新型抗增殖抗体的制作方法

专利名称：：新型抗增殖抗体的制作方法新型抗增殖抗体本发明涉及能够抑制肿瘤生长的新型抗体，尤其是鼠单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体，以及编码这些抗体的氨基酸和核酸序列。一方面，本发明涉及能够抑制肿瘤细胞增殖的新型抗体、衍生化合物或功能片段。本发明还包含这种抗体在用作癌症的预防性和/或治疗性处置的药物中的用途，以及在与癌症诊断有关的操作或试剂盒中的用途。最后，本发明包括包含这种抗体的组合物，所述抗体与其它抗癌症化合物(如抗体)联合或者与毒素相结合，及其在某些癌症的预防和/或治疗中的用途。一般地，选择用以制备单克隆抗体的标准是识别经鉴定是潜在治疗靶标的免疫原。实际中，小鼠以与免疫原对应的重组蛋白免疫接种，在回收小鼠产生的单克隆抗体之后，就这些抗体以特异性方式识别免疫原的能力进行首次筛选。在第二阶段，将如此选择出来的抗体进行体内和体外试验以确定其活性以及其特性和/或作用机制。该"经典"方法尽管有可能从一开始就获知作用靶标，但该方法经常产生大量确实能够特异性识别特定靶标，但却在体内不表现出明显生物活性的抗体。在癌症领域，的确已知尽管一种抗体在体外产生良好的效果但却并不是不可避免的意味着这种抗休后续在体内表现出真正的抗肿瘤活性。本发明不同于在先的方式并甚至与前述方式相反，由于它基于"功能性"方法，更特别地在主要的筛选方法基于功能上寻找抗体而非在识别的抗原上寻找抗体。更特别地，本发明的发明人选定了特定功能，即抑制细胞的基础性增殆而不抑制细胞的诱导性增殖作为抗体选择参数。所用的制备方法将在以下实施例中详细描述。通过该功能性方法，以令人惊奇的方式，本发明人已经制备出并选择出体外和/或体内能够以显著的方式抑制肿瘤细胞增殖的抗体。根据第一方面，本发明涉及体外和/或体内能够抑制肿瘤细胞增殖的分离抗体、或其衍生化合物或功能片段；所述抗体或其衍生化合物或功能片段，包含至少一种选自SEQIDNo.l、2、3、4、5或6序列的互补性决定区(CDR)的CDR或至少一种其序列经优化比对后与SEQIDNo.l、2、3、4、5或6序列的同一性至少是80%,优选85%、90%、95%、98°/。的CDR。抗体的"功能片段"尤其是指抗体片段，如Fv、scFv(sc^单链)、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc片段或双体或任何其半衰期延长的片段。本说明书以后将对这种抗体片段进行详细描述。抗体的"衍生化合物"尤其是指由肽支架和至少一种原始抗体的CDR之一组成的结合蛋白以保留其被识别的能力。这种本领域技术人员熟知的衍生化合物将在以下本说明书中更详细描述。更优选地，本发明包含通过基因重组或化学合成获得的本方面所述的抗体、抗体衍生化合物或抗体功能片段，特别是嵌合或人源化抗体。根据优选的具体实施方式，本发明所述的抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于其由单克隆抗体组成。应理解"单克隆抗体"是指几乎同源的抗体群中产生的抗体。更特别地，除一些可能以最小比例发现天然出现的突变之外，群组中的单个抗体相同。换句话讲，单克隆抗体由培育单一细胞克隆(例如杂交瘤细胞、转染了编码同源抗体的DNA分子的真核宿主细胞、转染了编码同源抗体的DNA分子的原核宿主细胞等)产生的同源抗体组成，并且其一般特征是一种并且是唯一一种类别或亚类的重链，和唯一一种类型的轻链。单克隆抗体是高度特异性的并直接抗单一抗原。此外，与多克隆抗体的制备相反，多克隆抗体通常包括直接抗各种决定簇或表位的各种抗体，而每种单克隆抗体直接抗抗原的单一表位。此处必须理解，本发明并不涉及天然形式的抗体，即这些抗体并非取自其天然环境，而是从天然来源中分离的或纯化而获得的，或由基因重组或化学合成获得的，因此这些抗体能带有非天然氨基酸，这些抗体将在下文描述。更特别地，根据本发明的优选具体实施方式，抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于其包含轻链，该轻链包含至少一种其氨基酸序列选自SEQIDNo.]、3或5的CDR，或至少一种其序列经优化比对后与序列SEQIDNo.l、3或5的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的CDR;或它包含重链，该重链包含至少一种其氨基酸序列选自SEQIDNo.2、4或6的CDR，或至少一种其序列经优化比对后与序列SEQIDNo.2、4或6的同一性至少是80%，优选85%、卯％、95%和98%的CDR。更加优选地，本发明所述的抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于其包含重链，该重链包含序列是SEQIDNo.2、4和6的三种CDR中的至少一种，或至少一种其序列经优化比对后与序列SEQIDNo.2、4或6的同一性至少是80%，优选85%、卯％、95%和98%的序列。甚至更优选的是，本发明所述的抗体或其一种衍生化合物或功能片段的特征是其包含包含以下3种CDR(分别是CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3)的重链，其中-CDR-Hl包含序列SEQIDNo.2、7或9,或经优化比对后与序列SEQIDNo.2、7或9的同一性至少是80%的序列；-CDR-H2包含序列SEQIDNo.4或ll,或经优化比对后与序列SEQIDNo.4或11的同一性至少是80%的序列；-CDR-H3包含序列SEQIDNo.6或12,或经优化比对后与序列SEQIDNo.6或912的同一性至少是80%的序列；根据特定具体实施方式，抗体或其一种衍生化合物或功能片段的特征在于其包含包含序列是SEQIDNo.7的CDR-H1，序列是SEQIDNo.4的CDR-H2和序列是SEQIDNo.12的CDR-H3的重链。根据另一特定具体实施方式，抗体或其一种衍生化合物或功能片段的特征在于其包含包含序列是SEQIDNo.9的CDR-H1，序列是SEQIDNo.ll的CDR-H2和序列是SEQIDNo.6的CDR-H3的重链。根据另一具体实施方式，本发明所述的抗体或其一种衍生化合物或功能片段的特征在于其包含包含至少序列是SEQIDNo.1、3和5的三种CDR中至少一种或至少一种其序列经优化比对后与序列SEQIDNo.1、3和5的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列的轻链。以优选方式，本发明所述的抗体或其一种衍生化合物或功能片段的特征在于其包含包含下列三种CDR(分别是CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的轻链，其中-CDR-L1包含序列SEQIDNo.l或8或经优化比对后与序列SEQIDNo.l或8的同一性至少是80%的序列；-CDR-L2包含序列SEQIDNo.3或IO,或经优化比对后与序列SEQIDNo.3或10的同一性至少是80%的序列；-CDR-L3包含序列SEQIDNo.5或经优化比对后与序列SEQIDNo.5的同一性至少是80%的序列；根据特定具体实施方式，抗体或其一种衍生化合物或功能片段的特征在于其包含包含序列是SEQIDNo.l的CDR-LI，序列是SEQIDNo.3的CDR-L2和序列是SEQIDNo.5的CDR-L3的轻链。根据另一特定具体实施方式，抗体或其一种衍生化合物或功能片段的特征在于其包含包含序列是SEQIDNo.8的CDR-L1，序列是SEQIDNo.10的CDR-L2和序列是SEQIDNo.5的CDR-L3的轻链。在本发明说明书中，术语"多肽"、"多肽序列"、"肽"和"与抗体化合物或其序列连在一起的蛋白"可互换。必须理解，本发明并不涉及天然形式的抗体，即这些抗体并非取自其天然环境，而是从天然来源中分离的或纯化而获得的，或由基因重组或化学合成获得的，因此这些抗体能带有非天然氨基酸，这些抗体将在下文描述。在第一具体实施方式中，互补性决定区或CDR意思是免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，如Kabat等人所定义(Kabat等人，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thEd"USDepartmentofHealthandHumanServices,NIH,1991,和后来的版本)。有三种重链CDR和三种轻链CDR。此处，取决于情况，术语"CDR"和"CDRs"用于指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在第二具体实施方式中，CDR区或CDR是指IMGT定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。将IMGT唯一的编号定义为与可变结构域比较，而无论抗原受体或链类型或物种是什么[LefrancM,P"ImmunologyToday18,509(1997)/LefrancM.-P"TheImn腿ologis,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P"Pommi6,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V"Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Coutet,V.禾flLefranc,Dev.Comp.Immunol"27,55-77(2003)]。在IMGT唯一编号中，保守氨基酸的位置总是相同，例如半胱氨酸23(第1-CYS)，色氨酸41(保守-TRP)、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104(第2-CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT唯一编号就框架区(FR1-IMGT:位置1至26,FR2-IMGT:39至55,FR3-IMGT:66至104和FR4-IMGT:118至128)和互补性决定区CDR1-IMGT:27至38,CDR2-IMGT:56至65和CDR3-IMGT:105至117提供了标准化定界。缝隙(gap)代表未占用位置，CDR-IMGT长度(以括号内的内容表示，用点分开，例如[8.8.13p成为关键信息。2D代表性图形中所用的IMGT唯-一编号命名为IMGTColliersdePerles[Ruiz,M.和Lefranc,M,P"Immunogenetics,53，857-883(2002)/Kaas,Q.和Lefranc,M,P"CurrentBioinformatics,2,21-30(2007)]，并用在IMGT/3D结构-DB中的3D结构中(Kaas,Q.,Ruiz,M.andLefranc,M.-P"TcellreceptorandMHCstructuraldata.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004))。存在三条重链CDR和3条轻链CDR。此处所用术语CDR或CDRs的目的是指，根据情况，包含一种或多种或者甚至全部的对抗体与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。为使其更清楚，必须理解在下述说明书中和更特别地在表2和3中，CDR以IMGT编号、kabat编号和普通编号定义。普通编号将IMGT和theKabat编号系统所定义的CDR相同的每种CDR的部分残基重新分组。IMGT编号系统法根据上述IMGT系统定义CDR，而kabat编号系统根据上述kabat系统定义CDR。更特别地，CDR-L1由普通编号和IMGT编号系统的SEQIDNo.l(QDINNY)和kabat编号系统的SEQIDNo.8(KASQDINNYIA)组成。CDR-L2由普通编号和IMGT编号系统的SEQIDNo.3(YTS)和kabat编号系统的SEQIDNo.lO(YTSTLQA)组成。CDR-L3bt)三个编号系统中每个SEQIDNo.5(LQYDNLWT)组成。对于重链，CDR-H1由普通编号系统的SEQIDNo.2(TDYS)、IMGT编号系统的SEQIDNo.7(GYSFTDYS)和kabat编号系统的SEQIDNo.9(TDYSMY)组成。CDR-H2由普通编号系统和IMGT编号系统的SEQIDNo.4(IDPYNGGT)和kabat编号系统的SEQIDNo.ll(YIDPYNGGTRYNQKFKG)组成。最后，CDR-H3由普通和kabat编号系统中的SEQIDNo.6(QTDYFDY)，而它山IMGT编号系统的SEQIDNo.12(ARQTDYFDY)组成。在本发明的意义上讲，两条核酸或氨基酸序列之间的"同一性百分数"是指两条进行比较的序列之间经优化比对后获得的相同的核苷酸或氨基酸残基的百分数，这个百分数是纯粹统计学上的，并且两条序列之间的区别沿其长度随机分布。两条核酸或氨基酸序列之间的比较通常通过比较两者经优化比对后的序列而进行，所述比较可分段进行或用"比对界面"进行。用于比较的优化比对，除人工比较外，可通过Sm池和Waterman的局部同源性算法(1981)[Ad.App.Math.2:482]、通过Neddleman和Wimsch的局部同源性算法(1970)[J.Mol.Biol.48:443]、通过Pearson和Lipman的相似性查找方法(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444]或通过使用这些算法的计算机软件(GAP、BESTFIT、FASTAandTFASTAintheWisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr"Madison,WI,orbythecomparisonsoftwareBLASTNRorBLASTP)进行。两条核酸或氨基酸序列之间的同一性百分数通过比较两条优化比对序列确定，其中，与两条序列之间进行优化比对的参照序列相比，进行比较的核酸或氨基酸序列可有添加或删除。同一性百分数通过确定两条序列之间相同氨基酸核苷酸或残基的位置数，将相同位置数除以比对界面中的位置总数，并将结果乘以IOO以获得两条序列之间的同一性百分数。例如，可使用BLAST程序"BLAST2序歹U"(Tatusova等人，"Blast2sequences-anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences",FEMSMicrobiol,1999，Lett.174:247-250)在网址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html可得到该程序，使用缺省参数(特别是参数"丌放缝隙罚分"5禾[l"延伸缝隙罚分"2;程序建议的选择的矩阵例如"BLOSUM62"矩阵)即可。直接通过程序计算两条比较序列之间的同一性百分数。对于与参照氨基酸序列相比，具有至少80%，优选85%、卯％、95%和98%同一性的氨基酸序列而言，优选实施例包括那些含有参照序列的实施例、某些修饰，特别是至少一个氨基酸的删除、添加或取代、截短或延伸。就取代一个或多个连续或不连续氨基酸的情况，这样的取代是优选的即被取代的氨基酸被"等价"氨基酸替换。此处，术语"等价氨基酸"是指可能被结构性氨基酸之一取代，然而并未改变其相应的抗体的生物学活性的氨基酸和下列特定实施例定义的氨基酸。等价氨基酸可根据其与被取代氨基酸的结构同源性或根据各种可能产生的抗体之间生物活性的比较性测试结果而确定。