专利名称：具有np-i拮抗活性的精氨酸衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有NP-1拮抗活性并具有潜在治疗作用的肽模拟物。
背景技术：
一种非酪氨酸激酶跨膜蛋白——神经毡蛋白-1(neuropilin-1，NP-1)，是血管生成细胞因子VEGF家族成员(特别是VEGF-A165)的受体，也是名为脑信号蛋白(semaphorin)或脑衰蛋白家族分子的受体，脑信号蛋白或脑衰蛋白对于哺乳动物发育过程中的神经轴轴突的导向具有重要作用。具体而言，已知NP-1可介导脑信号蛋白3A的生长锥萎陷和化学排斥活性。NP-1已显示出在初次T细胞免疫应答中起作用。
在很多疾病中NP-1都发挥重要的病理学作用。这些疾病包括中风、缺血性眼病、癌症和类风湿性关节炎。
发明内容
已发现具有NP-1拮抗剂活性的新化合物。
本发明的第一方面为一种式I或式II的化合物或者其可药用的盐、溶剂合物或多晶型物，
其中 X为CH2、C(O)、NH、O或SO2； Y为连接键或亚呋喃基(furanylene)； Z1为亚芳基或杂芳基； Z2为连接键、SO2NH、CONH或NHCONH基团； Z3为芳基或杂芳基； Z4为CH2或NR1； Z5为H、OH、C(O)OR1或P(O)(OR1)2； Z6为OR1或NHR2； 每个R1独立地为H或烷基； 每个R2独立地为H或CN、OH或SO2CH3基团；并且 n为0、1或2。
具体实施方案 该化合物优选为式I的化合物，其中X、Y、Z1-6和R1-2如上定义。
应理解，本发明的化合物含有不对称取代的碳原子。式(I)化合物中存在的不对称中心可导致立体异构体的产生，对于每种情况，都应认为本发明涵盖包括对映异构体和非对映异构体在内的所有这类立体异构体、及其包括消旋和非消旋混合物在内的所有混合物。
还应理解，本发明的特定化合物存在互变异构体，它们也被包括在本发明的范围之内。这些互变异构体可在氢原子发生形式上的迁移并且单键与相邻的双键之间发生转换后形成。互变异构化的方法是本领域技术人员熟知的。
本申请中单独使用或结合使用的术语“烷基”是指直链或支链烷基部分，包括例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基等。
术语“芳基”意为芳族烃部分，包括苯基、联苯基或萘基基团。芳环可被取代，例如被NO2基团取代。
术语“亚芳基”意为二价的芳族烃部分，包括亚苯基、亚联苯基或亚萘基。亚芳环可被取代，例如被NH2基团取代。
术语“杂芳基”是指至少一个环原子选自O、N或S的单价或二价的芳环体系，包括例如，苯并稠合的呋喃基、亚噻吩基、亚噻吩基(苯基)、吡啶基、吲哚基、哒嗪基、哌嗪基、嘧啶基、亚噻唑基(thiazolylene)等。
本发明的化合物的活性是指它们可用于治疗NP-1具有重要病理学作用的疾病。本发明的化合物可用于促进神经修复、用于治疗神经变性，以及用于抗癌治疗。它们还可用于治疗需要调节免疫系统的疾病，例如移植手术之后。其他可使用本发明的化合物治疗的疾病包括皮肤疾病(例如银屑病)、需要免疫调节的疾病、眼部血管新生、糖尿病、黄斑变性、青光眼和心力衰竭。
为用于治疗，可通过使用本领域普通技术人员已知的方法和组分配制本发明的化合物的制剂并进行给药。本发明化合物的合适剂量可由普通技术人员根据常见因素来选择，例如，待治疗的受试者的疾病状况、化合物的效能、给药途径等。合适的给药途径包括口服、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内和皮下给药。
NP-1拮抗剂可与脑信号蛋白-3A竞争结合NP-1，从而拮抗脑信号蛋白-3A对轴突生长和神经细胞迁移的抑制作用。该原理可应用于刺激神经突生长、促进神经修复或治疗神经变性。此外，NP-1拮抗剂可提高脑信号蛋白-3A反应性神经元的存活率，该作用可证实或强化它在上述应用范围内的用途，并可扩展其应用至，例如治疗如在中风和某些眼病中由于局部缺血发作所致的神经元死亡。
最近的证据证明了NP-1在血管生成中的作用。该证据显示，NP-1可能是癌症、眼病、类风湿性关节炎和其他疾病中VEGF诱导的血管生成所必需的。因此，NP-1拮抗剂可用于抑制疾病中依赖VEGF的血管生成。
