包含fyn激酶的修饰的sh3结构域的特异性的且高亲和力的结合蛋白的制作方法

专利名称：：包含fyn激酶的修饰的sh3结构域的特异性的且高亲和力的结合蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明涉及包含FYN激酶的Src同源性3结构域(SH3)的至少一种衍生物的重组结合蛋白，其中在src环中或位于src环附近最高达2个氨基酸的至少一个氨基酸和/或在RT环中或位于RT环附近最高达2个氨基酸的至少一个氨基酸被置换、缺失或添加。此外，本发明涉及融合蛋白，其包含与药学上和/或诊断上的活性组分融合的根据本发明的结合蛋白。另外，本发明涉及编码这些结合蛋白和/或融合蛋白的核苷酸以及对应的载体和宿主细胞。最后、但不是最少，本发明涉及本发明的结合蛋白和/或融合蛋白用于制备药物或诊断工具的用途，以及包含所述结合蛋白和/或融合蛋白的药物或诊断组合物。
背景技术：
：特异性的且高亲和力的粘合剂是生物和医学研究必不可少的工具，且也具有用于医学诊断、预防和治疗的效用。目前，单克隆抗体是可以就与事实上任意靶的高亲和力和特异性快速分离的主要结合分子种类。但是，免疫球蛋白具有主要基于它们的一般生物物理学性质和它们的相当复杂的分子结构的限制。因此，在二十世纪九十年代几个研究组已经采用小球形蛋白作为抗体的替代品。该概念的要旨是，通用结合位点从抗体结构转移到替代蛋白构架，即所谓的支架。到目前为止已经描述了超过40种支架，其中有2种SH3结构域，即Abl和Src激酶的SH3结构域(参见Binz等人，NatureBiotechnology,Vol.23,No.10,1257-1268,2005)。在许多参与细胞内信号传导和细胞骨架组构的不同蛋白中发现了SH3结构域(Cohen等人，"Modularbindingdomainsinsignaltransductionproteins."Cell80(2):237-48,1995)。尽管它们的一级结构存在可变性，但这些SH3结构域共有非常类似的总体结构和结合共有作为天然SH3结合的关键决定子的最小共有序列PxxP的蛋白的模式。SH3结构域的重要功能是参与高选择性的蛋白-蛋白相互作用。Erpel等人("MutationalanalysisoftheSrcSH3domain:thesameresiduesoftheligandbindingsurfaceareimportantforintra-andintermolecularinteractions."EmboJ.14(5):963-75,1995)研究了SrcSH3结构域的RT和n-Src环中突变的影响，并证实邻近疏水表面的2个环中的突变会影响该结构域参与分子间和分子内结合的能力。Hiipakka等人("SH3domainswithhighaffinityandengineeredligandspecificitiestargetedtoHIV-1Nef."J,Mol.Biol.293(5):1097-106,1999)研究了HckSH3结构域的RT-环起通用的特异性和亲和力决定子作用的能力。这些作者构建了Hck结构域的噬菌体文库，其中随机化RT-环的6个氨基酸(称作RRT-SH3)。使用该策略，他们鉴别出可以为Hck-Sh3的最高达40倍地结合HIV-1Nef的个别RRT-SH3结构域。这些作者指出RT环在SH3配体选择中的重要性作为生成具有所需的结合性质的SH3结构域的一般策略。Lee等人("AsingleaminoacidintheSH3domainofHckdeterminesitshighaffinityandspecificityinbindingtoHIV画lNefprotein."Embo.丄14(20):5006-15,1995)研究了对HIV-1Nef蛋白的Hck的不同SH3结合亲和力和特异性的结构基础，且能通过FynSH3结构域的RT环中的单突变(R96I)将HckSH3对Nef的结合性质转移至FynSH3结构域。Hosse等人("Anewgenerationofproteindisplayscaffoldsformolecularrecognition",ProteinScience,15:14-27,2006)特别解决了对适合治疗应用的结合蛋白的需求。作者注意到治疗上有用的结合蛋白的一些特征(例如血清稳定性，组织穿透，血液清除率，耙滞留和免疫应答)的重要性。在后一方面，指出应当与它们的人配对物尽可能相似地制备非人治疗蛋白，且人支架可能从开始就是更低免疫原性的。这些作者的结论是"但是，甚至完全的人支架也不能保证蛋白不引起人免疫应答，特别是如果它是细胞内蛋白。在文库构建过程中氨基酸的随机化可以潜在地导入新的T-细胞表位。甚至单点突变也可以使人蛋白是免疫原性的。此外，大多数人支架造成一些自身免疫应答。"现今，Abl和Hck激酶的SH3结构域被公认为生成具有建议的特异性的蛋白结合剂的蛋白支架，尽管到目前为止仅已鉴别出与已知配体如Nef蛋白或合成肽的结合剂(参见上面Binz等人)。Fyn激酶的SH3结构域(FynSH3)包含63个残基(Semba等人("yes-relatedprotooncogene,syn,belongstotheprotein-tyrosinekinasefamily."Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(15):5459-63,1986)和Kawakami等人("Isolationandoncogenicpotentialofanovelhumansrc-likegene."MolCellBiol.6(12):4195-201,1986)报道的序列的氨基酸83-145)。Fyn是酪氨酸激酶Src家族的59kDa成员。作为可变剪接的结果，Fyn蛋白存在两种差异在于它们的激酶结构域的不同同工型；一种形式在胸腺细胞、脾细胞和一些血淋巴(hematolymphoid)细胞系中发现，而第二种形式主要在脑中积累(Cooke和Perlmutter,"ExpressionofanovelformoftheFynproto-oncogeneinhematopoieticcells."NewBiol.1(1):66-74,1989)。Fyn的生物学功能是多样的，且包括通过T细胞受体的信号传导，脑功能的调节以及粘连介导的信号传导(Resh,M.D."Fyn,aSrcfamilytyrosinekinase."Int.J.Biochem.CellBiol.30(11):1159-62,1998)。它是细胞内蛋白。SEQIDNO:1显示了FynSH3序列(Kawakami等人和Semba等人在1986报道的Fyn激酶的氨基酸83-145，参见上面)GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEKFQILNSSEGD丽EARSITTGFTGYIPSMYVAPVDSIQ(SEQIDNO:1)RT-Src和n-Src环的序列分别标有下划线和双下划线。FynSH3的氨基酸序列在人、小鼠、大鼠和猴(长臂猿)中是完全保守的。与对应的人结构域相比，鸡FynSH3相差一个，非洲爪蟾(A"eo/my/aev&)之一相差2个氨基酸位置。正如其他SH3结构域，FynSH3由2个反向平行的(3-折叠组成，且含有2个柔性环(称作RT-Src和n-Src-环)，以与其它蛋白相互作用。总之，现有技术教导蛋白构架(即所谓的支架)作为确立的抗体结构的替代物。Src同源性3结构域(SH3)是这些约40个或更多个支架之一。在许多不同的SH3结构域(在人基因组中约300个，且到目前为止描述了自然界中的几千个)中，FynSH3是一个，它以前已使用过一次以总体上解释SH3结合特异性和亲和力。技术人员也知道，细胞内蛋白特别倾向于生成免疫应答，且因此通常对于体内应用(如治疗和诊断)的有用性更低或甚至无用。本发明的目的是提供适合用作研究试剂、且具体地用作诊断和医学试剂的改良的耙特异性的且高亲和力的结合蛋白。此外，这些结合蛋白应当在生理条件下是稳定的和可溶的，在接受它们的人中引起很少的或不引起免疫效应，并提供大靶结构也易接近的结合结构，即没有被位阻掩蔽。
发明内容令人惊讶地发现，Src家族的Fyn激酶的SH3结构域为设计对选才奪的靶具有特异性和高亲和力的重组结合结构域提供了优良性质。具体地，发现通过突变RT环和/或src环，从而导致更高的可变性和对许多靶的提高的结合性质，可以设计靶特异性。此外，意外地发现，不仅天然的FynSH3结合蛋白、而且突变的FynSH3-衍生的结合蛋白在体内都不是免疫原性的。因此，重组突变FynSH3结合蛋白特别适用于开发非免疫原性的蛋白治疗剂和/或诊断剂。作为上述内容的结果，本发明的第一方面涉及包含Fyn激酶的Src同源性3结构域(SH3)的至少一种衍生物的重组结合蛋白，其中(a)在src环中或位于src环附近最高达2个氨基酸的至少一个氨基酸，和/或(b)在RT环中或位于RT环附近最高达2个氨基酸的至少一个氨基酸被置换、缺失或添加，其中所述SH3结构域衍生物的氨基酸序列与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70、优选至少80、更优选至少90和最优选至少95%序列同一性，优选地条件是，该重组结合蛋白不包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且优选地，该重组蛋白不是在自然界中存在的含有天然SH3结构域的蛋白。下面提供了SEQIDNO:2的氨基酸序列(Lee等人的FynSH3变体R961,参见上面)。GVTLFVALYDYEAITEDDLSFHKGEKFQILNSSEGD丽EARSLTTGETGYIPSNWAPVDSIQ(SEQIDNO:2)在本发明的上下文中，Fyn激酶的RT环(有时也称作RT-Src-环)由位于SEQIDNO:1中的位置12至17的氨基酸EARTED组成。在RT环中或在RT环附近的要置换、缺失和/或添加的，即要突变的位置是氨基酸10至19、优选11至18、更优选12至17。在本发明的上下文中，FYN激酶的src环(有时也称作n-Src-环)由位于SEQIDNO:1中的位置31至34的氨基酸NSSE组成。在src环中或在src环附近的要置换、缺失和/或添加的，即要突变的位置是氨基酸29至36、优选30至35、更优选31至34。本发明的重组蛋白优选不是在自然界中存在的或从自然界分离的含有天然SH3结构域的蛋白。换而言之，本发明的范围优选排除含有野生型SH3结构域的蛋白。在自然界中存在丰富的含有SH3结构域的蛋白。这些天然SH3蛋白对它们的天然配体具有结合亲和力。大部分(如果不是所有的话)这些天然SH3配体都具有PxxP基序。