作为非限制性实施例，下表1总结了可能被取代而不使相应的修饰抗体的生物活性发生显著改变的可能取代位点；在相同条件下反向取代可能天然发生。表l原始残基取代基12Ala(A)Val、Gly、ProArg(R)Lys、HisAsn(N)GinAsp(D)GluCys(c)SerGln(Q)AsnGlu(G)AspGly(G)AlaHis(H)ArgUe(I)LeuLeu(L)Ile、Val、MetLys(K)ArgMet(M)LeuPhe(F)TyrPro(P)AlaSer(S)Thr、CysThr(T)SerTrp(W)TyrTyr(Y)Phe、TrpVal(V)Lcu、Ala本领域技术人员已知，在本领域的当前状态下，发现六条CDR之间最大的变异(长度和组成)位于三条重链CDR上，更特别地，在这条重链的CDR-H3上。结果是，很明显本发明所述抗体或其衍生化合物或功能片段的优选特征性CDR是重链的三个CDR，即分别由序列SEQIDNo.2、4和6编码的CDR，甚至是更优选的是序列SEQIDNo.6编码的CDR-H3相应的CDR。在特定具体实施方式中，本发明涉及鼠抗体或其衍生化合物或其功能片段。本发明所述的另一具体实施方式公开了一种抗体或其衍生化合物或功能片段，包含下列三种CDR的轻链序列是SEQIDNo.l的CDR-L1，或经优化比对后与序列SEQIDNo.l的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列；序列是SEQIDNo.3的CDR-L2，或经优化比对后与序列SEQIDNo.3的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列;禾口序列是SEQIDNo.5的CDR-L3，或经优化比对后与序列SEQIDNo.5的同一性至少是80%，优选85%、卯％、95%和98%的序列;禾口包含下列三种CDR的重链序列是SEQIDNo.7的CDR-H1，或经优化比对后与序列SEQIDNo.7的同一性至少是80%，优选85%、卯％、95%和98%的序列；序列是SEQIDNo.4的CDR-H2，或经优化比对后与序列SEQIDNo.4的同一性至少是80%，优选85%、卯％、95%和98%的序列；和序列是SEQIDNo.12的CDR-H3，或经优化比对后与序列SEQIDNo.12的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列。本发明所述的另一具体实施方式公丌了一种抗体或其衍生化合物或功能片段，包含下列三种CDR的轻链-序列是SEQIDNo.8的CDR-L1，或经优化比对后与序列SEQIDNo.8的同一性至少是80%，优选85%、卯％、95%和98%的序列；-序列是SEQIDNo.10的CDR-L2，或经优化比对后与序列SEQIDNo.10的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列；禾口-序列是SEQIDNo.5的CDR-L3，或经优化比对后与序列SEQIDNo.5的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列；禾口包含下列三种CDR的重链-序列是SEQIDNo.9的CDR-H1，或经优化比对后与序列SEQIDNo.9的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列；禾口-序列是SEQIDNo.ll的CDR-H2，或经优化比对后与序列SEQIDNo.ll的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列；禾口-序列是SEQIDNo.6的CDR-H3，或经优化比对后与序列SEQIDNo.6的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列。根据另一具体实施方式，本发明所述的抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于其包含一条轻链序列，该轻链序列包含氨基酸序列是SEQIDNo.13或经优化比对后与序列SEQIDNo.13的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列；以及在于，它包含一条重链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQIDNo.14或经优化比对后与序列SEQIDNo.14的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列。还公丌了人源化抗体或其衍生化合物或功能片段，其特征在于它包含一条轻链序列，该轻链序列包含氨基酸序列是SEQIDNo.17或经优化比对后与序列SEQIDNo.17的同一性至少是80%的序列，和其中它包含一条重链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQIDNo.18或19或经优化比对后与序列SEQIDNo.18或19的同一性至少是80%的序列。如上文，本发明还涉及如本发明所述的抗体衍生的任何化合物。更特别地，本发明所述的抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于，所述衍生化合物由结合蛋白组成，该结合蛋白包含肽支架，在该肽支架上以保留原始抗体的全部或部分抗体结合部位识别特性的方式移植至少一种CDR。本发明所述的六个CDR序列之中一个或多个序列还可出现在各种免疫球蛋白支架上。在这种情况下，蛋白序列使重新构建易于使移植CDR折叠的肽骨架成为可能，使其保留其抗体结合部位抗原-识别特性。一般地，本领域技术人员知道如何确定蛋白支架的类型，在所述蛋白支架上移植至少一种来自原始抗体的CDR。更特别地，已知选择这种支架必须满足下列条件的最大数目(SkerraA.,J.Mol.Recogn.,2000，13:167-187):-良好的种系发生保守性；-已知的三维结构(例如通过结晶学、NMR光谱学或任何本领域技术人员已知的其他技术)；-体积小；-几乎没有或没有转录后修饰；和/或-易于产生、表达和纯化。这种蛋白支架的起源可以是但不限于选自下列的结构纤连蛋白(优选III型纤连蛋白结构域10)、lipocalin、anticalin(SkerraA.,J.Biotechnol.,2001,74(4):257-75)、来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A的结构域B的蛋白Z、硫氧还蛋白A(thioredoxinA)或带有如"锚蛋白重复序列"的重复基序的蛋白(Kohl等人，PNAS,2003,vol.100,No.4,1700-1705)、"犰狳(armadillo)重复序列"、"富含亮氨酸的重复序列"和"四三共肽(tetratricopeptide)重复序列"。应该提及源自毒素(例如蝎子、昆虫、植物、软体动物等)和祌经元NO合成酶(PIN)的支架。作为这种杂合构建体的非限制方式的例子是在PiN的-一个环区内插入抗CD4抗体的CDR-H1(重链)，即名为13B8.2，因此获得的新的结合蛋白保留了与原始抗体相同的结合特性(Bes等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,2006,343(1)，334-344)。在纯粹说明性基础上，还可提到将抗-溶菌酶VHH抗体的CDR-H3(重链)移植到新抑癌蛋白(neocarzinostatin)的一个环区上(Nicaise等人，ProteinScience,2004,13(7):1882-1891)。最后，如上所述，这种肽支架可包含一至六个来自原始抗体的CDR。优选地，但非必要的，本领域技术人员将选择至少一个重链CDR，已知后者是抗体特异性的主要成因。对于本领域技术人员选择一或多个相关CDR是显而易见的，本领域技术人员将在其后选择已知技术(Bes等人，FEBSletters508,2001,67-74)。本发明的特定方面涉及选择本发明所述的抗体衍生化合物的方法，所述衍生化合物能抑制体内和/或体外肿瘤细胞生长，并且所述衍生化合物包含其上移植了至少一个抗体CDR的肽支架，该方法的特征在于它包含下列步骤a)在体外并在使细胞得以生长的条件下，使由其上移植了至少一个抗体CDR的肽支架组成的化合物与包含能够生长的肿瘤细胞的生物样品接触；和b)如果所述化合物能够抑制这些肿瘤细胞的生长，并且其特征在于所述至少一个移植CDR选自下列CDR，选择所述化合物-序列是SEQIDNo.l、8的CDR或经优化比对后与序列SEQIDNo.l、8的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列的CDR;-序列是SEQIDNo.3、10的CDR或经优化比对后与序列SEQIDNo.3、10的同一性至少是80%，优选85%、卯％、95%和98%的序列的CDR;-序列是SEQIDNo.5的CDR或经优化比对后与序列SEQIDNo.5的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列的CDR;-序列是SEQIDNo.2、7、9的CDR或经优化比对后与序列SEQIDNo.2、7、9的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列的CDR;-序列是SEQIDNo.4、11的CDR或经优化比对后与序列SEQIDNo.4、11的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列的CDR;禾口-序列是SEQIDNo.6、12的CDR或经优化比对后与序列SEQIDNo.6、12的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列的CDR。根据优选模式，该方法在步骤a)中可包含使包含其上移植了至少两个或三个抗体CDR的肽支架的化合物体外接触。根据该方法的甚至更优选模式，肽支架选自其结构在上文提到的支架或结合蛋白。显而易见的是，这些实施例绝不是限制性的，并且应将任何对于本领域技术人员是已知的或显而易见的其它结构视为涵盖在本专利申请的保护之内。本发明因此涉及其特征在于肽支架选自下列蛋白的抗体或其衍生化合物或功能片段a)种系发生保留良好的蛋白，b)结构结实的蛋白，c)具有熟知的3-D分子组成的蛋白，d)体积小的蛋白和/或e)包含可进行删除和/或插入修饰而未改变稳定性特性的蛋白。根据优选具体实施方式，本发明所述的抗体、或其衍生化合物或功能片段的特征在于所述肽支架选自i)来自纤连蛋白的支架、优选III型纤连蛋白结构域10的支架，lipocalin，anticalin，来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域B的蛋白Z，硫氧还蛋白A或具有如"锚蛋白重复序列"(Kohl等人，PNAS,2003,vol.100，No.4,1700-1705)、"犰狳重复序列"、"富含亮氨酸的重复序列"和"四三共肽重复序列"的重复基序的蛋白或iii)神经元NO合酶(PIN)。本发明的另一方面涉及上述抗体的功能片段。更特别地，本发明的目标是抗体或其衍生化合物或功能片段，其特征在于所述功能片段选自片段Fv、Fab、(Fab')2、Fab'、scFv、scFv-Fc或双体，或任何其半衰期延长的片段，如PEG化片段。本发明所述的抗体的这种功能片段由下列组成，例如，片段Fv、scFv(s(^单.16链)、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc或双体或任何其半衰期通过化学修饰而延长了的片段，如加成聚亚垸基二醇(polyalkyleneglycol)如聚乙二醇(PEG化)(PEG化的片段被称作Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab')2-PEG禾口Fab'-PEG)，或掺入脂质体、微球体、或PLGA;所述片段包含至少一个本发明所述的特征性CDR。该CDR特别是能发挥出其来源抗体的一般意义的活性甚至是部分活性。优选地，所述功能片段包含或包括其来源抗体的可变重或轻链的部分序列，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性，和足够的亲和力，优选至少等于其来源抗体的亲和力的1/100，更优选至少是其来源抗体的亲和力的1/10。这种功能片段将包含其来源抗体序列的至少五个氨基酸，优选6、7、8、10、15、25、50或IOO个连续氨基酸。优选地，这些功能片段将是Fv、scFv、Fab、F(ab')2、F(ab')、scFv-Fc或双体类型，这些功能片段一般具有与其來源抗体相同的结合特异性。根据本发明，本发明所述的抗体片段可通过如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或番木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原剪切二硫键的方法通过上述抗体获得。抗体片段还可通过重组遗传学技术(也是本领域技术人员所知)或通过肽合成技术获得，例如肽的合成可通过使用自动肽合成仪合成，如使用AppliedBioSystems等出售的自动肽合成仪合成。本发明的目标还是原始鼠抗体，即本发明所述的抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于所述抗体是鼠抗体，其含氨基酸序列SEQIDNo.l5的轻链，或经优化比对后与序列SEQIDNo.15的同一性至少是80%,优选85%,90%、95%和98%的序列，和氨基酸序列SEQIDNo.16的重链，或经优化比对后与序列SEQIDNo.16的同一性至少是80%，优选85%、90%、95%和98%的序列。为更清楚起见，下表2总结了与本发明所述抗体对应的各种氨基酸序列。表2(其中Mu，鼠和Hu尸人源化)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本发明的另一特定方面涉及嵌合抗体或其衍生化合物或功能片段，其特征在于所述抗体还包含从与小鼠特别是与人异源的物种的抗体衍生的轻链和重链恒定区。本发明的另一特定方面还涉及人源化抗体或其衍生化合物或功能片段，其特征在于从人抗体衍生的轻链和重链的恒定区分别是X或k区和yl、Y2或Y4区。根据另一方面，本发明涉及能分泌本发明所述单克隆抗体的鼠杂交瘤，特别是于2006年7月6日以保藏号1-3646保藏至法国微生物培养物中心(CNCM,PasteurInstitute,Paris,France)的鼠源杂交瘤。所述杂交瘤通过将Balb/C免疫接种的小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/0-Ag14细胞系融合而获得。单克隆抗体，此处称为6F4，或其衍生化合物或功能片段，其特征在于所述抗体是山明显构成本发明--部分的于2006年7月4日以保藏号1-3646保藏至CNCM的杂交瘤分泌的。本发明所述的抗体还包含嵌合或人源化抗体。嵌合抗体是由一种从给定物种衍生的包含天然可变区(轻链和重链)的抗体和与所述给定物种异源的物种的抗体轻链和重链的恒定区联合而成的抗体。抗体或抗体的嵌合片段可通过使用重组遗传学技术制备。例如，嵌合抗体可能通过克隆包含启动子和编码本发明所述的非人单克隆抗体(特别是鼠单克隆抗体)的可变区的序列和编码人抗体恒定区的序列的重组DNA而产生。本发明所述的由这样的重组基因编码的嵌合抗体可能是，例如，小鼠-人嵌合体，这种抗体的特异性通过衍生自鼠DNA的可变区确定，而且其同种型通过衍生自人DNA的恒定区确定。