NP-1拮抗剂也可在调节免疫系统中发挥作用。因此，在进行移植之前，期间或移植之后给予本发明的化合物是有用的。
此外，NP-1拮抗剂可与VEGF竞争结合肿瘤细胞中的NP-1并促进表达NP-1的肿瘤细胞的细胞死亡。对应的潜在用途是可用于抗肿瘤治疗。此外，NP-1拮抗剂由于其可有效抑制癌细胞粘附于细胞外基质蛋白以及细胞迁移而具有抗转移作用。
通过以下实施例对本发明进行举例说明。本文提供了合成本发明的肽模拟物的一般路线。还给出了固相和溶液相实验的具体实验内容。
缩写 Ar芳基；Arg精氨酸；Boc叔丁氧羰基；Trt三苯甲基；tBu叔丁基；Acm乙酰氨基甲基；DIC二异丙基碳二亚胺；DIPEAN，N-二异丙基乙胺；Et乙基；Fmoc，9-芴甲氧羰基；HATU2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐；HBTU2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐；HetAr杂芳基；HOBt1-羟基苯并三唑；HPLC高效液相色谱；LC-MS液相色谱质谱；Me甲基；Pbf2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；PG，保护基团；py，吡啶；PyBrOP，三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐；THF，四氢呋喃；TLC，薄层色谱。
固相 定义和终化合物表征 磺酰胺类合成的一般步骤
在氮气气氛中，于20℃下，将3-氨基噻吩-2-甲酸甲酯(100-500mg，1eq)与相应的芳基磺酰氯(1.1eq)一起在吡啶(5mL)中搅拌18小时。
采用TLC监测反应，在此之后，向反应混合物中加入水(约1mL)并在真空条件下除去溶剂。使所得的红色/粉红色固体在1M盐酸(水溶液，20mL)和乙酸乙酯(20mL)之间分配。分离各相，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取水相。合并有机相，并用水(25mL)、盐水(饱和水溶液，25mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，真空条件下除去溶剂，通常得到红色/棕色油性固体。之后采用闪式硅胶柱色谱纯化该固体(洗脱剂为25:75的乙酸乙酯异己烷)。
向搅拌中的含苯胺(1.5mmol，1eq)、游离酸(1.5mmol，1eq)和N，N-二异丙基乙胺(3eq)的乙腈溶液(5mL)中加入三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(1eq)。然后在85℃将反应混合物搅拌20h。此后，在真空下除去反应溶剂，并将剩余物溶解于乙酸乙酯(15mL)中。
噻吩氨基酸与磺酰氯反应的一般步骤
将胺(1eq)溶解于1，4-二噁烷(7.5mL)，将碳酸钠(5eq)溶解于水(7.5mL)中，将两溶液合并强力搅拌。在1小时内按份加入磺酰氯(1.5-2.5eq)，室温下将棕色反应混合物搅拌48小时。此后，反应溶剂减至一半体积，并用水(15mL)稀释。用乙醚(15mL)洗涤该相后，用硫酸氢钾(10％水溶液)酸化。用乙酸乙酯将得到的沉淀物萃取出来，分离各相，在真空下除去溶剂得到棕色半固体，该半固体用闪式硅胶柱色谱纯化得到目的化合物(洗脱剂从50:50的乙酸乙酯:异己烷增至 10:90的甲醇/乙酸乙酯)。
酯结构单元/中间体溶液相PyBroP偶联的一般步骤
将羧酸(20-250mg，1eq)和三吡咯烷基溴化鳞六氟磷酸盐(1.1eq)悬浮于二氯甲烷(5mL)中，在20℃将混合物搅拌10分钟。将N，N-二异丙基乙胺(7eq)加至该混合物中，继续搅拌10分钟。加入合适的胺(1.1eq)后在20℃将反应混合物搅拌24-48小时。此后，在真空下除去反应溶剂，使剩余物在盐酸(1M水溶液，20mL)和乙酸乙酯(20mL)之间分配。分离各相，并用乙酸乙酯(3×20mL)萃取水相。合并有机相，并用盐水(饱和的水溶液，25mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，真空下除去溶剂得到粗品剩余物。
