病毒抑制性核苷酸序列和疫苗的制作方法

专利名称：：病毒抑制性核苷酸序列和疫苗的制作方法序列和疫苗本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。本发明是在通过美国能源部项目U.S.DE-FG02-90ER40542的政府支持下完成。因此，美国政府具有本发明的某些权利。
背景技术：
：慢病毒属于病毒的逆转录病毒家族。术语"lenti"是"慢"的拉丁文。慢病毒的特征在于具有长潜伏期和直接感染邻近细胞而不必形成细胞外颗粒。它们的'ft速周转(turnover),加上它们在细胞内长期保持的能力，使慢病毒特别善于逃避被感染的受试者的免疫反应。慢病毒包括免疫缺陷病毒，例如人免疫缺陷症病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺损病毒(FIV)和马感染性贫血病毒(equineinfectiousanemiaviruses,EIAV)。慢病毒感染可引起严重的疾病，并且，如果不进行治疗，可以是致命的。在最近几年，已开发了减少病毒载量和改善HIV感染的症状的几种抗逆转录病毒药物和药物混合物。然而，尽管它们是成功的，但这些药物通常不能全根除病毒感染。相反，病毒通常以潜伏存留在被感染的受试者中。也已经进行许多产生抗慢病毒疾病例如HIV的疫苗的努力。然而，迄今为止，还没有可商购获得的疫苗。因此，在本领域需要开发抗慢病毒例如HIV的新型药物和疫苗。发明概述本发明提供了与人基因组中的相对照的基因相比在HIV病毒的基因组中过度出现(over-represented)的三核苷酸序列基序AGG。AGG基序也以高水平存在于其他病毒的基因组中。据认为AGG基序是抑制性核苷酸信号序列或和"INS"序列。在一个实施方案中，本发明涉及已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的病毒核酸。在一些实施方案中，病毒核酸来自HIV病毒。在其他实施方案中，已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的病毒核酸存在于^sg、jw/或e/2r基因中。在另一个实施方案中，本发明涉及产生具有一个或多个已突变的AGG的病毒核酸的方法，该方法包括提供包含一个或多个AGG序列的病毒核酸和将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。AGG序列可位于或来源于病毒基因组的任何位置，包括编码和非编码区。在另一个实施方案中，如果AGG序列位于编码蛋白质的病毒核酸的区域，选择由AGG序列改变成的非AGG序列以使其不会不利地影响由所述病毒核酸编码的蛋白质的序列、结构、功能或免疫原性。在其他实施方案中，病毒核酸是HIV核酸。在另一方面，本发明涉及具有已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的基因组的突变病毒。在一些实施方案中，突变病毒是突变的HIV病毒。在另一个实施方案中，本发明涉及不为病毒但包含已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的病毒核酸序列的重组病毒。在另一个实施方案中，突变病毒核酸是突变HIV核酸。在另外的实施方案中，本发明涉及从突变病毒核酸序列表达的病毒蛋白质，所述突变病毒核酸序列已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。在另一个实施方案中，本发明涉及从已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的突变HIV核酸序列表达的HIV蛋白质。在另一个实施方案中，本发明涉及包含已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的病毒核酸序列的病毒疫苗。在另一个实施方案中，本发明涉及HIV疫苗，所述HIV疫苗包含进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的HIV核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及病毒疫苗，所述疫苗包含任意上述病毒核酸序列，其中包括具有比在天然病毒的核酸序列中发现的更少的AGG基序的病毒核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及HIV疫苗，所述HIV疫苗包含具有比在相应的天然HIV林系的核酸序列中发现的更少的AGG基序的HIV核酸序列在另一个实施方案中，本发明涉及能够比相应的野生型病毒更高地表达蛋白质的病毒疫苗，其中所述病毒疫苗包含具有比野生型病毒核酸序列更少的AGG序列的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及能够比相应的野生型HIV病毒更高地表达蛋白质的能力的HIV疫苗，其中所述HIV疫苗包含具有比野生型HIV病毒核酸序列更少的AGG序列的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及包含从病毒核酸产生的病毒疫苗，所述病毒核酸已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。在另一个实施方案中，本发明涉及包含从HIV核酸产生的蛋白质的HIV疫苗，所述HIV核酸已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。在另一个实施方案中，本发明涉及包含如由本发明提供的疫苗和选自药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂和佐剂的其他组分的纟且合物。在另一个实施方案中，本发明涉及用于免疫受试者以抗病毒的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的本发明的疫苗。在一个实施方案中，本发明涉及用于免疫受试者以抗病毒的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的病毒，所述病毒已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。在另一个实施方案中，本发明涉及用于免疫受试者以抗HIV的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的编码病毒蛋白质的核酸，所述核酸已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。在另一个实施方案中，在另一个实施方案中，本发明涉及用于免疫受试者以抗病毒的方法，所迷方法包括对受试者施用有酸已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。在一些实施方案中，本发明涉及用于免疫受试者以抗HIV的方法。在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定试剂的方法，所述试剂抑制或刺激病毒RNA的产生、慢病毒蛋白质的产生或病毒颗粒的产生，或抑制或刺激病毒的潜伏。在另一个实施方案中，所述方法包括提供包含至少一种病毒核酸序列的对照细胞(所述病毒核酸序列包含至少一个AGG基序)和包含至少一种病毒核酸序列的受试细胞(所述病毒核酸序列包舍至少一个突变成非AGG序列的AGG基序)，将所述受试细胞和所述对照细胞与一种或多种试剂接触，和鉴定至少一种试剂，与在对照细胞相比，所述试剂在受试细胞中抑制或刺激病毒RNA的产生、慢病毒蛋白质的产生或病毒颗粒的产生、或抑制或刺激病毒的潜伏。在其他实施方案中，所述试剂抑制或刺激HIVRNA的产生、HIV蛋白质的产生或HIV颗粒的产生、或抑制或刺激HIV潜伏。在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定AGG基序结合剂的方法。在另一个实施方案中，方法包括提供包含至少一个AGG基序的对照核酸和包含至少一个已突变成非AGG序列的AGG基序的受试核酸，将所述受试核酸和所述对照核酸与一种或多种试剂接触，和鉴定至少一种试剂，所述试剂结合所述对照核酸但不结合所述受试核酸或以比其与受试核酸结合的更高亲和力结合对照核酸。在另一个实施方案中，本发明涉及AGG基序结合剂，例如使用本发明的方法中的一个鉴定的AGG基序结合剂。在另一个实施方案中，本发明涉及抑制或刺激AGG结合剂与包含至少一个AGG基序的核酸结合的试剂和用于鉴定此类试剂的方法。本发明还涉及用于鉴定病毒的基因中除了AGG基序外的INS序列的方法。本发明的这些和其他实施方案进一步描述于所附的说明书、附图和权利要求中。附图概述图1，(a)和(b)部分显示HIV-1^g基因的核苷酸序列和编码的蛋白质的氨基酸序列。(a)部分显示核苷酸位点1至780，(b)部分显示核苷酸位点781至1543。该序列包含44个AGG基序。在核苷酸序列上面图解说明在这些AGG基序内可产生的可能的突变中的一些突变。例如，所述图显示始于核苷酸位点1442的AGG基序可从AGG改变成AAG。图1图解说明了38个AGG突变。图2显示来自4个独立转染实验的瞬时转录的293细胞中Gag表达的结果。两个不同的Gag序列是我们产生的密码子优化形式(Adarc)和基序优化形式(RK)。Gag基因的RK形式具有比所述密码子优化形式大约2倍高的表达。图3显示小鼠中GagDM疫苗的免疫原性。两种不同形式的Gag被制备成DNA疫苗，并且被注射入Balb/C小鼠，然后在第4周进行加强。在第4周和第6周时间点上，通过ELISA测量抗Gag抗体水平。我们的形式RK-Gag在第4周诱导比密码子优化形式5倍高的免疫反应，在第6周后这增加至6倍的差异。发明详述本发明涉及病毒基因组中的抑制性核苷酸信号序列或"INS"序列。本发明的INS序列可以例如通过减少病毒RNA在宿主细胞中的水平或使其保持低稳定状态水平而对病毒具有抑制性作用。本发明的INS序列还可以在病毒潜伏期中起着重要作用。在一个方面，本发明提供包含其中的INS序列已进行了突变的病毒核酸的疫苗或从所述病毒核酸产生的疫苗。在另一个方面，本发明提供了用于影响INS序列的功能的方法和组合物，和用于鉴定INS序列的方法。本文描述了这些和其他实施方案。除非内容清楚地指出其他意思，单数形式"一"、"一个，，和"该，，包括复数涵义。因此，例如，"病毒"包括多个此类病毒。术语"AGG"、"AGG基序，，、"AGG序列"和"AGG序列基序"在本文中可互换使用，表示核酸中具有序列AGG的三个核普酸的连续序列。本文中使用的术语"突变体"是指已通过一个或多个核苷酸或氨基酸的插入、缺失和/或置换改变的经修饰的核酸或蛋白质。例如，术语突变体用于指例如通过用另一个核苷酸置换AGG基序中的一个或多个核普酸，或插入一个或多个核普酸以破坏AGG基序，或缺失AGG基序中的一个或多个核苷酸而不将它们置换为其他核苷酸来进行改变以破坏AGG基序的核酸。当说明书和权利要求提及将AGG基序突变成非AGG序列，这包括用另一个核苷酸置换AGG基序中的一个或多个核普酸，或插入一个或多个核苷酸以破坏AGG基序，或从AGG缺失一个或多个核苷酸而不将它们置换为其他核苷酸。.本文使用的术语"野生型"或"WT"是指没有被改变以破坏AGG基序的核酸和包含所述核酸的病毒、栽体和细胞。术语"野生型"还指由此类核酸编码的蛋白质。因此，术语"野生型"包括天然的核酸、病毒、载体、细胞和蛋白质。然而，此外，术语"野生型，，还包括非天然的核酸、病毒、细胞和蛋白质。例如，除非另外指出，已进行了遗传改变的核酸、病毒、栽体和细胞包括在术语"野生型"中，只要这些核酸、病毒、和细胞没有改变而在其中破坏AGG。如本文中所使用的，术语"同源物"是与本文中提及的核苷酸序列共有至少大约60%、大约70%、大约80%、大约90%或更高同一性的核苷酸序列，例如本文中提及的野生型慢病毒核苷酸序列。百分比同一性可以是60%至99.9%的范围内的任何数(包括60%和99.9%)。术语"同源于"还用于指具有与本文中提及的蛋白质(例如本文中提及的慢病毒蛋白质)的氨基酸序列共有至少大约60%、70%、80%、90%或更高同一性的氨基酸序列的蛋白质。百分比同一性可以是60%至99,9%的范围内的任何数(包括60°/。和99.9%)。在一些实施方案中，本文中描述的蛋白质的同源物具有与本文中描述的野生型慢病毒蛋白质基本上相似的结构和/或功能和/或免疫原性。如此处所使用的，"病毒，，包括具有围绕遗传材料的RNA或DNA核心的蛋白质外壳的任何感染性颗粒。如此处所使用的，术语"病毒"还指所有DNA和RNA病毒的所有林系、分离林和分化体(clade)。