制备嵌合抗体的方法参见Verhoeyn等人(BioEssays,8:74,1988)。"人源化抗体"是指包含非人来源抗体的CDR区的抗体，该抗体分子的其它部分衍生自一种(或几种)人抗体。此外，可修饰一些骨架区段残基(称作FR)以保留结合亲和力(Jones等人，Nature,321:522-525，1986;Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536,1988;Riechmann等人，Nature,332:323-327,1988)。本发明所述的人源化抗体或其功能片段可通过本领域技术人员已知技术制备(如例如那些文献描述过的技术(Singer等人，J.Immun.,150:2844-2857,1992;Mountain等人，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10:1-142,1992;和Bebbington等人，Bio/Technology,10:169-175,1992.)。这种人源化抗体因其在体外诊断或预防性和/或体内治疗性处置方法中的用途而优选。其它人源化技术，也是本领域技术人员已知的，如例如，PDL在专禾lJEP0451261、EP0682040、EP0939127、EP0566647或US5,530,101、US6,180,370、US5,585,089和US5,693,761、US专利5,639,641或6，054,297、5,886,152和5,877,293中描述的"CDR移植"技术也可引用。此外，本发明还涉及上述鼠抗体来源的人源化抗体。更特别地，在实施例2和3中分别就轻链和重链详细描述了6F4抗体的人源化方法。以优选方式，人抗体衍生的轻链和重链恒定区分别是人或k和y-l、y-2或y-4区。在对应于IgGl同种型IgGl的具体实施方式中，抗体额外特征是表现出效应子功能，如抗体依赖性细胞毒效应(ADCC)和/或互补依赖性细胞毒效应(CDC)。在本发明的另一方面，申请人还鉴定出本发明所述的抗体识别的抗原。用于实现该歩骤的方法详见下列实施例4的描述。JAM-A是属于免疫球蛋白超家族(IgSF)的膜蛋白，属于接合粘连分子(JAM)家族。在人类中，JAM家族包含几种成员，这些成员包括JAM-A、JAM-B、JAM-C、A33禾PA34蛋白。在JAM家族成员之中，JAM-A与JAM-B和JAM-C有最高的同源性，约35%氨基酸序列同一性和与这两种蛋白的45%相似性。JAM-A蛋白还被称为JAMA、F11R、Fll受休、JAM-1、JAM1、PAM-1或CD321。鉴定出JAM-A前体的不同长度胞外区的两种亚型-亚型a:299个氨基酸(SEQIDNo.61)-亚型b:259个氨基酸(SEQIDNo.63)这两种亚型的核苷酸序列以SEQIDNo.62代表亚型a，以SEQIDNo.64代表亚型b。人细胞表面表达的蛋白是带有胞内C-木端结构域、单一跨膜结构域(21个氨基酸)和包含两个"Ig样"结构域的N-末端胞外区的单一多肽链。JAM-A具有N-糖基化位点，在其亚型a的的185位和亚型b的145位具有Asn残基，和两个二硫键，一个在IgN-末端结构域50位和109位的Cys残基之间，一个在第二Ig结构域的153位和212位的Cys残基之间。结晶学证实了两个胞外Ig样结构域的存在(Kostrewa等人，2001，EMBOJ.16:4391-4398;Prota等人，2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:5366-5371)。这两19个结构域通过三肽接头(序列VLV[127-129]，亚型A)连接。这些结构性研究还证实，JAM-A在细胞表面包含胞外区的亲同种抗原之间的相互作用中的意义；这个区以重组形式产生并能在溶液屮形成同源二聚体(Bazzoni等人，2000,J.Biol.Chem.275:30970-30976)，该区还使有可能鉴定参与该相互作用的氨基酸Arg59、Glu6]、Lys63、Leu72、Tyr75、Met110、Glu114、Tyr119和Glu121。三肽RVE[59-61]在JAM家族中相对保守(对于JAM-B是RLE,对于JAM-C是RIE)，并构成同源二聚体形成的最小基序(Kostrewa等人，2001,EMBOJ.16:4391-4398)。在表皮和内皮细胞上，发现.TAM-A主要在紧密连接处(Liu等人，2000，J.CellSci.,113:2363-2374)。胞浆区在其C-末端位置包含II型PDZ结构域(序列FLV[298-300](亚型a))负责形成JAM-A与各种与紧密连接相关的胞桨蛋白之间的相互作用，还包含PDZ结构域如ZO-l、AF-6、MUPP-1和PAR-3(Ebnet等人，2000,J.Biol.Chem.,275:27979-27988;Itoh等人，2001,J.CellBiol,154:491-498;Hamazaki等人，2002，J.Biol.Chem.,277:455-461)。直接抗参与二聚体形成的[111-123]区的鼠抗体，所谓J3R1和J10.4抗体，能够抑制JAM-A同源二聚化作用和体外表皮屏障的重建(Mandell等人，2004,J.Biol.Chem.,279:16254-16262)。JAM-A与整合素ccvf33相互作用并参与内皮细胞沿玻连蛋白(整合素aVp3的配基)迁移(Naik和Naik,2005,J.CellSci.1]9:490-499)。抗JAM-A抗体J3F.1，作为抗av(33抗体以相同的方式抑制内皮细胞的迁移和体外bFGF诱导的血管生成(Naik等人，2003,Blood，102:2108-2114)。证明了内皮细胞内各种信号通路MAP激酶、PI3-激酶和PKC(NaiketNaik，2005，J.CellSci"119:490-499;Naik等人，2003，Blood,102:2108-2〗14;Naik等人，2003,Artherioscler.Thromb.Vase.Biol,23:2165-2171)。单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板也表达JAM-A(Williams等人，1999，Mol.Immunol,36:1175-1188)。然而，最初JAM-A蛋白是作为Fll抗体的受体被鉴定出来的，Fll抗休能激活血小板并诱导血小板聚集(Naik等人，1995,Biochem.J.，310:155-162;Sobocka等人，2000,Blood,95:2600-2609)。肽[28-60〗和[97-109]属于Fll抗体表位并参与血小板激活和聚集现象和同源二聚化作用(Babinska等人，2002,Thromb.Haemost"87:712-721)。大鼠抗体BV11，直接抗鼠型JAM-A，抑制体外和体内的单核细胞的跨内皮细胞迁移(DelMaschio等人，1999,J.Exp.Med.，190:1351-1356)。Ostermann及其同事(2002,NatureImmunol"3:151-158)表明JAM-A是aJ32或LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原1)整合素的配基，其在抗炎症反应的发展过程中受某些化学趋化因子的诱导而过表达并对于白细胞渗出或迁移至炎症位点是必需的。JAM-A，通过第二Ig样结构域，贡献于T淋巴细胞和中性粒细胞的粘附和跨内皮细胞的迁移(Ostermann等人，2002,NatureImmunol,3:151-158)，并因此在白细胞向炎症位点的归巢中发挥重要作用。JAM-A蛋白还参与病毒感染现象。JAM-A的确是呼肠孤病毒(reovims)的受体，呼肠孤病毒是通过与粘附蛋白之间相互作用的方式而形成某些类型脑炎的病毒(Barton等人，2001,Cell104:441-451)。抗JAM-A抗体抑制呼肠孤病毒与JAM-A的结合(Forrest等人，2003,J.Biol.Chem.,278:48434-48444)。至今，上述直接抗人型JAM-A的病毒无一表现出体内活性，低得多的抗肿瘤活性。这种抗体只是用作研究工具。因此，在现有技术中，真正缺乏体外和体内都有抗肿瘤活性的抗体。根据特定方面，本发明所述抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于其能够特异性结合JAM-A蛋白(根据英文名称"JunctionalAdhesionMolecules")。根据另一个特定方面，本发明所述抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于其表现出结合JAM-A的KD是约]nM至约1pM。更加优选地，所述结合JAM-A的KD是约10pM至约40pM。术语"KD"是指给定抗体-抗原复合体的解离常数。KD=K。IT/K。n中，K。ff由抗体从抗体-抗原复合体上解离的"结束速率"常数组成，而K。n由抗体结合抗原的水平组成(ChenY.等人，1999，J.Mol.Biol,293:865-881)。本发明的新型方面涉及分离的核酸，其特征在于其选自下列核酸(包括任何简并遗传密码)a)编码本发明所述抗体或其衍生化合物或功能片段的核酸、DNA或RNA;b)与a)中定义的核酸互补的核酸；c)能够在高度严谨条件下与至少一条核酸序列SEQIDNo.20至31或至少一条经优化比对后与序列SEQIDNo.20至31的同一性至少80%,优选85%,90%、95%和98%的序列的CDR杂交的至少18个核苷酸的核酸；和d)能够在高度严谨条件下与至少核酸序列SEQIDNo.32或36的轻链和/或核酸序列SEQIDNo.33、37或38的重链或经优化比对后与序列32或36禾tl/或33、37或38的同一性至少是80%的重链杂交的至少18个核苷酸的核酸。下表3总结了涉及本发明抗体的各种核苷酸序列。表3抗体CDR编号重链轻链SEQIDNo.CDR-U20CDR-L222普通CDR-L324CDR-H121CDR-H223CDR-H325CDR-L120CDR丄222IMGTCDR層L32421<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>酸的探针是42°C)，接着是于20°C以2XSSC+2%SDS洗涤两次每次20分钟，于于20°C以0.1XSSC+0.1%SDS洗涤一次20分钟。最后一次洗漆对于长度>100个核酸的探针是以0.1XSSC+0.1%SDS于60'C洗涤30分钟。上述对于确定大小的多核苷酸的高度严谨性杂交条件可由本领域技术人员根据Sambrook等人(Molecularcloning:alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratory;3rdedition,2001)描述的流程对较长或较短寡核苷酸做适应性改变。本发明还涉及包含本发明所述的核酸的载体。本发明的目标特别是克隆和/或表达包含这种核苷酸序列的载体。本发明所述的载体优选包含使核苷酸序列在给定宿主细胞内表达和/或分泌的元件。因此，载体必须包含启动子、翻译起始和终止信号，以及合适的转录调节区。它必须能以稳定方式在宿主细胞内持续存在并可选地具有翻译蛋白的特异性分泌的特异性信号。这几种元件可由本领域技术人员根据所用宿主细胞选择和优化。为了这个目的，核苷酸序列可插入在所选宿主体内自我复制的载体或是所选宿主的整合性载体。本领域技术人员通过一般使用的方法制备这种载体，而且所得克隆可通过标准方法(如脂质体、电穿孔、热休克或化学方法)引入合适的宿主体内。载体是，例如，质粒或病毒来源的载体。这些载体用于转化宿主细胞以克隆或表达本发明所述的核苷酸序列。本发明还包含被本发明所述载体转化了的宿主细胞或包含本发明所述载体的宿主细胞。宿主细胞选fi原核或真核系统如细菌细胞，例如，以及酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。也可用昆虫或植物细胞。木发明还涉及具有木发明所述的转化细胞的动物，不包括人。本发明的另一方面涉及产生本发明所述的抗体或其一条功能片段的方法，该方法的特征在于所述方法包含下列歩骤a)在培养基和合适的培养条件下培养本发明所述的宿主细胞；和b)从培养基中或从所述培养细胞中回收所述抗体或其一条功能片段。本发明所述的转化细胞用于制备本发明所述的重组多肽的方法中。制备本发明所述的重组形式的多肽的方法的特征在于，所述方法使用载体和/或转化了本发明所述载体的细胞，该方法也包含在本发明中。优选地，将转化了本发明所述载体的细胞在使上述多肽表达和回收所述重组肽的条件下培养。正如已经提到的，宿主细胞可选自原核或真核系统。尤其是，可能鉴定在这种原核或真核系统中促进分泌的本发明的核苷酸序列。带有这种序列的本发明所述载体可因此有利地用于产生待分泌重组蛋白。的确，这些目的重组蛋白的纯化可由于其存在于细胞培养液的上清中而不是宿主细胞内的事实而被促进。本发明所述的多肽也可通过化学合成制备。一种这类制备方法也是本发明的23目标。本领域技术人员巳知化学合成的方法，如固相技术(特别是见Steward等人，1984,Solidphasepeptidessynthesis,PierceChem.Company,Rockford，〗11,2nded.)或部分固相合成技术(通过片段縮合或在溶液中常规合成)。本发明还包含通过化学合成获得并能够含有相应非天然氨基酸的多肽。本发明还包含通过本发明所述的方法可能获得的抗体或其衍生化合物或功能片段。根据另一方面，本发明涉及上述抗体，特征在于它额外能够特异性结合人酪氨酸激酶家族受体和域能够特异性抑制这种受体的酪氨酸激酶活性。根据新具体实施方式，本发明涉及抗体或其衍生化合物或功能片段，由具有双特异性的抗体组成，所述双特异性在于其包含能够与参与肿瘤发展的任何受体(例如VEGFR、VEGF、EGFR、IGF-1R、HER2neu、HGF、cMET、FGF、跨膜四超家族(tetraspanins)、整合素、CXCR4或CXCR2)相互作用的第二基序。根据第一具体实施方式，一个这种抗体由双特异性抗体组成并包含第二基序，所述第二基序特异性抑制EGF与人表皮生长因子受体(EGFR)的结合和/或特异性抑制所述EGFR的酪氨酸激酶活性。根据本发明的另一甚至更优选方面，所述第二抗EGFR基序来自单克隆抗体cetuximab(C225或erbitux)、matuzumab、huR3、HuMax-EGFR或panitumab。根据第二具体实施方式，本发明所述的抗体由双特异性抗体组成，并包含特异性抑制HER2/neu受体调节的活性和/或特异性抑制所述HER2/neu受体的酪氨酸激酶活性的第二基序。更特别地，所述第二抗HER2/neu基序来自小鼠单克隆抗体4D5或2C4或来自人源化抗体trastuzumab或pertuzumab。根据第三具体实施方式，本发明所述的抗体由双特异性抗体组成，并包含特异性抑制肝细胞生长因子(HGF)与cMET受体的结合和/或特异性抑制所述cMET受体的酪氨酸激酶活性的第二基序。根据第四具休实施方式，本发明所述的抗体由双特异性抗体组成，并包含特异性抑制IGF-1R受体调节的活性和/或特异性抑制所述IGF-IR受体的酪氨酸激酶活性的第二基序。更特别地，所述第二抗IGF-1R基序来自小鼠单克隆抗体7C10、来自相应的人源化抗体h7C10(Goetsch等人，国际专利申请WO03/059951)、来自hEM164抗体(Maloney等人，CancerRes"2003，63(16):5073-5083)、来自Abgenk开发的抗IGF-1R抗体(见美国专利申请2005/281812)或来自Mab39、lH7(Li等人，CancerImmunol.Immimother.,2000，49(4陽5):243-252)或4G11(Jackson-Booth等人，Horm.Metab.Res.,2003,35(11-12):850-856)。