但是，本发明的重组蛋白是设计成对非天然靶具有亲和力的工程化蛋白，即非天然輩巴作为任意靶，例如在自然界中，优选在哺乳动物，更优选在人类中，排除天然(野生型)SH3配体。更优选地，本发明的重组蛋白对任意天然SH3结合配体、最优选对具有PxxP基序的任意天然SH3结合配体基本上不具有结合亲和力。优选地，要加入一个和/或两个环中的氨基酸的数目是1至20个、更优选1至10个或1至5个氨基酸，且最优选向环中不加入氨基酸。在另一个优选的实施方案中，位于RT和src环外的SH3结构域衍生物部分尽可能多地保守，以不引入免疫原性的基序。优选地，本发明的重组蛋白在哺乳动物中、优选在小鼠、大鼠和/或人中、最优选在人中基本上不引起免疫原性反应。当然，本发明的完整重组蛋白的免疫原性不仅依赖于SH3结构域衍生物部分，而且受完整蛋白的其它部分的影响。在本发明的优选的实施方案中，至少重组蛋白的SH3结构域衍生物部分在哺乳动物中、优选在小鼠、大鼠和/或人中、最优选在人中基本上是非免疫原性的。例如，本领域技术人员可以通过标准的和常规的技术测定重组蛋白或它的SH3结构域衍生物部分的免疫原性反应，例如通过给哺乳动物例如小鼠施用(例如静脉内(i.v.)注射)目标重组蛋白或它的SH3结构域衍生(例如白细胞介素)的响应。在更优选的实施方案中，根据本发明的结合蛋白是这样的，其中所述SH3结构域衍生物在src和RT环外与FYN激酶的Src同源性3结构域(SH3)具有至少70或至少85、优选至少90、更优选至少95、最优选至少98至100%同一性。在优选的实施方案中，将突变引入RT和src环中。在另一个更优选的实施方案中，本发明的结合蛋白包含在SH3结构域衍生物的位置37和/或50的一个或优选两个改变的残基、优选两个疏水的改变的残基、更优选Trp37和/或Tyr50,Trp37和Tyr50是最优选的。如下面图3b所证实的，它们的随^/L化可以增加亲和力。本文使用的术语"FYN激酶的Src同源性3结构域(SH3)的衍生物"意在包括与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70、优选至少80、更优选至少90和最优选至少95%序列同一性的氨基酸序列。相同的含义适用于在src和RT环外与FYN激酶的Src同源性3结构域(SH3)具有至少70或至少85、优选至少90、更优选至少95、最优选至少98%同一性的SH3结构域衍生物，例外是，当测定序列同一性时，排除形成所述环的氨基酸。为了测定FynSH3结构域的衍生物与SEQIDNO:1的氨基酸序列的序列同一性程度，可以采用例如SIM局部相似性程序(XiaoquinHuang和WebbMiller,"ATime-Efficient,Linear-SpaceLocalSimilarityAlgorithm."AdvancesinAppliedMathematics,vol.12:337-357,1991.),它可以从作者和他们的研究所自由得到(也参见环球网http:〃www.expasy.org/tools/sim-prothtml);对于多重比对分析，可以使用ClustalW(Thompson等人，，，CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequence,weighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.",NucleicAcidsRes.,22(22):4673—4680,1994.)。优选地，相对于SEQIDNO:1的完整序列，测定衍生物与SEQIDNO:l的序列同一性程度。在优选的实施方案中，本发明的结合蛋白包含FynSH3结构域的至少两种衍生物。更优选地，它是二价结合蛋白。SH3结构域的至少两种衍生物可以相同或不同。优选地，它们是相同的。本发明的结合蛋白可以设计成对给定靶具有任意特定的结合亲和力。在优选的实施方案中，所述靶是基于氨基酸的靶例如肽或蛋白、更优选包含PxxP基序的。当然，仅少数天然的和生理上有关的耙蛋白含有PxxP基序。下面的实施例证实，可以得到对于具有除了PxxP以外的基序的靶(例如纤连蛋白的ED-B结构域)的根据本发明的结合蛋白。因此，本发明的结合蛋白绝不限于PxxP基序，且可以对任意给定的耙(例如糖、多肽等)具有特定的结合亲和力。更优选地，根据本发明的结合蛋白对耙具有10_7至10-12M、优选10—8至10"M的特定的结合亲和力，优选治疗上和/或诊断上有关的耙、更优选包含PxxP基序的基于氨基酸的耙。在最优选的方面，根据本发明的结合蛋白对癌胚纤连蛋白的胞外域(ED-B)具有10-7至10"M、优选10—8至10"M的特定的(体内和/或体外)结合亲和力。在优选的实施方案中，本发明涉及重组结合蛋白，其包含FYN激酶的Src同源性3结构域(SH3)的至少一种衍生物，其中(a)在src环中或位于src环附近最高达2个氨基酸的至少一个氨基酸，和/或(b)在RT环中或位于RT环附近最高达2个氨基酸的至少一个氨基酸被置换、缺失或添加，其中SH3结构域衍生物的氨基酸序列与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70、优选至少80、更优选至少90和最优选至少95%序列同一性，优选地条件是，该重组结合蛋白不包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，且优选地条件是，所述重组蛋白不是在自然界中存在的含有天然SH3结构域的蛋白，其中所述结合蛋白对癌胚纤连蛋白的胞外域(ED-B)具有优选10—7至10"至10"M的特定的(体内和/或体外)结合亲和力。