除去Fmoc-Arg-Wang树脂的Fmoc基团的一般步骤
用N，N-二甲基甲酰胺(2ml)溶胀Fmoc-Arg-Wang树脂(一般为100mg，1eq)30分钟。除去N，N-二甲基甲酰胺，加入含哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(2ml，1:5)，搅拌树脂5分钟。除去溶剂，再加入含哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(2ml，1:5)，再搅拌15分钟。除去溶剂，用二氯甲烷(5mL)、甲醇(5ml)、N，N-二甲基甲酰胺(5ml)洗涤树脂，并真空干燥。进行Kaiser试验，如果为阳性(即存在游离胺)就认为该树脂适于下一步转化。
将羧酸支架与Arg-Wang树脂偶联的一般步骤
方法A(DIC/HOBt) 将支架(3eq)、1-羟基苯并三唑水合物(3eq)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(3eq)溶于N，N-二甲基甲酰胺(2mL)，并加至树脂中。将反应混合物室温搅拌3小时，但部分支架搅拌18小时。除去树脂中的反应物，用二氯甲烷(5mL)、甲醇(5mL)和N，N-二甲基甲酰胺(5mL)洗涤树脂。进行Kaiser试验，如果为阴性(即不存在游离胺)就认为树脂适于下一步转化。
方法B(HBTU/HOBt/DIPEA) 将支架(3eq)、1-羟基苯并三唑水合物(3eq)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(3eq)溶于N，N-二甲基甲酰胺(2mL)，并加至树脂中。加入N，N-二异丙基乙胺(9eq)，室温下搅拌反应混合物3小时，但部分支架搅拌18小时。除去树脂中的反应物，用二氯甲烷(5mL)、甲醇(5mL)和N，N-二甲基甲酰胺(5mL)洗涤树脂。进行Kaiser试验，如果为阴性(即不存在游离胺)就认为树脂适于下一步转化。
方法C(PyBrOP/DIPEA) 将支架(3eq)、三吡咯烷基溴化鳞六氟磷酸盐(4eq)溶于N，N-二甲基甲酰胺(2mL)或二氯甲烷/N-甲基-2-吡咯烷酮(2mL，19:1)中，并加至树脂中。加入N，N-二异丙基乙胺(9eq)，室温下搅拌反应混合物3小时，但部分支架搅拌18小时。除去树脂中的反应物，用二氯甲烷(5mL)、甲醇(5mL)和N，N-二甲基甲酰胺(5mL)洗涤树脂。进行Kaiser试验，如果为阴性(即不存在游离胺)就认为树脂适于下一步转化。将得到的树脂真空干燥，然后脱保护/裂解。
磺酰胺类固相合成的一般步骤
用二氯甲烷(3×5mL)洗涤N末端苯胺树脂(一般为100mg，1eq)，将4-硝基苯磺酰氯(5eq)加入无水二氯甲烷(2mL)中，然后加入三乙胺(3eq)。之后在室温下搅拌反应混合物16小时。除去反应物，用二氯甲烷(2×5mL)、甲醇(2×5mL)和N，N-二甲基甲酰胺(2×5mL)洗涤树脂。进行氯醌试验，如果为阴性(即不存在游离苯胺)就认为树脂适于下一步转化。
脲固相合成的一般步骤
用二氯甲烷(3×5mL)洗涤N端基苯胺树脂(一般为100mg，1eq)，将4-硝基苯基异氰酸酯(5eq)加入二氯甲烷(2mL)中，并在室温下将反应混合物搅拌16小时。之后，除去反应物，用二氯甲烷(2×5mL)、甲醇(2×5mL)和N，N-二甲基甲酰胺(2×5mL)洗涤树脂。进行氯醌试验，如果为阴性(即不存在游离苯胺)就认为树脂适于下一步转化。
将酸与结合有树脂的苯胺化合物偶联的一般步骤
用尽量少量的二氯甲烷将苯胺树脂(一般为100mg，1eq)溶胀20分钟，同时，在室温下搅拌酸(4eq)、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(4.8eq)和2，6-卢剔啶(15eq)15分钟，并将其加至预先溶胀的树脂中。然后在室温下搅拌反应混合物24小时，以实现偶联，然后用N，N-二甲基甲酰胺(3×10ml)、N，N-二甲基甲酰胺N，N-二异丙基乙胺(1:1，3×10ml)洗涤，再用N，N-二甲基甲酰胺(3×10m1)、二氯甲烷(3×10ml)、甲醇(3×10ml)和乙醚(3×10ml)洗涤。进行针对苯胺的氯醌试验，如果为阴性(即不存在游离的胺类)就认为树脂适于裂解。