最后，根据最后一个具体实施方式，本发明所述的抗体由双特异性抗体组成，并包含能够与参与肿瘤发展的任何类型的受体相互作用的第二基序，所述受体如，作为非限制性举例，VEGFR、VEGF、FGF(成纤维生长因子)或CXCR(趋化因子受体)家族的任何成员，如CXCR2或CXCR4。24提到的适合的还有抗CD20抗体，如rituximab、ibritumomab或tositumoniab;抗CD33抗体如gemtuzumab或lintuzumab;抗CD22抗体，如epratuzumab;抗CD52抗体，如alemtuzumab;抗EpCAM抗体，如edrecolomab、Chl7-lA或IGN-101;抗CTP21或16抗体，女QXactin;抗DNA-Ag抗体，如13l-CotaraTNT-1;抗MUC1抗体，如pemtumomab或Rl50;抗MUC18抗体，如ABX-MA1;抗GD3抗体，如mitumomab;抗ECA抗体，如CeaVac或labetuzumab;抗CA125抗体，如OvaRex;抗HLA-DR抗体，如apolizumab;抗CTLA4抗体，如MDX-010;抗PSMA抗体，如MDX-070、"'In&90Y-J591、177LuJ591、J591-DM1;抗LewisY抗体，如IGN311;抗血管生成抗体，如AS1405和90YmuBCl;抗Trail-Rl抗体，如TRAILRmAb或TRAILR2mAb。双特异性或双功能性抗体构成第二代单克隆抗体，其中两种不同可变区在同一分子中组合起来(Hollinger禾卩Bohlen,1999,Cancerandmetastasis,rev,18:411-419)。由于能够增加新的效应子功能或能够耙向肿瘤细胞表面的几种分子而用于诊断性和治疗性领域，在这方面的有用性已得到证实。这种抗体可通过化学方法(GlennieMJ等人，1987,J.Immunol.139,2367-2375;ReppR.等人，1995,J.Hemat"377-382)或体细胞方法(somaticmethod)(StaerzU.D.和BevanM丄，1986,PNAS83,1453-1457;SureshM.R.等人，1986,MethodEnzymol，121:210-228)获得，也可优选通过遗传工程技术获得，遗传工程技术使异源二聚体化成为可能并因此促进目标抗体的纯化(Merchand等人，1998，NatureBiotech.,16:677-681)。这些双特异性抗体可构建为具有完整IgG、双特异性Fab'2、Fab'PEG、双体或双特异性scFv的结构，也可作为四价双特异性抗体的结构，其中对于每个靶抗原存在两个结合位点(Park等人，2000,MoL.Imtmmol,37(18):U23-30)或上述项目的片段。除特定的经济优势外，双特异性抗体的生产和使用比两个特异性抗体的生产更经济，使用这种双特异性抗体还具有降低治疗毒性的优势。的确，使用双特异性抗体有可能降低循环抗体的全部用量和随之产生的可能的毒性。在本发明的优选具体实施方式中，双特异性抗体是二价或四价抗体。最后，本发明涉及上述抗体或其衍生化合物或功能片段作为药物的用途。本发明还涉及包含由本发明所述抗体或其一种衍生化合物或功能片段组成的化合物作为活性成分的药物组合物。优选地，所述抗体中补充添加赋形剂和/或药学上可接受的载体。根据另一优选具体实施方式，本发明还涉及包含至少一个第二抗肿瘤化合物的上述药物组合物，所述第二抗肿瘤化合物选自能够特异性抑制受体(例如IGF-IR、EGFR、HER2/neu、cMET、VEGFR或VEGF或本领域技术人员已知的任何其它抗肿瘤化合物)的酪氨酸激酶活性的化合物。在本发明的第二优选方面，所述第二化合物可选自抗EGFR、抗IGF-IR、抗HER2/neu、抗cMET、VEGFR、VEGF等抗体、其分离抗体或其功能片段和衍生化合物，上述分离抗体或其功能片段和衍生化合物能够抑制所述受体启动的转移性扩散的增殖和/或抗凋亡和/或血管生成和/或诱导活性。根据本发明另一优选具体实施方式，组合物还包含至少一种如IGF-IR、EGFR、HER2/neu、cMET和VEGFR受体的酪氨酸激酶活性抑制剂，以作为联合产物以同时、分开或延长(extended)的方式使用。在另一优选具体实施方式中，所述这些受体的酪氨酸激酶活性抑制剂选自衍生天然试剂dianilinophthalimide、吡唑-或吡咯并-吡啶并嘧啶或喹唑啉。这种本领域技术人员熟知的抑制剂的描述见文献(CiardielloF.,Dmgs2000,Suppl.1,25-32)。另一本发明的补充性具体实施方式由上述组合物组成，其还包含细胞毒/细胞生长抑制剂以作为联合产物以同时、分开或延长使用。"同时使用"是指使用包含在单一剂型中组合物中的两种化合物。"分开使用"是指同时使用包含在不同剂型中的组合物中的两种化合物。"延长使用"是指依次使用包含在不同剂型中的组合物中的两种化合物。一般地，本发明所述的组合物显著提高癌症治疗的有效性。换句话讲，本发明所述的抗体的治疗性效果通过使用细胞毒试剂而以意料之外的方式增强。本发明所述的组合物产生的另一主要后续优势可能与使用较低有效剂量的活性成分有关，因此可能避免或降低副作用出现的风险，尤其是细胞毒试剂的效果。而且，该组合物可能更快地达到预期的治疗性效果。"治疗性抗癌剂"或"细胞毒试剂"是指当其为患者使用时，治疗或预防患者癌症的发展的物质。这种试剂的非限制性例子包括"烷化"剂、抗代谢剂、抗肿瘤性抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素剂、抗雄激素剂和免疫调节剂。例如，在V1DAL中在肿瘤学和血液学相关化合物的那一页，在"细胞毒的"题目下引用这种试剂；该文件作为参照引用的细胞毒性化合物作为优选细胞毒试剂在此处引用。"垸化剂"是指可在细胞内与任何分子(优选核酸，例如DNA)共价结合或能使这些分子烷化的物质。这种垸化剂的例子包括氮芥类，如双氯乙基甲胺(mechloreth證ine)、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、盐酸氮芥、哌泊溴烷(pipobroman)、泼尼莫司汀(prednimustine)、磷酸二钠或磷酸钠雌氮芥(estramustine);oxazaphosphorine类，如环磷酰胺、六甲密胺、曲磷胺(trofosfamide)、磺基磷酰胺(sulfofosfamide)或异环磷酰胺；氮丙啶类或氮杂环丙烷类，如塞替派(thiotepa)、三亚乙基二胺(triethyleneamine)或altetramine;亚硝(基)脲类，如亚础基脲氮芥、streptozocine、福莫司汀(fotemustine)或氯乙环己亚硝脲(lomustine);烷基磺酸盐类，如白消安(busulfan)、曲奥舒凡(treosulfan)或英丙舒凡(improsulfan);三氮烯类，如达卡巴嗪(dacarbazine);或铂复合物，如顺铂、奥克赛铂(oxaliplatine)或碳铂。"抗代谢剂"是指通过干扰某些活性(通常是DNA合成)阻断生长和/或细胞代谢的物质。抗代谢剂的例子包括甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、5-氟脱氧尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷、氟达拉滨(fludarabine)、胞嘧啶阿糖胞苷、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-巯基鸟嘌呤(6-TG)、氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、吉西他滨(gemcitabine)、克拉屈滨(cladribine)、脱氧柯福霄素(deoxycoformycin)和喷司^也丁(pentostatin)。"抗肿瘤性抗生素"是指可阻止或抑制DNA、RNA和/或蛋白合成的化合物。这种抗肿瘤性抗生素的例子包括多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(dau加rubicin)、伊达比星(idambicin)、戊柔比星(valmbicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、放线菌素(dactinomycin)、米拉霉素(mithramycin)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素C、博来霉素(bleomycin)和丙卡巴肼(procarbazine)。"有丝分裂抑制剂"阻止细胞周期和有丝分裂的正常进行。一般地，微管抑制剂或"紫杉垸"(如紫杉醇和紫杉萜)能够抑制有丝分裂。长春花属生物碱类如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)也能够抑制有丝分裂。"染色质抑制剂"或"拓扑异构酶抑制剂"是抑制形成染色质的蛋白(如拓扑异构酶I和II)的正常功能的物质。这种抑制剂的例子包括，对于拓扑异构酶I有喜树碱(camptothechie)及其衍:生物，如伊立替康(irinotecan)或托泊替〖荣(topotecan);对于拓扑异构酶lI有依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷和替尼泊苷(teniposide)。"抗血管生成剂"是任何抑制血管生长的药物、化合物、物质或试剂。抗血管生成剂的例子包括(但不限于此)雷佐生(razoxin)、马立马司他(i丽imastat)、巴马司他(batimastat)、普財木司4也(prinomastat)、坦诺司他(tanomastat)、伊洛马司他(ilomastat)、CGS-27023A、卤夫酮(halofuginone)、COL-3、新伐司他(neovastat)、BMS-275291、沙利度胺、CDC501、DMXAA、L画651582、角鳖胺(squalamine)、endostatine、SU5416、SU6668、干扰素-ouEMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁(angiostatin)和vitaxin。"抗雌激素剂"或"雌激素拮抗剂"是指任何降低、拮抗或抑制雌激素活性的物质。这种试剂的例子是他漠昔芬(tamoxifene)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、iodoxyfene、阿那曲唑(anastrozole)、来曲啤(letrozole)和依西美坦(exemestane)。"抗雄激素剂"或"雄激素拮抗剂"是指任何减少、拮抗或抑制雄激素活性的物质。抗雄激素剂的例子包括氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、螺内酉旨(sprironolactone)、乙酸环丙孕酉同(cyproteroneacetate)、非那雄胺(finasteride)和甲氰咪胍(cimitidine)。免疫调节剂是刺激免疫系统的物质。免疫调节剂的例子包括干扰素、白介素27(如阿地白介素、OCT-43、denileukindiftitox或白介素-2)、月中瘤坏死因子(如tasonermine)或其它类型的免疫调节剂，如蘑菇多糖、西佐喃(sizofiran)、罗喹美克(roquinimex)、匹多莫德(pidotimod)、培加l酉每(pegademase)、thymopentine、polyI:C或左旋咪唑与5-氟尿嘧啶联合使用。对于进一歩的细节，本领域技术人员可参照theFrenchAssociationofTherapeuticChemistryTeachers出版的名为TherapeuticChemistry,vol.6,Antitumordrugsandperspectivesinthetreatmentofcancer,TECandDOCedition,2003[inFrench]"的手册。在特别优选的具体实施方式中，本发明所述的作为联合产物的组合物的特征在于所述细胞毒试剂以化学方式结合至所述抗体上以同时使用。在特别优选的具体实施方式中，所述组合物的特征在于所述细胞毒/细胞生长抑制性试剂选自纺锤体抑制剂或稳定剂，优选长春瑞滨和/或长春氟宁和/或长春新碱。为促进所述细胞毒试剂与本发明所述的抗体之间的结合，可在结合的两种化合物之间引入间隔分子，如聚多烯基乙二醇、聚乙烯乙二醇或氨基酸；或者，在另一具体实施方式中，可使用其内已引入能够与所述抗体反应的官能的所述细胞毒试剂的活性衍生物。这些结合技术对于本领域技术人员是已知的，在本发明中其细节将不再讨论。其它EGFR抑制剂包括(非限制性)单克隆抗体C225和抗EGFR22Mab(ImCloneSystemsIncorporated)、ABX-EGF(Abgenix/CellGenesys)、EMD-7200(MerckKgaA)或化合物ZD-1834、ZD-1838和ZD-1839(AstraZeneca)、PKl-166(Novartis)、PKI-166/CGP-75166(Novarlis)、PTK787(Novartis)、CP70〗(Cephalon)、flunomide(Pharmacia/Sugen)、CI-〗033(WarnerLambertParkeDavis)、CI-1033/PD183,805(WarnerLambertParkeDavis)、CL-387,785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(BoehringerMannheimGMBH/Roche)、NaamidineA(Bristol-boardMyersSquibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(BoehringerIngelheim)、OLX-103(Merck&Co)、VRCTC-310(VentechResearch)、EGF融合毒素(SeragenInc.)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM扁252808(ImperialCancerResearchFund)、RG-50864(INSERM)、LFM-A12(ParkerHughesCenterCancer)、WHI-P97(ParkerHughesCenterCancer)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(KyowaHakko)或"EGFR疫苗"(YorkMedical/CentroofImmunologiaMolecular)。本发明的另一方面涉及特征在于至少一种所述抗体或其衍生化合物或功能片段与细胞毒素和/或放射性同位素结合的组合物。优选地，所述毒素或所述放射性同位素能够阻止肿瘤细胞的生长或增殖，特别是能够完全灭活所述肿瘤细胞。还是优选的，所述毒素是肠道细菌毒素，特别是假单胞细菌属(Pseudomonas)28外毒素A。优选与治疗性抗体联合使用的放射性同位素是放射Y射线的同位素，优选碘'31、钇，金199、钯,、铜67、铋2'7和锑211。在治疗上也可使用放射a和卩射线的同位素。"与至少一种本发明所述抗体或其功能片段联合使用的毒素或放射性同位素"是指任何使所述毒素或所述放射性同位素可能与至少一种抗体结合，特别是两个化合物之间以共价结合(引入或不引入结合分子)的方法。