在更优选的实施方案中，所述SH3结构域衍生物在src和RT环外与FYN激酶的Src同源性3结构域(SH3)具有至少85、优选至少卯、更优选至少95、最优选至少98至100%同一性。在另一个更优选的实施方案中，上面的ED-B-特异性的结合蛋白包含SH3结构域的至少两种衍生物，优选它是二价结合蛋白。优选地，所述ED-B-特异性的结合蛋白具有一个或多个、优选2个在SH3结构域衍生物的位置37和/或50处的改变的、优选疏水的残基，尤其Trp37和/或Tyr50,Trp37和Tyr50是最优选的。次于对多肽和蛋白靶的特定的结合亲和力，本发明的结合蛋白也可以对小的有机的或非基于氨基酸的化合物(例如糖、寡糖或多糖、脂肪酸等)具有特定的结合亲和力。已经研究了许多抗体-细胞因子融合蛋白用于例如关节炎或癌症治疗中的应用，经常具有令人印象深刻的结果。例如，对纤连蛋白的ED-B结构域(血管发生的标记)特异性的人抗体L19已经用于向实体瘤递送促炎细胞因子(例如IL-2、IL-12或TNF),有时具有显著的治疗益处[关于综述和对应的参考文献，参见Neri&Bicknell,Nat.Rev.Cancer(2005)5:436國446,和WO01/62298]。本发明的结合蛋白现在允许替换在现有技术融合蛋白中的抗体，和设计用于体内和体外药物和诊断应用的新的和更低免疫原性的融合蛋白。在第二方面，本发明涉及融合蛋白，其包含与药学上和/或诊断上的活性组分相融合的本发明的结合蛋白。本发明的融合蛋白可以包含非多肽组分，例如非肽接头，非肽配体，例如用于治疗上或诊断上有关的放射性核素。优选地，所述活性组分是细胞因子、优选选自下述的细胞因子IL-2、IL-12、TNF-a、IFNa、IFN卩、IFN丫、IL-IO、IL-15、IL-24、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-ll、IL-13、LIF、CD80、B70、TNF卩、LT-卩、CD-40配体、Fas-配体、TGF-卩、IL-la和IL-lp。更优选地，所迷活性组分是毒性化合物，优选小有机化合物或多肽，优选选自下述的毒性化合物加利车霉素、新抑癌蛋白、埃斯波霉素(esperamicin)、达内霉素(dynemicin)、可达菌素(kedarcidin)、12maduropeptin、阿霉素、柔红霉素、auristatin、蓖麻毒蛋白-A链、蒴莲根毒素、截短的假单胞菌外毒素A、白喉毒素和重组多花白树毒蛋白。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的融合蛋白是这样的，其中所述活性组分是趋化因子、优选选自下述的趋化因子IL-8、GROa、GRO卩、GROy、ENA-78、LDGF-PBP、GCP-2、PF4、Mig、IP画IO、SDF國la/卩、BUNZO/STRC33、I-TAC、BLC/BCA-1、MIP-la、MIP-1卩、MDC、TECK、TARC、RANTES、HCC-1、HCC-4、DC-CK1、MIP-3a、MIP陽3卩、MCP-l-5、嗜伊红粒细胞趋化蛋白、嗜^尹红粒细胞趋化蛋白-2、1-309、MPIF-1、6Ckine、CTACK、MEC、淋巴细胞趋化蛋白和CX3C趋化因子(Fmctalkine)。在进一步优选的实施方案中，根据本发明的结合蛋白含有人工氨基酸。在本发明的融合蛋白的进一步优选的实施方案中，所述活性组分是荧光染料、优选选自下述的组分AlexaFluor或Cy染料(Berlier等人，"QuantitativeComparisonofLong-wavelengthAlexaFluorDyestoCyDyes:FluorescenceoftheDyesandTheirBioconjugates",JHistochemCytochem.51(12):1699-1712,2003.);光敏剂，优选双(三乙醇胺)Sn(IV)二氢卟酚e6(SnChe6);促凝血因子，优选组织因子；前体药物激活酶，优选选自羧肽酶、葡糖酪酸糖苷酶和葡糖苦酶的酶；来自？辐射同位素的放射性核素，优选99mTc、123I、mIn,或来自阳电子发射体的放射性核素，优选"F、64Cu、68Ga、86Y、124I,或来自|3-发射体的放射性核素，优选1311、9QY、177Lu、67Cu,或来自oi-发射体的放射性核素，优选^Bi、211At;和/或功能性Fc结构域，优选人功能性Fc结构域。上述功能性Fc结构域将允许指导哺乳动物对融合蛋白的结合蛋白组分的特异性耙结合位点的免疫应答，例如在治疗、预防和/或诊断应用中。另一个优选的实施方案涉及如上所迷的根据本发明的融合蛋白，其另外包含调节血清半衰期的组分，优选选自聚乙二醇(PEG)、免疫球蛋白和清蛋白结合肽的组分。在最优选的实施方案中，如上所述的本发明的融合蛋白包含与癌胚纤连蛋白的外结构域(ED-B)具有10-7至l(T12M、优选10-8至l(T12M的特定(体内和/或体外)结合亲和力的本发明的结合蛋白。