B220+类浆细胞(plasmacytoid) 树突细胞(图7L)。体外培养来源于骨髓的DC也表达TEM8(图7M， 7N)。 简言之，本文所用的技术的流程如下
本发明检验人的6例前列腺瘤和9例乳腺瘤。所用的组织用福尔马林 固定并且用石蜡包埋。对于每种独立的情形，切成8mm厚的切片。将载 玻片在二甲苯中脱石蜡30分钟，使用梯度乙醇浓度再水合，并且在植物 蒸汽机中在柠檬酸缓冲液中在98。C汽蒸30分钟。在用过氧化氢酶猝灭5 分钟并且用抗生物素蛋白封闭生物素后，切片用在PBS缓冲液中的1: 200 稀释的多克隆抗-ATR/TEM8抗体(N 19， Santa Cmz生物技术)稀释液或1: 100稀释的抗人CD68 (DakoCytomation)抗体温育过夜。抗体结合的检测
使用生物素酰化的二级抗体和辣根过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白 (DakoCytomation)以及3',3'-二氨基-联苯胺作为色素原而获得。载玻片用苏 木精复染色。适当的阳性和阴性对照载玻片平行染色(图7J)。
对于在图7K中所述的结果，LNs和肿瘤从第10天的携带B16-基质 胶的小鼠中切下。将肿瘤和LN通过细胞滤器粉碎。另外，将肿瘤在Percoll 梯度上离心，以富集活细胞级分。肿瘤细胞用CDllbAPC，CDllbAPCCY7， TEM8 (+抗-兔PE二抗)和7AAD染色。在染色后，细胞对7AAD-(活) 细胞门控(gated)。
对于图7L所述的结果，LN细胞用CDllcAPC, B220Percp和TEM8(+ 抗-兔PE 二抗)或CD1 lb APC， CD1 lbAPCCY7和TEM8(+抗-兔PE 二抗) 染色。基于正向和侧分斷FSC-SSC)形态，在C中所示的分析在活细胞上 门控\。对于图7M所述的结果，DCs来源于C57B16小鼠股骨的骨髓，并 且用RPMI 10%FBS、 Gln、 PEN-STREP、 (3-巯基乙醇、30ng/ml GM-CSF 培养指定的天数。将含有10吗总蛋白的裂解物上样到10。/。二-tris丙烯酰 胺凝胶上，进行蛋白质印迹。对于在图7N中所述的结果，流式分析在 DAPI-活细胞上门控(显示CDllcAPC， TEM8+抗rabPE染色)。除了抗 -TEM8 (兔)购自亲和生物试剂(Affinitybioreagents)之外，用于流式细胞术的所有抗体都购自BD。
此外，还观察到在用多克隆激活剂脂多糖(LPS)刺激后，培养的
Dcs或巨噬细胞显著增加TEM8的表达(图70)。 LPS增加共同刺激标记 CD86的表面表达，并且诱导细胞因子IL-6和IL-12在DCs中的分泌。 TEM8的表达以与TNFa相同的动力学发生。
简言之，DC如前文所述来源于骨髓，并且将骨髓用RPMI7.5。/。FBS, Gin, PEN- STREP, 10ng/ml M-CSF培养而获得巨噬细胞。第10天的DC和 第5天的巨噬细胞用1 pg/ml LPS (西格玛)处理。在LPS刺激后24小时收 集巨噬细胞，DC在指定时刻收集。使用TRIZOL (invitrogen)按照供应商 的使用说明提取RNA。使用高能力cDNA archive试剂盒(High Capacity cDNA archive kit) (ABI)，将2叱RNA反转录。60 ng cDNA用作qPCR 反应的模板。
使用商购的TEM8， TNFa和18S特异性TAQman探针(应用生物系 统(Applied Biosystems))。反应使用标准混合物(ABI)和ABI 7500热循环仪 (ABI)进行。结果表示相对于相关的18S的表达，并且相对于未处理样品 在相同时刻的表达标准化的所指RNA的表达倍数增加。综合考虑，这些 实验表明TEM8可以是活化的抗原呈递细胞(APCs)的新标记，其对于 肿瘤免疫性和抗原呈递具有特别的相关性。
实施例18
当与编码HER2/neu或TYRPl/gp75的DNA疫苗组合时，TEM8 DNA增 强肿瘤免疫性
