方法

专利名称：：方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于鉴定针对疾病保护性和/或有效的T细胞受体(TCR)的方法。该TCR可用于鉴定能够诱导保护性和/或有效免疫应答的疾病抗原或抗原决定簇。
背景技术：
：自从18世纪晚期就已知道疫苗接种的概念(给个体接种病原体衍生物质来诱导免疫)。由于种种原因，包括回复成野生型的风险，不想要使用活体减毒的或灭活的病原体的疫苗办法。为了这个原因，已经对使用“亚单位”疫苗办法感兴趣，由此媒介或载体中仅仅包括病原体的关键抗原序列。为了开发亚单位疫苗，需要鉴定病原体中的关键抗原。复杂的病原体编码大量潜在抗原(数百种至数千种)，而且这种复杂性阻碍系列测试方法来鉴定那些诱导保护性和/或有效应答的抗原。迄今，用于评估候选抗原是否具有在疫苗中使用的潜力的主要标准在于其诱导免疫应答的能力。换言之，注意力集中在那些加强最强免疫应答的抗原。然而，诱导应答与诱导保护不同。免疫系统是反应性的，而且在传染性攻击期间会响应大量抗原。不幸的是，大多数诱导的应答(尤其是在病原体是抗原性复杂的情况中)无法有效控制病原体。例如，能够诱导有力的病原体特异性免疫应答且并非必然针对疾病保护性的疫苗候选物可能无法针对随后的病原体攻击提供保护(Melby等(2001)69=4719-4725；Hechard等(2004)53861-868；Stober等(2006)同上)。针对抗原性复杂的病原体的DNA库(pool)疫苗的研究已经显示仅有少量的疫苗候选物是保护性的，而且有些疫苗候选物实际上加重疾病(Stober等(2006)Vaccine24:2602-2616；Stemke-Hale等(2005)Vaccine233016-3025；Melby等(2000)InfectionandImmunity68:5595-5602)。当使用连续分级来筛选针对真菌病原体粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)的疫苗候选物时，自包含800-1000种基因的cDNA文库鉴定出一种保护性基因(Ivey等(2003)4359-4367)。有趣的是，已经显示对于抗原性复杂的病原体(例如寄生物)，保护性抗原定位于基因组内少量的基因座(Blake等(2004)Mol&BiochemParasitoll38143-52；Martinelli等(2005)PNAS102:814_819)。当使用免疫应答产生作为疫苗候选物的选择标准时，可改进“应答”测定法来测定所谓的“正确”类型的应答(即与保护有关的免疫应答类型)，例如使用IFNy产生作为ThlT细胞应答的指示剂。尽管这些类型的策略用来减少所鉴定的抗原的数目，但是T细胞应答的基础使得产生“正确类型的应答”的大多数这些T细胞在体内无效。此外，在许多情况中有效或保护性应答针对一个小子集的“所应答的”抗原，但是保护需要多于一种特异性的应答。因而，需要在针对病原体的免疫应答期间产生的有响应细胞的大组库内鉴定有效3/保护性应答。还需要鉴定造成保护性/有效免疫应答产生的抗原。发明概述本发明人开发了一种体内办法来鉴定保护性/有效免疫特异性。在第一个实施方案中，本发明提供一种用于鉴定针对疾病保护性和/或有效的T细胞受体(TCR)的方法，其包含下述步骤i)自供体非人动物获得T细胞；ii)以使得至少一只受体动物针对疾病受到保护但至少一只动物仍然未受到保护的量将T细胞过继转移入多只T细胞缺陷型受体非人动物；并iii)确定仅仅在受到保护的动物中存在的TCR。