结合树脂的芳族硝基化合物还原的一般步骤
用N，N-二甲基甲酰胺(2mL)将含硝基的树脂(一般为100mg，1eq)溶胀30分钟。除去N，N-二甲基甲酰胺，在含树脂的N，N-二甲基甲酰胺(2mL)中加入二水氯化锡(10eq)，并在室温下将反应混合物搅拌3小时，然后继续搅拌18小时(与新反应物一起)。除去反应物，并用N，N-二甲基甲酰胺(5mL)、20％的吡啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)、二氯甲烷(5mL)、甲醇(5mL)和N，N-二甲基甲酰胺(5mL)洗涤树脂。进行针对苯胺的氯醌试验，如果为阳性(即存在游离的胺类)就认为树脂适于裂解。将所得树脂真空干燥，然后脱保护/裂解。
固相还原性胺化的一般步骤
用二氯甲烷(2×5mL)洗涤含3及4-氨基苯基的树脂(一般为100mg，1eq)。向洗涤后的树脂的乙酸-1，2二氯乙烷(2mL，98:2)溶液中加入醛(10eq)，在20℃将反应混合物搅拌3小时。加入三乙酰氧基硼氢化钠(20eq)，在20℃将反应混合物搅拌2天。除去反应物，用二氯甲烷(2×5mL)、甲醇(2×5mL)、N，N-二甲基甲酰胺(2×5mL)和二氯甲烷(2×5mL)洗涤树脂。将所得树脂真空干燥，然后脱保护/裂解。
固相Sonogashira反应的一般步骤
将含溴的树脂(一般为100mg，1eq)、炔(5eq)和碘化铜(0.2eq)悬于脱气的N，N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃(5mL，1:1)中。加入三乙胺(5eq)，将反应混合物进一步脱气，加入四(三苯基膦)合钯(0)(0.1mg)，并在90℃将反应混合物搅拌18小时。之后，过滤树脂，并用N，N-二甲基甲酰胺/四氢呋喃(1:1，15mL)、N，N-二甲基甲酰胺/水(2×15mL)、N，N-二甲基甲酰胺(15mL)、二氯甲烷(15mL)、甲醇(15mL)和乙醚(14mL)洗涤树脂。将所得树脂真空干燥，然后脱保护/裂解。
固相铃木反应的一般步骤
将含溴的树脂(一般为100mg，1eq)、硼酸(1-5eq)和碳酸钠(10eq，2M，水溶液)悬于脱气的N，N-二甲基甲酰胺四氢呋喃(1:1，4mL)中。加入[1，1′-双(二苯基膦)二茂铁]二氯钯(II)(与二氯甲烷复合，约5mg)，并将溶液进一步脱气。在100℃下温和搅拌反应混合物18小时。之后将树脂过滤，并用N，N-二甲基甲酰胺(15mL)、N，N-二甲基甲酰胺/水(15mL)、N，N-二甲基甲酰胺(15mL)、二氯甲烷(15mL)、甲醇(15mL)和乙醚(14mL)洗涤树脂。将所得树脂真空干燥，然后脱保护/裂解。
裂解Arg-Wang的一般步骤
用二氯甲烷(3×5mL)充分洗涤肽模拟物的树脂(约100mg)，并用氮气干燥，之后，加入三氟乙酸(1.9mL)、三异丙基硅烷(50μL)和水(50μL)的溶液，将裂解混合物搅拌90分钟。取出裂解混合物，用二氯甲烷(1mL)进一步洗涤树脂。将裂解物/二氯甲烷混合物合并，继续搅拌90分钟，逐滴加至冷乙醚(30mL，-78℃)中。沉淀出白色固体，将其离心成小球，倾去乙醚，加入另一份冷乙醚(20mL)，充分混合，离心并倾去。该过程重复一次。将最终的化合物粗品真空干燥，并用2g的C18柱(洗脱剂乙腈/水)洗脱纯化，或者用制备型C18柱(Phenomenex Gemini，50 x 21.2mm，5μm)通过(连质谱的)制备型LC-MS以如下条件洗脱纯化AB线性梯度(B从5％至95％)洗脱15分钟，流速20mL/分钟，其中洗脱剂A为0.1％甲酸/水，洗脱剂B为0.1％甲酸/乙腈。然后将纯化的肽模拟物冻干(-54℃，0.08mbar)，并通过反相LC-MS(分析型C18柱，Thermo Betabasic，100×4.6mm，5μm)进行分析，色谱条件为AB梯度(B从5％至95％)洗脱11分钟，流速1mL/分钟，其中洗脱剂A为0.1％甲酸/水，洗脱剂B为0.1％甲酸/乙腈。