编码大鼠HER2/neu细胞外结构域的DNA疫苗在自发乳腺瘤发生转 基因小鼠模型中抑制肿瘤发生和生长(Amid等，1998, Esserman等，1999; Piechocki等，2001; Foy等，2001; Quaglino等，2004)，并且这种作用被细胞 因子增强(Chen等，1998; Pilon等，2001; Disis等，2003; Croci等，2004; Lin 等，2004; Spadaro等，2005)。当将HUVEC与大鼠HER2/neu DNA联合注 射时，还提高了对内源性乳腺瘤的保护作用(Venanzi等，2002)。
为了开发更容易转变为临床应用的分子定义的疫苗，确定将血管标记 结合到本发明的疫苗中而不是HUVEC细胞中。选择TEM8作为免疫靶点，并且全细胞HUVEC疫苗用编码TEM8细胞外结构域部分(aa 28- 279) 的cDNA取代。将具有活化的大鼠neu癌基因的乳房表达的雌性转基因 FVB/neuNT小鼠(品系233)每两周一次免疫三次(three times bi-weekly),免 疫使用肌内注射进行，并且然后用233-VSGA1肿瘤细胞攻击。出于统计 学原因选择这种模型，因为植入的肿瘤比内源性乳腺瘤生长更快更均匀。 此外，植入的肿瘤在活动物中更容易监测。作为单一试剂的HER2/neu疫 苗提供部分肿瘤保护(P-0.0002)，而单独的TEM8没有活性。
在用单独的ECD免疫的小鼠中，在肿瘤攻击后56天，50%是没有肿 瘤的，而编码TEM8和HER2/neu的DNA的共同注射在这种小鼠模型中 赋予完全的肿瘤保护作用；与单独的HER2/neu相比，这代表显著的提高 (P=0.06)(图8A)。在用不同的DNA递送方法即粒子轰击法免疫的亲本、 非转基因FVB/N小鼠中观察到非常相似的结果。代替肌内免疫所用的共 同注射时间表，采用每周一次的时间表。每周，在HER2/neu DNA注射前 3天，小鼠(15只/组)注射TEM8 DNA。在用单独的HER2/neu免疫的 小鼠中观察到对233-VSGAl肿瘤攻击的部分保护作用(15%)( =0.01)，而 单独的TEM8没有活性。并列施用HER2/neu和TEM8两种疫苗在60%的 小鼠中诱导长期(IOO天)的肿瘤保护作用(图8B)。由联合疫苗提供的 保护作用显著比在对照动物(PB/0.0001)中和在接受单独的TEM8 (P^.0001)或HER2/neu (P-0.01)的小鼠中观察到的保护作用更好。感兴趣 地，还观察到，用联合疫苗(TEM8 + HER2/neu)免疫的15只FVB/N小鼠 中有4只在它们完全排斥肿瘤之前多达50天表现出初始肿瘤生长(图 8C)。
为了研究与其它肿瘤Ag组合的TEM8 DNA注射是否还增加对其它 肿瘤类型的抗肿瘤免疫性，TEM8与编码黑素细胞分化Ag、异源(人) hTYRPl/hgp75的DAN疫苗组合。先前表明，异源黑素细胞分化Ag诱导 针对在小鼠黑素瘤B16F10中表达的对应小鼠Ag的交叉反应保护性免疫 性。例如，人TYRP-l/hgp75DNA提供对小鼠黑素瘤B16F10的部分保护 作用，所述DNA表达相关性接近的小鼠TYRP- (80%相同性和90%同源 性)(Naftzger等，1996; Bowne等，1999; Pcrales等，2002)。使用同前的每 周一次时间表，小鼠用单独的hTYRPl/hgp75或与TEM8 DNA联合免疫数周，并且用4—/104 B16F10黑素瘤细胞攻击。结果与使用HER2/neu系 统观察到的那些相似单独的TEM8 DNA对肿瘤生长没有作用，而单独 的hTYRPl/hgp75 DNA延迟肿瘤生长并且提供部分肿瘤保护作用(P二 0.1)。联合疫苗进一步将没有肿瘤的存活提高与在对照组中测量的水平显 著不同的水平(P二 0.002)。这在攻击后31天是明显的，那时单独的 hTYRPl/hgp75提供57%的没有肿瘤的存活，并且hTYRPl/hgp75和TEM8 的组合提供93%的没有肿瘤的存活(图9A)。