使全部或部分结合成分之间形成化学键(共价键)、静电键、或非共价键的试剂的例子包括，尤其是苯醌、碳化二亚胺，并更特别地EDC(l-乙基-3-[3-二甲基-氨基丙基]-氯化碳化二亚胺)、二马來酰亚胺(dimaleimide)、二硫代双硝基苯甲基(DTNB)酸、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、具有一个或多个基团的桥键试剂、具有一个或多个侧苯基(phenylaside)基团的桥键试剂、与紫外线(UV)反应的试剂、最优选N-[-4(叠氮水杨酰氨基)丁基]-3'-(2'-二硫代吡啶基)-丙酰胺(APDP)、N-琥珀酰亚胺-基3(2-二硫代吡啶基)丙酸酯(SPDP)和6-肼基-烟酰胺(HYNIC)。特别是对于放射性同位素，另一种结合形式可由双功能离子螯合剂组成。这种螯合剂的例子包括EDTA(乙二胺四乙酸)或DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)衍生螯合剂，这些衍生螯合剂被丌发出来以使金属(尤其是放射活性金属)与免疫球蛋白结合。因此，DTPA及其衍生物在碳链上可以被各种基团取代以使配基-金属复合体的稳定性和刚度增加(Krejcarek等人，1977;Brechbiel等人，1991;Gansow,1991;美国专利4,831,175)。例如，DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)及其衍生物，以其游离形式或以其与金属离子复合的形式，在药物和生物学领域在长时间内广泛应用，表现出显著的与金属离子形成稳定螯合剂的特征，该稳定螯合剂可与治疗目的或诊断目的的蛋白例如抗体偶合，以开发用于癌症治疗的放射-免疫交联剂(Meases等人，1984;Gansow等人，1990)。还是优选地，所述至少一种形成所述交联剂的本发明所述抗体选自其功能片段，特别是丧失其Fc成分的片段，如scFv片段。本发明还包含组合物在制备旨在预防或治疗癌症的药物中的用途。本发明还涉及抗体或其衍生化合物或其功能片段(优选人源化抗体)和/或本发明所述的组合物在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。一般地，本发明涉及抗体或其衍生化合物或其功能片段(优选人源化抗体)和/或组合物在制备癌症预防或治疗的药物中的用途。可被预防和/或治疗的癌症优选包括前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌或任何其他癌症。以优选方式，所述癌症选自雌激素相关的乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌和/或胰腺癌。本发明的另一方面涉及所述抗体在JAM-A表达水平相关疾病诊断方法(优选体外诊断)中的用途。优选地，在所述诊断方法中，所述JAM-A蛋白相关疾病是癌症。因此，本发明所述的抗体或其衍生化合物或其功能片段可用于生物样品中的JAM-A蛋白的体外检测和域定量方法中，特别是用于与该蛋白的非正常表达相关疾病(如癌症)的诊断中，其中所述方法包含下列歩骤a)使生物样品与本发明所述抗体或其衍生化合物或其功能片段接触；b)证实可能形成的抗原-抗体复合体。因此，本发明还包含实现所述方法(所述方法是用于检测巴黎嗜肺性军团菌(丄eg/o"e〃aParis)或相关生物体基因表达的方法，或检测和/或鉴定巴黎嗜肺性军团菌细菌或相关微生物的方法)的试剂盒或组件，其包含下列成分a)本发明所述的多克隆抗体或单克隆抗体；b)可选地，构成有益于免疫反应发生的介质的试剂；c)可选地，显示免疫反应产生的抗原-抗体复合体的试剂。优选地，可将抗体或其功能片段固定在支持物上，特别是固定在蛋白芯片上。一种这类蛋白芯片是本发明的目标。优选地，可将蛋白芯片用于检测和/或定量生物样品中的JAM-A蛋白所需的试剂盒或组件中。必须说明的是，术语"生物样品"此处涉及取自活的生物体的样品(特别是血液、组织、器官或其它取自哺乳动物特别是取自人的样品)或任何可能包含一种这类JAM-A蛋白的样品(如细胞样品，如果需要的话，是转化了的细胞样品)。所述抗体或其功能片段可以是免疫交联剂的形式或以标记抗体的形式，以获得检测和/或可定量的信号。本发明所述的标记抗体或其功能或片段包括，例如抗体交联剂(免疫交联剂)可与例如酶结合，这些酶如过氧化物酶、碱性磷酸酶、a-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱脂酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和葡萄糖-6磷酸脱氢酶，或可与分子结合如生物素、地高辛或5-溴代脱氧尿嘧啶核苷。荧光标记物也可结合本发明所述的抗体或其功能片段，包括特别是荧光素及其衍生物、荧光色素、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、绿色荧光蛋白(GFP)、丹酰、伞形酮等。在这种交联剂中，本发明所述的抗体或其功能片段也通过本领域技术人员已知方法制备。它们可与酶或荧光标记物直接结合；通过间隔基团或连接基团结合，如多醛、戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)或二亚乙基三胺五乙酸(DPTA);或在结合试剂存在条件下结合，如那些上面提到的用于治疗性交联剂的结合剂。带有荧光标记物的交联剂可与异硫氰酸酯发生反应而制备。其它交联剂还包括化学发光标记物，如鲁米诺和二环氧丙垸(dioxetane)，生物发光标记物，如荧光素酶和荧光素，或放射活性标记物，如碘'"、碘125、碘126、碘133、溴77、锝"m、铟111、铟113"\镓67、镓68、钌95、钌97、钌1，钌，汞107、汞203、铼"m、铼101、铼'°5、钪47、碲'21,1，、碲1221，1、碲'25m、铥'65、铥，铥'68、氟'8、钇，和碘131。本领域技术人员已知的现有放射性同位素与抗体结合方法，直接结合或通过螯合剂如上述EDTA或DTPA结合，可作为诊断性放射性同位素使用。因此，应该提到，通过氯亚明(chloramine)-T技术以[碘125]钠标记的方法(HunterW.M.和GreenwoodF.C.(1962)Nature194:495);如Crockford等人所述的以锝99m标记(美国专利4,424,200)的方法或如Hnatowich所述经DTPA结合(美国专利4,479,930)。本发明还涉及本发明所述的抗体在制备用于将具有生物活性的化合物特异性靶向表达或过表达JAM-A蛋白的细胞的药物中的用途。在本说明书的意义上讲，"具有生物活性的化合物"是任何能够调节(特别是抑制)细胞活性，特别是生长活性、增殖活性、转录和基因翻译活性的化合物。本发明还涉及由本发明所述的抗体或其功能片段，优选标记的抗体或其功能片段，特别是放射性标记的抗体或其功能片段组成的体内诊断试剂，及其在医学成像中的用途，特别是在细胞表达或过表达JAM-A蛋白相关的癌症的检测中的用途。本发明还涉及作为联合产物的组合物或涉及用作药物的本发明所述的抗JAM-A/毒素交联剂或放射性同位素。优选地，所述作为联合产物的组合物或所述交联剂中添加补充赋形剂和/或药学载体。在本说明书中，"药学载体"是指化合物或化合物的组合，其包含在药物组合物中，不会引起次级反应，并且例如促进活性化合物的使用、延长其在机体中的存在时问和/或有效性、增强其在溶液中的溶解性或改善其贮存。本领域技术人员已熟知这种药学载体，并可根据选择的活性化合物的特性和使用途径而作调整。优选地，这种化合物通过全身途径使用，特别是通过静脉内、肌内、皮内、腹膜腔内、皮下或口服途径使用。更优选地，由本发明所述的抗体组成的组合物分间隔时间相同的几次剂量使用。根据制定适合患者的治疗方法时一般考虑的条件，例如，患者年龄或体重、他的一般状态的严重程度、他对治疗的耐受性和经历过的副作用，确定组合物的使用途径、剂量时间表和最佳盖仑形式。因此，本发明涉及抗体或其一种功能片段在制备用于将具有生物活性的化合物特异性靶向表达或过表达JAM-A的细胞的药物中的用途。本发明的其他特征和优势在说明书的实施例和附图(以下是)中进一歩描述。3图1分别显示鼠6F4抗体重链和轻链序列。下划线和加粗部分是CDR(根据Kabat编号)。图2A和2B代表鼠6F4抗体的V区(图2A)禾QJ区(图2B)分别与选择的鼠细胞系的比对，即对于V区为IGKV19-93*01(SEQIDNo.39)，对于J区为IGKJ1*01(SEQIDNo.40)。图3A和3B代表鼠6F4抗体的V区(图3A)和J区(图3B)分别与选择的人细胞系的比对，即对于V区为IGKV1-33*01(SEQIDNo.41)，对于J区为IGKJ1*01(SEQIDNo.42)。图4代表分别参照KABAT和1MGT编码系统的6F4抗体轻链的蛋白序列。图5A、5B和5C代表鼠6F4抗体的V区(图5A)、D区(图5B)和J区(图5C)分别与选择的鼠细胞系的比対，即对于V区为IGHV1S135*01(SEQIDNo.43),对于D区为IgHD-ST4*01(SEQIDNo.44)，对于J区为IgHJ2*01(SEQIDNo.45)。图6A、6B和6C代表鼠6F4抗体的V区(图6A)、D区(图6B)和J区(图6C)分别与选择的人细胞系的比对，即对于V区为IGHV1-P01(SEQIDNo.46)，对于D区为IGHD1-1*01(SEQIDNo.47)，对于J区为IGHJ4*01(SEQIDNo.48)。图7代表分别参照KABAT和IMGT编码系统的6F4抗体重链的蛋白序列。图8A和8B代表HT-29细胞膜的6F4抗原的6F4-琼脂糖免疫纯化。还显示SDS-PAGE电泳(图8A)和western杂交(图8B)对收集的组分的分析。图9A和9B显示SDS-PAGE电泳(图9A)禾tlwestern杂交(图9B)对免疫纯化的蛋白的分析。在还原或非还原条件下进行并分析两个纯化(#1和#2)。图10显示胰蛋白酶水解后杣提的肽混合物的MALDI-TOF质谱分析。图11A禾tl11B由western杂交(在非还原条件下)鉴定的蛋白的确认用6F4抗体(图l]A)和抗人.TAM-A多克隆抗体揭示(图l]B)。图12显示6F4抗体对于人JAM-A蛋白的特异性。每种蛋白使用的量是250ng、25ng禾口10ng。图13代表将HBS-EP缓冲液中100nm的6F4抗体注射(双箭头)至鼠JAM1Fc蛋白(流动细胞#1,底部曲线)和鼠JAMlFc蛋白(流动细胞#2，顶部曲线)上2分钟后获得的传感图谱，在25。C下解离时间5分钟，流速是30pl/min(CM4:m-JAMl-Fc501.6RU(Fcl)和511.5RU(Fc2))。图14代表使用双参照，(Fc2-Fcl)6F4(Fc2-Fcl)HBS-EP获得的传感图谱。曲线使用LangmuirA+B结合模型拟合。计算出的动力学参数如下11=(1.38±0.001)*105M—V';kd=(0.25±1.58)*10-V；Rmax(整体拟合)=371RU;k2=0.853。图15显示瑞士裸鼠MCF-7细胞异种移植模型中6F4抗体的抗肿瘤活性。通过IP途径，非纯化形式(腹膜腔液体)，以理论剂量250吗/小鼠，一周两次检测6F4抗体。9G4抗体是同一同种型(IgGl)的抗体，与测定的活性不相关。32图16显示各种肿瘤细胞系表面Mab6F4识别的JAM-A蛋白表达。图17代表人源化6F4VL结构域序列，其中带*的是对应于与人对应物相比实际上发生改变的氨基酸，带1的对应于分析其被人源化能力的氨基酸，人残基以其下有标记注明，并且带2的对应于在人源化6F4VL结构域中保留的鼠的氨基酸。图18代表人源化6F4VH结构域序列，其中带*的是对应于与人对应物相比实际上发生改变的氨基酸，带1的对应于分析其被人源化能力的氨基酸，人残基以其下有标记注明，并且带2的对应于在人源化6F4VH结构域中保留的鼠的氨基酸。图19显示6F4MAb诱导的JAM-A体外下调。图20显示6F4MAb诱导的体内的肿瘤细胞增殖的抑制作用。图21代表6F4Mab诱导的JAM-A体内下调。图22代表在体内模型中，6F4及其F(ab')2片段对MCF-7的效应比较的曲线。图23显示甲状腺正常组织与肿瘤组织JAM-A表达的比较。图24显示肺正常组织与肿瘤组织JAM-A表达的比较。图25显示乳腺正常组织与肿瘤组织JAM-A表达的比较。图26代表显示6F4对裸鼠A431表皮样癌异种移植物的体内活性曲线。图27显示A:6F4抗体对PHA诱导的非特异性淋巴细胞增殖的效应；B:6F4抗体对抗原递呈过程的效应。第--次实验有2名独立供体。图28显示A:6F4抗体对PHA诱导的非特异性淋巴细胞增殖的效应；B:6F4抗体对抗原递呈过程的效应。第二次实验有2名独立供体。图29显示10名人正常供体的血小板聚集。结果以均值+Asd表示。图30代表10名人正常供体的血清毒素释放。结果以均值+Asd表示。图31代表6F4VH结构域与IGHV1-03*01种系基因(SEQIDNo.49)之间的比对。实施例实施例1:6F4抗体的产生为产生鼠单克隆抗体(Mab)，使用来自ATCC的5xl06MCF-7细胞免疫接种BALB/C小鼠。最后加强注射107个MCF-7细胞后，将来自小鼠淋巴结的细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞使用Kohler和Milstdn描述的经典技术融合。然后筛选融合后杂交瘤的上清液的功能活性，即其体外抑制MCF-7细胞增殖的活性。为了这个筛选，将MCF-7细胞培养在96-孔培养板中，培养密度是每孔100^不含胎牛血清的杂交瘤培养基中含5^03个细胞。将培养板在含5%C02的空气中于37'C温育24小吋。24小时后，在每孔中加入50nl待筛选的杂交瘤上清液。培养板的最后一行留作对照-在三个孔中添加50^与目的活性不相关的杂交瘤上清液(其在与融合细胞所使用的培养基相同的培养基中培养)。这些细胞将用于校正非活性上清液对氚标记脱氧胸腺嘧啶核苷的影响；-在三个孔中添加50^杂交瘤培养基。在培养大约52小时后，每孔添加0.25pCiSH脱氧胸腺嘧啶核苷，并于37'C再温育20小吋。3H脱氧胸腺嘧啶核苷在DNA中的引入指示细胞增殖可通过测定液体闪烁计数而定量。对于作为对照孔(仅包含培养基和包含不相关杂交瘤上清液)功能的每个板确定背景噪音和阈值。通过这种方法，在第一次筛选后筛选出43种分泌抑制MCF-7细胞生长的抗体的杂交瘤。这43种杂交瘤中有11种活性弱或不存在生长并被丢弃。在杂交瘤的扩展和克隆后进行的增殖试验中，只有其上清对MCF-7细胞增殖具有》20%抑制活性的杂交瘤才被选择。在克隆/选择过程结束时，只有一个克隆证实具有需要的特性，6F4克隆。实施例2:通过6F4抗体的轻链可变区(6F4VL)CDR-移栴的人源化过程a)6WPX麽^^/与厥萄"/5效崴潘應賓^之/坊游怂發作为CDR-移植的人源化的初歩歩骤，首先将6F4VL核苷酸序列与IM:GT数据库(网址http://imgt.cines.fr)中存在的所有鼠细胞系序列进行比较。鉴定出具有V区序列同一性是98.56%，J区序列同一性是100%的鼠细胞系的V和J区，分别是IGKV19-93*01(SEQIDNo.39,EMBL命名法AJ235935)和IGKJI永Ol(SEQIDNo.40，EMBL命名法:V00777)。考虑到这些同一性百分数，决定直接使用6F4VL序列。图2A代表V区的比对而图2B代表J区的比对。b)6何n凝,廢,，-与/^*义潘應系^游化麥为鉴定对于CDR-移植最好的人候选分子，寻找与6F4VL具有最大可能的同一性的人起源的种系。为这个目的，将小鼠6F4VL核苷酸序列与IMGT数据库中存在的所有人序列比较。