所有的终化合物以三氟乙酸盐的形式分离。
表1归纳了使用上述方法制备的终化合物。
表1
α-羰基胍化合物的制备 溶液相PyBroP偶联的一般步骤
将羧酸(200-300mg，1eq)和三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(1.1eq)悬于二氯甲烷(5mL)中，在20℃搅拌混合物10分钟。向该混合物中加入N，N-二异丙基乙胺(7eq)，继续搅拌10分钟。加入经适当保护的胺(来自天冬氨酸，1.1eq)，然后在20℃搅拌反应混合物2天。之后，真空下除去反应溶剂，使剩余物在盐酸(1M水溶液，20mL)和乙酸乙酯(20mL)间分配。分离各相，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取水相。合并有机相，用盐水(饱和的水溶液，25mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，真空下除去溶剂得到剩余物粗品。
表2归纳了使用上述方法制备的化合物。
表2
溶液相PyBroP偶联(侧链酸偶联)的一般步骤
将具有合适侧链的羧酸(50-150mg，1eq)和三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(1.5eq)悬于二氯甲烷(5mL)中，在20℃搅拌该混合物10分钟。向混合物中加入N，N-二异丙基乙胺(9eq)，继续搅拌该溶液10分钟。加入叔丁氧基羰基胍(1.5eq，根据参考文献1制备)后在20℃搅拌该反应混合物20小时。之后，真空下除去反应溶剂，并使剩余物在盐酸(1M水溶液，20mL)和乙酸乙酯(20mL)之间分配。分离各相，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取水相。合并有机相，用盐水(饱和的水溶液，25mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，真空下除去溶剂得到剩余物粗品。
表3归纳了使用该方法制备的化合物。
表3
EG00247；(S)-5-胍基-2-{[3-(4-硝基-苯磺酰氨基)-噻吩-2-羰基]-氨基}-5-氧-戊酸
在80℃下将(S)-5-(叔丁氧羰基)-胍基-2-{[3-(4-硝基-苯磺酰氨基)-噻吩-2-羰基]-氨基}-5-氧-戊酸甲酯(10mg，0.016mmol)和盐酸(2M水溶液:四氢呋喃；1:1)混合搅拌4小时。之后，真空下除去反应溶剂，剩余物粗品经2gC18柱洗脱纯化(洗脱剂:水，然后是乙腈:水，20:80)得到所需化合物，该化合物以盐酸盐的形式分离。
EG00302；(S)-2-{[3-(苯并[1，2，5]噻二唑-4-磺酰氨基)-噻吩-2-羰基]-氨基}-5-胍基-5-氧-戊酸
在20℃下，在二氯甲烷/三氟乙酸(2.5mL，5:1)中将(S)-2-{[3-(苯并[1，2，5]噻二唑-4-磺酰氨基)-噻吩-2-羰基]-氨基}-戊二酸1-叔丁酯5-甲酯搅拌16小时。之后，真空下除去溶剂，用制备型LC-MS纯化所得黄色剩余物。
所需化合物以三氟乙酸盐的形式分离。
EG00285；(S)-5-胍基-2-{[3-(2-硝基-苯磺酰氨基)-噻吩-2-羰基]-氨基}-5-氧-戊酸
在80℃下，在盐酸(1:1，4M水溶液四氢呋喃)中将(S)-5-叔丁氧羰基-胍基-2-{[3-(2-硝基-苯磺酰氨基)-噻吩-2-羰基]-氨基}-5-氧-戊酸甲酯搅拌3小时，然后在室温下搅拌48小时，再在80℃下搅拌2小时。真空下除去溶剂，剩余物用2g C18柱进行色谱纯化(洗脱剂从水到20:80的乙腈:水)得到所需化合物，该化合物以盐酸盐形式分离。
溶液相铃木偶联(羧酸甲酯)的一般步骤