实施例19
针对TEM8 DNA的免疫反应
在尝试测量针对TEM8的免疫反应中，分析来自用单独的TEM8 DNA 或与HER2/neu DNA结合免疫的小鼠的血清的TEM8-特异性Ab。 TEM8 的细胞外结构域在细菌中过量表达，并且TEM8重组蛋白用作用来自每组 小鼠的血清集合显影的蛋白质印迹中的Ag来源。在用TEM8 DNA疫苗 或联合疫苗(TEM8+HER2/neu)免疫的小鼠中都没有检测到针对TEM8的 Ab反应性(图9B)。
进行了数个实验，以评估免疫小鼠中针对TEM8的T细胞反应。BM 细胞在GM-CSF和IL-4中培养7天。得到的不成熟DC用重组TEM8蛋 白脉冲2天，并且用作离体(ex-vivo) IFNg细胞内细胞因子测定的靶， 所述测定使用从用TEM8 DNA免疫的小鼠的DLN分离的细胞进行。没有 观察到特异性的识别。从一级TEM8序列合成肽，其具有与H2Kb或H2Db 的高预测结合。在来自用TEM8 DNA免疫的小鼠的CD8+ T细胞的离体 刺激后，在潜在的同源肽的存在下没有IFN-g释放。
此外，其中用重组TEM8蛋白刺激来自免疫的小鼠的脾细胞的增殖测 定也没有给出特异性识别的证据。因为TEM8在一些正常组织中表达，以 一周的时间间隔注射5次TEM8 DNA的小鼠进行了完全的尸检，以鉴定 任何自我免疫病理的区域。除了脾脏中较少的血浆细胞增生和轻度多病灶 窦组织细胞增生反应以及在C57BL/6小鼠中常见的胆囊透明变性之外， 在所检查的25个器官中没有报告显著的病理损伤。心、肝、肺、肾、脾、 子宫和皮肤都表现正常。实施例20
TEM8注射增加DC从皮肤到引流淋巴结的迁移
本发明检查上文所讨论的TEM8增强免疫反应的机制。为了做到此， 比较了在注射TEM8 DNA或空载体后的DC迁移。简言之，使用基因枪 对小鼠注射空载体或TEM8 DNA。在1 ， 3, 5或7天后的小鼠(在腹部剃 毛)用10 |_d含有3.3% FITC和5%DMSO的皮肤-致敏溶液(1:1丙酮邻 苯二甲酸二丁酯)处理。
在FITC染色后24小时，收集引流的LNs，并且处理如下以用于流 式细胞术首先，将组织在37X:在具有1 mg/ml胶原酶的PBS中温育1 小时。然后，将LNs通过细胞滤器粉碎，并且用PBS洗涤。将两百万个 细胞用CDllcAPC、 MHCIIpe、 CD3APCCY7、 CD19TexasRED染色。观 察到，在TEM8施用后第3天和第5天，与用空载体处理的小鼠相比较， 在DCs从皮肤到引流淋巴结的迁移百分数中存在显著增加(图10)。
为了进一步研究TEM8在抗原呈递和T细胞激活中的作用，设计几 种siRNAs，并且在瞬时转染后检测它们抑制TEM8 RNA的能力。简言之， 将NIH-3T3细胞接种在12孔板中，并且利用脂转染胺2000 (Invitrogen) 按照供应商的用法说明，用25 nM浓度的指定的siRNA进行转染。寡聚 物#1, #2, #3和CTR购自Sigma-proligo, #am购自ambion。 24小时后，将 细胞用胰蛋白酶消化，洗涤，并且按上述用Trizol(Iiwitrogen)提取RNA。 如上述制备cDNA，并且通过qPCR进行分析。在检测的3种siRNAs中， 两种将TEM8的表达减少至少5倍(图11 )。这些将用来在体外击倒APC 中的TEM8，并且检测APC的运动性，和抗原呈递。
为了在体内研究TEM8在APC成熟和功能中的作用，生成一系列 TEM8条件性裸鼠。耙载体产生如下通过PCR扩增TEM8基因组的3 个片段。这些是3 Kb侧连外显子2和3的"5'臂"，包括外显子2禾a 3的 4kb片段，和这些外显子下游的5Kb的"3'臂"。克隆并且测序每个片段， 然后如所示引入到所述靶载体中。使用安玛西亚Readyprime II标记试剂 盒用32P标记的探针X和Y用来在DNA印迹中检测TEM8基因。