病毒包括但不限于所有腺病毒、苜蓿花叶病毒属、青葱病毒属、异轻病毒属、a潜隐病毒属、卩月旨毛谨菌体、Alphanodoavirus、a乳头瘤病毒属(Alphapapi1lomavirus)、oc逆转录病毒属、ot病毒属、阿留申水貂病毒属、葡萄巻叶病毒属、口蹄疫病毒属、水生双RNA病毒属、水生呼肠孤病毒属、沙粒病毒属、动脉炎病毒属、嚢泡病毒属、非洲猪瘟病毒属、腺胸腺病毒属、黄金葛病毒属、禽星状病毒属、燕麦病毒属、禽腺病毒属、禽双RNA病毒属、禽嗜肝DNA病毒属、禽痘病毒属、禽副勦病毒属(Avulavirus)、香蕉顶束病毒属、杆状DM病毒属、杆状RM病毒属、螺弧菌微小噬菌体、菜豆金色花叶病毒属、P潜隐病毒属、P脂毛噬菌体、Betanodovirus、P乳头瘤病毒属、P逆转录病毒属、P四病毒属、博卡病毒属、波纳病毒属、茧蜂病毒属、短颈浓核病毒属、雀麦花叶病毒属、大麦黄化花叶病毒属、毛状病毒属、山羊痘病毒属、心病毒属、香石竹潜病毒属、香石竹斑驳病毒属、花椰菜花叶病毒属、香石竹斑驳病毒属(Cavemovirus)、衣原体孩i小噬菌体、绿藻病毒属、绿色虹彩病毒属、青霹病毒属、圆环病毒属、线形病毒属、颗石藻类病毒属、科罗拉多壁虱热病毒属属(Coltivirus)、虹豆花叶病毒属、冠状病毒属、被盖病毒属、蜷蟀麻痺病毒属、南瓜花叶病毒属、甜菜曲顶病毒属、质型多角体病毒属、嚢状病毒属、巨细胞病毒属、质型弹状病毒属、香石竹病毒属(Dainthovirus)、5乳头瘤病毒属、5逆转录病毒属、浓核病毒属、依赖病毒属、依波拉病毒属、碗豆耳突花叶病毒属、肠道病毒属、昆虫双片段RNA病毒属、A昆虫痘病毒属、B昆虫痘病毒属、C昆虫痘病毒属、短暂热病毒属、e專L头瘤病毒属、s反转录病毒属、马鼻病毒属、马鼻病毒属、红细胞病毒属、A乳头瘤病毒属、蚕豆萎蔫病毒属、斐济病毒属、黄病毒属、凹陷病毒属、微小纺锤形噬菌体、y脂毛噬菌体(Gammalipothrixvirus)、y乳头瘤病毒属、Y逆转录病毒属、贾第鞭毛虫病毒属、颗粒体病毒属、微状病毒属(Guttavirus)、环病毒属(Gyrovirus)、汉坦病毒属、半病毒属、亨尼帕病毒属、肝炎病毒属、嗜肝DNA病毒属、肝病毒属、减毒病毒属、姬蜂病毒属、鮰鱼疱渗病毒属、呼肠孤病毒属、等径易变病毒属、传染性喉气管炎病毒属、流感病毒属A型、流感病毒属B型、流感正粘病毒属C型、丝状病毒属、i乳头瘤病毒属(Iotapapillomavirus)、甘薯病毒属、虹彩病毒属、传染性鲑鱼贫血病毒属、重复病毒属、K乳头瘤病毒属(Kappapapi1lomavirus)、嵴病毒属、兔病毒属、X乳头瘤病毒属(Lambdapapillomavirus)、利什曼原虫病毒属、'艮病毒属、野兔症病毒属，轻小病毒属、黄矮病毒属、淋巴隐伏病毒属、淋巴嚢肿病毒属、狂犬病病毒属、玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)、橙桑花叶病毒属、葡萄斑点病毒属、哺乳动物星状病毒属、栊柑(柑橘)病毒属(Mandarivirus)、玉米雷亚多非纳病毒属、马尔堡病毒属、马立克病毒属、Marnavirus、哺乳动物腺病毒属、玉米线条病毒属、肿大细胞病毒属、Metapneumovirus、转座病毒属、微小病毒属、线粒体病毒属、软祝痘病毒属、麻渗病毒属、M乖pillomavirus、鼠巨细胞病毒属、苍蝇呼肠病毒属(Mycoreovirus)、纳^尹罗病毒属、纳米病毒属(Nanovirus)、棵露RM病毒属、坏死病毒属、线虫传多面体病毒属、诺瓦病毒属、粒外弹状病毒属、核多角体病毒属、核型弹状病毒属、p乳头瘤病毒属(N攀pillomavirus)、头曱病毒属、雀麦花叶病毒属、co四病毒属、辰型乳头瘤病毒属、环状病毒属、正布尼病毒属(Orthob呵avirus)、正肝去氧核糖核酸病毒属、正痘病毒属、正呼肠孤病毒属、7jc稻病毒属(Oryzavirus)、中白尼科病毒属(Panicovirus)、副症病毒属、葛'J肠孤病毒属、分病毒属(Patitivirus)、细小病毒属组、黑胸大蠊浓核病毒属、瘟疫病毒属、牵牛花叶脉透明样病毒属(Petuvirus)、褐藻病毒属、白蛉病毒属、植物呼肠病毒属、Tt乳头瘤病毒属、芽生病毒属、Plectrovi、肺病毒属、马铃薯巻叶病毒属、多瘤病毒属、马铃薯X病毒属、马铃薯Y病毒属、寄生藻病毒属、金藻病毒属、假病毒属、蛙病毒属、针晶藻病毒属、呼吸道病毒属、猴18病毒属(Rhadinovirus)、鼻病毒属、玫瑰渗病毒属、轮状病毒属、风渗病毒属、腮腺炎病毒属、古噬菌体、黑麦草花叶病毒属、沙波病毒属、Seadornavirus、伴生病毒属(Sequivirus)、唾液酸酶病毒属、单纯疱渗病毒属、斑驳病毒属、螺旋体微小噬菌体、泡沫病毒属、猪痘病毒属、覆盖层病毒属、捷申病毒属、e乳头瘤病毒属(Thetapapillomavirus)、托高土病毒属、番茄丛矮病毒属、番茄伪曲顶病毒属、环状病毒属、番茄斑萎病毒属、全病毒属、发状病毒属、小麦属病毒属、东格鲁病毒属、芜菁黄花叶病毒属、水痘病毒属、水泡性病毒属、水泡渗病毒属、葡萄病毒属、矮化病毒属、白斑病毒属、《乳头瘤病毒属(Xipapillomavirus)、亚塔痘病毒属或G乳头瘤病毒属(Zetapapillomavirus)或其任何組合。如此处所使用的术语"逆转录病毒"，是指所有逆转录病毒的所有抹系、分离林和分化体，包括但不限于所有cc逆转录病毒、P逆转录病毒、5逆转录病毒、e逆转录病、Y逆转录病毒、泡沫病毒和慢病毒。如此处所使用的术语"慢病毒"，是指所有慢病毒的所有林系、分离林和分化体，包括但不限于牛免疫缺损病毒、马传染性贫血症病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、山羊关节炎脑炎病毒、髓鞘脱落-呼吸急促病毒、人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒II型(HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。如本文中所使用的术语中"HIV"，是指HIV-1和HIV-2的所有林系、分离林和分化体。因此，除非另外指出，当使用术语HIV而不指定类型(即不指明1型或2型)时，假定HIV-1和HIV-2都是指，包括HIV-1和HIV-2的所有林系、分离林和分化体。如此处所使用的术语"蛋白质，，和"肽"，是指氨基酸的多聚体链。尽管术语"肽，，通常用于指相对短的氨基酸的多聚体链，和术语"蛋白质"用于指更长的氨基酸的多聚体链，但就可被当作蛋白质的分子和可被当作肽的分子而言存在一些重叠。因此，术语"蛋白质"和"肽"在本文中可以互换使用，并且当使用此类术语时，它们并不旨在以任何方式限定提及的氨基酸的多聚体链的长度。除非另外提出，术语"蛋白质"和"肽"应当解释为包括提及的特定蛋白质的所有片段、衍生物、变体、同源物和模拟物，且可包括天然的氨基酸或合成的氨基酸。术语"玉米"和"免疫原性组合物，，在本文中可互换使用，是指能够诱导抗病毒的免疫反应的试剂或组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了能够诱导抗慢病毒例如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV或EIAV的免疫反应的疫苗。术语"疫苗"和"免疫原性組合物"包括预防性或防止性疫苗和治疗性疫苗。本发明的疫苗组合物还可与多种不同的病毒交叉反应和有效地抗所述病毒。例如，本发明的免疫原性组合物可与多种不同类型的病毒、慢病毒和/或多种不同类型的免疫缺陷性病毒交叉反应和有效地抗所述病毒。类似地，本发明的免疫原性组合物可以在相同病毒的不同林系和分化体之间交叉反应。例如，有效地抗HIV的一个林系的根据本发明的免疫原性组合物还可有效地抗HIV的多个林系。如本文中所使用的术语"蛋白质疫苗"、"蛋白质性质的疫苗"和"亚基疫苗，，可互换使用，是指包含慢病毒或病毒的蛋白质组分的疫苗。本文中使用的术语"试剂，，一般用于表示任何分子，例如蛋白质、肽或药物，包括但不限于结合AGG基序的试剂、抑制AGG基序的功能的试剂、刺激AGG基序的功能的试剂、抑制或刺激另一种试与AGG基序的结合的试剂、包含具有突变的AGG基序的核酸或由所述核酸制备的疫苗、与本发明的疫苗一起共施用的分子等。术语"宿主"是指可通过病毒、慢病毒感染的或可用于培养、扩增或表达本文中描述的任何疫苗林系、病毒、载体、质粒或蛋白质的任何动物或细胞类型(包括动物细胞、细菌细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。本文中使用的"受试者"是指可对其施用根据本发明的疫苗或试剂的任何动物，包括人和其他哺乳动物物种。"免疫原性"包括物质刺激免疫反应的能力。免疫原性例如通过确定对于所述物质是特异性的抗体的存在来进行测量。抗体的存在通过本领域内已知的方法例如ELISA测定法来进行检测。在一个方面，本发明涉及具有减少的AGG序列的数目的病毒。在一些实施方案中，本发明涉及慢病毒。在其他实施方案中，本发明涉及慢病毒HIV。HIV生物学HIV基因组编码几种蛋白质，其中一些蛋白质被产生为在蛋白水解切割后产生不同功能实体的"多蛋白(poly-protein)"。所有由HIV基因组编码的蛋白质(包括但不限于"多蛋白"和它们的蛋白水解切割产物)在本发明的范围内，并且在本文中可称为"HIV蛋白"、"HIV肽"、"HIV多蛋白"、"本发明的蛋白质"、"本发明的多蛋白"或"本发明的肽"。本发明的INS可存在于编码任何或所有这些蛋白质的核苷酸序列中。本发明的INS还可存在于HIV基因组的非编码区中。例如，HIV基因组编码可被病毒蛋白质酶切割成组成病毒的核心的pl7MA、p24CA、p7和p6蛋白的pr55GAG蛋白。Prl60GAG-P0L前体蛋白产生通过翻译移码(translationalframeshifting)产生并且随后被切割成逆转录酶(RT)、RNA酶H、蛋白酶(PR)和整合酶(IN)的聚合酶多蛋白。Gpl60包膜蛋白被细胞蛋白酶切割成将病毒附着至CD-4受体和共受体的Gpl20蛋白(ENV)以及将病毒包膜融合入宿主细胸膜的Gp41跨膜蛋白。这些蛋白是HIV颗粒的主要的结构蛋白和酶。两种另外的蛋白Tat和Rev调控整合的前病毒的转录(Tat)和未剪接的mRNA(GAG-POL和病毒基因RNA)从细胞核至细胞质的转运(Rev)。这些活动在复制周期中调控病毒基因的表达和时间事件。四种辅助蛋白Vpu、Vif、Vpr和Nef是与细胞蛋白质形成复合物的接头(adaptor)，其在体内增强感染性病毒的产生，但在一些细胞培养物中具有更小的表型。所有这些HIV蛋白质在本发明的范围之内。HIV病毒通过使用其gpl20ENV蛋白而附着至T细胞和单核细胞，所述gpl20ENV蛋白结合细胞表面的CD-4蛋白和共受体。T细胞表达细胞因子受体CXCR4，单核细胞表达CCR5共受体，外周血淋巴细胞表达两者。ENV蛋白的遗传改变产生嗜单核细胞病毒(R5病毒)、嗜T细胞病毒(X4病毒)和双嗜性病毒(dualtropicvir腦)。共受体对于ENV附着和Gp41融合是必需的。缺乏正常HIV共受体(例如因为他们具有CCR5/532多态性)的人几乎完全抗HIV感染。(参见，例如，Deng等人，Nature(1996)第381巻，p661-6和Samson等人，Nature,(1996)第382巻p722-5)。阻断CCR5共受体的药物现正在进行临床试验中。在HIV病毒与细胞融合后，病毒核心颗粒通过使用逆转录酶(RT)将病毒RNA复制为DNA拷贝，并且颗粒移至细胞核，在此其使用整合酶(IN)将病毒DNA整合入细胞基因组。长末端重复(LTR)DNA序列包含对于从整合的DNA产生病毒mRNA是必需的许多转录因子结合位点。除了TATA元件以外，在LTR中存在由细胞转录因子识别的两个NFKb位点和三个Sp-l位点。此外也存在针对LEF、ETS和USF转录因子的位点。这些细胞转录因子帮助起始转录，但这以非常低的水平发生。在产生TAT后，其结合细胞蛋白质(细胞周期蛋白Tl)和TAT-cycTl复合物，然后结合病毒mRNA中的RNA环结构(称为TAR)。TAT-cycTl复合物然后结合CDK9蛋白激酶，其磷酸化RNA聚合酶II的一个亚基的羧基端末端。这是病毒RNA转录(其增加100倍)的有效起始所必需的。通过这些事件产生30多种不同的病毒RNA分子。它们分为三类(l)用于产生GAG、POL和完整的病毒基因组的未剪接的RNA，(2)用于产生ENV、Vif、Vpu和Vpr蛋白的大小为大约5，OKb的局部剪接的RNA，和(3)翻译成REV、TAT和Nef的小的剪接的RNA(l.7-2.OKb)。将这些RNA转运至细胞核外对于完全剪接的mRNA最有效。因此，在感染后早期，只有TAT、REV和NEF被有效地产生。然后TAT与TAR的结合增加转录速率IOO倍。更大的、未剪接的或未充分剪接的mRNA只有在REV蛋白产生并且结合ENV基因中的Rev反应元件(Rev—responsiveelement,RRE)后,才能更有效地转运入细胞质。这样，TAT和REV的合成调控病毒生命周期的时间安排(timing)。除了TAT外，在HIV基因组中存在减少细胞中病毒RNA的稳定状态水平的第二套信号。这些信号称为抑制性核苷酸信号序列(INS序列)。之前在HIV基因组的^g/p^区域中已鉴定了假定的包含INS的区域(参见Schneider等人，JournalofVirology,(1997)，第71巻，p.4892-4903)。在由Schneider等人进行的先前研究中，对包含假定的INS序列的区域进行突变从而除去AUUUA五核苷酸和减少AU含量而不改变区域的编码容量。已经发现，这些突变导致HIVRM的水平增加多至70-130倍。在INS序列突变和在功能性REV存在的情况下，感染的细胞中的HIVRNA的增加比在这两种不同功能不存在的情况下高160倍。据认为，HIV病毒通过具有病毒RNA的低稳定状态水平而获得有利方面。已提出，快速复制和快速杀死细胞的病毒比利用更慢的周期的病毒产生更少的每细胞病毒数。事实上，如对于例如脊髓灰质炎病毒所观察到的，快速有效的病毒产生和细胞杀死，通常导致完全的病毒免疫清除和对随后感染的免疫。相反地，保留在细胞内以延长的周期的病毒能够逃避或至少减少免疫系统抵抗它们的功效。尽管gag/;70/基因的假定的包含INS的区域的突变是累加的，但之前未鉴定NIS的序列(Schneider等人)。包含INS的区域用于减少感染的细胞中病毒RNA的稳定状态水平。存在至少三种可能的机制，包括(l)转录速率的降低，(2)HIVRNA的RNA降解速率的增加，(3)HIVRNA至细胞核外的转运速率的降低(Schneider等人)。对Env和Gag的不足的免疫反应是在产生对于HIV-1的疫苗的努力中的主要问题。关于DNA疫苗，免疫反应与表达水平相关，因此这些ORF的表达的增加可减轻对有活力的疫苗的构建的重大阻碍。推测由于它们的RNA中编码的成组蛋白质结合位点，来自HIV的大mRNA具有加工问题并且不能有效地从细胞核运出。鉴定和除去引起核限制(nuclearconfinement)的信号可显著地增加这些ORF的表达水平和提高免疫反应。人免疫缺陷症病毒1型(HIV-1)的基因组包含9个开放阅读框架(0RF)，所有开放阅读框架通过选择剪接从单个启动子表达。