3-(2-溴-N-叔丁氧羰基-苯磺酰氨基)-噻吩-2-甲酸甲酯(1eq)、硼酸(2.5eq)和磷酸钾(三元碱，2M水溶液，4eq)悬于脱气的1，2-二甲氧基乙烷(10mL)中。将溶液进一步脱气，并一次加入[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯钯(II)(与二氯甲烷复合，0.1eq)。在90℃加热反应混合物4小时。之后，真空下除去溶剂，并采用下述三种方法之一分离棕色剩余物 A用盐酸(1M，水溶液)沉淀，然后过滤。
B使剩余物在乙酸乙酯和盐酸(1M水溶液)间分配。分离各相，用乙酸乙酯(3×15mL)萃取水相，合并的有机萃取液用水、盐水洗涤，并用硫酸镁干燥，真空下除去溶剂得到所需化合物。
C不进行任何进一步操作直接使用。
所有物质不进行进一步纯化用于随后的反应中。
使用氢氧化锂进行酯的水解(优选方法)的一般步骤
根据需要，在20-80℃下，在四氢呋喃/甲醇/水(10mL；5:3:2)中将甲酯(1eq)和氢氧化锂(2.53mmol，3-5eq)混合搅拌3至48小时。然后，真空下除去有机溶剂，用水将剩余物稀释到5mL，之后用盐酸(1M，水溶液，15mL)酸化，此后出现沉淀，过滤收集产物并在真空下干燥；或者用乙酸乙酯(3×10mL)萃取水相，合并的有机相用硫酸镁干燥，真空下除去溶剂，得到所需产物。
溶液相铃木偶联(羧酸)的一般步骤
将被适当取代的含3-、4-溴苯基的羧酸(50-200mg，1eq)、硼酸(2.5eq)和磷酸钾(三元碱，2M水溶液，4eq)悬于脱气的1，2-二甲氧基乙烷(10mL)中。将溶液进一步脱气，并一次加入[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯钯(II)(与二氯甲烷复合，0.1eq)。在90℃加热反应混合物4小时。在90℃加热反应混合物4小时。之后，真空下除去溶剂，通过下述方法之一分离棕色剩余物 A用盐酸(1M，水溶液)沉淀，然后过滤。
B使剩余物在乙酸乙酯和盐酸(1M水溶液)间分配。分离各相，用乙酸乙酯(3×15mL)萃取水相，合并的有机萃取液用水、盐水洗涤，并用硫酸镁干燥，真空下除去溶剂得到所需化合物。
所有物质不进行进一步纯化用于随后的反应中。
溶液中PyBroP偶联的一般步骤(使用H-Arg(Pbf)-OtBu)
将羧酸(20-100mg，1eq)和三吡咯烷溴化鏻六氟磷酸盐(1.1eq)悬于二氯甲烷(5mL)中，在20℃将混合物搅拌10分钟。向混合物中加入N，N-二异丙基乙胺(7.0eq)，继续搅拌10分钟。加入经保护的胺(1.1eq)，然后在20℃搅拌反应混合物16小时。之后，真空下除去溶剂，使剩余物在盐酸(1M水溶液，20mL)和乙酸乙酯(20mL)间分配。分离各相，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取水相。合并有机相，用盐酸(1M水溶液，3×10mL)、盐水(饱和水溶液，25mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，真空下除去溶剂得到棕色剩余物即所需产物。
表4归纳了使用上述方法制备的产物。
表4
EG00400/(S)-2-{[3-(3-硼氧基-苯磺酰氨基)-噻吩-2-羰基]-氨基}-5-胍基-戊酸
将经频哪醇、叔丁氧基及2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基保护的化合物溶于三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(10mL，95:2.5:2.5)中，在20℃将反应混合物搅拌2天。真空下除去溶剂，得到的黄色剩余物用制备型LC-MS纯化。
所需化合物以三氟乙酸盐的形式分离。
使用三氟乙酸脱去叔丁基和2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基的一般步骤
将经叔丁氧基及2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基保护的化合物溶于三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(10mL，95:2.5:2.5)中，在20℃将反应混合物搅拌2天。真空下除去溶剂，用制备型LC-MS纯化该化合物。