因此，生成了在其中引入了侧连TEM8基因座的外显子2禾n 3的loxp位点的靶载体。当表达Cre重组酶时，在TEM8基因座中的外显子2和3 将被切除，打断蛋白的I-结构域以及阅读框(图12A-12B)。将这种载体 转染到ES细胞中，筛选菌落，以选择准确同源重组事件。在将所选择的 ES克隆引入到胚胎中后，将小鼠与其它品系杂交，在所述其它品系中， 在DCs、巨噬细胞或其它确定的细胞类型中表达CDR重组酶。
下述参考文献是本文引用的参考文献
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权利要求
1.一种组合物，所述组合物包括免疫原性序列或其片段；TEM8或其片段；药用载体；或它们的组合。
2. 权利要求l的组合物，其中所述免疫原性序列或其片段或者TEM8或其片段是重组蛋白或肽。
3. 权利要求2的组合物，其中所述重组蛋白或所述肽包括修饰的氨 基酸、未修饰的氨基酸或二者。
4. 权利要求l的组合物，其中所述TEM8或其片段具有SEQIDNO: 2或SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。
5. 权利要求1的组合物，其中编码所述免疫原性序列或其片段的核 苷酸序列以及编码所述TEM8或其片段的核苷酸序列插入到载体中。
6. 权利要求5的组合物，其中所述载体是质粒、病毒载体或细菌载
7. 权利要求4的组合物，其中所述编码所述TEM8或它的所述片段 的核苷酸序列包括至少60个核苷酸。
8. 权利要求4的组合物，其中所述编码所述TEM8或其片段的核苷 酸序列具有SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 3所示的序列。
9. 权利要求1的组合物，其中所述免疫原性序列或其片段是肿瘤相 关抗原或病原体相关抗原的免疫原性序列或其片段。
10. 权利要求9的组合物，其中所述肿瘤相关抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-l， PSMA， TRYP-2， NY-ESO-l, MAGE-1， MAGE-3， CEA, PSA, 酪氨酸酶，突变体p53,突变体p21，突变体cdk4,突变体L9， BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
11. 权利要求9的组合物，其中所述病原体相关的抗原是细菌脂多糖， 炭疽致死因子，炭疽水肿因子，HlVgpl20或疟疾抗原，其中所述疟疾抗 原是CSP, TRAP/SSP2, LSA1, MSP1和AMA陽1 。
12. 在受试者中引起增强的免疫反应的方法，所述方法包括下述步骤给所述受试者施用免疫学有效量的权利要求1的组合物。
13. 权利要求12的方法，其中在所述组合物中的TEM8或其片段增 加所述组合物中的免疫原性序列或其片段在受试者中引发针对与癌症相 关的抗原或针对与病原体相关的抗原的抗体反应、CD4T细胞反应、CD8 T细胞反应或它们的组合的能力。
14. 权利要求12的方法，其中所述与癌症相关的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-l， PSMA， TRYP-2， NY-ESO-l, MAGE-l, MAGE-3, CEA, PSA, 酪氨酸酶，突变体p53，突变体p21，突变体cdk4,突变体L9, BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
15. 权利要求12的方法，其中所述与病原体相关的抗原是细菌脂多 糖，炭疽致死因子，炭疽水肿因子，HlVpgl20或疟疾抗原，其中所述疟 疾抗原是CSP, TRAP/SSP2, LSA1, MSP1和AMA-1 。
16. 权利要求12的方法，其中所述受试者患有乳腺癌、前列腺癌、 黑素瘤、结肠癌、慢性髓性白血病或宫颈癌，或者己经暴露于或怀疑暴露 于疟疾、炭疽、HIV或生物武器。