Gag、Pol、Env、Vpu、Vif和Vpr这6个0RF的剪接形式和全长mRNA一起包含在它们的RNA中编码的REV反应元件(RRE)。在REV蛋白不存在的情况下，这6个0RF表达不足。其他3个0RF，Tat、Rev和Nef,不依赖于REV蛋白有效地表达。包含RRE的mRNA似乎也包含未确定的阻止正常表达的信号或成组信号。这些ORF表达不足的主要原因是核限制。与人基因组中的成组的已知的编码基因相比，HIV-1的基因组具有异常的核苷酸分配。HIV-1的临床分离林中的平均腺嘌呤的百分数高于平均人编码基因。广泛用于本实验和疫苗试验中的密码子最优化的林系可增加转染入人细胞中的Gag的表达水平500至1000倍。然而，由密码子最优化而引起的表达的显著增加最多可间接地解决核隔离(nuclearisolation)的问题。HIV病毒颗粒的装配发生在其中GAG-POL多蛋白包装病毒RNA的细胞膜上。病毒颗粒从现已包含HIVENV和gp41蛋白质的宿主细胞的质膜出芽。在病毒颗粒释放后，病毒蛋白质酶(PR)切割GAG-POL多蛋白，从而产生成熟和感染性颗粒。据认为Vif参与病毒的装配。此外，NEF和Vpu参与细胞CD-4蛋白的降解和从感染的细胞的膜释放病毒。Vpr蛋白在装配中被整合入病毒粒子并且似乎在感染的早期起作用，将颗粒转运入细胞核，而Vif在细胞中拮抗抗病毒细胞酶活性。释放的感染性病毒附着至并且感染其他细胞，CD-4淋巴细胞的进行性感染和杀死导致免疫系统失去能力。本发明的INS序列因为遗传密码是简并的，所以核普酸序列可以在核苷酸水平上相互不同但却编码相同的蛋白质或肽。然而，在自然界中通常存在对具体密码子选择和AT/GC含量的选择性压力。还存在对由核苷酸序列编码的蛋白质中的氨基酸的频率和顺序(order)的选择性压力。已开发了对每一种此类选择性压力标准化，然后计算基因组中预期的序列基序(例如，长度为2至8个核苷酸的序列基序)的平均频率和将该频率与这些基序的实际频率比较的方法。该方法描述于共同未决的临时专利申请号60/808,420，也描述于Robins等人(2005)，JournalofBacteriology,第187巻，p.8370-74，其内容通过引用合并入本文。该方法可用于产生一系列在基因组中过度出现和/或出现不足的寡核苷酸序列基序。此类过度出现和/或出现不足的序列可包含功能信息。在本发明中，Robins等人的方法用于寻找HIV-1和人基因组中的此类过度出现和出现不足的序列基序。发现序列基序AGG在HIV基因组中过度出现并且在相对等的人基因中出现不足。例如，图1显示在HIV-1^sg基因中鉴定的48个AGG基序。超过三分之二的在^g基因中鉴定的AGG基序不存在于编码氨基酸的阅读框架中，这暗示这些序列由于选择的原因在氨基酸/蛋白质水平上不是保守的。然而第三密码子位置的变化在不同HIV分离林中是常见的，还发现AGG基序甚至在密码子的第三位置中也是特别保守的。此外，发现AGG基序在400多个已分析的HIV-1林系中和在HIV-2以及其他'I1病毒(包括FIV、SIV和EIAV)中是保守的。本发明的INS序列例如AGG序列基序可能可存在于许多不同类型的病毒的基因组中。在一个实施方案中，本发明涉及任何病毒家族的基因组中的INS序列，所述病毒包括但不限于腺病毒、苜蓿花叶病毒属、青葱病毒属、异轻病毒属、ot潜隐病毒属、P脂毛噬菌体、Alphanodoavirus、oc乳头瘤病毒属(Alphapapi1lomavirus)、a逆转录病毒属、a病毒属、阿留申水貂病毒属、葡萄巻叶病毒属、口蹄疫病毒属、水生双RNA病毒属、水生呼肠孤病毒属、沙粒病毒属、动脉炎病毒属、嚢泡病毒属、非洲猪瘟病毒属、腺胸腺病毒属、黄金葛病毒属、禽星状病毒属、燕麦病毒属、禽腺病毒属、禽双RNA病毒属、禽嗜肝DNA病毒属、禽痘病毒属、禽副黏病毒属(Avulavirus)、香蕉顶束病毒属、杆状DNA病毒属、杆状RNA病毒属、螺弧菌微小噬菌体、菜豆金色花叶病毒属、P潜隐病毒属、P脂毛噬菌体、病毒属、P逆转录病毒属、P四病毒属、博卡病毒属、波納病毒属、茧蜂病毒属、短颈浓核病毒属、雀麦花叶病毒属、大麦黄化花叶病毒属、毛状病毒属、山羊痘病毒属、心病毒属、香石竹潜病毒属、香石竹斑驳病毒属、花椰菜花叶病毒属、香石竹斑驳病毒属(Cavemovirus)、衣原体微小噬菌体、绿藻病毒属、绿色虹彩病毒属、青霉病毒属、圆环病毒属、线形病毒属、颗石藻类病毒属、科罗拉多壁虱热病毒属属(ColUvirus)、豇豆花叶病毒属、冠状病毒属、被盖病毒属、蟋蟀麻痺病毒属、南瓜花叶病毒属、甜菜曲顶病毒属、质型多角体病毒属、嚢状病毒属、巨细胞病毒属、质型弹状病毒属、香石竹病毒属(Dainthovirus)、5乳头瘤病毒属、5逆转录病毒属、浓核病毒属、依赖病毒属、依波拉病毒属、碗豆耳突花叶病毒属、肠道病毒属、昆虫双片段RNA病毒属、A昆虫痘病毒属、B昆虫痘病毒属、C昆虫痘病毒属、短暂热病毒属、s乳头瘤病毒属、s反转录病毒属、马鼻病毒属、马鼻病毒属、红细胞病毒属、A乳头瘤病毒属、蚕豆萎蔫病毒属、斐济病毒属、黄病毒属、凹陷病毒属、微小纺锤形喧菌体、Y脂毛噬菌体(Gammalipothrixvirus)、y乳头瘤病毒属、Y逆转录病毒属、贾第鞭毛虫病毒属、颗粒体病毒属、微状病毒属(Guttavirus)、环病毒属(Gyrovirus)、汉坦病毒属、半病毒属、亨尼帕病毒属、肝炎病毒属、嗜肝DNA病毒属、肝病毒属、减毒病毒属、姬蜂病毒属、鮰鱼疱渗病毒属、呼肠孤病毒属、等径易变病毒属、传染性喉气管炎病毒属、流感病毒属A型、流感病毒属B型、流感正粘病毒属C型、丝状病毒属、i乳头瘤病毒属(Iotapapillomavirus)、甘薯病毒属、虹彩病毒属、传染性鲑鱼贫血病毒属、重复病毒属、k乳头瘤病毒属(Kappapapillomavirus)、峰病毒属、兔病毒属、X乳头瘤病毒属(Lambdapapillomavirus)、利什曼原虫病毒属、慢病毒属、野兔痘病毒属，轻小病毒属、黄矮病毒属、淋巴隐伏病毒属、淋巴嚢肿病毒属、狂犬病病毒属、玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)、橙桑花叶病毒属、葡萄斑点病毒属、哺乳动物星状病毒属、栊柑(柑橘)病毒属(Mandarivirus)、玉米雷亚多非纳病毒属、马尔堡病毒属、马立克病毒属、Marnavirus、哺乳动物腺病毒属、玉米线条病毒属、肿大细胞病毒属、Metapneumovirus、转座病毒属、微小病毒属、线粒体病毒属、软祝痘病毒属、麻渗病毒属、M攀pilloraavirus、鼠巨细胞病毒属、苍螞呼肠病毒属(Mycoreovirus)、纳伊罗病毒属、纳米病毒属(Nanovirus)、棵露RNA病毒属、坏死病毒属、线虫传多面体病毒属、诺瓦病毒属、粒外弹状病毒属、核多角体病毒属、核型弹状病毒属、|u乳头瘤病毒属(Nupapillomavirus)、头甲病毒属、雀麦花叶病毒属、co四病毒属、辰型乳头瘤病毒属、环状病毒属、正布尼病毒属(Orthobunyavirus)、正肝去氧核糖核酸病毒属、正痘病毒属、正呼肠孤病毒属、水稻病毒属(Oryzavirus)、帕尼科病毒属(Panicovirus)、副症病毒属、副肠孤病毒属、分病毒属(Patitivirus)、细小病毒属组、黑胸大蠊浓核病毒属、痘疫病毒属、牵牛花叶脉透明样病毒属(Petuvirus)、褐藻病毒属、白蛉病毒属、植物呼肠病毒属、TT乳头瘤病毒属、芽生病毒属、Plectrovi、肺病毒属、马铃薯巻叶病毒属、多瘤病毒属、马铃薯X病毒属、马铃薯Y病毒属、寄生藻病毒属、金藻病毒属、假病毒属、蛙病毒属、针晶藻病毒属、呼吸道病毒属、猴病毒属(Rhadinovirus)、鼻病毒属、玫瑰渗病毒属、轮状病毒属、风疹病毒属、腮腺炎病毒属、古噬菌体、黑麦草花叶病毒属、沙波病毒属、Seadornavirus、伴生病毒属(Sequivirus)、唾液酸酶病毒属、单纯疱渗病毒属、斑驳病毒属、螺旋体微小噬菌体、泡沫病毒属、猪痘病毒属、覆盖层病毒属、捷申病毒属、6乳头瘤病毒属(Thetapapi1lomavirus)、托高土病毒属、番茄丛矮病毒属、番茄伪曲顶病毒属、环状病毒属、番茄斑萎病毒属、全病毒属、发状病毒属、小麦属病毒属、东格鲁病毒属、芜菁黄花叶病毒属、水痘病毒属、水泡性病毒属、水泡渗病毒属、葡萄病毒属、矮化病毒属、白斑病毒属、g乳头瘤病毒属(Xipapillomavirus)、亚塔痘病毒属或C乳头瘤病毒属(Zetapapillomavirus)的病毒。在另一个实施方案中，本发明涉及逆转录病毒科的病毒的基因组中的INS序列。此类病毒的实例包括但不限于a逆转录病毒、P逆转录病毒、5逆转录病毒、s逆转录病毒、y逆转录病毒、泡沫病毒和慢病毒属的病毒。在另外的实施方案中，本发明涉及慢病毒的基因组中的INS序列。此类慢病毒的实例包括但不限于牛免疫缺陷病毒、马感染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、山羊关节炎脑炎病毒、髓鞘脱落-呼吸急促病毒、人免疫缺陷症病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷症病毒2型(HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。AGG基序的过度出现和其在慢病毒科中的保守性，暗示着其在功能上是重要的。据信，AGG序列基序可以是INS序列，且可对具有其的病毒具有抑制效应。例如，据认为本发明的AGG基序可参与通常归因于INS序列的任何和所有抑制效应，包括但不限于保持病毒RNA的低稳定状态水平、减緩病毒的周转和可能的潜伏。AGG基序的发现提供了用于疫苗生产、重组病毒蛋白质的生产、新药的鉴定和用于研究病毒的潜伏等等的新机会。下面更详细地描述此类应用。在一个实施方案中，本发明涉及已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的慢病毒或病毒的核酸，例如HIV核酸。在另一个实施方案中，本发明涉及产生此类突变的方法。可在慢病毒或病毒的基因组中的任何位置(包括编码和非编码区)产生此类突变。例如，在一个实施方案中，突变可存在于慢病毒基因组的gag、;w/和/或e/^基因中。还可在来源于慢病毒或病毒的任何核酸中产生此类突变。本发明包括任何和所有来源于慢病毒或病毒的、已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的核酸以及任何和所有产生此类突变的方法，无论该核酸是否以游离的核酸分子存在于病毒、疫苗林系、质粒、表达栽体或其他地方。通过用另一个核苷酸置换AGG基序中的一个或多个核苷酸可将本发明的AGG基序可突变成任何非AGG序列。例如，可将AGG基序中的第一核苷酸从A突变成G、T、C、U或任何其他天然的或合成的核普酸。可将AGG基序中的第二核苷酸从G突变成A、T、C、U或任何其他天然的或合成的核苷酸。可将AGG基序中的第三核苷酸从G突变成A、T、C、U或任何其他天然的或合成的核苷酸。可改变AGG基序的任何一个位点，或可改变AGG基序的多个位点。例如，可改变AGG基序中的核苷酸位点l、2或3(其中位点l是原先为A的位点，位点2是原先为G的位点，以及位点3是原先为第二个G的位点)。此外，可如上所述改变AGG基序的任何两个位点，或可如上所述改变AGG基序的所有三个位点。将AGG基序突变成非AGG序列还包括其他类型的突变，例如插入一个或多个核苷酸以破坏AGG基序，或从AGG缺失一个或多个核苷酸而不用它们替代其他核苷酸。待改变的AGG基序可位于任何慢病毒、病毒、慢病毒来源的或病毒来源的核酸的任何位置，例如位于编码或非编码区。在其中AGG基序位于编码区的实施方案中，可将AGG基序改变成王改变由所述核酸编码的氨基酸的序列。例如，在AGG基序构成单个密码子，从而编码氨基酸精氨酸(Arg)的情况下，可将基序改变成AGA、CGG、CGA、CGC、CGU或CGT，其各自也编码精氨酸。AGG基序可能跨越编码区中的两个密码子。如果是这样的话，可能再次将AGG基序改变成不必改变由AGG基序跨越的两个密码子中的任一个编码的氨基酸的序列。通过参考遗传密码或RM或DNA密码子表，本领域技术人员可容易地确定如何改变AGG基序中的一个或多个核苷酸位置而不改变所编码的氨基酸。在一些实施方案中，可将AGG基序改变成丕影响所编码的氨基酸的非AGG三核苷酸。此类突变可导致一个或多个不同的氨基酸被编码，或可导致一个或多个氨基酸缺失或添加至氨基酸序列。如果将AGG基序改变成丕影响所编码的氨基酸的非AGG三核苷酸，可能产生不会不利地影响所编码的蛋白质的结构、功能或免疫原性的多个氨基酸改变中的一个。例如，由突变核酸编码的突变蛋白可具有与野生型蛋白基本上相同的结构和/或功能和/或免疫原性。一些氨基酸的改变可能可以导致增加的免疫原性，本领域技术人员知道何时此类修饰是适当的。29可通过本领域内已知的任何合适的诱变方法产生AGG基序至非AGG基序的突变，所述方法包括但不限于，定点诱变、寡核苷酸指导的诱变、阳性抗生素选择法、单一限制性位点消除法(uniquerestrictionsiteelimination，USE)、脱氧尿脊整合法(deoxyuridineincorporation)、磷硫酰整合法(phosphorothioateincorporation)和基于PCR的i秀变法。此类方法的详细内容可见于例如Lewis等人(1990)Nucl.AcidsRes.18，p3439;Bohnsack等人(1996)Meth.Mol.Biol.57，pi;Vavra等人(1996)PromegaNotes58，30;AlteredSitesII/力y/froMutagenesisSystemsTechnicalManual#TM001，PromegaCorporation;Deng等人.