所有的终化合物以三氟乙酸盐的形式分离。
表5归纳了使用上述方法制备的终化合物。
表5
EG00323；(S)-5-胍基-2-({3-[3-(2-吡啶-3-基-乙基)-苯磺酰氨基]-噻吩-2-羰基}-氨基)-戊酸
将乙炔(EG00298/5-胍基-2-{[3-(3-吡啶-3-基乙炔基-苯磺酰氨基)-噻吩-2-羰基]-氨基}-戊酸；约10mg)溶于四氢呋喃:水(4:1，2mL)中，加入钯/炭(约10重量％)，经气球通入氢气。在20℃搅拌反应混合物24小时，其间不时地填充氢气气球。之后用CeliteTM过滤反应混合物，真空下除去溶剂。用制备型LCMS纯化黄色剩余物。
EG00369；(S)-2-({3-[3-(3-氨基-丙基)-苯磺酰氨基]-噻吩-2-羰基}-氨基)-5-胍基-戊酸
将乙炔(EG00274/(S)-2-({3-[3-(3-氨基-丙-1-炔基)-苯磺酰氨基]-噻吩-2-羰基}-氨基)-5-胍基-戊酸；约10mg)溶于四氢呋喃水(4:1，2mL)中，加入钯/炭(约10重量％)，经气球通入氢气。在20℃搅拌反应混合物24小时，其间不时地填充氢气气球。之后用CeliteTM过滤反应混合物，真空下除去溶剂。用制备型LCMS纯化黄色剩余物，所需化合物以三氟乙酸盐的形式分离。
EG00466，3-(苯并[1，2，5]噻二唑-4-磺酰氨基)-噻吩-2-甲酸((S)-4-胍基-1-羟基氨甲酰基-丁基)-酰胺
在40℃，在N，N-二甲基甲酰胺(2mL)中将EG00229/(S)-2-{[3-(苯并[1，2，5]噻二唑-4-磺酰氨基)-噻吩-2-羰基]-氨基}-5-胍基-戊酸(1.0eq)，N，N-二异丙基乙胺(9.0eq)和HATU(2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐，1.5eq)混合搅拌30分钟。加入羟胺盐酸盐(1.5eq)，在40℃下将反应混合物搅拌16小时。之后，真空下除去溶剂，用制备型LCMS纯化黄色剩余物。所需化合物以三氟乙酸盐的形式分离。
下文描述了对本发明的几种化合物所进行的各种结合和粘附研究的实验方法。研究结果示于下文中。
一般实验方法 细胞培养 在含10％胎牛血清(FBS)和25μg/ml潮霉素B的Ham F12培养基中培养表达神经毡蛋白-1的猪主动脉内皮细胞(PAE/NP-1)。在含10％FBS和250μg/ml庆大霉素G418的Ham F12培养基中培养表达KDR的PAE细胞(PAE/KDR)。在含10％FBS和L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中培养人癌细胞系(DU145、A549和ACHN)。
125I-VEGF-A165结合 用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)洗涤24孔板中汇合的细胞两次。在4℃，加入用结合培养基(DMEM培养基，25mM HEPES pH 7.3，含0.1％BSA)稀释的各种浓度的肽或肽模拟物，然后加入0.1nM125I-VEGF-A165(1200-1800Ci/mmol，GE Healthcare)。在4℃温育2h后，吸去培养基，用冷PBS洗涤4次。用0.25M NaOH，0.5％SDS溶液裂解细胞，用γ计数器测量裂解物的结合放射活性。在存在100倍过量的未标记的VEGF-A165时测定非特异性结合。
细胞基质粘附 通过Innocyte ECM细胞粘附测定(Calbiochem)来测量细胞与胞外基质蛋白(基底膜蛋白复合物，层粘连蛋白I，胶原蛋白IV，纤连蛋白或玻璃粘连蛋白)的粘附。用非酶细胞解离溶液(Sigma)使细胞脱落，用RPMI1640培养基洗涤并重悬。将经肽模拟物处理的细胞和未经其处理的细胞以3×104个细胞/基质包被孔的密度接种于96孔板中。温育1.5h后，用PBS洗涤细胞。用绿色荧光染料钙黄绿素-AM标记贴壁细胞，通过荧光板读数仪进行测量，激发波长485nm，发射波长520nm。