鉴定出具有V区序列同一性是81.36%，即IGKV1-33*01(SEQIDNo.41,EMBL命名法M64856),J区序列同一性是86.84%，即IGKJ1*01(SEQIDNo.42,EMBL命名法J00242)的人源细胞系的V和J区。因此，对于V区选择细胞系IGKV1-33*01，对于J区选择细胞系IGKJ1*01作为小鼠6F4VLCDR的人受体序列。图3A显示V区的比对，图3B显示J区的比对。c)6何K丄游乂嚴众嚴,人源化过程由下列歩骤组成将IGKV1-33*01与IGK.T1*01细胞系序列连接起来，然后将小鼠6F4VLCDR连在同种系抗体的支架区上。人源化过程的这个阶段中，将小鼠6F4Fv区的分子模型对于选自待保留的小34鼠残基是特别有用的，因为它们在维持分子的三维结构(CDR、VH/VL界面的规范结构等)或在结合抗原上发挥重要作用。在支架区，非常仔细地检查了小鼠(6F4VL)和人(IGKV1-33*01/IGKJ1*01)核酸之间的每一处区别。下面为更清楚起见，图4代表参照KABAT和IMGT分类法的6F4VL序列。鉴定出3个必须保留的鼠残基。根据IMGT，残基33(lie)参与CDR1锚定，根据Kabat其是CDR1的一部分。根据IMGT，残基49(His)参与CDR2锚定，参与构成VH/VL界面并属于Vernier区。根据IMGT,残基53(Thr)参与CDR2锚定，根据Kabat其是CDR2的一部分。最初将研究IGKV1-33*01和IGKJ1*01支架区的三个改变。这些改变涉及残基24、69和71(IMGT命名法)。应理解，当然，这三个改变是彼此独立地研究的并也可形成各种联合形式。目标是得到可用的所有可能的突变体以测试这些突变体并选择那些保留了最好的结合特性的突变体。因此将每个突变体进行ELISA/Biacore结合试验。残基24(Lys/Gln)靠近CDR1，并因此对于维持能使CDR1正确呈现的构型很重要。更特别地，该残基可能与残基69-70在Vemier区内相互作用。Lys在人VL中是唯一不太重要的，但根据Kabat其是CDR1的一部分。尽管残基69(Arg/Thr)在Vernier区内并因此直接参与CDR1的规范结构，该残基在人VL中总是Thr。尽管残基71(Tyr/Phe)直接参与CDR1的规范结构，该残基在人VL中总是Phe。第二，可考虑将残基56(Ala)修改为Thr。根据IMGT该残基尽管在CDR夕卜，根据Kabat也属于CDR2。第三和最后，可将残基34和55(IMGT命名法)进行两个额外的改变。这两个残基，在IMGT定义的CDR夕卜，但包括在Kabat定义的CDR内。根据Kabat，残基34(Ala/Asn)属于CDR]并部分参与形成VH/VL界面。这种突变保留相关，尽管在人中Ala的强烈代表。根据Kabat，残基55(Gln/Glu)是CDR2的一部分，并还参与形成VH/VL界面。这种突变保留相关，尽管在人中Gln的强烈代表。如上所述，这三突变可独立试验或以各种联合形式试验。实施例3:通过6F4抗体的重链可变区(6F4VH)CDR-移植的人源化过程a)6WK丄孩-,凝,身与,夯t^7lf潘屋力,^^之/^游仏茨作为CDR-移植的人源化的初歩歩骤，首先将6F4VH核苷酸序列与IMGT数据库(网址http://imgtxines.fr)中存在的所有鼠细胞系序列进行比较。鼠细胞系的V区、D区和J区对于V区序列同一性是99.30%(1GHV1S135*01;35SEQIDNo.43;EMBL命名法AF304556),对于D区序列同一性是80%(IgHD-ST4*01;SEQIDNo.44;EMBL命名法:M23243),对于J区序列同一性是100%(IgHJ2*01;SEQIDNo.45;EMBL命名法V00770)。图5A代表V区的比对，图5B代表D区的比对，图5C代表J区的比对。考虑到这些同一性百分数，决定直接使用6F4VH序歹U，就像6F4VL的情况。图2A代表V区的比对而图2B代表J区的比对。b)柳樣/歸与扁，〃乂雄薪磨/娥为鉴定对于CDR-移植最好的人候选分子，寻找与6F4VH的三个V、D和J区中每个区具有最大可能的同一性的人起源的种系。为这个目的，将小鼠6F4VH核苷酸序列与IMGT数据库中存在的所有人细胞系序列比较。鉴定出人起源种系，其对于V区序列同一性是75.34%(IGHVI-P01;SEQIDNo.46;EMBL命名法Z12305)，对于D区是71.42%(IGHD1-1*01;SEQIDNo.47;EMBL命名法X97051)，对于J区是87.51%(IGHJ4*01;SEQIDNo.48，EMBL命名法J00256)。对于V、D和J区中每一区而言，选择上述种系并重新排列各区。图6A代表V区比对，图6B代表D区比对，图6C代表J区比对。c)6F4w/游乂iT众麽本人源化过程山下列歩骤组成将IGHVI陽:POI、IGHD1-1*01与IGHJ4*0]细胞系序列连接起来，然后将小鼠6F4VHCDR连在这些同种系抗体的支架区上。人源化过程的这个阶段中，小鼠6F4Fv区的分子模型对于待保留小鼠残基的选择特别有用，因为它们在维持分子的三维结构(CDR、VH/VL界面等的规范结构)或在结合抗原上发挥重要作用。在支架区，非常仃细地检查了小鼠(6F4VH)和人(IGHVI-:POI、IGHD1-1*01和IGHJ4*01)核酸之问的每一处区别。下面为更清楚起见，图7代表参照KABAT和IMGT分类法的6F4VH序列。正像轻链的情况，鉴定出4个鼠残基必须保持不变。残基2(lie)是Vernier区的一部分，并参与形成CDR3结构。根据IMGT，残基35(Tyr)参与CDR1锚定，根据Kabat其是CDR1的一部分，并还参与形成VH/VL界面，并与CDR3相互作用。根据IMGT,残基50(Tyr)参与CDR2锚定，根据Kabat其是CDR2的一部分，还是Vernier区的一部分并参与形成VH/VL界面。根据IMGT，残基59(Arg)参与CDR2锚定，根据Kabat其是CDR2的一部分并参与形成VH/VL界面。第一人源化版本将能分别包括残基61、62和65上的三个突变(1MGT分类法)。根据Kabat，这三个残基位于CDR2上并参与形成VH/VL界面。残基61(Asn/Ala)不直接参与抗原识别。因此可考虑该位置的突变。残基62(Gln/Glu)和残基65(Lys/Gln)。36第二，将评价另外两种改变。这两种改变涉及残基48和74(IMGT命名法)。残基48(1e/Met)属于支架区，参与形成VH/VL界面。残基74(Lys/Thr)是Vernier区的一部分，并可参与形成CDR2结构。第三和最后，可考虑第三系列突变，即残基9(Pro/Ala)和41(His/Pro)上的改变。因此，与6F4VL上计划的突变相似的方式，目标是尽可能近得接近人的种系而不改变CDR的锚定功能。仅是总结目的，下表4和5分别列出所使用的细胞系及其氨基酸和核苷酸序列编号。表4种系(EMBL编号)SEQIDNo.IGKV19-93*01(AJ235935)39IGKJ1*01(V00777)40IGKV1-33*01(M64856)411GKJ1*01(J00242)42IGHV1S135承01(AF304556)43IGHDST4*01(M23243)44IGHJ2*01(V00770)45IGHV〗-f*01(Z12305)46IGHD1-1*01(X97051)47IGHJ4*01(J00256)48IGHV1-03*01(X62109)49种系(EMBL编号)SEQIDNo.IGKV19-93*01(AJ235935)50IGKJ1*01(V00777)51IGKV1-33*01(M64856)52GKJ1*01(00242)53IGHV1S135*01(AF304556)54IGHD-ST4*01(M23243)55IGHJ2*01(V00770)56IGHVl-f*01(Z12305)57IGHD1-P01(X97051)58IGHJ4*01(J00256)59IGHV1-03*01(X62109)60实施例4:6F4抗体抗原靶标的纯化和鉴定免疫亲和纯化6F4抗体的抗原靶标是从富含膜组分的HT-29细胞中纯化获得的。在溶解于3750mMTris/HCl缓冲液(pH7.4，含有150mMNaCl、TritonX-100和IGEPAL)后，将膜蛋白与固定在琼脂糖微珠上的6F4抗体于4'C，轻轻混合，温育过夜。然后将微珠上形成的6F4-Ag复合体用各种包含去污剂的溶液洗涤以去除非特异性结合的蛋白。用0.1MGly/HCl缓冲液，pH2.7将6F4抗原靶标从6F4-琼脂糖支持物上洗脱下来。将收集的组分进行SDS-PAGE电泳(10%凝胶，非还原条件)，将凝胶转移到硝酸纤维素膜上后进行western杂交分析(使用的6F4第一抗体的浓度是0.5吗/ml，化学发光检测)，以选择富含目的抗原的组分(图8A和8B)。western杂交分析证实在非选择组分和洗涤液中不含目的蛋白，后者在酸性pH时特异性洗脱。然后将来源于两个纯化的富集组分进行SDS-PAGE电泳(10%凝胶)，并在以前描述的条件下进行western杂交分析。western杂交中6F4抗体识别的抗原在还原条件下分析后表观分子量(apparentmolecularweight)是35kDa(图9A和9B)。当电泳在非还原条件下进行时，可注意到表观分子量的区别，在这样的条件下，表观分子量的确稍微低于在还原条件下观察到的表观分子量。抗原耙标的鉴定SDS-PAGE(10%凝胶)电泳后，以胶体(colloidal)蓝用与质谱分析方法相适合的方法将蛋白染色(图IO)。将对应于western杂交检测出来的蛋白的目的带用解剖刀切下来，然后在25mM碳酸氢铵溶液中温育脱色。还原(DTT)/烷化(碘乙酰胺)后，蛋白经胰蛋白酶(P腿ega)"凝胶上"水解(37'C水解过夜)，胰蛋白酶是在赖氨酸和精氨酸残基位置水解蛋白的蛋白水解酶，因此释放具有C-末端位置是赖氨酸或精氨酸残基的肽，在甲酸存在下，用乙腈/水混合物(70/30,v/v)抽提产生的蛋白。然后在ATFA存在条件下，将这些蛋白放置在带有基质U-氰-羟基肉桂酸，BrukerDaltonics)的混合物中的MALDI靶标上，并然后进行MALDI-TOF质谱分析(Autoflex,Brukei'Dahonics)。获得的质谱见图10。将从这项分析中推断出的肽列表通过用Mascot查找引擎(MatrixSciences)查找数据库用于鉴定蛋白。NCBInr数据库查找结果，限于人起源的蛋白内，指示三种蛋白具有显著的得分(得分>64):1.人I型连接粘连分子的品体结构得分=116该蛋白对应于用于结构研究的F11R/JAM-A蛋白的胞外区结构域。2.F11受体(人类)得分=116该蛋白对应于蛋白Fll/R亚型a的前体。3.F11受体亚型b(人类)得分=65这是蛋白F11R的前体，其相对于亚型a有两个20个氨基酸的删除。因此，将通过这个方法鉴定的蛋白称为FllR或Fll受体。事实上，这是该蛋白当其首次作为所谓的Fll抗体的受体被描述时采用的官方指定名称(Naik等人，1995,Biochem..T.，310,155-162)。如今该蛋白以其名称JAM-A或"连接粘连分子A"而广为人知，还可称为JAM1、PAM-1、CD321或抗原106。胰蛋白酶水解释放的和经质谱分析的肽中，9种肽的实验分子量对应于(在O.lDa以内)对JAM-A/亚型a的人类形式进行理论水解获得的肽的实验分子量。这9种肽包含该蛋白37%的一级序列。而且，JAM-A前体(~32.9kDa)的理论分子量与SDS-PAGE实验性确定的表观分子量一致。western杂交鉴定的靶标的确定然后，将通过蛋白水解方法鉴定的JAM-A通过western杂交确定，其中western杂交是在10。/,SDS-PAGE凝胶在非还原条件下进行，6F4抗体是0.5吗/ml,通过化学发光检测。如图11A所示，6F4抗体识别HT-29膜抽提物中的和免疫纯化方法富集组分(表观MW=35kDa)中的天然JAM-A蛋白，以及二聚体重组蛋白JAM-A/Fc(R&DSystemsref.1103-JM,表观MW120kDa)。该识别等同于商售抗人JAM-A山羊多克隆抗体(R&DSystems,ref.AF1103)稀释至1A000(图IIB)。实施例5:6F4抗体对人JAM-A的特异性6F4抗体的特异性通过在上述条件下进行western杂交而确定。图12显小，6F4抗体对于人类形式的.1AM-A具有特异性，山于其识别重组蛋白hJAM-A/Fc(R&DSystemsref.1103-JM),而不识别人类形式的JAM-B和JAM-C(重组蛋白hJAM-B/Fc和hJAM-C/Fc，R&DSystemsref.1074-VJ和1189-J3)也不识别鼠形式的JAM-A(重组蛋白m.TAM-A/Fc,R&DSystemsref.1077-JM)。实施例6:通过BIAcore(表面等离子体共振技术)测定6F4抗体的亲和力原理使用BIAcore，6F4抗体对于可溶性蛋GJAM-l-Fc(胞外结构域与该抗体的Fc片段融合并以重组形式在NSO细胞中产生)的亲和力常数Kd(M)可根据公式KD=kd/ka(Rich和Myszka,J.Mol.Recog.,2005,18,431)由结合动力学(ka)(1/m.s)和解离动力学(kd)(l/s)的确定计算出来。材料和方法發:^游汰器.'BIAcoreX和BIAevaluation3.1X软件(Uppsala,SW)感-鼠单克隆6F4抗体1.3mg/ml-人JAM-l-Fc(ref.1103-JMR&D系统)50(ig无载体-小鼠.TAM-l-Fc(ref.1077-JMR&DSystems):50叱无载体-运行缓冲液HBS-EP(BIAcore)-结合试剂盒"胺"(BIAcore)-结合缓冲液乙酸盐pH5.0(BIAcore)-捕获抗体山羊IgGFc抗人^GAH山羊抗人)(Bioscience)-再生缓冲液甘氨酸、HClpH1.5，作用30秒(BIAcore)zy讼浙兹论图13的数据显示鼠6F4抗体与人JAM-1蛋白胞外部分结合，但不与鼠JAM-1蛋白胞外部分结合图14的数据使得有可能计算在这些实验条件下6F4抗体对于人JAM-1蛋白的Kd是22pM。慢解离动力学显示抗体对于抗原的亲和力现象的参与(二价分析模型)。实施例7:6F4抗体在MCF-7异种移植物模型体内的活性6F4抗体(未纯化和以250pg/小鼠的剂量经1P途径注射)试验证明该抗体显著抑制体内MCF-7细胞的生长，与PBS注射(图15)的小鼠相比，其抑制百分数达56%。用作IgGl对照同种型的非相关的9G4抗体是，如预期，无抗肿瘤活性。实施例8:6F4识别的抗原在--系列肿瘤细胞上的分布的研究为了确定6F4抗体的潜在效果，4种类型的肿瘤用流式细胞仪就其膜表达的特征进行了研究。选定的细胞系是MCF-7(雌激素相关乳腺癌)、A549(非小细胞肺癌)、HT29及Cok)205(结肠癌)和BxPC3(胰腺癌)。对于标记细胞，试验了一系列剂量(10|ig/ml、5吗/ml、1吗/ml、0.5叱/ml、0.25吗/ml和0.125吗Zml)。图16屮的结果显示，6F4抗体识别在所有试验的细胞表面显著表达的抗原。获得的标记是饱和的，这证实其特异性。位点的饱和从浓度是1吗/ml的抗体获得，这证明6F4抗体对于]AM-A抗原的亲和力是高的。