(1992)Anal.Biochem.200，p81;Kunkel等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，p488;Kunke等人(1987)Meth.Enzymol.154，p367;Taylor等人(1985)Nucl.AcidsRes.13，p8764;Nakamaye等人(1986)Nucl.AcidsRes.14，p9679;Higuchi等人(1988)Nucl.AcidsRes.16,p7351;Shimada等人(1996)Meth.Mol.Biol.57，pl57;Ho等人(1989)Gene77，p51;Horton等人(1989)Gene77，p61和Sarkar等人(1990)BioTechniques8，p404。用于进行定点诱变的许多试剂盒是可商购获得的，例如获自StratgeneInc.的QuikChangeIISite-DirectedMutagenesis试剂盒和获自PromegaInc的AlteredSitesII体外诱变系统。此类商购可获得的试剂盒还可用于将AGG基序突变成非AGG序列。纽本发明的方法和组合物可以特别地用于疫苗的生产。在感染周期中产生的少量病毒颗粒，结合它们在细胞内长时间保持的能力，限制了慢病毒例如HIV对免疫系统的暴露。该性质对于病毒是有利的，但不利地影响了产生有效疫苗的能力。例如，设计用于感染宿主细胞和在其中复制的病毒疫苗可产生低水平的后代和在宿主细胞中保持长时间的"潜伏"。因此，此类疫苗不能有效地触发免疫反应和免疫记忆。类似地，编码一种或多种慢病毒或病毒抗原的DNA疫苗似乎在宿主中表达低水平的抗原，因而限制了DNA疫苗在产生免疫反应和免疫记忆中的功效。本发明的AGG基序的发现增加了产生突变病毒的可能性，所述突变病毒具有更少的AGG基序，因而具有增加的病毒RNA的稳定状态水平、增加的病毒编码的蛋白质的表达、增加的感染周期和增加的对免疫系统的暴露。此类突变病毒可用作病毒疫苗。下面更详细地描述包含或来源于此类突变病毒的疫苗。本发明的AGG基序的发现还增加了产生突变病毒核酸序列的可能性，所述核酸序列以比在其他情况下高得多的速率(rate)和/或大得多的量产生病毒编码的蛋白质。此类突变核酸可用作DNA疫苗，如在下面更详细地描述的。此外，此类突变核酸还可用于产生用于蛋白质疫苗的病毒蛋白质。下面也更详细地描述了包含或从此类蛋白产生的疫苗。本发明包括预防/防止性疫苗和治疗性疫苗两者。预防性疫苗是对未感染疾病的受试者施用的疫苗，所述疫苗针对所述疾病设计以提供保护。理想的预防性疫苗将阻止病毒在接种的受试者中引起感染，即其将提供完全的保护性免疫。然而，即使其不提供完全的保护性免疫，预防性疫苗仍然可赋予受试者一些保护作用。例如预防性疫苗可减少疾病的症状、严重性和/或持续时间。在HIV的情况下，即使在其不足以提供完全的保护性免疫，预防性疫苗可阻止或延迟典型的艾滋病(fullblownAIDS)的进展。施用治疗性疫苗以减少病毒感染在已感染该病毒的受试者中的影响。治疗性疫苗可减少疾病的症状、严重性和/或持续时间。在HIV的情况下，治疗性疫苗的施用可阻止或延迟典型的艾滋病的进展。本发明包括任何和所有类型的疫苗，所述疫苗包含具有突变的AGG基序的核酸或从具有突变的AGG基序的核酸产生。本文公开了几咱不同类型的疫苗。然而，本领域技术人员会认识到存在其他类型的可使用的疫苗和用于产生疫苗的其他方法。本发明不限定于举例说明的特定类型的疫苗。相反，其包括任何和所有疫苗，所述疫苗包含具有突变的AGG基序的核酸或从具有突变的AGG基序的核酸产生。本发明包括"病毒疫苗"。如本文中所使用的，术语"病毒疫苗，，包括减毒病毒疫苗、灭活的病毒疫苗和病毒载体疫苗。本发明还包括DNA疫苗和蛋白质性质或"亚单位"疫苗，其各自在下文中描述。应当指出，在不同类型的疫苗之间存在明显的重叠。例如，病毒疫苗可包含与用于制备DNA疫苗的核酸相同或相似的核酸。类似地，DNA疫苗和病毒疫苗可表达与用于制备蛋白质性质的疫苗的蛋白质相同或相似的蛋白质。因此，任何一种类型的疫苗的所提供的描述不应当解释为只用于该疫苗类型。相反，所有关于任何一种类型的疫苗的描述可用于和可互换地用于本发明包括的任何和所有类型的疫苗。在某些方面，本发明提供了能够诱导抗包括本发明的慢病毒的病毒的免疫反应、包含SEQIDNO:1的免疫原性组合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物能够改善慢病毒或病毒感染的症状和/或减少慢病毒或病毒感染的持续时间。在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物能够诱导抗病毒感染的保护性免疫。本发明的免疫原性组合物可有效地抗本文公开的慢病毒，还可与慢病毒的多个不同分化体和林系交叉反应和有效地抗所述病毒和抗其他病毒。病毒疫苗A)减毒病毒疫苗在一个实施方案中，本发明提供了具有一个或多个突变的AGG序列的减毒病毒疫苗。减毒病毒是这样的病毒，即所述病毒已进行了改变从而使它们减弱，这样它们就不再引起疾病，但仍然可刺激免疫反应。存在可使病毒减毒的许多方法。例如，可通过除去或破坏引起疾病所需的病毒序列，同时使编码被免疫系统识别的抗原的序列保持完整来使病毒减毒。减毒病毒可以能够或不能够在宿主细胞中复制。能够复制的减毒病毒是有用的，因为病毒在对受试者施用后在体内扩增，从而增加了可获得用于刺激免疫反应的免疫原的量。根据本发明，可获得或产生合适的减毒病毒林，所述减毒病毒抹中的一个或多个AGG序列突变成非AGG序列。已显示几种减毒活病毒疫苗用于保护免受慢病毒或病毒感染。例如，活减毒猿猴免疫缺陷病毒(SIV)已用于保护灵长类免受SIV的攻击。参见，例如，Daniel等人，"Protectiveeffectsofa1iveattenuatedSIVvaccinewithadeletioninthenefgene"(1992)Science258，pl938;Almond等人，"Protectionbyattenuatedsimianimmunodeficiencyvirusinmacaquesagainstchallengewithvirus-infectedcells"(1995)Lancet345，p1342。这些参考资料中公开的减毒方法和减毒病毒林可与本发明组合使用。减毒的其他方法已由Desrosiers等人("Identificationofhighlyattenuatedmutantsofsimianimmunodeficiencyvirus"(1998)J.Virol.72，pl431)和Guan等人("Constructionandinvitropropertiesofaseriesofattenuatedsimianimmunodeficiencyviruseswithallaccessorygenesdeleted"(2001)J.Virol.75，p4056)描述。应当指出，SIV是HIV的常用模型，用于SIV的减毒方法也可用于HIV。公布的专利申请WO/2001/007637描述了经修饰只在四环素类似物存在的情况下复制的活减毒HIV疫苗。已开发了多种其他活减毒HIV林，例如为缺乏nef、vpr、vpu和Nef-应答元件或NRE基因的HIV-1的"54"，和基于54疫苗林但在编码NFkB结合元件的基因中具有额外缺失的"5kURN"。还有几篇描述产生活减毒HIV疫苗的方法的论文。参见例如，Mills等人"LiveattenuatedHIVvaccines:aproposalforfurtherresearchanddevelopment.,，(2000)AIDSResHumRetroviruses16,p1453。可按照本发明4吏用用于减毒的任何此类方法。如果使用的减毒方法涉及病毒基因组内或病毒核酸内的缺失，那么可产生这些突变，使之大到足以减少偶然回复(chancereversion)。例如如果使用此类方法，可缺失20个碱基或更多碱基。B)被杀死的病毒疫苗在另一个实施方案中，本发明提供了具有一个或多个突变的AGG序列的"杀死的"或"灭活的"病毒疫苗。此类疫苗通常是无功能的，从而不表达病毒基因或在接种的受试者中不复制。然而，本发明的方法可用于在灭活病毒之前在体外或离体促进病毒的扩增和生长。例如，通过将病毒中的一个或多个AGG基序突变成非AGG序列时，病毒的扩增速度可增加，从而产生更大量的病毒，然后将其灭活以用作疫苗。本领域内已知的任何合适的灭活方法可用于灭活本发明的突变病毒，例如化学、热或物理灭活法或通过使用电离辐射的辐射进行的灭活。例如，Ilyinskii等人已开发了HIV的物理灭活方法，所述方法以使其成为非感染性而不包含其三级结构和可能的免疫原性的方试，使用气体来破裂/破坏病毒结构(参见Ilyinskii等人"DevelopmentofanInactivatedHIVVaccine"(2001)AIDSVaccineSep5-8;abstractno.192)。其他人已开发了通过使用0.2%P-丙内酯(BPL)化学灭活HIV病毒同时保持其免疫原性的方法(参见Addawe等人"ChemicallyinactivatedwholeHIVvaccineinduceseellularresponsesinmice"(1996)IntConfAIDSJul7-12;11:4;abstractno.Mo.A.100)。完整-灭活的HIV疫苗也已在人试验中进行测试。例如，已在HIV感染的患者中，将通过化学处理和辐射的组合进行灭活的治疗性疫苗Remune(也称为"HIV-1免疫原"、"索尔克疫苗"或"AG1661")作为免疫疗法进行了研究(参见，Fernandez-Cruz等人"5—yearevaluationofatherapeuticvaccine(HIV-lifflinunogen)administeredwithantiretroviralsinpatientswithHIVchronicinfection:inductionoflong-lastingHIV-specificcellularimmunitythatimpactonviralload"(2003)SecondInternationalAIDSSocietyConferenceonHIVPathogenesisandTreatment,Paris,abstract486)。本发明的方法可以与4壬意上述灭活方法或本领域内已知的其他病毒灭活方法组合使用。C)病毒载体疫苗还可将已进行了突变从而将一个或多个AGG序列突变成非AGG序列的本发明的慢病毒或病毒的核酸序列整合入适合用于对受试者施用的病毒载体。慢病毒或病毒的核酸可编码任何慢病毒或病毒的蛋白质，包括但不限于GAG、pl7MA、p24CA、p7和p6、GAG-P0L、34RT、RMaseH、PR、IN、Gpl60、Gpl20ENV、Gp41、Tat、Rev、Vpu、Vif、Vpr和Nef以及其片段、变体、同源物和衍生物。合适的病毒载体的实例包括但不限于痘苗病毒(例如经修饰的痘苗病毒Ankara或"MVA"，用于天花疫苗的牛痘的高度减毒林)、逆转录病毒、痘病毒类(包括金丝雀痘、牛痘和禽痘)腺病毒和腺伴随病毒。与它们的天然病毒相应物相比，可改变这些病毒载体，例如可对它们进行减毒和/或使它们成为非复制性的。本领域技术人员可容易地选择适合的病毒栽体和将本发明的突变核酸插入这^"的载体中。所述突变核酸应当在用于指导慢病毒或病毒的蛋白质在接种的受试者中表达的适合启动子的控制之下。可使用已存在于病毒载体中的启动子。备选地，可使用外源启动子。合适的启动子的实例包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、HIV长末端重复(HIV-LTR)、HTLV-1LTR(HTLV-LTR)和单纯疱渗病毒(HSV)胸苷激酶启动子。可用于将本发明的核酸序列插入病毒表达栽体中的技术对于本领域技术人员来说是熟知的。参见例如Sambrook等人(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y("Sambrook")。本发明的方法还可与本领域内已知的任何类型的病毒载体疫苗组合使用或用作对所述病毒载体疫苗的改进。目前正在开发中的HIV病毒载体疫苗的实例包括包含HIV分化体BGAG-POLNef的Merck的非复制性腺病毒载体、包含分化体BEnv、GAG、Pro、RT和Nef的SanofiPasteur的金丝雀痘栽体和包含分化体BEnv和GAG的Therion的MVA载体。目前在正开发中的这些和其他HIV疫苗的详情由w亂hvtn.org的HIVVaccineTrialsNetwork提供。本发明的方法可以用于提高病毒载体疫苗(例如通过将慢病毒或病毒的核酸组分中的抑制性AGG基序突变成非AGG序列，从而导致提高慢病毒或病毒的蛋白质在接种的受试者中的表达的病毒载体疫苗)的功效。DNA疫苗本发明还包括适合用于对受试者施用的DNA疫苗。可将编码任何慢病毒或病毒的蛋白质或其部分、片段、衍生物或同源物的慢病毒或病毒的核酸(已将所述核酸的一个或多个AGG序列改变成非AGG序列)插入DNA质粒或表达载体以产生根据本发明的DNA疫苗。例如，在一个实施方案中，所述DNA疫苗包含含有一个或多个编码蛋白质的、将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的腺病毒或病毒的核酸的质粒，所述蛋白质选自GAG、pl7MA、p24CA、p7和p6、GAG-P0L、RT、RNAaseH、PR、IN、Gpl60、Gpl20ENV、Gp41、Tat、Rev、Vpu、Vif、Vpr和Nef、以及其片段、变体、同源物和衍生物的。本领域技术人员可容易地选择合适的DNA质粒或表达载体和将本发明的突变核酸插入这样的质粒或表达栽体中。编码慢病毒或病毒的蛋白质的核酸应当在用于指导将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的核酸在接种的受试者中表达的适合启动子的控制之下。可使用已存在于表达载体中的启动子。备选地，可使用外源启动子。合适的启动子的实例包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、HIV长末端重复(HIV-LTR)、HTLV-1LTR(HTLV-国和单纯疱渗病毒(HSV)胸苷激酶启动子。