由于提供给受体动物的免疫组库(immuner印ertoire)受限，因此随后的感染引起克隆受限的免疫应答产生。换言之，与由具有完整组库的动物产生的免疫应答相比，在接受受限免疫组库的受到保护的动物中产生的免疫应答含有更大比例的保护性/有效T细胞。因此，由于减少了总TCR组合(portfolio)，使用本发明的方法有可能区分保护性/有效的与无保护性/无效的有响应T细胞，从而确定那些介导保护性/有效免疫的TCR。本发明的方法较体外筛选具有如下优点其完全聚焦于保护性/有效T细胞应答，而非所有抗原刺激的T细胞应答。因此，它提供针对疾病保护性和/或有效的TCR的无价fn息ο通过本发明方法鉴定的TCR可用于鉴定引发保护性和/或有效应答的抗原。TCR(或其序列)可因此用于筛选“相关”抗原序列。在第二个方面，本发明提供一种用于筛选能够诱导保护性和/或有效免疫应答的抗原或抗原决定簇的方法，其包括下述步骤(i)通过依照前述权利要求任一项的方法鉴定保护性和/或有效的TCR；(ii)生成表达保护性/有效TCR的细胞；(ii)使用表达TCR的细胞来筛选候选抗原/抗原决定簇(iv)选择受到保护性/有效TCR识别的抗原/抗原决定簇。抗原可衍生自病原体。或者，抗原可“模拟”病原体衍生抗原(或其一部分)，但在化学上是不相似的。在第三个方面，本发明提供一种制造亚单位疫苗的方法，其包括下述步骤(i)通过依照本发明第二个方面的方法鉴定一种或多种有效的抗原或抗原决定簇；(ii)将该抗原/抗原决定簇掺入亚单位疫苗。在第四个方面，本发明提供一种针对艾美球虫(Eimeria)感染保护性和/或有效的TCR，其包含下述TCRVβCDR3序列之一FQPPQNFQVDQTPC(SEQIDNO.1)GADICAKTTPSLSFLPH(SEQIDNO.2)GQTSVQKPHPPLF(SEQIDNO.3)。在第五个方面，本发明提供依照第四个方面的TCR筛选能够诱导针对艾美球虫感染保护性和/或有效的免疫应答的抗原或抗原决定簇的用途。附图简述图IA是阐明从首次用于实验、响应和恢复的供体小鼠到T细胞缺陷型受体的淋巴细胞过继转移的保护效应的图解。图IB是显示保护性TCR体内分析一般方案的示意图。图2是显示用于寻找⑶4+细胞特异性及其TCR的方法的进度表。图3显示了接受300个⑶4+T细胞的TCR(βχδ)-/-小鼠的卵囊输出。图4显示了FACS分析结果，证实了在转移300个⑶4+Τ细胞后2个月在受到保护和未受到保护的受体小鼠中存在相似数目的CD4+T细胞。图5显示了从受到保护和未受到保护的小鼠到第二组T细胞缺陷型受体的细胞受限组库连续过继转移的结果。图6显示了通过RT-PCR进行的TCRVβ分析。使用3只受到保护和3只未受到保护的小鼠进行一系列RTPCR。描述了RTPCR的实例(右图)，并且以表格格式概况了结果(一个记号代表来自一只小鼠的阳性产物)，在左侧注释Vβ。图7显示了来自3只受到保护和3只未受到保护的小鼠每一只的TCR组库的详情。图8来自3只受到保护和3只未受到保护的小鼠的TCRVβ4和TCRVβ14的TCRVβ⑶R3序列(氨基酸)的身份。图9是显示抗原鉴定一般方案的示意图。发明详述本发明的第一方面涉及一种通过从供体动物到受体动物过继转移有限数目的T细胞来鉴定针对疾病保护性和/或有效的T细胞受体(TCR)的方法。供体动物供体动物是一种在其完整T细胞组库之中包含保护性和/或有效T细胞的动物。