优选地，所述ED-B-特异性的结合蛋白具有在SH3结构域衍生物的位置37和/或50的一个或多个、优选2个疏水残基，尤其Trp37和/或Tyr50，Trp37和Tyr50是最优选的。根据本发明的结合和融合蛋白可以通过许多常规的且众所周知的技术中的任一种来制备，例如通常的有机合成策略、固相-辅助的合成技术或通过可商业上得到的自动化合成仪。另一方面，它们也可以通过单独的或与常规合成技术相组合的常规重组技术来制备。本发明的其它方面涉及(i)编码根据本发明的结合蛋白或融合蛋白的多核普酸，(ii)包含所述多核普酸的载体，(iii)包含所述多核苷酸和/或所述载体的宿主细胞。多核普酸可以是DNA、RNA、PNA和其任意其它类似物。载体和宿主细胞可以是适合下述目的的任意常规类型例如，生产本发明的结合和融合蛋白、治疗上有用的载体和宿主细胞，例如用于基因治疗。技术人员将能从丰富的现有技术中选择那些多核苷酸、载体和宿主细胞，并通过常规方法证实它们用于所需目的的特殊适合性，且无需过度负担。本发明的结合和融合蛋白在哺乳动物中、尤其在人和小鼠中不引起强烈的免疫应答且优选基本上不具有免疫应答，如关于小鼠所证实的，且类似地预见到这也适用于人，因为FynSH3在两种哺乳动物物种中是相同的。令人惊讶地发现，天然的FynSH3和突变的FynSH3都不在静脉内注射任一种的小鼠中造成免疫应答。这是令人意外的，因为Fyn激酶是细胞内蛋白，且不参与新生的B细胞选择。因此，具有设计的耙特异性和亲和力的FynSH3-衍生的结合和融合蛋白特别适用于治疗、预防和/或体内"^断应用。因此，本发明的非常相关的方面涉及根据本发明的结合或融合蛋白用于制备药物的用途。在另一个方面，本发明的结合或融合蛋白用于制备诊断工具、尤其用于体内应用。优选地，如上所述的ED-B特异性的结合或融合蛋白用于制备用于治疗或断癌症的药物或_珍断工具。本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含本发明的结合或融合蛋白和任选地药学上可接受的赋形剂。本发明的另一个方面涉及诊断组合物、优选用于体内应用，其包含本发明的结合或融合蛋白和任选地药学上可接受的赋形剂。优选地，药物或诊断组合物包含ED-B特异性的本发明的结合或融合蛋白和任选地药学上可接受的赋形剂。用于本发明体内应用的药物组合物和诊断工具通常包含治疗上或诊断上有效量的根据本发明的结合蛋白和/或融合蛋白和任选的辅助物质，例如药学上可接受的赋形剂。所述药物组合物以制药领域众所周知的方式来制备。载体或赋形剂可以是可以用作活性成分的媒介物或介质的液体材料。合适的载体或赋形剂是本领域众所周知的，且包括例如，稳定剂、抗氧化剂、pH-调节物质、控释赋形剂。本发明的药物制剂可以适用于，例如，肠胃外用途，且可以以溶液等形式施用给患者。最后，本发明的另一个方面涉及治疗或诊断方法，其中将有效量的上面的药物或诊断组合物施用给需要的患者、优选遭受或被怀疑遭受癌症和/或炎性疾病的患者。在实施治疗或诊断患病受试者时，本发明的结合或融合蛋白可以以使治疗或诊断化合物生物可利用的任意形式或模式以有效量施用，包括经口或肠胃外途径。例如，本发明的组合物可以皮下地、肌内地、静脉内地等施用。制备制剂领域的技术人员可以容易地选择正确的形式和施用模式，这取决于选择的产品的具体特征、待治疗或诊断的疾病或状况、疾病或状况的病期和其它有关情况(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(1990))。本发明的组合物可以单独地或以与药学上可接受的载体或赋形剂相组合的药物或诊断制剂的形式施用，其比例和性质由选择的产品的溶解度和化学性质、选择的施用途径和标准的药物和诊断实践决定。本发明的产品尽管本身是有效的，但为了稳定性、结晶方便、增加的溶解度等目的，可以以它们的药学上可接受的盐的形式配制和施用，例如酸加成盐或石咸加成盐。图1阐明了斑点印迹分析。使用抗-HIS-HRP抗体缀合物(Sigma)作为检测试剂，通过细菌细胞裂解物的斑点印迹分析，测定表达可检测量的可溶FynSH3突变体的克隆的百分比。使用ECLplus蛋白印迹检测系统(Amersham)，检测过氧化物酶活性。A)具有随机化的RT-Src-环的Fy11SH3突变体。B)具有延伸的(4-〉6)和随机化的n-Src-环的FynSH3突变体。C)具有RT-和n-Src随机化的环的FynSH3。图2阐明了单克隆噬菌体-ELISA。针对MSA第三轮淘选后，使用包被有MSA(100卞g/ml过夜,100pl/孔)的MaxiSorp板(Nunc)，通过ELISA测试含有展示FynSH3突变体的噬菌体的单克隆细菌上清液。使用抗M-13-HRP抗体缀合物(Amersham),检测结合的噬菌体。图3阐明了使用包被有MSA(100|Lig/ml过夜，100pl/孔)的MaxiSorp板(Nunc)进行一轮亲和力成熟选择后的单克隆噬菌体-ELISA(针对MSA)。A)G4的第一个子文库(随机化的n-Src环和Trp37和Tyr50)的噬菌体ELISA。亲本克隆G4用箭标指示。B)G4的第二个子文库(随机化的和延伸的n-Src环)的噬菌体ELISA。亲本克隆G4用箭标指示。C)在有利于具有长k。ff的结合剂的条件下进行的一轮淘选后，第一个和第二个子文库的噬菌体ELISA。亲本克隆G4用箭标指示。