细胞迁移 用趋化24小室板(24-transwell plate)测量细胞迁移，该板中含胶原蛋白I包被的小室。将各种浓度的血清的RPMI1640/0.1％BSA溶液加至下方的小室中，而将含PET(聚对苯二甲酸乙二酯)径迹蚀刻膜(带8微米的小孔，Becton Dickinson Biosciences)的上方小室置于所述下方小室的上面。用胰蛋白酶消化细胞，洗涤并重悬于RPMI1640/0.1％BSA中。将所述经肽或肽模拟物处理的或未经处理的1.5×106个细胞加入每个上方小室中，在37℃将趋化小室板温育4h。温育后，将小室之间的膜的上方的未迁移细胞移去，用REASTAINQuick-Diff试剂盒(REAGENA)对该膜下方的迁移细胞染色。使用目镜微尺(100格)，以×100的放大率在4个视野下对每个小室的染色细胞计数。
细胞活力 通过测量四唑盐XTT形成formazon染料的转化反应来测定细胞活力。在存在或不存在NP-1肽或肽模拟物拮抗剂的情况下，以4×103个细胞/孔的密度将癌细胞接种于96孔板中。温育44h后，向培养物中加入XTT标记试剂混合物(Roche)，再将它们温育4小时。然后在A490nm处测量formazon的形成，参比波长为595nm。
结果 在细胞基质粘附研究中，发现EG00144在浓度为10-100μM时有效抑制DU145癌细胞与胞外基质蛋白的粘附。
在细胞迁移研究中，发现EG00144在浓度为10-100μM时减少A549和ACHN细胞的迁移。
在细胞活力研究中，发现EG00229在浓度为100μM时降低A549细胞的活力。
以下化合物的IC50小于20μMEG00144、EG00174、EG00203、EG00224、EG00225、EG00229、EG00264、EG00265、EG00274、EG00280、EG00283、EG00285、EG00287、EG00288、EG00291、EG00299、EG00316、EG00317、EG00318、EG00319、EG00323、EG00332、EG00350、EG00369、EG00428、EG00475。
权利要求
1.一种式I或式II的化合物或者其可药用盐、溶剂合物或多晶型物，
其中
X为CH2、C(O)、NH、O或SO2；
Y为连接键或亚呋喃基；
Z1为亚芳基或杂芳基；
Z2为连接键、SO2NH、CONH或NHCONH基团；
Z3为芳基或杂芳基；
Z4为CH2或NR1；
Z5为H、OH、C(O)OR1或P(O)(OR1)2；
Z6为OR1或NHR2；
每个R1独立地为H或烷基；
每个R2独立地为H或CN、OH或SO2CH3基团；并且
n为0、1或2。
2.权利要求1的化合物，其中Z2为SO2NH基团。
3.权利要求1或2的化合物，其中Z1为亚苯基、亚联苯基、亚噻吩基、-亚噻吩基(苯基)、-亚噻吩基(烷基)、亚呋喃基、亚噻唑基或亚吡啶基。
4.前述权利要求之一的化合物，其中Z3为芳基。
5.权利要求4的化合物，其中Z3为-芳基(硝基)或芳基(氨基)基团。
6.权利要求1-3之一的化合物，其中Z3为含有一个或多个选自N、O或S的杂原子的苯并五元稠环。
7.权利要求6的化合物，其中Z3为苯并[1，2，5]噻二唑。
8.前述权利要求之一的化合物，用于治疗。
9.前述权利要求之一的化合物，用于促进神经修复。
10.权利要求1-8之一的化合物，用于治疗神经变性。
11.权利要求1-8之一的化合物，用于治疗癌症。
12.权利要求1-8之一的化合物，用于调节免疫系统。
13.一种通过使用权利要求1-7之一的化合物促进神经修复的方法。
14.一种通过使用权利要求1-7之一的化合物治疗神经变性的方法。
15.一种通过使用权利要求1-7之一的化合物治疗癌症的方法。
16.一种通过使用权利要求1-7之一的化合物调节免疫系统的方法。
全文摘要
本发明为一种适于用作NP-1拮抗剂的式(I)或式(II)化合物。
文档编号C07D277/56GK101522648SQ200780037119
公开日2009年9月2日 申请日期2007年10月4日 优先权日2006年10月4日
发明者贾海燕, I·扎卡里, M·蒂克纳, 程莉莉, C·查普曼, K·艾拉迪, B·哈佐拉克斯, A·贾维斯, R·林奇, J·纳莉, D·赛尔伍德, M·斯图尔特 申请人:Ark治疗学有限公司