17. —种组合物，所述组合物包括免疫原性序列或其片段；与TEM8的氨基酸序列或其片段具有至少90%同源性的氨基酸序列；药用载体； 或它们的组合。
18. 权利要求17的组合物，其中所述TEM8或其片段的氨基酸序列 具有SEQ IDNO:2或SEQ IDNO:4所示的序列。
19. 权利要求17的组合物，其中所述免疫原性序列或其片段以及与 TEM8或其片段同源的序列是重组蛋白或肽。
20. 权利要求19的组合物，其中所述重组蛋白或所述肽包括修饰的 氨基酸、未修饰的氨基酸或二者。
21. 权利要求17的组合物，其中编码所述免疫原性序列或其片段以及与TEM8或其片段同源的所述序列的核苷酸序列插入到载体中。
22. 权利要求21的组合物，其中所述载体是质粒、病毒载体或细菌 载体。
23. 权利要求21的组合物，其中编码所述与TEM8或它的所述片段 同源的所述序列的核苷酸序列包括至少60个核苷酸。
24. 权利要求21的组合物，其中编码TEM8或其片段的核苷酸序列 具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3所示的序列。
25. 权利要求17的组合物，其中所述免疫原性序列或其片段是肿瘤 相关的抗原或病原体相关的抗原的免疫原性序列或其片段。
26. 权利要求25的组合物，其中所述肿瘤相关的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-l， PSMA， TRYP-2, NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3， CEA, PSA， 酪氨酸酶，突变体p53,突变体p21,突变体cdk4,突变体L9， BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
27. 权利要求25的组合物，其中所述病原体相关的抗原是细菌脂多 糖，炭疽致死因子，炭疽水肿因子，HlVgpl20或疟疾抗原，其中所述疟 疾抗原是CSP, TRAP/SSP2, LSA1， MSP1和AMA画1 。
28.在受试者中引起增强的免疫反应的方法，所述方法包括下述步骤给所述受试者施用免疫学有效量的权利要求17的组合物。
29. 权利要求28的方法，其中在所述组合物中的与TEM8或其片段 同源的序列增加所述组合物中的免疫原性序列或其片段在受试者中引发 针对与癌症相关的抗原或针对与病原体相关的抗原的抗体反应、CD4 T细 胞反应、CD8T细胞反应或它们的组合的能力。
30. 权利要求29的方法，其中所述与癌症相关的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-1 ， PSMA ， TRYP画2， NY陽ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, CEA, PSA， 酪氨酸酶，突变体p53,突变体p21,突变体cdk4，突变体L9, BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
31. 权利要求29的方法，其中所述与病原体相关的抗原是细菌脂多 糖，炭疽致死因子，炭疽水肿因子，HlVgpl20或疟疾抗原，其中所述疟 疾抗原是CSP, TRAP/SSP2, LSA1, MSP1和AMA-1 。
32. 权利要求28的方法，其中所述受试者患有乳腺癌、前列腺癌、 黑素瘤、结肠癌、慢性髓性白血病或宫颈癌，或者己经暴露于或怀疑暴露 于疟疾、炭疽、HIV或生物武器。
33. —种组合物，所述组合物包括 免疫原性序列或其片段；与TEM8或其片段的序列具有至少80%同源性的氨基酸序列； 药用载体，-或它们的组合。
34. 权利要求33的组合物，其中所述TEM8或其片段的氨基酸序列 具有SEQ ID NO: 2或SEQ IDNO:4所示的序列。