图4显示了根据生产商的说明书(Qiagen,天然条件)克隆(pQE-12载体)、表达和纯化可溶蛋白后，几个MSA结合克隆的可溶的ELISA(使用包被有MSA(100pg/ml过夜，100pl/孔)的MaxiSorp板(Nunc))。使用抗-HIS-HRP抗体缀合物作为检测剂。向仅用4。/。MPBS封闭的孔中加入相同的结合蛋白作为对照。图5可溶蛋白的特异性ELISA。使用包被有不同清蛋白(各100pg/ml过夜，100pl/孔)的MaxiSorp板(Nunc),测试选择的MSA结合FynSH3突变体对人血清清蛋白(HSA)、大鼠血清清蛋白(RSA)、牛血清清蛋白(BSA)和卵清蛋白的结合。图6D3的BIACore分析。使用的浓度4、2、1和0,5(从上面起)。图7关于鼠抗体存在的血液样品的ELISA分析。A)给MaxiSorp板(Nunc)包被FynSH3(20^g/ml过夜，100jli1/孔)。以稀释系列(从1:4至1:IOO)应用5只小鼠中的每一只的血液样品(从75至200pl)。使用抗-小鼠-IgG-HRP抗体缀合物(Sigma)，进行抗体的检测。使用抗-HIS-HRP-缀合物(Sigma)作为包#:效率的对照。B)给MaxiSorp板(Nunc)包被FynSH3D3(20|iig/ml过夜，100p1/孔)。以稀释系歹'J(从1:4至1:1OO)应用5只小鼠中的每一只的血液样品(从75至200pl)。使用抗-小鼠-IgG-HRP抗体缀合物(Sigma)，进行抗体的检测。使用抗-HIS-HRP-缀合物(Sigma)作为包被效率的对照。C)给MaxiSorp板(Nunc)包被scFv(60pg/ml过夜，100inl/孔)。以稀释系歹ij(从l:4至1:100)应用4只小鼠中的每一只的血液样品(从75至200pl)。使用抗-小鼠-IgG-HRP抗体缀合物(Sigma)，进行抗体的检测。使用抗-myc-HRP-缀合物(Roche)作为包被效率的对照。图8显示了F9鼠畸胎癌組织切片上的D3(图8a)、对应的阴性对照(8.b)、抗-CD31染色(图8.c)和对应的阴性对照(8.d)的免疫荧光。图9显示了FynSH3-D3的肿瘤滞留(图9.a))，而不可观察到FynSH3wt的积累(图9.b))。将靶向结果表达为每g组织保留的1251-标记的蛋白的o/o注射剂量(o/oID/g)。在下面，将参考具体实施方案更详细地描述本发明的主题，这些实施方案不应解释为对本发明范围的限制。实施例实施例1:FvnSH3突变体的表达为了评价FynSH3的突变体的表达，进行了3种不同的FynSH3子文库的斑点印迹分析(图1):在第一个文库中，仅RT-环被随机化，在第二个中，Src环被随机化，并延伸至6个残基，且在第三个文库中，RT-和Src环被同时随机化，后一个环从4个延伸至6个残基。表达的FynSH3突变体的百分比范围是59-90%。表1.<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例2:针对小鼠血清清蛋白的噬菌体展示选择生成107个不同的FynSH3的文库(仅RT-环被随机化)，并克隆进噬菌粒载体pHENl(Hoogenboom等人"Multi-subunitproteinsonthesurfaceoffilamentousphage:methodologiesfordisplayingantibody(Fab)heavyandlightchains",NucleicAcidsRes,19(15):4133-7,1991)。在噬菌体上展示文库，且针对小鼠血清清蛋白(MSA)进行3轮淘选。第三轮后，通过单克隆噬菌体-ELISA筛选结合蛋白；检测到13个阳性克隆(图2)。13个克隆的测序揭示，富含2个不同的序列，命名为G4和C4。但是，在pQE-12载体(Qiagen,在天然条件下根据生产商的手册进行表达和纯化)中亚克隆和表达G4后，由于低亲和力(噬菌体ELISA比可溶蛋白的ELISA更灵敏)，通过ELISA不能检测到蛋白与MSA的结合(图4)。因此，将G4的序列用于2个不同的亲和力成熟文库(大小每个文库107个克隆)。在第一个中，n-Src环的4个残基和残基Trp37(SEQIDNO:l)和Tyr50(SEQIDNO:l)被随机化，在第二个中，将n-Src环从4个延伸到6个随机化的残基。一轮淘选后，两个子文库的几个克隆在噬菌体ELISA中给出比亲本克隆G4更强的信号(图3)。在亚克隆和表达几个克隆后，通过ELISA证实可溶蛋白的结合(图4)。表观解离常数在100nM范围内(通过BIAcore测定)。一些克隆与其它血清清蛋白交叉反应(测试了人血清清蛋白(HSA)、大鼠血清清蛋白(RSA)、牛血清清蛋白(BSA)和卵清蛋白)，而其它克隆对MSA是高度特异性的，表明可能分离高特异性的结合蛋白(图5)。实施例3:针对纤连蛋白的外结构域b(ED-B)的噬菌体展示选择将ED-B选择为靶蛋白，以证实针对药学上有关的蛋白选择FynSH3衍生的结合剂的能力。ED-B是91氨基酸III型同源性结构域，它通过在初级转录物水平可变剪接的机理插入纤连蛋白分子，不论何时发生组织重建(Zardi等人，"Transformedhumancellsproduceanewfibronectinisoformbypreferentialalternativesplicingofapreviouslyunobservedexon."EmboJ.6(8):2337-42,1987)。