供体动物可以是首次用于实验的动物(即之前未经历疾病或抗原攻击的动物)。供体动物可被处理以扩增循环T细胞数目。这可通过例如会引起合适的免疫系统刺激及相关的T细胞群扩增的处理程序或“疫苗株”得以进行。该动物可用疾病或与疾病有关的抗原制备物攻击，这应当引起“特异性”T细胞扩增及提高潜在相关细胞在总淋巴细胞群中的比例。该动物可例如通过直接感染(如在实施例中所显示的已用艾美球虫病原体所进行的)或给予减毒生物体制备物或其它疫苗粗制备物来攻击。优选地，该动物是“主动响应的”，即处于产生针对病原体或其抗原制备物的免疫应答的过程中。或者，动物可以是“恢复的”，即之前产生过针对病原体或其抗原制备物的免疫应答但不再主动响应的动物。如果合适的T细胞群被扩增，那么这应当意味着有可能通过较少转移细胞的过继转移对T细胞缺陷型受体赋予保护。还更容易找到仅有小比例(比方说10-20%)的受体动物受到保护的合适转移细胞数目(TCN)。由于免疫应答的随机特性，因此很可能在不同的供体动物中会产生不同的保护性/有效T细胞。如果期望确定尽可能多的抗原决定簇和/或保护性/有效T细胞特异性，那么可选择多只供体动物。或者，如果目标在于确定(最小数目)造成免疫的TCR，那么优选使用单只供体动物，以容许直接比较受体动物及避免系统过度复杂化。受体动物受体动物是“T细胞缺陷型”，即其不具有有效的内源性T细胞。T细胞缺陷型动物可以例如是TCR或RAG敲除、SCID或“裸”动物。有限数目的T细胞从供体动物转移到受体动物。然后可给予受体动物T细胞扩增处理，例如感染(用活的或减毒的病原体或其制备物)或未表征的疫苗制备物。复杂表达文库也可用作疫苗用于扩增处理(1，20)。在给定一段时间(诸如1个月)后，用野生型病原体攻击受体动物并在攻击后适当时间评估抗性/敏感性。供体和受体动物可以都是人MHC转基因的。动物可以是人I类和/或人II类MHC转基因的。其具有这样的优点，即存在证据提示T细胞应答的精确的肽特异性会更准确地表现人应答(即动物会响应与人免疫应答中相同的表位)。转移的细胞将来自供体动物的T细胞过继转移到受体。T细胞可作为细胞群的一部分(诸如自供体小鼠获得的细胞或组织样品的一部分)转移。可处理自供体小鼠获得的细胞样品以提高其响应T细胞或特定类型T细胞的比例。例如，细胞样品可被为“正”(对于T细胞)或“负”(用于除去其它细胞类型)分选(例如通过FACS或使用磁珠)。T细胞可通过例如它们的TCR、⑶3、⑶4或⑶8的表达而得以选择。转移到受体的T细胞可代表来自供体动物的总T细胞的一个子集。例如，该群可分选⑶4+或⑶8+T细胞。如果已经知道一种或其它类型的应答与体内保护有关，那么这可能是有利的。为了提高T细胞或潜在相关T细胞的比例，可离体刺激细胞群。转移细胞数目(TCN)将自供体动物衍生的包含T细胞的细胞样品转移到受体动物。细胞样品应当代表一个不完整或受限的T细胞组库。该组库应当充分受限以致于扩增的T细胞群(在随后的感染或抗原攻击后)以相对少量的有效/保护性TCR为主。保护性/有效TCR的数目(其可例如低于50、40、30、20或10个/受到保护的动物)应当足够低至所有TCRVi^序列的测序在实际上切实可行。在本发明第一方面的方法中，可以以使得至少一只动物针对疾病受到保护但至少一只动物仍然未受到保护的量将T细胞转移到受体动物。因此，TCN处于在基本上所有受体动物都将受到保护的情况中的转移细胞数目和在非常小比例的将受到保护的情况中的数目量(意味着在用于实验的动物数目中，可以不产生受到保护的动物)之间的阈。