实施例9:通过6F4抗体轻链可变区(6F4VL)的CDR-移植的人源化-免疫遗传学分析的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>-最接近的人V基因鉴定的详细数据最接近的V区(从V区第-一核苷酸至第二-CYS密码子加15nt的CDR3-IMGT计算而來)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>M64855IGKV1D-33*0192281.36%(227/279nt)X63398IGKV1-27*0186879.21%(221/279nt)Y14865IGKV1-NL1*0184178.14%(218/279nt)X72817IGKV1D-43*0184178.14%(218/279nt)-最接近的人J基因鉴定的详细数据最接近的J-区得分同一性J00242IGKJ1*0114086.49%(32/37nt)AF103571IGK.T4*0212281.08%(30/37nt)J00242IGKJ4*0111378.38%(29/37nt)Z70260IGKJ2*0210475.68%(28/37nt)Z46620IGKJ2*049572.97%(27/37nt)-关键残基的鉴定在对外部CDR的关键残基的定义和分级中包含几种标准。这些标准至少包括，巳知的参与形成VH/VL界面、与抗原结合或CDR结构、鼠和人残基之间的氨基酸类别改变、可变结构域的3D结构中残基的定位等。发现6F4VL结构域与最接近的IGKV1-33*01人种系V基因之间有21个氨基酸不同，所有这些不同在CDR残基之外。从这21个残基之中，对上述引用的参数的分析导致鉴定出9个最有可能起作用的残基。这些鼠残基是K24、139、A40、H55、T66、Q68、A69、R85和Y87。在这9个残基之中，设想其中3个残基甚至更加重要以致于在人源化形式中保持其鼠源。这些残基是139和H55和T66，分别位于CDR1和CDR2锚上。最后，单独和/或联合分析6个氨基酸以确定它们是否能人源化或是否保持其鼠源。由于J-区不参与抗原结合和V-区结构形成，决定使用原生人IGKJ1*01种系基因。在图17描述的人源化6F4VL结构域的设计序列中*对应于实际上其人的对应物发生改变的氨基酸；1对应于分析了其人源化能力的氨基酸，人的残基下面用标记表明；2对应于在人源化6F4VH结构域保持鼠源的氨基酸。实施例10:6F4抗体重链可变区(6F4VH)CDR-移植的人源化的第一版本-免疫遗传学分析总结结果总结产生性IGH重排序列(无终止密码子和以框架连接)v基因和等位基因IGHV1-P01七i、K、vn同一性=75.35%(217/288nt)J基因和等位基因IGHJ4*01得分=181同一性=87.23%(41/47nt)CDR-IMGT长度和AA连[8、8、9JCARQTDYFDYW41_^_^_D-基因严格属于VH结构域的CDR3区。人源化过程是基于"CDR-移植"方法。在该策略中最接近的人D基因分析是无用的。-最接近的人V基因鉴定的详细数据最接近的V-区(从V-区第一核苷酸至第二-CYS密码子计算而来)得分同一性Z12305IGHV1-P0179675.35%(217/288nt)X62106IGHVl-2*0278775.00%(216/288nt)X92208IGHVl-2*0378274.65%(215/288nt)Z12310IGHVl-2*0477874.65%(215/288nt)M99642IGHV1-24*0176073.96%(213/288nt)--最接近的人J基因鉴定的详细数据最接近的J-区得分同一性J00256IGHJ4*0118187.23%(41/47nt)X86355IGHJ4*0217285.1]%(40/47nt)M25625IGHJ4*0317285.11%(40/47nt)J00256IGHJ1*0113874.51%(38/51nt)J00256IGHJ5*0113374.00%(37/50nt)-关键残基的鉴定在对外部CDR的关键残基的定义和分级中包含几种标准。这些标准至少包括，已知的参与形成VH/VL界面、与抗原结合或CDR结构、鼠和人残基之间的氨基酸类别改变、可变结构域的3D结构中残基的定位等。发现在6F4VH结构域与最接近的IGHV1-P01人种系V基因之间有31个氨基酸不同，所有这些氨基酸是CDR外部的残基。在这31个残基中，分析上述引用参数导致鉴定出9个最有可能起作用的残基。这些鼠残基是I2、Y40、153、Y55、R66、N68、Q69、K72和K82。在这9个残基中，设想其中2个甚至是更加重要的以致在人源化形式中保持其鼠源。这些残基是残基Y55和R66，位于CDR2锚上。最后，各自和/或联合这7个氨基酸以确定它们是否能人源化或它们是否保持其鼠源。由于J-区不参与抗原结合和V-区结构形成，决定使用原生人IGHJ4*01种系基因。在图18描述的人源化6F4VH结构域的设计序列中*对应于实际上其人的对应物发生改变的氨基酸；1对应于分析了其人源化能力的氨基酸，人的残基下面用标记表明；2对应于在人源化6F4VH结构域中保持鼠源的氨基酸。42实施例ll:通过6F4抗体重链可变区(6F4VH)的CDR-移植的人源化的第二版主另一种鉴定人V-基因的CDR-移植的候选基因的方法是用IMGT/DomainGapAlign工具在氨基酸水平寻找人的同源性。-IMGT/DomainGapAlign免疫遗传学分析的结果总结如下:等位基因物种结构域Smith-Waterman得分同一性百分数重叠IGHV1-3*01人类145164.398-在IGHV1-03*01种系中关键残基的鉴定(SEQIDNo.49,EMBL命名法:X62109)。图31显示6F4VH结构域与IGHV1-3*01蛋白序列之问的比对。这些残基的选择和分级是基于不同的标准，这些标准是基于每个单一位置根据其结构相关性的相对重要性，其已知结构-功能的关系，氨基酸类别转换的相关性(如果发生的话)，并且还利用在第一人源化过程中获得的结果的优势。在第一个目的中，所有不同的"CDR外部"氨基酸相对于其人的对应物已改变，除了残基Y55和R66，强烈建议将这两个残基包含于结合中，如CDR2-锚分配的残基一样。当进行所有其它后续描述的分析时，在过程结束时将研究这两个残基的人源化能力。的确，亲本抗体全部活性的揭示，必须将6F4Hz2复人源化的VH结构域改进如下；"去人源化"过程将由(如果必要的化)在其鼠对应物上的这些氨.基酸的回复突变组成第一组残基，即E1Q、K43R和K75R表现出标准的强烈结合并对应于评价"去人源化"的第一位置(如果找寻益处的化)。然后，第2组的残基，即K48Q、S49R、F88Y和H90R是化学相关突变，但是在结构上却是稍微不是设想的关键残基，将在第二轮实验中进行试验。第三组的六个残基大概更是参与全部和/或核心-导向的残基，并因此设想其较少参与结合并因此在第三轮改进中，只要必要就对其加以研究。设想第4组的残基较少是结构性的和/或氨基酸类别转换相关的，对于哪个"去人源化"将稍后研究。最后，下列6个残基，12V、Y40H、153M、N68S、K72Q和K82T对应于人源化不改变(至少在初始联合中)首先人源化的VH结构域的结合活性的氨基酸。这些残基的"去人源化"将在改进的最后一轮进行。D-基因严格属于VH结构域的CDR3区。人源化过程基于"CDR-移植"方法。分析最接近的人D-基因在该策略中是无用的。由于在抗原结合和V-区的结构形成过程中不包含J区，所以决定使用原生人IGHJ4*01种系基因。-获得的再人源化的6F4抗体的实验数据在下列实验中，再人源化仅涉及重链，轻链总是对应于QTY/AET人源化的436F4VL结构域，正像实施例9所示例的那样，这个最终选定的人源化VL结构域表现出抗-JAM-a结合活性，与重组嵌合6F4抗体类似。相似的是，参照ELISA分析(数据未显示)定义的重组嵌合6F4抗体抗-JAM-a结合活性进行再人源化版本改进分析。实施例12:6F4MAb体外下调JAM-A表达选择MCF-7、HT29和A549细胞系以确定6F4Mab对JAMA表达的效应。简言之，将细胞铺在75cm"瓶中，于37。C，空气中含5%C02的条件下，在添加0%胎牛血清(FCS)的培养基中温育24小时。然后将这些细胞用PBS洗涤3遍，并在无血清培养基中再温育一天。第二次温育后，移除无血清培养基，换上单独的新鲜无血清培养基，或换上含6F4或含IgGl同种型对照(描述为9G4)的新鲜无血清培养基。温育5或16小时后，冷裂解缓冲液(10mMTrisHC1缓冲液，pH7.5、15%NaCl1M(SigmaChemicalCo.)、0%去污剂混合物(10mMTris-HCl、10%Igepal裂解缓冲液)(SigmaChemicalCo.)、5。/。脱氧胆酸钠(SigmaChemicalCo.)、1个蛋白酶抑制剂鸡尾酒完整TM药片(Roche)和1%磷酸酶抑制剂鸡尾酒SetII(Calbiochem),pH7.5)，将细胞置于冰上使其破碎。4'C离心使裂解液澄清。蛋白通过BCA蛋白分析定量，在Biorad4-12%Bis-Tris凝胶的每个泳道内上样25吗蛋白。样品于IO(TC加热5分钟，并保持在-20。C或直接在4-12%SDS-PAGE凝胶上上样，并转移至硝酸纤维素膜上。杂交首先用5%BSA封闭所有抗体。与特异性抗JAMA第一抗体在室温温育2小时。在TBST中洗涤滤纸，与合适的HRP-偶联的第二抗体于室温温育1小时。在用ECL(Amersham)使蛋白显影之前，在TBST中洗涤膜。如图19所显示，观察到以6F4MAb处理的3个细胞系的JAM-A显著下调。MCF-7似乎是最敏感的细胞系，早在6F4温育后5小时就出现完全和稳定下调。注意到HT29细胞的JAM-A部分下调，但却是持续下调。A549细胞下调的动力学不同，因为观察到A549细胞在与6F4Mab温育的早期无明显效应，而在与6F4Mab温育16小时后出现完全的抑制效应。正如预料，未处理细胞和与9G4同种型对照温育的细胞之间未观察到明显不同。实施例13:单次注射6F4对体内肿瘤增殖的效应为确定6F4Mab在体内的作用机制，将MCF-7细胞注射入饲喂雌激素丸剂的7周龄雌鼠体内。当肿瘤达到80至100mm3的体积时，产生3组具有可比较的肿瘤的小鼠。注射任何物质之前，将肿瘤从这些组中的一只小鼠体内移除以检查在未处理肿瘤内肿瘤细胞的基础增殖。其它2组的小鼠注射lmg6F4或相同剂量的所述的IgGl同种型对照(描述为9G4)。注射后6小时，切除肿瘤，用福尔马林固定，石蜡包埋，切成5pm的切片，并用抗Ki67抗体染色以确定处理肿瘤比对照肿瘤的增殖水平。如图20所示，注射前切除的肿瘤(记作T0，即第0次)与注射同种型对照449G4的肿瘤之间未观察到不同。另一方面，单次注射6F4后观察到肿瘤细胞增殖的显著抑制。实施例14:单次注射6F4对体内JAM-A表达的效应除了很快将切除的肿瘤冻在液氮中用于进行western杂交分析以外，该研究的体内流程与所述的体内增殖实验相同。按照上面实施例13所述进行western杂交实验。图21证明，在未处理小鼠(记作T0，即第0次)和注射一次9G4同种型对照的小鼠之间未观察到不同。注意到，当6F4Mab处理小鼠时显著下调，这提示该抗体的体内抗肿瘤作用的潜在机制可能是使受体下调。这个结果与体外观察到的结果和在实施例13中下面描述的观察到的结果一致。实施例15:6F4与其F(ab')2片段的抗肿瘤活性的比较由于MCF-7细胞高表达JAM-A，并且尽管事实是6F4是IgGl(已知小鼠体内很少参与效应子功能的同种型)，在MCF-7模型中进行6F4与其F(ab')2片段之间的体内比较以确定在体内活性中是否可能有效应子功能的参与。为了上述目的，将五百万MCF7细胞移植入饲喂雌激素丸剂的7周龄雌鼠体内。细胞移入后5天，用300吗的6F4或用200吗的6F4F(ab')2处理小鼠，每周三次。第一次注射时注射了600吗的抗体和400吗的6F4F(ab')2。每周测量两次肿瘤体积，共测量4周。图22显示6F4和6F4F(ab')2处理的小鼠体内肿瘤生长显著不同于对照小鼠体内肿瘤的生长，从D3至D27(6F4:p《0.03;6F4F(ab')2:p《0.015)。在6F4和6F4F(ab')2组小鼠之间未观察到不同，这表明效应子功能未参与形成6F4的活性。实施例16:评估JAM-A在人的组织中的表达进行肿瘤组织与正常患者组织中JAM-A表达的比较以选择过表达JAMA的肿瘤类型。该研究选择成对的同一患者的正常与肿瘤组织。在这些患者中，正常组织选取肿瘤附近的组织。通过免疫组织化学(IHC)使用组织排列(Superships)测定JAM-A的表达。简言之，使用Dakocytomation溶液S1699，于98。C下20分钟，使玻片脱蜡和抗原还原。使内生过氧化物酶失活(0.3%11202溶液5分钟)和封闭非特异性位点(Ultra-V-Block;Labvision,ref.TA-125-UB)后，将第一抗体(抗hJAM-A、AF1103(R&Dsytem)或山羊IgG同种型对照(Zymed))室温温育1小时。用TBS-tween洗涤后，抗-h.TAM-A的结合用LSAB+试剂盒(dakocytomation)显示。通过显色反应HRP-DAB使第一Ab和LSAB+的复合体显色。然后将玻片用苏木精复染。分析了甲状腺癌、肺癌、乳腺癌样品。对于甲状腺样品(图23)，在正常甲状腺组织未观察到表达，而在同一患者的肿瘤切片(膜染色)上JAM-A似乎强烈表达。在肺的正常组织，肺泡上皮细胞(pneumocyte)表达JAM-A。然而，在所有肿瘤样品中观察到强烈的膜表达(图24)。对于乳腺癌，正常乳腺组织中观察到有弱的JAM-A表达，位于小叶导管。癌症切片上，图25显示的3个癌症样品(浸润性导管癌、非典型性髓质癌和浸润性乳突癌)证实，JAM-A在乳腺癌组织过表达。这些数据提示甲状腺癌、乳腺癌和肺癌可以是JAMA治疗的良好耙标。实施例17:6F4在A431表皮样癌异种移植裸鼠中的体内活性A-431细胞在添加10%热灭活胎牛血清(Sigma)的DMEM(Lonza)中常规培养。移植之前两天，将细胞传代以使其处于指数生长期。将1千万个A-431细胞移植入7周龄无胸腺裸鼠体内。移植5天(D5)后，将小鼠随机分组以下列各项处理(i.p.):对照组接受一周两次注射PBS，6F4处理组，首先i.p.注射2mg充填剂量的抗体，然后--周两次注射lmg剂量的抗体。一周两次测定肿瘤，用下列公式计算肿瘤体积兀/6x长度x宽度x高度。对每个时间点用Mann-Whitney检验和SigmaStat软件进行统计学分析。图26显示6F4Mab能够显著抑制A-431细胞系在体内的生长(第38天至第56天，p<0.009)。实施例18:6F4对抗原递呈细胞(APC)的抗原递呈活性评价JAM蛋白在人体全身各个组织表达，还在血小板、白细胞和红细胞表面表达(Naik1995;Malergue1998;Komeki1990;Williams1999;Gupta2000)。JAM-A似乎在血小板、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和红细胞表达(见Mandell2005综述)。为确定6F4处理是否能破坏患者的抗原递呈作用，进行了以包括巨噬细胞和树突细胞在内的抗原递呈细胞(APC)进行潜在干预的评价。在递呈过程中，APC使抗原内部化(internalise)并使抗原降解产生在细胞浆内与CMH类II型分子结合的肽。然后，该复合体在APC膜上表达并被递呈给通过增殖对刺激产生应答的特异性T淋巴细胞。在本研究的下述内容屮，评价了6F4对人PBMC递呈破伤风类毒素的潜在效应。为了上述目的，通过Ficoll梯度离心法从血液中分离PBMC。用PBS洗涤细胞，计数并用添加10%热灭活胎牛血清(FCS)、谷氨酰胺和抗生素的RPMI1640培养基悬浮，浓度是0.25xl(^细胞/ml。向在96孔板的孔中加入抗原或待测抗体至10叱/ml终浓度，然后在每孔中接种100jilPBMC。9G4Mab用作IgGl同种型对照，弓I入植物凝集素PHA(终浓度2.5吗/ml)，一种淋巴细胞多克隆激活剂，作为阳性对照。选择特异性抗原激活剂破伤风类毒素(TT),并将其以100吗/ml加入至TOMC中。然后将培养板于37'C在含有5%C02的空气中温育96小时。然后，将0.25pCi的"H脱氧胸腺嘧啶核苷加入孔中并温育24小时。