它是在多种实体瘤(例如肾细胞癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、高级星形细胞瘤、头和颈肿瘤、膀胱癌等)中超表达的血管发生的高质量标记，但是在正常成体组织中事实上不可检出(例外是在增殖期的子宫内膜和卵巢中的一些血管)(关于ED-B作为輩巴的更多细节，参见Menrad和Menssen,"ED-Bfibronectinasatargetforantibody-basedcancertreatments."ExpertOpin.Ther.Targets9(3):491-500,2005)。制备了超过10亿FynSH3突变体的文库，并在噬菌体上展示(RT-Src和n-Src环的同时随机化)。针对ED-B淘选3轮后，通过噬菌体ELISA鉴别出3个结合克隆。测序揭示出2个不同的序列(克隆命名为B11和D3)。使用BIAcore3000仪器，通过表面等离振子共振实时相互作用分析，测定D3的解离常数，且显示出8.5x1(T8M的值(图6)。D3(SEQIDNO:3)GVTLFVALYDYHAQSGADLSFHKGEKFQILKFGRGKGD丽EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ实施例4:免疫原性蛋白的免疫原性是蛋白相关的疗法的主要缺点，尤其对于包含重复施用药物的治疗而言。由于FynSH3序列在小鼠和人中的保守性，通过给5只小鼠重复注射2种蛋白，在体内研究了FynSH3野生型蛋白(FynSH3wt)和FynSH3突变体(FynSH3D3,针对ED-B的结合剂)的免疫原性潜力。给小鼠注射20pg蛋白4次(每3天)。在第4次注射后一天，处死小鼠，采取血液样品用于纟全查是否存在鼠抗-FynSH3wt和抗-FynSH3D3抗体。作为阳性对照，给4只小鼠注射单链Fv形式(scFv)的人抗体(相同的注射时间点和相同的剂量(=60pg))。但是，scFv组的一只小鼠在第3次注射后20分钟死亡，且另外3只接近死亡，所以在第3次注射后已经采取血液样品。图7a和b表明，不存在针对FynSH3wt和FynSH3D3的可检测的抗体，而在对照组观察到强信号(图7c)。实施例5:免疫组织荧光(immunohistofluorescence)为了研究FynSH3-D3(D3,针对ED-B的结合剂)是否会识别它的组织中天然构象的靶，在F9畸胎癌切片上进行免疫荧光。图8阐明了D3结合血管周围的肿瘤基质(图8.a)。用抗-His-Alexa488抗体缀合物进行检测。在阴性对照中，没有加入D3蛋白(图8b)。为了使血管显影，用大鼠抗-小鼠-CD31抗体共染色相同的切片，且使用驴抗-大鼠Alexa594缀合物作为第二抗体(图8.c)。使用不含笫一抗体的第二抗体作为阴性对照(图8.d)。实施例6:体内定量生物分布在携带皮下(s.c.)移植的F9鼠畸胎癌的小鼠中，通过生物分布实验，评价FynSH3-D3(针对ED-B的结合剂)和FynSH3野生型(ED-B的非结合剂)的体内靶向性能。由于ED-B在小鼠和人中是相同的，所以肿瘤靶向研究的结果应当能预测在人中的D3性能。静脉内(i.v.)注射1251-标记的D3和SH3wt,且24h后，处死动物，切除器官，称重，并计数放射性。图9.a表明，D3选择性地积累在肿瘤中(肺瘤器官比范围是3:1至10:1),而对于FynSH3野生型蛋白没有观察到富集(图9.b)。权利要求1.重组结合蛋白，其包含FYN激酶的Src同源性3结构域(SH3)的至少一种衍生物，其中(a)在src环中或位于src环附近最高达2个氨基酸的至少一个氨基酸，和/或(b)在RT环中或位于RT环附近最高达2个氨基酸的至少一个氨基酸，被置换、缺失或添加，其中所述SH3结构域衍生物的氨基酸序列与SEQIDNO1的氨基酸序列具有至少70、优选至少80、更优选至少90和最优选至少95％序列同一性，优选地条件是，该重组结合蛋白不包含SEQIDNO2的氨基酸序列，且优选地条件是，所述重组蛋白不是在自然界中存在的含有天然SH3结构域的蛋白。2.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述SH3结构域衍生物在src和RT环外与FYN激酶的Src同源性3结构域(SH3)具有至少85、优选至少90、更优选至少95、最优选至少98至100%同一性。3.根据权利要求1或2的结合蛋白，其中(a)在src环中的至少一个氨基酸和(b)在RT环中的至少一个氨基酸，被置换、缺失或添加。4.根据权利要求1-3中任一项的结合蛋白，其包含SH3结构域的至少两种衍生物，优选二价结合蛋白。5.根据权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其包含在SH3结构域衍生物的位置37和/或50的一个或优选两个改变的残基，优选两个疏水的改变的残基，更优选Trp37和/或Tyr50,Trp37和Tyr50是最优选的。6.根据权利要求1-5中任一项的结合蛋白，其对粑具有10-7至10-12M、优选10"至l(T12M的特定的结合亲和力，优选治疗上和/或诊断上有关的靶，更优选包含PxxP基序的基于氨基酸的靶。7.根据权利要求1-6中任一项的结合蛋白，其对癌胚纤连蛋白的胞外域(ED-B)具有IO-7至l(T12M、优选IO-8至l(T12M的特定的结合亲和力。8.