期望相对低比例的接受给定TCN的动物显示受到保护的表型。这使造成保护的转移T细胞数目减至最少并因此当鉴定单个TCR时简化了图像。例如，可选择TCN使得至少1只，但少于50%、40%、30%、20%或10%的受体动物显示受到保护的表型。优选地，两只或更多只受体动物受到保护，使得可以比较它们的TCR表达样式。为了针对给定系统确定最适TCN，可进行有限稀释分析。这样，可以以不同的6TCN(例如介于10-100百万个细胞之间)给予受体动物以供体细胞。然后可选择导致例如10-20%的受体动物受到保护的TCN(或最低TCN)作为最适TCN。作为实施一个单独的步骤来确定能赋予免疫的最小T细胞数目的替代，可以在小范围的每一个TCN(例如100、300、1000和5000个细胞)用大量受体动物进行实验。然后，取自给予保护所需要的最低细胞数目的受到保护的动物可直接用于确定保护性和/或有效TCR。“受到保护的”的定义会取决于疾病和动物模型而改变。一般而言，当与未受到保护的等同动物相比时，受到保护的动物会显示降低的死于疾病的倾向，降低的疾病严重性，明显的疾病症状改善或降低的病原体负载。在艾美球虫系统中，当与没有接受细胞的TCR缺陷型动物相比其产生统计显著的较少卵囊时，动物被认为是“受到保护的”。TCN可低于5000、1000或500个T细胞/受体动物。对保护性/有效TCR的分析为了鉴定针对疾病保护性/有效的TCR，确定在受到保护的动物中存在的TCR。这可例如通过比较在受到保护的和未受到保护的受体中表达的TCR来完成。可在离体分析之前刺激细胞，例如使用抗原粗制备物或活病原体。它们还可被刺激以提高CD4+或CD8+细胞的比例，或被分选以分离这两个亚群(使得可以仅考虑一种细胞类型，或使得可以独立考虑这两种细胞类型)。可以自受到保护和未受到保护的小鼠收获T细胞(诸如脾T细胞，或来自固有层、上皮内区室或肠系膜淋巴结的T细胞)，然后通过PCR和序列分析对TCRVβ表达进行分析。从来自候选“保护性”TCR观点看感兴趣的TCRVii是在受到保护的受体中表达，但在未受到保护的受体中不表达或未被充分代表的那些。特别感兴趣的是在一只受体动物中(表明单克隆性)或在两只或更多只受体动物之间(表明该TCRVii序列与受到保护的表型的一般关联)仅显示单一序列的TCRVii。TCRα为了鉴定完整的TCR，期望从与“保护性”TCRVβ相同的细胞分离TCRVa链。这可通过使用本领域已知的技术来进行，诸如使用FACS或利用Vβ特异性抗体的磁分选(通过νβ分子分析指示)，继之以PCR来鉴定TCRVα链。如果TCRVa链难以分离，那么TCRVβ可用于制备会与发育期间胸腺中各种TCRVa有关的转基因动物。使用基于应答或保护的测定法，可自这些动物分离TCRVa链。或者，可使用包含已知TCRVii而不知TCRVa链的TCR转基因。一种替代方法是进行T细胞的离体克隆，然后对所得克隆进行TCRVii筛选。表达TCR的细胞一旦知道了TCRVα和β，就可通过标准技术制造表达TCR的转染子。例如，可将基因转染入合适的受体细胞系以给出表达TCR的报道细胞。TCRVα和β序列(或仅仅是TCRVβ序列-参见之前章节)可用于制备表达TCR的转基因非人动物。这些动物提供了用于抗原筛选的细胞来源。另一项选择是使用自受到保护的受体动物衍生的原始细胞，TCRVii序列就是自它衍生的。例如，初始原种可用于制备T细胞杂交瘤，以获得稳定的表达TCR的细胞系。