可用于将本发明的核酸序列插入DNA质粒和表达栽体中的技术对于本领域技术人员来说是熟知的。例如，可使用的标准重组DNA技术描述于Sambrook中。本发明的方法还可与本领域内已知的任何类型的慢病毒或病毒DNA疫苗组合使用或用作对所述病毒DNA疫苗的改进。目前正在开发中的DNA疫苗的实例包括包含分化体BGag、Pol、Nef和分化体A、B以及C、Env的NIHDNA质粒、包含分化体BGag和Env的Chiron的DNA质粒以及为包含分化体BGag的DNA质粒的GENEVAX。目前正在开发中的这些和其他HIV疫苗的详情由www.hvtn.org的HIVVaccineTrialsNetwork(HVTN)提供。本发明的方法可以用于提高疫苗(例如通过将慢病毒或病毒的核酸组分中的抑制性AGG基序突变成非AGG序列，从而导致提高慢病毒或病毒的蛋白质在接种的受试者中的表达的疫苗)的功效。蛋白质疫苗本发明还包括蛋白质疫苗。任何慢病毒或病毒的蛋白质南、其片段、衍生物、变体或同源物可用于产生根据本发明的蛋白质疫苗。例如，在一个实施方案中，选择以通过本发明的方法进行修饰的慢病毒或病毒的核酸选自编码GAG、pl7MA、p24CA、p7和p6、GAG-P0L、RT、RNA酶H、PR、IN、Gpl60、Gpl20ENV、Gp41、Tat、Rev、Vpu、Vif、Vpr和Nef的核酸和其片段、变体、同源物和衍生物。使用本发明的方法产生此类疫苗的有利方面是通过将一个或多个AGG基序突变成非AGG序列，可显著增加产生的蛋白质的量和/或蛋白质产生的速率。在一个实施方案中，将通过本发明的方法修饰的慢病毒或病毒的核酸整合入合适的表达载体以允许所述蛋白质在合适的表达系统中表达。合适的表达系统的实例包括但不限于培养的哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌细胞或酵母细胞。然后可在细胞中表达慢病毒或病毒的蛋白质或肽并且对其进行纯化。然后可将纯化的蛋白质整合入适合用于对受试者施用的组合物。用于表达和纯化重组蛋白质的方法和技术在本领域内是熟知的，可使用任何此类合适的方法。可使用任何质粒或表达载体，只要其包含指导慢病毒或病毒的蛋白质在希望的表达系统中表达的启动子。例如，如果要在细菌细胞中产生蛋白质，那么应当使用能够在细菌中指导表达的启动子，如果要在哺乳动物细胞中产生蛋白质，那么应当使用能够在哺乳动物细胞中指导表达的启动子，如果要在昆虫细胞中产生蛋白质，那么应当使用能够在昆虫细胞中指导表达的启动子，如果要在酵母中产生蛋白质，那么应当使用能够在酵母中指导表达的启动子。在另一个实施方案中，在哺乳动物表达系统中从哺乳动物启动子表达蛋白质。合适的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、HIV长末端重复(HIV-LTR)、HTLV-1LTR(HTLV-LTR)、单纯疱療病毒(HSV)胸苷激酶启动子和SV40病毒早期启动子。合适的表达37载体包括但不限于，粘粒、质粒和病毒栽体例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱渗病毒、痘苗病毒、减毒痘苗病毒、金丝雀痘病毒、慢病毒和疱渗病毒等等。还可使用已包舍合适的启动子和用于外源核酸加入的克隆位点的可商购获得的表达载体。可使用任何合适的表达系统，例如细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞表达系统。在另一个实施方案中，在已用本发明的突变的慢病毒或病毒的核酸稳定地或瞬时地转染的哺乳动物细胞中表达慢病毒或病毒的蛋白质。可使用的合适的哺乳动物细胞的实例包括但不限于C0S、CH0、BHK、HEK293、VER0、HeLa、MDCK、WI38和NIH3T3细次代细胞也可用作表达系统。本领域技术人员可容易地选择按照本发明使用的合适的表达系统、启动子和表达栽体。可使用的细胞系和表达载体的组合的实例描述于Sambrook。可用于将本发明的核酸序列插入表达载体的技术对于本领域技术人员来说是熟知的。参见，例如，Sambrook。本发明的方法还可与本领域内已知的任何类型的蛋白质疫苗组合使用或用作对所述蛋白质疫苗的改进。目前正在开发中的蛋白质疫苗的实例包括包含Chiron的蛋白质亚基分化体BEnv,和GlaxoSmithKline的分化体BNef-Tat融合蛋白和分化体BEnv亚基)。本发明的方法可以用于提高疫苗(例如通过将编码各种蛋白质亚基的核酸内的抑制AGG基序突变成非AGG序列的疫苗)的生产功效。本发明的免疫原性组合物可包含亚单位疫苗。亚单位疫苗包括核酸疫苗例如DNA疫苗，所述核酸疫苗包含编码一种或多种病毒蛋白质或亚基，或者这些蛋白质或亚基的部分的核酸。当使用此类疫苗时，给受试者施用所述核酸，在受试者中表达由核酸编码的免疫原性蛋白质或肽，从而在所述受试者中产生了抗所述蛋白质或肽的免疫反应。亚单位苗也可以是蛋白质疫苗，其本身包含病毒的蛋白质或亚基，或者此类蛋白质或亚基的一部分。本发明的亚单位疫苗可编码或包含任何本文公开的慢病毒或病毒的蛋白质或肽或在受试者中具有免疫原性的其任何部分、片段、衍生物或突变体。本领域技术人员可容易地测试本文描述的慢病毒或病毒的蛋白质和肽的免疫原性，且可选择合适的蛋白质或肽用于亚单位疫苗。疫苗组合物本发明的疫苗组合物包含至少一种病毒(包括减毒病毒、灭活的病毒和病毒载体)、核酸或蛋白质，例如上文所述的。所述组合物还可包含一种或多种额外的组分，包括但不限于药学上可接受的载体、緩沖剂、稳定剂、稀释剂(例如水)、防腐剂、增溶剂或免疫调节剂。合适的免疫调节剂包括但不限于促进本发明的疫苗的至少一个组分被免疫系统识别的佐剂、细胞因子、编码细胞因子的多核苷酸和试剂。本领域技术人员可容易地选择合适的添加剂以包含在本发明的疫苗组合物中。本发明的疏水性化合物的载体可以是包含苯甲醇、非极性表面活性剂、可与水混溶的有机聚合物和水相的共溶剂系统。所述共溶剂系统可以是VPD共溶剂系统。VPD是3。/。w/v苯甲醇、8y。w/v的非极性表面活性剂聚山梨醇酯80和65。/。w/v聚乙二醇300在无水乙醇中混合組成的溶液。VPD共溶剂系统(VPD:5W)由用5%的葡萄糖水溶液以1:1稀释的VPD组成。该共溶剂系统充分溶解疏水化合物，且在全身性施用后本身产生低毒性。天然地，共溶剂系统的比例可发生相当大的改变而不破坏其溶解性和毒性特征。此外，共溶剂组分本身可以变化例如，可使用其他低毒性非极性表面活性剂而非聚山梨醇酯80;聚乙二醇的级分大小可以是变化的；其他生物相容性聚合物可取代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；以及其他糖或多糖可替代葡萄糖。备选地，可使用用于疏水免疫原性化合物的其他递送系统。脂质体和乳剂是用于疏水药物的递送媒介物或载体的熟知实例。也可使用某些有机溶剂例如二曱亚砜，尽管通常以更大的毒性代价。此外，可使用持续释放系统例如包含治疗剂的固体疏水聚合物的半透性基质来递送化合物。已建立多种类型的持续释放材料，所述材料对于本领域技术人员来说是熟知的。根据它们的化学性质，持续释放胶囊可从数周至100多天持续释放化合物。根据治疗剂的化学性质和生物学稳定性，可使用用于稳定蛋白质或其他活性成分的另外的策略。所述免疫原性组合物还可包含合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。此类栽体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。可以以与免疫原性相容的平衡离子的盐的形式提供许多本发明的活性成分。此类免疫性可接受的碱加成盐是保持游离酸的生物学有效性和性质的盐和通过与无机或有机碱例如氢氧化钠、氢氧化镁、氨、三烷基胺、二烷基胺、一烷基胺、氨基二羧酸(dibasicaminoacid)、醋酸钠、苯甲酸钾、三乙醇胺等反应获得的盐。本发明的免疫原性组合物可以是本发明的蛋白质或其他活性成分与蛋白质或肽抗原一起的复合物形式。蛋白质和/或肽抗原将刺激信号递送至B淋巴细胞和T淋巴细胞。B淋巴细胞将通过它们的表达免疫球蛋白受体响应抗原。T淋巴细胞将在通过MHC蛋白进行的抗原呈递后，通过T细胞受体(TCR)响应抗原。MHC和结构相关蛋白质(包括宿主细胞上由I类和II类MHC基因编码的蛋白质)用于将肽抗原呈递至T淋巴细胞。还可以以单独的或与可直接向T细胞发信号的共刺激分子一起的纯化的MHC肽复合物形式提供抗原組分。备选地，可将能够结合B细胞上的表面免疫球蛋白和其他分子的抗体以及能够结合T细胞上的TCR和其他分子的抗体与本发明的免疫原性组合物混合。本发明的免疫原性组合物可以脂质体的形式存在，在所述脂质体中，本发明的蛋白质与，除其他可接受的栽体外，在水溶液中以聚集的形式如微团、不溶性单层、液晶或薄片层形式存在的两亲性试剂例如脂质混合。用于脂质体制剂的合适的脂质包括但不限于甘油单酯、甘油二酯、疏苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、^苷、胆汁酸等。此类脂质体制剂的制备在本领域技术人员的水平之内，如在例如美国专利号4，235，871;4,501,728;4，837，028和4，737，323所公开的，其全部通过引用合并入本文。用于疫苗制剂的其他添加剂是已知的且对于本领域技术人员来说是显而易见的。有效量应当对受试者施用"免疫有效量"的本发明的疫苗组合物。如本文中所使用的，术语"免疫有效量"是指能够在受试者中诱导希望的免疫反应或增强所述免疫反应的诱导的量。所述希望的反应可包括，除其他以外，诱导抗体或细胞介导的免疫反应或两者、减少病毒载量、改善感染的症状、延迟症状的发生、减少感染的持续时间等。所述免疫有效量还可以是有效诱导保护性免疫的量。本领域技术人员可容易地确定何为"免疫有效量"而无需过度的实验。例如，可通过常规方法(从低剂量开始，然后不断增加剂量，同时监测免疫效应)确定有效量。当确定施用的最佳量时，可以考虑许多因素，包括受试者的身材大小、年龄和一般身体状况、其他疫苗或药物在受试者中的存在、对受试者进行接种以抵抗的特定病毒的毒性等。可在考虑来自不同实验动物研究的结果后选择实际剂量。递送/施用方案的途径可以以单剂、多剂或使用"初始-加强"方案施用本发明的疫苗组合物。当使用初始-加强方案时，本发明的疫苗可用作"初始"剂或"加强"剂或两者。可通过任何合适的途径或途径的组合施用组合物，所述途径包括但不限于胃肠外、皮内、经皮、皮下、肌内、静脉内、腹膜内、鼻内、口服或眼内途径。还可使用将其上已包被本发明的组合物的颗粒例如金颗粒射入受试者的皮肤的"枪"装置施用所述组合物。本领域技术人员将能够根据选择的递送途径配制所述疫苗组合物。病毒纯化纯化灭活的病毒的方法在领域内是已知的且可包括例如梯度离心、超速离心、连续流动超速离心(continuous-flowultracentrifugation)和层析例如离子交换层析、大小排阻层析和液体亲和层析中的一个或多个方法。另外的纯化方法包括超速离心和diainitration。参见J"PGregersen"HerstellungvonVirussimpfstoffenausZellkulturen"Chapter4.2inPharmazeutischeBiotecnology(eds.0.Kayser和RHMueller)WissenschaftlicheVerlagsgesellschaft，Stuttgart,2000。也参见，0'Neil等人，"VirusHarvestingandAffinityBasedLiquidChromatography.AMethodforVirusConcentrationandPurification",Biotechnology(1993)11:173-177;Prior等人，"ProcessDevelopmentforManufactureofInactivatedHIV-"，PharmaceuticalTechnology(1995)30-52;和Majhdi等人，"IsolationandCharacterizationofaCoronavirusfromElkCalveswithdiarrhea"JournalofClinicalMicrobiology(1995)35(11):2937-2942。适合用于本发明的纯化方法的其他实例包括聚乙二醇或硫酸铵沉淀(参见Trepanier等人，"Concentrationofhumanrespiratorysyncytialvirususingammoniumsulfate,polyethyleneglycolorhollowfiberultrafiltration"JournalofVirologicalMethods(1981)3(4):201-211;Hagen等人，"OptimizationofPoly(ethyleneglycol)PrecipitationofHepatitisVirusUsedtoprepareVAQTA,aHighlyPurifiedInactivatedVaccine"BiotechnologyProgress(1996)12:406-412;和Carlsson等人，"PurificationofInfectiousPancreaticNecrosisVirusbyAnionExchangeChromatographyIncreasestheSpecificInfectivity"JournalofVirologicalMethods(1994)47:27-36)以及超速离心和孩吏量过滤法(参见Pay等人，DevelopmentsinBiologicalStandardization(1985)60:171-174;Tsurumi等人，"Structureandfiltrationperformancesofimprovedcuprammoniumregeneratedcellulosehollowfibre(improvedBMMhollowfibre)forvirusremoval"PolymerJournal(1990)22(12):1085-1100;和Makino等人，"Concentrationof1ive42retroviruswitharegeneratedcellulosehollowfibre,BMM"，ArchivesofVirology(1994)139(1-2):87-96.)