35. 权利要求33的组合物，其中所述免疫原性序列或其片段以及与 TEM8或其片段同源的序列是重组蛋白或肽。
36. 权利要求35的组合物，其中所述重组蛋白或所述肽包括修饰的 氨基酸、未修饰的氨基酸或二者。
37. 权利要求33的组合物，其中将编码所述免疫原性序列或其片段 的核苷酸序列以及编码与TEM8或其片段同源的所述序列的核苷酸序列 插入到载体中。
38. 权利要求37的组合物，其中所述载体是质粒、病毒载体或细菌 载体。
39. 权利要求37的组合物，其中编码所述与TEM8或它的所述片段 同源的所述序列的核苷酸序列包括至少60个核苷酸。
40. 权利要求37的组合物，其中编码TEM8或其片段的核苷酸序列 具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3所示的序列。
41. 权利要求33的组合物，其中所述免疫原性序列或其片段是肿瘤 相关的抗原或病原体相关的抗原的免疫原性序列或其片段。
42. 权利要求41的组合物，其中所述肿瘤相关的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP陽l， PSMA， TRYP-2, NY-ESO-l, MAGE-1， MAGE-3, CEA, PSA, 酪氨酸酶，突变体p53,突变体p21,突变体cdk4,突变体L9, BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
43. 权利要求41的组合物，其中所述病原体相关的抗原是细菌脂多糖，炭疽致死因子，炭疽水肿因子，HlVgpl20或疟疾抗原，其中所述疟 疾抗原是CSP, TRAP/SSP2， LSA1， MSP1和AMA-1 。
44. 在受试者中引起增强的免疫反应的方法，所述方法包括下述步骤给所述受试者施用免疫学有效量的权利要求33的组合物。
45. 权利要求44的方法，其中在所述组合物中的与TEM8或其片段 同源的序列增加所述组合物中的免疫原性序列或其片段在受试者中引发 针对与癌症相关的抗原或针对与病原体相关的抗原的抗体反应、CD4T细 胞反应、CD8T细胞反应或它们的组合的能力。
46. 权利要求45的方法，其中所述与癌症相关的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-l, PSMA, TRYP-2, NY-ESO-l， MAGE-l, MAGE画3， CEA, PSA, 酪氨酸酶，突变体p53,突变体p21,突变体cdk4,突变体L9, BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
47. 权利要求45的方法，其中所述与病原体相关的抗原是细菌脂多 糖，炭疽致死因子，炭疽水肿因子，HlVgpl20或疟疾抗原，其中所述疟 疾抗原是CSP, TRAP/SSP2, LSA1, MSP1和AMA陽1 。
48. 权利要求44的方法，其中所述受试者患有乳腺癌、前列腺癌、 黑素瘤、结肠癌、慢性髓性白血病或宫颈癌，或者已经暴露于或怀疑暴露 于疟疾、炭疽、HIV或生物武器。
49. 一种组合物，所述组合物包括 TEM8或其片段以及药用载体。
50. 权利要求49的组合物，其中所述TEM8或其片段是重组蛋白或
51. 权利要求50的组合物，其中所述重组蛋白或所述肽包括修饰的 氨基酸、未修饰的氨基酸或二者。
52. 权利要求49的组合物，其中所述TEM8或其片段具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列
53. 权利要求49的组合物，其中将编码所述TEM8或其片段的核苷酸序列插入到载体中。
54. 权利要求53的组合物，其中所述载体是质粒、病毒载体或细菌载体。
55. 权利要求53的组合物，其中所述编码所述TEM8或它的所述片 段的核苷酸序列包括至少60个核苷酸。