抗原筛选在第二方面，本发明提供了一种筛选在诱导有效/保护性免疫应答中有效的抗原或抗原决定簇的方法。在适应性免疫应答中，T淋巴细胞能够识别自蛋白质抗原衍生的肽。抗原呈递细胞(APC)摄取蛋白质抗原并将它们降解为短肽片段。肽可结合细胞内部的主要组织相容性复合体(MHC)I或II类分子并被携带至细胞表面。当与MHC分子一起在细胞表面呈递时，肽可为T细胞(通过T细胞受体(TCR))所识别，在这样的情况中该肽是T细胞表位。该筛选方法可用于确定为保护性/有效TCR识别的表位。或者，该筛选可鉴定包含所识别表位的抗原(或其一部分)，无需精确地限定表位自身。抗原决定簇是造成T细胞活化的抗原的一部分。该筛选可用于鉴定例如复杂抗原混合物(其可被分级)、表达文库或基于组合化学的肽文库(以寻找模拟肽)中的候选抗原。疾病本发明的方法可用于任何如下疾病(i)疾病的合理动物模型存在，和(ii)T细胞特异性是疾病过程的有效部分。所有能适应动物系统的传染性、变应性、自身免疫性和肿瘤疾病对于该系统都是合适的靶标。在此使用的术语通常适用于传染病。然而，正如对于本领域技术人员清楚的是，将该系统应用于其它疾病(诸如变态反应、自身免疫等)可能需要使用替代的(但类似的)术语。例如，在传染病抗原可衍生自病原体的情况中，对于变态反应，其可以是变应原，而对于自身免疫病，其可以是自身抗原。针对的人传染病包括单纯疱疹病毒(HSV)衣原体(Chlamydiaspp.)巨细胞病毒(CMV)呼吸道合胞病毒(RSV)单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)白色假丝酵母(Candidaalbicans)分枝杆菌(Mycobacteriumspp.)利什曼虫(Leishmaniaspp.)疱原虫(Plasmodiumspp.)鞭虫(Trichurisspp.)隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)鼠弓形体(Toxoplasmagondii·)。术语“保护性”用于表示抗原引起的或T细胞介导的是针对疾病提供保护或针对疾病有效的免疫应答。因此该效果可以是预防性的、治疗性的或两者皆有。方案一般方法概述于图9中。该图描述了鉴定针对一般病原体的保护性和/或有效T细胞的情况，但可修改该方法以鉴定实现变态反应、自身免疫性或肿瘤排斥的T细胞。第1阶段建立“保护性/有效单位”最佳的第一步是确定能在扩增阶段后赋予免疫性的最小T细胞数目。这通过有限稀释过继转移来实现。该阶段可省去，处理时间受限于以100、300、1000和5000个T细胞的细胞转移数目使用大量受体小鼠执行实验，并自给予保护所需的最低细胞数目取出小鼠。其目的在于使用保护大约10%受体小鼠的细胞数目。根据传染系统及自供体小鼠取出细胞的时间，实际的细胞数目可不同。对于大多数感染，文献中早已确定了T细胞转移最有效的时间，但是如果不可得的话，那么可容易地通过用大量细胞(例如IO7个细胞)进行实验性转移来确定。每次实验使用单一供体小鼠是最有用的，原因在于在不同的个体中免疫诱导的随机特性会产生不同的保护性/有效T细胞克隆。实际上，该技术不是用来确定能给出效果的每一种T细胞特异性，但是会确定免疫所需的最小T细胞受体群。对于该技术而言，这是一项重要的额外益处，因为其会确定成功的亚单位疫苗中需要包括的特异性(及抗原)数目。其它有用信息可包括关于CD4+或CD8+T细胞应答在效果(例如保护)表达中的相对重要性的先验知识。