。可使用层析例如离子交换层析纯化病毒。层析纯化允许产生大体积的包含病毒的悬浮液。可通过简单的吸附/去吸附机制将目的病毒产物与层析介质相互作用，然后可在单一载荷中处理大体积样品。对于吸附剂不具有亲和力的污染物通过柱子。然后以浓缩的形式洗脱病毒材料。可使用的阴离子交换树脂包括DEAE、EMDTMAE。可使用的阳离子交换树脂可包含磺酸修饰的表面。可使用包含用于第一步骤的强阴离子交换树脂(例如EMDTMAE)和用于第二步骤的EMD-SO.sub.3(阳离子交换树脂)的离子交换层析纯化病毒。金属结合亲和层析步骤可以任选地用于进一步纯化。(参见，例如，wo97/06243)。还可使用树脂例如Fractogel.TM.EMD.。该基于合成的异丁烯酸酯的树脂具有共价附着的长线性聚合物链(所谓的"触须"(tentacle))。该"触须化学物质，，允许大量的空间上易接近的配体结合生物分子而无任何空间位阻。该树脂也具有提高的压力稳定性。基于柱子的液体亲和层析是可用于本发明的另一种纯化方法。用于纯化方法的树脂的一个实例是Matrex.TM.Cellufine.TM.Sulfate(MCS)。MCS由3，000道尔顿的排阻极限的坚硬的球状(大约45-105jim的直径)纤维素基质(其孔结构排阻大分子)组成，所述基质在纤维素的6位置上具有低浓度的硫酸酯官能团)。当官能配体(硫酸酯)相对高度扩散时，其呈现不足的阳离子电荷密度，从而使大部分可溶性蛋白质吸附至珠粒表面上。因此，从柱子上洗出在典型病毒库中发现的大量蛋白质(细胞培养物上清液，例如热原和大部分污染蛋白质，以及核酸和内毒素)，从而获得结合的病毒一定程度的纯化。MCS的坚硬的高强度的珠粒倾向于抗压缩。MCS树脂的压力/流动特征允许高线性流速，进而允许甚至在大柱子中进行高速处理，4吏其成为易于升级的(scalable)单元操作。此外，使用MCS的层析纯化步骤提供了增加保证安全和产物无菌性，从而避免过度的产物操作和安全性考虑。当内毒素不与其结合时，MCS纯化步骤允许快速和无污染的去热原。温和的结合和洗脱条件提供了高容量和产物产量。因此MCS树脂表示用于浓缩、纯化和去热原的简单、快速、有效和节约成本的方法。此外，可重复地再次用MCS树脂。灭活的病毒可通过梯度离心或密度梯度离心进一步纯化。关于商业规模操作，连续流动的蔗糖梯度离心可以是一个选择。该方见JPGregersen"HerstellungvonVirussimpfstoffenausZellkulturen'1Chapter4.2inPharmazeutischeBiotechnology(eds.0.KayserandRHMueller)WissenschaftlicheVerlagsgesellschaft，Stuttgart,2000.)。可用于纯化本发明的病毒的其他纯化方法包括核酸降解剂、核酸降解酶(例如具有DNA酶和RNA酶活性的核酸酶，或者内切核酸酶，例如来自粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescen)的作为Benzonase.TM.商购获得的内切核酸酶)、具有阴离子官能团的膜吸附器(例如Sartobind.TM.)或使用阴离子官能团(例如DEAE或TMAE)的额外的层析步骤的使用。还可向纯化方法中加入超滤/dialfiltration和最终的无菌过滤步骤。本发明的纯化的病毒制备物基本上不含有来源于细胞或细胞培养物的污染性蛋白质，其可包含低于大约1000、500、250、150、100或50pg细胞核酸/jug病毒抗原，和低于大约1000、500、250、150、100或50pg细胞核酸/剂量。纯化的病毒制备物还可包含低于大约20pg或低于大约10pg。测量病毒样品中宿主细胞核酸水平的方法在本领域内是已知的。可使用由监督管理部门例如WHO或FDA批准的或推荐的标准化方法。本发明的其他实施方案在其他实施方案中，本发明涉及用于鉴定抑制或刺激病毒RNA的产生、病毒蛋白质的产生或病毒颗粒的产生的试剂，或者抑制44或刺激病毒的潜伏的试剂的方法。在另一个实施方案中，所述方法包括提供包含至少一个含有至少一个AGG基序的病毒核酸序列的对照细胞和包含至少一个含有至少一个已突变成非AGG序列的AGG基序的病毒核酸序列的受试细胞，将受试细胞和对照细胞与一种或多种试剂接触，以及鉴定至少一种，与对照细胞相比，在受试细胞中抑制或刺激病毒RNA的产生、病毒蛋白质的产生或病毒颗粒的产生的试剂，或者抑制或刺激病毒的潜伏的试剂。在其他实施方案中，本发明涉及用于鉴定抑制或刺激慢病毒RM的产生、慢病毒蛋白质的产生或慢病毒颗粒的产生的试剂，或者抑制或刺激慢病毒的潜伏的试剂的方法。在另一个实施方案中，所述方法包括提供包含至少一个含有至少一个AGG基序的慢病毒或病毒的核酸序列的对照细胞和包含至少一个含有至少一个已突变成非AGG序列的AGG奉序的慢病毒或病毒的核酸序列的受试细胞，将受试细胞和对照细胞与一种或多种试剂接触，以及鉴定至少一种，与对照细胞相比，在受试细胞中抑制或刺激慢病毒或病毒RNA的产生、慢病毒或病毒的蛋白质的产生或慢病毒或病毒的颗粒的产生的试剂，或者抑制或刺激慢病毒或病毒的潜伏的试剂。在一些实施方案中，所述试剂抑制或刺激HIVRM的产生、HIV蛋白质的产生或HIV颗粒的产生、或者抑制或刺激HIV潜伏。例如，可以使用高通量篩选方法以该方式筛选试剂的整个"文库"。本领域技术人员可容易地设计高通量篩选方法以鉴定抑制或刺激慢病毒或病毒RNA的产生、慢病毒或病毒的蛋白质的产生或慢病毒或病毒的颗粒的产生的试剂，或者抑制或刺激慢病毒的潜伏的试剂。用于在多孔板中培养细胞的方法是熟知的，用于向多孔板的不同孔中施用来自试剂文库的不同试剂的方法是已知的。几种方法可用于确定文库试剂对慢病毒或病毒RNA的产生、慢病毒或病毒的蛋白质的产生或慢病毒或病毒的颗粒的产生的影响，或者对慢病毒或病毒的潜伏的影响。例如，用于高通量筛选的细胞可进行改造以编码一种或多种融合蛋白，例如慢病毒或病毒的蛋白质与荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)之间的融合。这样，可通过荧光检测方法监测慢病毒或病毒的蛋白质的产生，所述检测方法使得刺激或抑制慢病毒或病毒的蛋白质的产生的试剂能够被检测到。在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定AGG基序结合剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括提供包含至少一个AGG基序的对照核酸和包含至少一个已突变成非AGG序列的AGG基序的受试核酸，将受试核酸和对照核酸与一种或多种试剂接触，和鉴定至少的亲和力更高的亲和力结合对照核酸的试剂。在另一个实施方案中，所述方法包括提供包含多个重复AGG基序的受试核酸和包含核苷酸的随机组合和顺序的对照核酸，将受试核酸和对照核酸与一种或多种试剂接触，和鉴定至少一种结合受试核酸但不结合受试对照核酸的试剂或以比其与对照核酸结合的亲和力更高的亲和力结合受试核酸的试剂。存在可检测结合这些结构的试剂的许多方法。例如，在一个实施方案中，可在柱子上或一些其他合适的固体基质上提供上述受试核酸和对照核酸，和将受试样品(例如细胞裂解物或受试试剂的文库)通过这些基质。可洗脱和分析结合受试物质和/或对照物质的试剂。在其他实施方案中，酵母单杂交法可用于鉴定结合AGG基序的试剂。在另外的实施方案中，可进行电泳迁移率变动分析(EMSA)以鉴定结合AGG基序的试剂。适合用于鉴定核苷酸结合剂的其他方法在本领域内是已知的，并且任何此类方法可用于鉴定结合AGG基序的试剂。本发明还包括AGG基序结合剂，例如使用本发明的方法的鉴定的AGG基序结合剂。在另一个实施方案中，本发明涉及抑制或刺激AGG结合剂与包含至少一个AGG基序的核酸的结合的试剂和如上所述用于鉴定此类试剂的方法。本发明的这些和其他实施方案进一步描述于下列非限性实施例中。实施例实施例1-鉴定HIV-1基因组中的AGG基序因为遗传密码是简并的，因此核苷酸序列可在核苷酸水平上相互不同但编码相同的蛋白质或肽。然而，在自然界中，通常存在对于特定密码子选择和AT/GC含量的选择性压力。还存在对由核苷酸序列编码的蛋白质中的氨基酸的频率和顺序的选择性压力。就这些选择性压力中的每一种进行标准化，然后计算基因组中预期的序列基序(例如，长度为2至8个核苷酸的序列基序)的平均频率，然后将该频率与该实际频率比较的方法用于寻找序列基序，所述序列基序与人基因组相比，在HIV-1基因组中过度出现或出现不足。该方法描述于共同未决的临时专利申请号60/808,420，和Robins等人(JournalofBacteriology,(2005)第187巻，p.8370-74，其内容通过引用合并入本文。基于上文描述的HIV试剂的生物学知识，HIV基因组可能包含一种或多种INS基序。我们预期这些基序不存在于具有相当富含A的含量(HIV基因组具有高A含量)的宿主(即人)基因中。通过使用上述方法鉴定和研究了具有与HIV相当的A含量的4，000个人基因。鉴定了与预期的频率相比在这些人基因中出现不足的序列基序AGG。发现相同的AGG基序在HIV-1基因组的gag基因和；o/基因中都过度出现。在存在于^g基因中的48个AGG寡核苷酸序列(如图1中所示的)中，超过三分之二不在编码氨基酸的阅读框架中，暗示这些序列由于选择的原因在氨基酸/蛋白质水平上是不保守的。然而第三密码子位置的改变在不同的HIV分离林中是常见的，也发现AGG基序即使在密码子的第三位置中是特别保守的。此外，也发现AGG基序在已分析的400多个不同的HIV-1林系中过度出现(发现全部都包含44至48个拷贝的AGG基序)。这些结果表明AGG基序在人基因组(即在HIV的宿主中)可以是逆向选择的，然而在HIV基因中得到保持和/或富集。总地说来，这些结果表明AGG基序可以是INS序列。在许多种慢病毒中研究AGG基序的存在，所述慢病毒包括HIV-2、几个抹系的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺损病毒(FIV)和马传染性贫血病病毒(EIAV)。发现所有这些病毒具有预期的或高于预期的AGG基序的频率。然而，发现人T细胞白血病病毒(HTLV-1)和人逆转录转座子LINE-1不具有预期的或高于预期的AGG基序的频率。实施例3-用于鉴定其他INS序列的方法HIV基因组可能包含除了AGG基序以外的另外的INS序列。AGG基序也可能形成更大的INS序列的一部分。上述关于鉴定AGG基序的方法可用于在HIV基因组或事实上在任何其他病毒(例如其他慢病毒或其他逆转录病毒)的基因组中发现另外的INS序列。实施例4-AGG基序的功能通过突变一个或多个基序而不改变氨基酸的编码来测试AGG基序的作用。例如，将包含野生型或突变的HIV-1^g序列(各自被HIVLTR调控)的质粒转染(瞬时或稳定地)入相同细胞类型，然后例如使用实时PCR来测量产生的w^mRNA的稳定状态水平。该实验将检测^g基因中的AGG序列是否影响转录速率、该mRNA至细胞质的转运或mRNA的半衰期。使用在^g和po/区域中都具有一个或多个已突变的AGG序列的构建体重复该相同的实验。为了观察AGG基序在蛋白质水平上的作用，使用包含GAG-POL和绿色荧光蛋白(GFP)的编码序列的构建体。然后使用标准的荧光检测方法例如荧光显微术检测产生GAG-POL-GFP的细胞。还可使用流式细胞术和荧光激活细胞分选术。用编码野生型GAG-POL-GFP或突变的GAG-POL-GFP(即具有一个或多个突变成非AGG基序的AGG基序的构建体)的核酸转染细胞。预期在用突变序列转染的细胞中存在水平高得多的被检测到的GFP。如果该实验产生预期的结果，将证明(1)AGG基序是INS序列，和(2)AGGINS序列可用于降低HIVmRNA在细胞中的稳定状态水平。还将检测这些构建体的TAT和REV依赖性。预期用AGG突变构建体转染的细胞即使在TAT和REV不存在的情况下也产生高水平的GAG-POLRNA(比野生型构建体可能高70至130倍)。预期用TAT和/或REV表达构建体或包含TAT和REV编码序列的GAG-POL构建体共转染细胞进一步增加GAG-POLRNA的水平。实施例5-疫苗迄今为止，还没有可商购获得的能够赋予抗HIV攻击的免疫。存在许多理由来解释之前不可能产生这样的疫苗。在产生疫苗中可能引起困难的一个因素可以是HIV在细胞内长期保留的能力。细胞内病毒被保护免受抗体介导(但非CD-8T细胞介导)的免疫。由于其緩慢的细胞内产生速率、其保持在细胞内潜伏的能力和其通过细胞融合从细胞扩散至细胞的能力，HIV病毒能够在细胞内保持隐蔽很长时间。HIV病毒的这些性质可不利地在多个水平上影响产生有效疫苗的能力。在一个水平上，基于HIV病毒的疫苗例如灭活的或减毒HIV疫苗可进入并且保留在宿主细胞中以很长时间，野生型HIV病毒也如此。因此，由于病毒的緩慢生命周期和病毒于细胞外暴露的有限时间，免疫系统不能产生强到足以提供抗使用HIV的随后攻击的保护性免疫。在另一个水平上，由于INS序列例如AGG基序在所使用的核酸构建体中的存在，DNA可表达极低水平的HIV编码的抗原。一般而言，产生的抗原越多，免疫反应将越大。因此，如果产生低水平的HIV抗原，产生的抗这些抗原的免疫反应也将很低。可能可以通过突变用在或用于产生疫苗的病毒核酸内的一个或多个AGG基序来克服这些问题，从而产生更有效的疫苗。例如，可产生其中除了被改变以减少其引起疾病的能力外，也进行了突变以破坏一个或多个AGG基序的减毒HIV疫苗。为了检测上述方法，可产生具有突变的AGG基序的减毒HIV病毒。使用细胞培养系统体外研究这些突变病毒感染宿主细胞、表达编码的HIV蛋白质和产生新的病毒颗粒的能力。