根据权利要求7的结合蛋白，其具有一个或多个、优选2个在SH3结构域衍生物的位置37和/或50处的改变的、优选疏水的残基，更优选Trp37和/或Tyr50,且最优选TYp37和Tyr50。9.根据权利要求1-8中任一项的结合蛋白，其包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。10.根据权利要求1-9中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白对蛋白或小有机化合物具有结合特异性。11.融合蛋白，其包含与药学上和/或诊断上的活性组分相融合的根据权利要求1至10中任一项的结合蛋白。12.根据权利要求11的融合蛋白，其中所迷組分是细胞因子，优选选自下述的细胞因子IL-2、IL-12、TNF-a、IFNa、IFN卩、IFNy、IL-IO、IL-15、IL-24、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-ll、IL画13、LIF、CD80、B70、TNF)3、LT-p、CD-40配体、Fas-闺己体、TGF隱J3、IL-la和IL-1卩。13.根据权利要求11的融合蛋白，其中所述组分是毒性化合物，优选小有机化合物或多肽，优选选自下述的毒性化合物加利车霉素、新抑癌蛋白、埃斯波霉素、达内霉素、可达菌素、maduropeptin、阿霉素、柔红霉素、auristatin、蓖麻毒蛋白-A链、蒴莲根毒素、截短的假单胞菌外毒素A、白喉毒素和重组多花白树毒蛋白。14.根据权利要求11的融合蛋白，其中所述组分是趋化因子，优选选自下迷的趋化因子IL-8、GROa、GRO卩、GROy、ENA-78、LDGF-PBP、GCP陽2、PF4、Mig、IP-IO、SDF陽la/卩、BUNZO/STRC33、I-TAC、BLC/BCA-1、MIP-la、MIP-1p、MDC、TECK、TARC、RANTES、HCC-1、HCC-4、DC國CK1、MIP-3a、MIP-3卩、MCP-l-5、嗜伊红粒细胞趋化蛋白、嗜伊红粒细胞趋化蛋白-2、1-309、MPIF-1、6Ckine、CTACK、MEC、淋巴细胞趋化蛋白和CX3C趋化因子。15.根据权利要求11的融合蛋白，其中所述组分是荧光染料，优选选自AlexaFluor或Cy染料的组分。16.根据权利要求11的融合蛋白，其中所述组分是光敏剂，优选双(三乙醇胺)Sn(IV)二氢卟酚e6(SnChe6)。17.根据权利要求11的融合蛋白，其中所述组分是促凝血因子，优选组织因子。18.根据权利要求11的融合蛋白，其中所述组分是前体药物激活酶，优选选自羧肽酶、葡糖醛酸糖苦酶和葡糖普酶的酶。19.根据权利要求11的融合蛋白，其中所述组分是来自Y-辐射同位素的放射性核素，优选99mTc、123I、mIn,或来自阳电子发射体的放射性核素，优选"F、64Cu、68Ga、86Y、124I，或来自卩-发射体的放射性核素，优选1311、9GY、177Lu、67Cu,或来自a-发射体的放射性核素，优选2"Bi、211At。20.根据权利要求11的融合蛋白，其中所述组分是功能性Fc结构域，优选人功能性Fc结构域。21.根据权利要求11-20中任一项的融合蛋白，其另外包含调节血清半衰期的组分，优选选自聚乙二醇(PEG)、免疫球蛋白和清蛋白结合肽的组分。22.根据权利要求11-21中任一项的融合蛋白，其包含根据权利要求7、8或9的结合蛋白。23.编码根据权利要求1-22中任一项的结合蛋白或融合蛋白的多核苷酸。24.包含根据权利要求23的多核苷酸的载体。25.宿主细胞，其包含根据权利要求23的多核苷酸和/或根据权利要求24的载体。26.根据权利要求1-14、16-18和20-22中任一项的结合蛋白或融合蛋白用于制备药物的用途。27.根据权利要求7、8或9的结合蛋白和/或根据权利要求22的融合蛋白用于制备用于治疗癌症的药物的用途。28.根据权利要求1-10、15、19、21和22中任一项的结合蛋白或融合蛋白用于制备诊断工具的用途。29.根据权利要求7、8或9的结合蛋白和/或根据权利要求22的融合蛋白用于制备用于诊断癌症的诊断工具的用途。30.药物组合物，其包含根据权利要求1-14、16-18和20-22中任一项的结合蛋白或融合蛋白和任选地药学上可接受的赋形剂。31.诊断组合物，其包含根据权利要求1-11、15、19、21和22中任一项的结合蛋白或融合蛋白和任选地药学上可接受的赋形剂。全文摘要本发明涉及包含FYN激酶的Src同源性3结构域(SH3)的至少一种衍生物的重组结合蛋白，其中在src环中或位于src环附近最高达2个氨基酸的至少一个氨基酸和/或在RT环中或位于RT环附近最高达2个氨基酸的至少一个氨基酸被置换、缺失或添加。此外，本发明涉及融合蛋白，其包含与药学上和/或诊断上的活性组分融合的根据本发明的结合蛋白。另外，本发明涉及编码这些结合蛋白和/或融合蛋白的核苷酸以及对应的载体和宿主细胞。最后、但不是最少，本发明涉及本发明的结合蛋白和/或融合蛋白用于制备药物或诊断工具的用途，以及包含所述结合蛋白和/或融合蛋白的药物或诊断组合物。文档编号C07K14/435GK101506230SQ200780030974公开日2009年8月12日申请日期2007年8月20日优先权日2006年8月21日发明者D·内里,D·格拉布洛夫斯基申请人:瑞士联邦苏黎世技术大学