56. 权利要求53的组合物，其中编码所述TEM8或其片段的核苷酸 序列具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3所示的序列。
57. 增加免疫原性组合物在受试者中引发免疫反应的能力的方法，所 述方法包括下述步骤给所述受试者施用免疫学有效量的权利要求49的组合物。
58. 权利要求57的方法，所述方法还包括.-给所述受试者施用免疫原性序列或其片段。
59. 权利要求58的方法，其中所述免疫原性序列或其片段在施用包 括所述TEM8或其片段的组合物之前、同时或之后施用。
60. 权利要求58的方法，其中所述免疫原性序列或其片段是肿瘤相 关的抗原或病原体相关的抗原的免疫原性序列或其片段。
61. 权利要求60的方法，其中所述肿瘤相关的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-l， PSMA， TRYP-2, NY-ESO-1, MAGE-l, MAGE-3， CEA, PSA， 酪氨酸酶，突变体p53,突变体p21,突变体cdk4,突变体L9, BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
62. 权利要求60的方法，其中所述病原体相关的抗原是细菌脂多糖， 炭疽致死因子，炭疽水肿因子，HlVgpl20或疟疾抗原，其中所述疟疾抗 原是CSP, TRAP/SSP2， LSA1， MSP1和AMA-1 。
63. 权利要求57的方法，其中所述免疫反应包括抗体反应、CD4 T 细胞反应、CD8T细胞反应或它们的组合。
64. 权利要求57的方法，其中所述受试者患有乳腺癌、前列腺癌、 黑素瘤、结肠癌、慢性髓性白血病或宫颈癌，或者已经暴露于或怀疑暴露 于疟疾、炭疽、HIV或生物武器。
65. —种组合物，所述组合物包括与TEM8或其片段的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸 序列以及药用载体。
66. 权利要求65的组合物，其中TEM8或其片段的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示的序列。
67.权利要求65的组合物，其中与TEM8或其片段同源的序列是重 组蛋白或肽。
68. 权利要求67的组合物，其中所述重组蛋白或所述肽包括修饰的 氨基酸、未修饰的氨基酸或二者。
69. 权利要求65的组合物，其中将编码所述与TEM8或其片段同源 的序列的核苷酸序列插入到载体中。
70. 权利要求69的组合物，其中所述载体是质粒、病毒载体或细菌 载体。
71. 权利要求68的组合物，其中编码所述与TEM8或它的所述片段 同源的序列的核苷酸序列包括至少60个核苷酸。
72. 权利要求68的组合物，其中编码所述TEM8或其片段的核苷酸 序列具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3所示的序列。
73. 增加免疫原性组合物在受试者引发免疫反应的能力的方法，所述 方法包括下述步骤给所述受试者施用免疫学有效量的权利要求65的组合物。
74. 权利要求73的方法，所述方法还包括 给所述受试者施用免疫原性序列或其片段。
75. 权利要求74的方法，其中所述免疫原性序列或其片段在施用包 括与TEM8或其片段同源的序列的组合物之前、同时或之后施用。
76. 权利要求74的方法，其中所述免疫原性序列或其片段是肿瘤相关的抗原或病原体相关的抗原的免疫原性序列或其片段。
77. 权利要求76的方法，其中所述肿瘤相关的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP-1, PSMA ， TRYP-2， NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, CEA, PSA， 酪氨酸酶，突变体p53,突变体p21,突变体cdk4，突变体L9， BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