同样，使用合适的HIV感染的动物模型测试这些突变病毒在体内在宿主中产生免疫反应的能力。此外，使用SIV病毒和FIV病毒测试相同的方法。产生具有突变的AGG基序的减毒FIV和SIV病毒。使用细胞培养系统体外研究这些突变病毒感染细胞的能力。同样，在体内在对SIV和/或FIV感染易感的宿主中测试这些突变的病毒产生免疫反应的能力。这些SIV和FIV实验将提供用于HIV疫苗/HIV感染的有用模型。此外，猿猴物种中抗SIV疫苗的产生和测试，猫种中抗FIV疫苗的产生和测试本身是有用的。能够在猿猴物种中提供抗SIV攻击的保护作用的免疫组合物和/或能够在猫种中提供抗FIV的保护作用的免疫组合物在本发明的范围内。实施例6-HIV潜伏和AGG基序在潜伏中的作用的模型在与上述实验相似的实验中，将野生型和突变型^g-po/构建体稳定转染入细胞。由于AGG序列的活性，预期具有野生型AGG的整合拷贝的细胞系将产生低水平的GAG和P0LRNA以及蛋白质。由于据认为参与潜伏的随机表型转换(stochasticphenotypicswitching)的现象，还预期一些克隆将不产生任何GAG-POLmRNA或蛋白质。这些克隆将提供潜伏的细胞培养模型。为了将这些表达低水平的GAG-POL的克隆与不表达GAG-POL的克隆区分开，可使用GAG-P0L-GFP表达构建体。因此，可通过荧光检测法检测表达GAG-POL-GFP的细胞，和将细胞分选术(例如焚光激活细胞分选术或FACS)用于分离这两种细胞，即表达和不表达GAG-P0L-GFP的细胞。也可能测试这些克隆以确认它们事实上包含编码GAG-POL-GFP蛋白的核酸的整合的拷贝。根据HIV潜伏的随机表型转换模型，我们预期非表达克隆的百分数将在一些点上开始GAG-POL-GFP的表达。然后可测量GAG-POL基因打开的频率/速率以及影响该转换的环境变量。这样的模型用于鉴定逆转HIV潜伏状从而使病毒对治疗更具反应性的试剂(例如蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、DNA破坏剂和其他试剂)。究AGG基序对潜伏的影响。预期，在REV和TAT不存在的情况下，AGG序列可发挥作用以减少HIVRNA的稳定状态水平。AGG基序还可能能够一并完全消除HIVRNA的产生，如在潜伏期中发生的一样。事实上，AGG基序可能负责HIV的潜伏或是其中的重要因素。实施例7-AGG结合蛋白和试剂已提出，INS序列可通过结合细胞蛋白而起作用，所述蛋白因而发挥作用以产生对于转录是无活性的染色质(参见Schneider等人)。在该研究中，在4,OOO个筛选的基因中鉴定出具有与HIV—样高的AGG频率的9个细胞基因。因此细胞AGG结合蛋白可能存在于人细胞中。为了确定这样的蛋白是否存在，如果存在则分离所述蛋白，用竟争者人DNA清洗将T细胞提取物通过AGG寡核苷酸柱。如果鉴定了这样的蛋白，确定该蛋白质的氨基酸序列，和鉴定编码该蛋白质的基因。如果已鉴定，这样的AGG结合蛋白或模拟所述蛋白的效应(即通过与AGG的结合)的试剂可用于诱导病毒的潜伏。这在一些情况下是希望的一一如果可通过使用试剂的处理诱导潜伏，其可能在感染的宿主中使HIV感染的任何后果减少至最低限度或完全消除。还可预期这样的蛋白或试剂对宿主只有最小的副作用，因为大多数宿主基因具有比HIV的AGG频率低100倍的AGG频率。此外，如果鉴定了这样的AGG结合蛋白，可能筛选阻断或减少所述蛋白对AGG的结合的亲和力或破坏AGG结合活性的试剂。此类试剂可用于逆转HIV病毒周转中的潜伏。此类效应在某些情况下是希望的，例如在增加其他药物和/或疫苗根除HIV感染的能力情况下是希望的。AGG结合蛋白、模拟AGG结合蛋白的效应的试剂以及阻断、减少AGG结合蛋白的亲和力或破坏其活性的试剂的效应可使用本文中描述的方法进行检测，和也可在HIV例如SIV和/或FIV的动物模型中进行检测。51实施例8在HIV-1基因组和人基因组的系统性比较中鉴定多种核苷酸基序在本实施例中，在HIV-1基因组和人基因组的系统性比较中鉴定被怀疑在核限制中起成因作用的多种核苷酸基序。鉴定了在人基因组和HIV-1基因组中编码基因之间具有最大差异表现的短基序AGG。通过使用本发明的方法进行该鉴定。所述方法鉴定了许多在HIV-1基因组和人编码基因之间的表现中展示显著差异的基序。为了分离其对受控实验中表达水平的贡献，本实施例中提供的结果集中于单种基序。修饰Gag的密码子最优化形式，产生同义改变以减少AGG发生的数目上。产生两种质粒，一种具有Gag的原始密码子最优化(CO)序列，另一种具有拥有显著减少的AGG的基序最优化(MO)序列。将所述构建体转染入人上皮细胞系(293细胞)，显示Gag的表达比M0序列的表达高70%。也将Gag的两个序列制备成可注射的小鼠疫苗以测试两种构建体之间的差异抗体反应。使用MO形式的疫苗的小鼠在4周后具有4.5倍大的抗Gag抗体反应。在第4周使用DNA加强并且在第6周进行第二次读取，gap继续加大M0和C0疫苗之间的差异。本发明的方法(上述的Robins-Krasnitz法)在人基因组的编码区中发现不依赖于氨基酸的顺序和密码子选择的短核苦酸基序。密码子选择定义为表示在给定的基因中使用的各密码的总分数。Robins-Krasnitz法的结果是一组长度为2至7个碱基的、在人基因组的编码区出现不足和过度出现的确切的核苷酸基序。将这些基序列与HIV基因组进行比较。Robins-Krasnitz法的第一步骤是产生与人基因组比较的背景序列。该背景是来自受各基因中的氨基酸秩序和密码子选择的约束的人基因组的编码序列的完全随机化形式。可设计随机改变各基因内的各氨基酸的密码子的次序的MonteCarlo程序。表1是举例说明的示例。表1:改组方法的示例<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>获得最大熵分布(MED)的方法包括一组的随机化迭代(iteration)。在编码各氨基酸的核苷酸的三联体中随机地改变它们本身的次序。这是具有8个氨基酸的模拟短蛋白的举例说明性示例。改组法(shufflingprocedure)随机改变L!、L2、L和L的次序和分别地改变仏、H2和H3的次序。每一个迭代产生新的序列。对于本实施例，对于亮氨酸存在12种不同的组合，对于组氨酸存在3个组合，从而产生36个单一序列。在改组法中对它们进行加权以使在大量重复的范围内获得MED。上述改组法产生了一组的随机化序列。从这些序列中获得概率分布。只要总的序列组中发现的各基序的发生数目适度地大，可通过根据其在所有基序的组中的分数估计给定的基序的概率来形成概率分布。在进行改组法后，确定两个分布，从实际序列中发现的真实分布和用作背景的替代的最大熵分布(MED)。信息理论标准用作用于选择出现不足和过度出现的基序的方法。为真实分布和MED之间的差异形成提供最多信息字节的基序是第一选择基序。使用信息理论具有以相同的单位、字节数目输入所有结果的良好特征。这允许不同长度的基序和过度出现或出现不足的基序列的比较。用于计算在两个分布之间贡献最多信息字节的基序的^〉式是Kullback-Leibler距离或相对熵。计算各基序的相对熵贡献，选择最大值。在鉴定序列中表现最不足或表现最过度的基序后，选择下一个出现不足和下一个过度出现的基序。然而，一次不能简单地获得具有下一个最大相对熵的基序。这是因为基序是重叠的，因此给定的基序的出现不足或过度出现影响所有其他基序的分布。CpG的实例举例说明了这一点。在人基因组中，二核苷酸基序CG将具有最大的相对熵。然而，包含CG作为亚组的所有8个三聚体落在前50个最大的相对熵基序中。这单单只是针对CG的选择的人为现象。在重新计算相对熵以发现下一个基序之前，需要除去来自MED的CG的分布。如果基序列称为w，按照相同的量重新调整包含(F的所有基序，这样重新调整20的MED对于^具有与真实分布相同的分布。这迫使w的相对熵变为0，同时，消除来自所有其他基序的^的贡献。重新调整的该选择单一地减少分布之间的总相对熵。重复所述方法，这样可通过MED的重新调整从相对熵一次除去一种基序的分布。然后，选择下一种基序。随着迭代所述方法的继续，发现另外的基序，直至如通过比较改组的基因组所确定的，具有最大剩余相对熵的基序在统计学上不显著为止。始于一组100个在人基因组中表现最不足或表现最过度的基序列，在考虑总"A"含量后，本文中提供的方法鉴定了在HIV基因组和人基因组之间具有最大密度差异的基序。将基序限定于具有在1。/。的平均HIV"A"含量内的"A"含量的人基因的组。然后将HIV基因組中的密度率除以人编码区中的密度。如果人的密度大于HIV的密度，则用其倒数代替所述的量。具有最大密度比率的基序是对于HIVmRNA的核分离的成因信号的预测。考虑到核苷酸的偏爱性，发现在人基因组的编码区中表现极其不足的AGG三联体在HIV中具有高频率。本发明的目的是通过减少基序AGG的频率来再编码HIV的0RF将增加蛋白质表达。对于本研究，实验性测试集中在Gag基因上。这样通过系统性除去所有AGG再编码Gag的密码子最优化序列(称为Adarc-Gag)，以使所述氨基酸序列未进行修饰和不导入非常稀有的密码子。结果是RK-Gag。第一步骤是确定M-Gag与密码子最优化形式Adarc-Gag相比是否具有增加的表达。因为RK-Gag中的修饰取消了部分密码子最优化，因而预期蛋白质表达水平减少，除非基序AGG显著抑制mRNA的加工或转运。为了比较表达水平，用Gag的两种不同形式中的一种体外转染人293细胞。测量蛋白质水平，RK-Gag比密码子最优化的Adarc-Gag高70%(图2)。为了测试表达的几乎两倍的增长对免疫反应的影响，从每一个序列产生DNA疫苗。将这些DNA疫苗注射入Balb/C小鼠的后腿肌肉，然后在4周后提供加强注射。在第4周和第6周时间点上通过抗P24ELISA测量抗Gag抗体滴度(关于详细内容参见方法)。结果见于图3。在小鼠模型中，体外表达的70%的增加转化为成超过5倍的体液免疫反应的差异。再编码Gag基因以减少单个三联体的发生在小鼠模型中显著地提高了对HIVDNA疫苗的免疫反应。该短基序在人编码序列中比在小鼠中更罕见，因此预期结果在人中甚至更显著。需要一組步骤用以临床上有活性的疫苗，所述步骤包括同样再编码ENVORF和测试其诱导免疫反应的能力。另一个步骤可寻找灵长类动物中的中和抗体反应。本工作的目的是提供与现有密码最优化方案相比，再编码HIV0RF可大大提高表现和免疫反应的证据。此外，本发明的方法的应用是产生一组的应当整合入再编码方法的基序的有效方法。通过本发明的方法确定的其他基序的系统性包含具有改进本实施例中展示的大量增加的潜力。权利要求1.已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的病毒核酸。2.权利要求l的病毒核酸，其中所述病毒是慢病毒。3.权利要求l的病毒核酸，其中所述病毒是HIV。4.包含导致一个或多个AGG序列改变成一个或多个非AGG序列的突变的HIV核酸。5.包含导致^g、；o/或e/3r基因中的一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的一个或多个突变的病毒核酸。6.包含导致^sg、po/或e/2r基因中的一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的一个或多个突变的HIV核酸。7.具有在gM基因中拥有少于47个AGG序列的序列的HIV核酸。8.具有在^g基因中拥有少于大约45个AGG序列的序列的HIV核酸。9.具有在gag基因中拥有少于大约43个AGG序列的序列的HIV核酸。10.具有在^g基因中拥有少于大约41个AGG序列的序列的HIV核酸。11.具有在^g基因中拥有少于大约39个AGG序列的序列的HIV核酸。12.具有在^g基因中拥有少于大约37个AGG序列的序列的HIV核酸。13.具有在^2g基因中拥有少于大约35个AGG序列的序列的HIV核酸。14.具有在^2g基因中拥有少于大约33个AGG序列的序列的HIV核酸。15.具有在^g基因中拥有少于大约31个AGG序列的序列的HIV核酸。16.具有在^g基因中拥有少于大约29个AGG序列的序列的HIV核酸。17.具有在^g基因中拥有少于大约27个AGG序列的序列的HIV核酸。18.具有在^g基因中拥有少于大约25个AGG序列的序列的HIV核酸。19.具有在^g基因中拥有少于25个AGG序列的序列的HIV核酸。20.包含一个或多个图1中显示的AGG突变的HIV核酸。21.用于产生具有一个或多个突变的AGG序列的突变病毒核酸的方法，所述方法包括提供包含一个或多个AGG序列的病毒核酸和将一个或多个AGG序列突变成非AGG序列。22.权利要求21的方法，其中如果一个或多个AGG序列存在于编码蛋白质的病毒核酸的区域中，那么选择突变AGG序列产生的非AGG序列以使其不改变由所述病毒核酸编码的蛋白质的氨基酸序列。23.权利要求21的方法，其中如果一个或多个AGG序列存在于编码蛋白质的病毒核酸的区域中，那么选择突变AGG序列产生的非AGG序列以使其不改变由所述病毒核酸编码的蛋白质的结构、功能或免疫原性。24.权利要求21的方法，其中使用如下方法进行将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的步骤，所述方法选自定点诱变、寡核苷酸指导的诱变、阳性抗生素选择法、单一限制性位点消除法、脱氧尿苷整合法、磷疏酰整合法和基于PCR的诱变。25.权利要求21的方法，其中所述病毒核酸包含所述病毒的整个基因組。26.权利要求21的方法，其中所述病毒核酸包含病毒基因组的部分，该部分足以指导病毒颗粒在宿主细胞中的产生。27.权利要求21的方法，其中所述病毒核酸包含病毒基因组的部分，该部分足以指导至少一种病毒蛋白质的表达。28.^5l利要求21的方法，其中所述病毒核酸编码至少一种病毒蛋白质或其片段、衍生物、变体或同源物。29.权利要求28的方法，其中所述病毒核酸编码至少一种选自GAG、P0L、ENV的病毒蛋白质和其片段、衍生物和同源物。30.