温育后收获细胞，使滤膜干燥，并用液闪计数仪计数放射性活性的量。就图27A和28A显示两个独立性实验值，用作TOMC制备物的阳性对照的PHA(多克隆激活剂)，是淋巴细胞增殖的有力诱导剂，其指数的范围是30至70，46取决于供体和实验。在这些条件下，淋巴细胞增殖指数不变，无论温育的抗体是什么，6F4不表现出任何显著的激动剂或拮抗剂活性。显示两个独立实验数值的图27B和28B，显示在向TT激活的淋巴细胞增殖的供体之间可出现显著差异。在这些实验中，其指数的范围是2至5，取决于供体和实验。然而，在6F4存在条件下未观察到对抗原递呈作用的千预。总之，尽管JAM-A在APC和淋巴细胞上显著表达，使用直接抗该靶标的抗体既不会破坏淋巴细胞的特异性增殖也不会破坏抗原递呈过程。实施例19:血小板的聚集和6F4温育后激活的评价为研究结合人血小板的6F4是否可具有任何生物活性，测定了两个参数血小板聚集和血清素释放。,JJWlPfM'J，^nry]、alW<n丄|.f卞jK十、口'J乂、皿M"IPC力乂LTT'l寸观yJ7U牛、D)ig/mU温育。已报道PM6/248(抗allb(33)诱导血小板聚集。将9G4用作阴性同种型对照。如在人血小板的试验中所预期的那样，凝血酶(thrombine)和ADP诱导聚集。PM6/248也诱导血小板聚集。与6F4温育后，未测到血小板聚集。该效应可与以9G4(用作阳性对照，图29)温育的效应相比。以相似的方式，6F4不能诱导血清素释放(图30)，而如预期，凝血酶诱导5-HT释放。总之，这些结果提示，尽管人血小板表达.TAM-A，但在6F4激活后，人血小板上并无生物功能被激发。4权利要求1、一种能够在体外和/或体内抑制肿瘤细胞增殖的分离抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于它包含至少一种CDR，所述CDR选自序列包含至少SEQIDNo.1、2、3、4、5或6的序列的CDR，或者所述CDR的序列经与序列SEQIDNo.1、2、3、4、5或6优化比对后具有至少80％的同一性。2、根据权利要求1所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其由单克隆抗体组成。3、根据权利要求1或2所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其包含重链，该重链包含序列为SEQIDNo.2、4、6的三种CDR中的至少一种，或至少一种其序列经优化比对后与序列SEQIDNo.2、4、6的同一性至少是80%的序列。4、根据前述权利要求任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其包含重链，该重链包含下列三种CDR，分别是CDR-H1、CDR-H2禾口CDR-H3，其中-CDR-Hl包含序列SEQIDNo.2、7或9，或经优化比对后与序列SEQIDNo.2、7或9的同一性至少是80%的序列；-CDR-H2包含序列SEQIDNo.4或11，或经优化比对后与序列SEQIDNo.4或11的同一性至少是80%的序列；-CDR-H3包含序列SEQIDNo.6或12，或经优化比对后与序列SEQIDNo.6或12的同一性至少是80%的序列。5、根据前述权利要求任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其包含重链，该重链包含序列SEQIDNo.7的CDR-H1，序列SEQIDNo.4的CDR-H2和序列SEQIDNo.12的CDR-H3。6、根据权利要求1至5其中一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其包含重链，该重链包含序列SEQIDNo.9的CDR-Hl，序列SEQIDNo.l1的CDR-H2和序列SEQIDNo.6的CDR-H3。7、根据前述权利要求任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其包含轻链，该轻链包含序列为SEQIDNo.l、3、5的三种CDR中的至少一种，或至少一种经优化比对后与序列SEQIDNo.l、3和5的同一性至少是80%8、根据前述权利要求任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其包含重轻链，该轻链包含下列三种CDR，分别是CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中-CDR-L1包含序列SEQIDNo.l或8，或经优化比对后与序列SEQIDNo.l或8的同一性至少是80%的序列；-CDR-L2包含序列SEQIDNo.3或10，或经优化比对后与序列SEQIDNo.3或10的同一性至少是80%的序列；-CDR-L3包含序列SEQIDNo.5，或经优化比对后与序列SEQIDNo.5的同一性至少是80%的序列。9、根据前述权利要求任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其包含轻链，该轻链包含序列SEQIDNo.l的CDR-Ll，序列SEQIDNo.3的CDR-L2，和序列SEQIDNo.5的CDR-L3。10、根据权利要求1至8其中一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其包含轻链，该轻链包含序列SEQIDNo.8的CDR-Ll，序列SEQIDNo.10的CDR-L2和序列SEQIDNo.5的CDR-L3。11、根据前述权利要求任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其包含轻链，该轻链包含下列三种CDR:-CDR-Ll包含序列SEQIDNo.l，或经优化比对后与序列SEQIDNo.l的同一性至少是80%的序列；-CDR-L2包含序列SEQIDNo.3，或经优化比对后与序列SEQIDNo.3的同一性至少是80%的序列；-CDR-L3包含序列SEQIDNo.5，或经优化比对后与序列SEQIDNo.5的同一性至少是80%的序列，和包含下列三种CDR的重链-CDR-H1包含序列SEQIDNo.7,或经优化比对后与序列SEQIDNo.7的同--性至少是80%的序列；-CDR-H2包含序列SEQIDNo.4，或经优化比对后与序列SEQIDNo.4的同一性至少是80%的序列；-CDR-H3包含序列SEQIDNo.12，或经优化比对后与序列SEQIDNo.12的同一性至少是80%的序列。12、根据权利要求1至10任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，其特征在于其包含轻链，该轻链包含下列三种CDR:-CDR-L1包含序列SEQIDNo.8，或经优化比对后与序列SEQIDNo.8的同一性至少是80%的序列；-CDR-L2包含序列SEQIDNo.lO，或经优化比对后与序列SEQIDNo.10的同一性至少是80%的序列；-CDR-L3包含序列SEQIDNo.5，或经优化比对后与序列SEQIDNo.5的同一性至少是80%的序列，和包含下列三种CDR的重链-CDR-H1包含序列SEQIDNo.9，或经优化比对后与序列SEQIDNo.9的同--性至少是80%的序列；-CDR-H2包含序列SEQIDNo.l1，或经优化比对后与序列SEQIDNo.11的同一性至少是80%的序列；-CDR-H3包含序列SEQIDNo.6，或经优化比对后与序列SEQIDNo.6的同一性至少是80%的序列。13、根据前述权利要求任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其包含轻链序列，该轻链序列包含氨基酸序列SEQIDNo.13或经优化比对后与序列SEQIDNo.13的同一性至少是80%的序列，并且在于其包含重链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQIDNo.14或经优化比对后与序列SEQIDNo.14的同一性至少是80%的序列。14、根据权利要求1至12任意一项所述的人源化抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其包含轻链序列，该轻链序列包含氨基酸序列SEQIDNo.17或经优化比对后与序列SEQIDNo.17的同一性至少是80%的序列，并且在于其包含重链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQIDNo.18或19或经优化比对后与序列SEQIDNo.18或19的同一性至少是80%的序列。15、根据前述权利要求任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于所述衍生化合物由包含肽支架的结合蛋白组成，其中至少一种CDR以保留原始抗体的全部或部分抗体结合部位识别特性的方式移植。16、根据权利要求15所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于肽支架选自下列蛋白a)种系发生保留良好的蛋白、b)具有结实的结构蛋白、c)具有熟知的3-D分子结构的蛋白、d)体积小的蛋白和/或e)包含能被删除和/或插入修饰而未改变稳定性特性的蛋白。17、根据权利要求15或16所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于所述肽支架选自i)来自纤连蛋白的支架、优选III型纤连蛋白结构域10的支架，lipocalin，anticalin，来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域B的蛋白Z，硫氧还蛋白A或具有如"锚蛋白重复序列"、"犰狳重复序列"、"富含亮氨酸的重复序列"和"四三共肽重复序列"的重复基序的蛋白或iii)神经元NO合酶(PIN)。18、根据前述权利要求任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于所述功能片段选自片段Fv、Fab、(Fab')2、Fab'、scFv、scFv-Fc和双体，或任何其半衰期延长了的片段如聚乙二醇化片段。19、根据前述权利要求任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于所述抗体是鼠抗体，并且在于其包含氨基酸序列SEQIDNo.15，或经优化比对后与序列SEQIDNo.J5的同一性至少是80%的序列的轻链，和氨基酸序列SEQIDNo.16，或经优化比对后与序列SEQIDNo.16的同一性至少是80%的序列的重链。20、根据前述权利要求任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于所述抗体是嵌合抗体，该嵌合抗体还包含来源于不同于小鼠的异种物种的轻链和重链的恒定区。21、根据权利要求20所述的嵌合抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于所述异种物种是人。22、根据权利要求21所述的人源化抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于來源于人的抗体的轻链和重链的恒定区分别是x或k和Y-l、y-2或y-4区。23、--'种于2006年7月6(H提交至巴黎巴斯德研究所的CNCM的编号是1-3646的鼠杂交瘤。24、一种权利要求23所述的杂交瘤分泌的抗体。25、根据前述权利要求任意一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其能特异性结合JAM-A(连接粘连分子-A)蛋白。26、根据权利要求25所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其对于JAM-A蛋白的Kd是约1nM至1pM，更优选是10pM至40pM。27、一种分离的核酸，特征在于其选自下列核酸a)编码如权利要求1至22和24至26其中一项所述的抗体或其衍生化合物或其功能片段的核酸、DNA或RNA;b)与a)中定义的核酸互补的核酸；c)具有能在高度严谨条件下与核酸序列SEQIDNo.20至31中的至少一种CDR杂交的至少18个核苷酸的核酸；和d)具有能在高度严谨条件下至少与核酸序列SEQIDNo.32或36的轻链杂交，和/或与核酸序列SEQIDNo.33、37或38的重链杂交的至少18个核苷酸的核酸。28、一种由权利要求27所述的核酸组成的载体。29、一种包含权利要求28所述的载体的宿主细胞。30、一种除人以外的包含经权利要求29所述载体转化的细胞的转基因动物。31、一种制备权利要求1至22和24至26中其中一项所述的抗体或其衍生化合物或其功能片段的方法，特征在于所述方法包含下列歩骤a)在培养基中并在合适的培养条件下培养权利要求29所述的宿主细胞；和b)从培养基或从所述培养细胞中回收所述抗体或其中一个功能片段。32、根据权利要求1至22和24至26任意--项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段，特征在于其山双特异性抗体组成，并且如此以至于其包含第二基序，该第二基序能够与参与肿瘤发展的选自受体VEGFR、VEGF、EGFR、IGF-1R、HER2neLi、HGF、cMET、FGF、CXCR4或CXCR2的受体相互作用。33、用作药物的如权利要求1至22、24至26和32其中一项所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段。34、一种由权利要求1至22、24至26、32和33所述的抗体，或其衍生化合物或其功能片段组成的化合物作为活性成分的组合物。35、一种权利要求34所述的组合物，特征在于其还包含作为联合产物以同时、分开或延伸方式使用的抗肿瘤抗体而不是直接抗JAM-A蛋白的抗体。36、一种权利要求34或35所述的组合物，特征在于其还包含作为联合产物以同时、分开或延长方式使用的细胞毒或细胞生长抑制性试剂。37、一种权利要求36所述的组合物，特征在于所述细胞毒或细胞生长抑制性试剂以化学方法与同时使用的所述组合物中的至少一种成分结合。38、一种权利要求34至37所述的组合物，特征在于至少一种所述抗体或其衍生化合物或其功能片段与细胞毒素和/或放射性同位素结合。39、用作药物的如权利要求34至38所述的组合物。40、如权利要求1至22、24至26、32和34其中一项所述的抗体或其衍生化合物或其功能片段，和/或权利要求33至38任意一项所述的组合物在制备用于预防或治疗肿瘤细胞增殖相关疾病的药物中的用途。41、根据权利要求40所述的用途，是用于制备癌症预防或治疗药物。42、根据权利要求41所述的用途，特征在于所述癌症选自前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌或结肠癌。43、根据权利要求42所述的用途，特征在于所述癌症选自与雌激素相关的乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌或胰腺癌。全文摘要本发明涉及能够在体外和/或体内抑制肿瘤细胞增殖的新型分离抗体，或其衍生化合物或功能片段，所述抗体通过功能筛选获得。更特别地，本发明涉及JAM-A蛋白特异性6F4抗体，以及其在癌症治疗中的用途。本发明还包含由这种抗体组成的药物组合物。文档编号C07K16/28GK101535344SQ200780040539公开日2009年9月16日申请日期2007年11月23日优先权日2006年11月24日发明者C·贝斯,J-F·黑犹,L·格奇,N·科尔瓦亚申请人:皮埃尔法布雷医药公司