78. 权利要求76的方法，其中所述病原体相关的抗原是炭疽致死因 子，炭疽水肿因子，HIV gpl20或疟疾抗原，其中所述疟疾抗原是CSP， TRAP/SSP2， LSA1， MSP1禾卩AMA-1 。
79. 权利要求73的方法，其中所述免疫反应包括抗体反应、CD4 T细胞反应、CD8T细胞反应或它们的组合。
80. 权利要求73的方法，其中所述受试者患有乳腺癌、前列腺癌、 黑素瘤、结肠癌、慢性髓性白血病或宫颈癌，或者已经暴露于或怀疑暴露 于疟疾、炭疽、HIV或生物武器。
81. —种组合物，所述组合物包括与TEM8或其片段的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列以及 药用载体。
82. 权利要求81的组合物，其中TEM8或其片段的氨基酸序列具有 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所示的序列。
83. 权利要求81的组合物，其中与TEM8或其片段同源的序列是重 组蛋白或肽。
84. 权利要求83的组合物，其中所述重组蛋白或所述肽包括修饰的 氨基酸、未修饰的氨基酸或二者。
85. 权利要求81的组合物，其中将编码所述与TEM8或其片段同源 的序列的核苷酸序列插入到载体中。
86. 权利要求85的组合物，其中所述载体是质粒、病毒载体或细菌 载体。
87. 权利要求85的组合物，其中编码所述与TEM8或它的所述片段 同源的序列的核苷酸序列包括至少60个核苷酸。
88. 权利要求85的组合物，其中编码所述TEM8或其片段的核苷酸 序列具有SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 3所示的序列。
89. 增加免疫原性组合物在受试者中引发免疫反应的能力的方法，所 述方法包括下述步骤给所述受试者施用免疫学有效量的权利要求81的组合物。
90. 权利要求89的方法，所述方法还包括 给所述受试者施用免疫原性序列或其片段。
91. 权利要求90的方法，其中所述免疫原性序列或其片段在施用包 括与TEM8或其片段同源的序列的组合物之前、同时或之后施用。
92. 权利要求90的方法，其中所述免疫原性序列或其片段是肿瘤相 关的抗原或病原体相关的抗原的免疫原性序列或其片段。
93. 权利要求92的方法，其中所述肿瘤相关的抗原是Her2/NEU, gp75/TYRP匿l， PSMA， TRYP-2, NY-ESO-l, MAGE-l, MAGE-3, CEA, PSA， 酪氨酸酶，突变体p53,突变体p21，突变体cdk4，突变体L9, BCR-ABL 或HPV16的E6/E7。
94. 权利要求92的方法，其中所述病原体相关的抗原是细菌脂多糖， 炭疽致死因子，炭疽水肿因子，HlVgpl20或疟疾抗原，其中所述疟疾抗 原是CSP, TRAP/SSP2， LSA1, MSP1和AMA-1 。
95. 权利要求89的方法，其中所述免疫反应包括抗体反应、CD4 T 细胞反应、CD8T细胞反应或它们的组合。
96. 权利要求89的方法，其中所述受试者患有乳腺癌、前列腺癌、 黑素瘤、结肠癌、慢性髓性白血病或宫颈癌，或者已经暴露于或怀疑暴露 于疟疾、炭疽、HIV或生物武器。
全文摘要
本发明公开了一种包括免疫原性序列或其片段和TEM8或其片段的组合物，其中所述TEM8或其片段作用为佐剂，并且增强由所述免疫原性序列或其片段介导的免疫反应的激发。本发明还公开了这样的组合物在治疗癌症或病原体相关的疾病中的应用。
文档编号C07K14/00GK101595123SQ200780019126
公开日2009年12月2日 申请日期2007年3月23日 优先权日2006年3月23日
发明者波莉·格雷戈尔, 艾伦·休顿 申请人:斯隆-凯特琳癌症研究院