具有已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的基因组的突变病毒。31.不是慢病毒的重组病毒，其中所述重组病毒包含已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的慢病毒核酸序列。32.包含已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的病毒核酸序列的病毒疫苗。33.包含已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列的HIV核酸序列的HIV病毒疫苗。34.包含具有比野生型病毒的AGG更少的AGG的病毒核酸序列的病毒疫苗。35.包含具有比野生型HIV的AGG更少的AGG的HIV核酸序列的HIV疫苗。36.能够比相应的野生型病毒更高地表达蛋白质的病毒疫苗，其中所述病毒疫苗包含具有比野生型病毒核酸序列更少的AGG序列的核酸序列。37.能够比相应的野生型HIV病毒更高地表达蛋白质的HIV疫苗，其中所述HIV疫苗包含具有比野生型HIV病毒核酸序列更少的AGG序列的核酸序列。38.包含通过表达病毒核酸产生的蛋白质的病毒疫苗，所述病毒核酸已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。39.权利要求38的病毒疫苗，其中在体外在宿主细胞中表达蛋白质。40.权利要求38的病毒疫苗，其中使用无细胞体外转录和翻译系统表达所述蛋白质。41.包含从HIV核酸表达的蛋白质的HIV疫苗，所述HIV核酸已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。42.权利要求41的HIV疫苗，其中在体外在宿主细胞中表达所述蛋白质。43.权利要求41的HIV病毒疫苗，其中使用无细胞体外转录和翻译系统表达所述蛋白质。44.包含权利要求32-43的任一项的疫苗和其他组分的免疫原性组合物，所述其他组分选自药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂和佐剂。45.用于免疫受试者以抗病毒的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的权利要求32、34、36和38-40的任一项的疫苗或免疫原性组合物。46.用于免疫受试者以抗HIV攻击的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的权利要求33、35、37和39-41的任一项的疫苗或免疫原性组合物。47.用于免疫受试者以抗病毒的方法，所迷方法包括对所述受试者施用有效量的编码病毒的核酸，所述核酸已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。48.用于免疫受试者以抗HIV的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的编码人免疫缺陷病毒的核酸，所述核酸已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。49.用于免疫受试者以抗病毒的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的从病毒核酸表达的病毒蛋白质，所述病毒核酸已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。50.用于免疫受试者以抗HIV的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的从HIV核酸表达的蛋白质，所述HIV核酸已进行了突变从而将一个或多个AGG序列改变成非AGG序列。51.用于最优化病毒蛋白质在宿主中的产生的方法，所述方法包括(a)提供(i)宿主细胞，(ii)来自宿主细胞的基因组的至少一部分的核苷酸序列，和(iii)病毒核酸序列；(b)鉴定一个或多个与核苷酸的随机分布相比，在宿主序列中出现不足或在宿主序列中过度出现的核苷酸序列基序，其中各基序长度为大约6个核苷酸；(c)确定所述病毒序列是否包含一个或多个在(b)中鉴定为出现不足或过度出现的基序；(d)改变所述病毒序列以增加出现不足的序列的数目或减少过度出现的序列的数目，或同时进行两者，以在宿主中最优化蛋白质的产生。52.用于最优化用于疫苗产生的病毒核酸序列以使所述病毒核酸序列得到改变，从而获得增加的病毒蛋白质的产生的方法，所述方法包括(a)提供(i)宿主细胞，(ii)来自宿主细胞的基因组的至少一部分的核苷酸序列，和(iii)病毒核酸序列；(b)鉴定一个或多个与核苷酸的随机分布相比，在宿主序列中出现不足或在宿主序列中过度出现的核普酸序列基序，其中各基序长度为大约6-大约12个核苷酸；(c)确定所述病毒序列是否包含一个或多个在(b)中鉴定为出现不足或过度出现的基序；(d)改变所述病毒序列以增加出现不足的序列的数目或减少过度出现的序列的数目，或同时进行两者，以最优化所述病毒核酸序列，从而在宿主中获得增加的蛋白质产量。53.权利要求51或52的方法，其中所述部分的长度为至少50kb。54.权利要求51或52的方法，其中所述部分的长度为至少100kb。55.权利要求51或52的方法，其中所述部分是一个或多个EST序列。56.权利要求51或52的方法，其中所述最优化的病毒核酸序列在宿主细胞中比未最优化的病毒核酸更有效地表达。57.权利要求51或52的方法，其中由所述病毒序列编码的所得氨基酸序列在(d)中的变化后不改变。58.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。59.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。60.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞。61.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是昆虫细胞。62.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细63.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是人细胞。64.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是灵长类动物。65.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是CH0细胞。66.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是小鼠细胞。67.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。68.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是山羊细胞。69.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是绵羊细胞。70.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是鸟类细胞。71.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞是鸡细胞。72.权利要求51或52的方法，其中所述宿主细胞在转基因动物73.权利要求51或52的方法，其中所述鉴定包括a)提供宿主细胞的基因组序列，b)提供随机化的背景基因組，其具有与宿主基因组相同的每个基因的氨基酸含量和密码子选择，但为随机的，c)进行迭代法以在宿主细胞的基因组序列中鉴定长度为大约2-大约7个核苷酸的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列代表如下序列，即该序列最大程度促成背景基因组和宿主细胞基因组之间的差异，其中所述方法包括步骤i)选择最明显地将宿主细胞基因组与背景基因组分开的寡核苷酸序列，ii)再次调整背景概率分布以排除由于步骤(i)中选择的寡核苷酸导致的差异；iii)重复步骤(i)直至背景分布接近宿主的分布，从而鉴定与核苷酸的随机分布相比，在宿主序列中出现不足或在宿主序列中过度出现的核苷酸序列基序。74.增加宿主细胞或宿主生物中目的病毒蛋白质的产量的方法，其中所述蛋白质对于宿主来说是外源的，所述方法包括置换编码所述蛋白质的核酸序列中的一个或多个核苦酸，这样所述置换在所述核酸序列内产生与随机分布相比，在所述宿主的核苷酸序列中过度出现的一个或多个序列基序，其中使用如下方法来鉴定在所述宿主的核苷酸序列中过度出现的片段，所述方法包括a)提供所述宿主细胞的基因组序列，b)提供随机化的背景基因组，其具有与所述宿主细胞基因组相同的每个基因的氨基酸含量和密码子选择，但为随机的c)进行迭代法以在所述宿主细胞的基因组序列中鉴定长度为大约2-大约7个核苷酸的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列代表这样的序列，即该序列最大程度促成所述背景基因组和所述宿主细胞基因组之间的差异，其中所述方法包括步骤i)选择最明显地将所述宿主细胞基因组与所述背景基因组分开的寡核苷酸序列ii)再次调整背景概率分布以排除由于步骤(i)中选择的寡核苷酸导致的差异；iii)重复步骤(i)直至背景分布接近所述宿主的分布，从而鉴定与核苷酸的随机分布相比，在所述宿主序列中出现不足或在所述宿主序列中过度出现的核苷酸序列片段。75.增加宿主细胞或宿主生物中病毒蛋白质的产量的方法，其中所述蛋白质对于宿主来说是外源的，所述方法包括置换编码目的病毒蛋白质的核酸序列中的一个或多个核苷酸，这样所述置换在外源核酸序列内除去与核苷酸的随机分布相比，在所述宿主的核苷酸序列中出现不足的一个或多个序列基序，其中使用如下方法鉴定或确定在所述宿主的核苷酸序列中出现不足的基序，所述方法包括a)提供所述宿主细胞的基因组序列，b)提供随机化的背景基因组，其具有与所述宿主细胞基因組相同的每个基因的氨基酸含量和密码子选择，但为随机的c)进行迭代法以在所述宿主细胞的基因组中鉴定长度为大约2-大约7个核苷酸的寡核苷酸序列，所述序列代表这样的序列，即该序列最大程度促成所述背景基因組和所述宿主细胞基因组之间的差异，其中所述方法包括步骤i)选择最明显地将所述宿主细胞基因组与所述背景基因组分开的寡核苷酸序列，H)再次调整背景概率分布以排除由于步骤(i)中选择的寡核苷酸而导致的差异，和Hi)重复步骤(i)直至背景分布接近所述宿主的分布；从而鉴定与核普酸的随机分布相比，在所述宿主序列中出现不足或在所述宿主序列中过度出现的核苷酸序列片段。76.用于鉴定抑制或刺激病毒RNA、病毒蛋白质或病毒颗粒的产生，或者抑制或刺激病毒的潜伏的试剂的方法，所述方法包括，(a)提供包含至少一个含有至少一个AGG基序的病毒核酸序列的对照细胞，和包含至少一个含有至少一个已突变成非AGG序列的AGG基序的病毒核酸序列的受试细胞，(b)将所述受试细胞和所述对照细胞与一种或多种试剂接触，和(c)鉴定至少一种试剂，与在所述受试细胞中相比，所述试剂在所述对照细胞中抑制或刺激病毒RNA的产生、慢病毒蛋白质的产生、病毒颗粒的产生，或者抑制或刺激病毒的潜伏。77.用于鉴定AGG结合剂的方法，所述方法包括(a)提供包含至少一个AGG基序的核酸，(b)将所述核酸与一种或多种试剂接触，和(C)鉴定至少一种结合所述核酸的试剂。78.用于鉴定AGG基序结合剂的方法，所述方法包括(a)提供包含至少一个AGG基序的对照核酸，和包含至少一个已突变成非AGG序列的AGG基序的受试核酸，(b)将所述受试核酸和所述对照核酸与一种或多种试剂接触，和(c)鉴定至少一种结合所述对照核酸但不结合所述受试核酸的试剂。79.用于鉴定结合AGG基序的试剂的的方法，所述方法包括，(a)提供包含至少一个含有至少一个AGG基序的病毒核酸序列的对照细胞，和包含至少一个含有至少一个已突变成非AGG序列的AGG基序的病毒核酸序列的受试细胞，(b)将所述受试细胞和所述对照细胞与一种或多种试剂接触，和(c)鉴定至少一种试剂，与所述受试细胞相比，所述试剂在所述对照细胞中抑制或刺激病毒RNA的产生、病毒蛋白质的产生、病毒颗粒的产生，或者抑制或刺激病毒的潜伏。80.使用权利要求77-79的任一项的方法鉴定的AGG基序结合剂。81.抑制或刺激AGG结合剂与包含至少一个AGG基序的核酸的结合的试剂。82.用于鉴定抑制或刺激AGG结合剂与包含至少一个AGG基序的核酸的结合的试剂的方法，所述方法包括，(a)提供包含至少一个AGG基序的核酸，(b)将所述核酸与AGG结合剂和至少一种第二试剂接触，和(c)鉴定抑制或刺激AGG结合剂与所述核酸的结合的第二试剂。83.权利要求5、21、30、32、34、36、38、44、45、47、49、51、52、74、75、76或79的任一项的方法，其中所述病毒是慢病毒。84.权利要求5、21、30、32、34、36、38、44、45、47、49、51、52、74、75、76或79的任一项的方法，其中所述病毒是HIV。全文摘要本发明涉及慢病毒基因组中的抑制性核苷酸信号序列或“INS”序列。具体地，本发明涉及存在于所有病毒基因组中的AGG基序。AGG基序可以例如通过减少或维持病毒RNA在宿主细胞中的低稳定状态水平，以及诱导和/或维持病毒的潜伏来对病毒具有抑制效应。在一个方面，本发明提供了包含病毒核酸或从病毒核酸产生的疫苗，在所述病毒核酸中，已对AGG序列进行了突变。在另一个方面，本发明提供了用于影响AGG基序的功能的方法和组合物以及用于鉴定病毒基因组中其他INS序列的方法。文档编号C07H21/00GK101600727SQ200780033577公开日2009年12月9日申请日期2007年7月12日优先权日2006年7月13日发明者A·勒维纳,D·威登,H·洛宾斯,M·科拉森内兹,R·拉巴丹申请人:高等研究学院