该信息通常可获得自文献，但并不是本研究的先决条件。此分析的价值的一个实例是通过在过继转移前分选细胞或通过在受到保护的动物鉴定后分选细胞，将分析限制于最有效的细胞子集。后一种办法可能耗时更多，但能从CD4+和CD8+细胞中鉴定有效TCR。在这些细胞子集之间的相互作用复杂的情况中，有效的最小组库可能比基于这两个细胞群的组合频率选择单一细胞群的情况要大。在这些情况中，分析可能需要更多的测序工作。下游抗原鉴定受表达有效TCR的T细胞类型影响并代表其它附加价值。第2阶段在受到保护和未受到保护的动物中界定受限组库从主动响应的供体小鼠中取少量的T细胞并过继转移到T细胞缺陷型受体小鼠(例如ΤΟΚβχδ)-/-或RAGl-/-或裸鼠或SCID小鼠)中。给予小鼠以T细胞扩增处理，可以是感染(如上所述用减毒病原体或药物处理方案)或未表征的疫苗制备物。在合适的一段时间(例如大约1个月)后，用野生型病原体再攻击受体小鼠并在攻击后适当时间评估抗性/敏感性。通过个体与没有接受T细胞的一组10-20只小鼠(真实数目将取决于病原体或其它系统)的统计比较来评估保护。10%-20%的动物展示针对感染的保护，则转移T细胞数目是最佳的，因为这容许鉴定赋予大比例T细胞完整但未受到保护的小鼠以效果/保护的最小T细胞群。所需要的受到保护的小鼠的数目取决于保护性和/或有效组库的特性，但不太可能超过10-15只小鼠个体(使用艾美球虫系统时，此分析在一次实验中有可能用到低至3只受到保护的小鼠)。第3阶段分析保护性和/或有效TCRVii组库此分析阶段包括从受到保护的和未受到保护的小鼠收获脾T细胞，如果合适的话，可通过磁分离成⑶4和⑶8子集用于进一步分析。细胞分成三组；一组通过在RLT或类似的缓冲液中破裂进行加工，用于分子分析，第二组在液氮中冷冻，用于可能的下游分析，而第三组连续转移入T细胞缺陷型小鼠“停放”(用于将来验证“保护性”表型)。通过FACS分析评估来自每只小鼠的小等分量的细胞以确定在每一只受体中存在的T细胞的比例。分子分析将破裂细胞的样品以等分试样冷冻保存。使用寡dT和/或T细胞受体恒定区引物制备多批cDNA。对这些cDNA样品使用设计成扩增每种鼠TCRVβ-TCRCβ产物的引物通过PCR评估不同TCRVii的存在并通过琼脂糖凝胶电泳显影。将阳性PCR产物克隆入TEasy质粒并用于转化合适的大肠杆菌菌株，然后铺在合适的选择性培养基上。最初，挑取20个阳性细菌菌落并使用合适的引物(例如TCRCii引物)获得插入物的序列。对所有“受到保护的”个体及对挑选的(优选至少6只)“未受到保护的”个体进行初次分析。此序列数据确定了在受到保护和未受到保护的个体这两个群中都存在的T细胞克隆的身份。细胞分析使用来自分子分析的信息来获悉用在随后的细胞分析的最好策略。细胞分析的目的在于分离与所鉴定的TCRVii链在同一细胞中的TCRVa链。例如，在保护相关TCRVii是单克隆的或以单个克隆为主的情况中，可对来自连续转移“停放”细胞或冷冻原种的细胞进行FACS或用Vβ特异性抗体进行的磁分选。细胞分析还可包括快速克隆“保护相关”T细胞，通过PCR来筛选正确的TCRVβ，然后使用此样品来鉴定TCRVα链。用于细胞的刺激取决于所考虑的细胞类型(CD4或CD8)及所考虑的病原体。这包括用抗原粗制备物或活病原体离体刺激。具有TCR的两条链使得能产生带有在实验中分离的正确TCR的转染子。这些代表了基于已知的给予保护的能力的靶向筛选。更详细地Va鉴定1.样品在淋巴细胞群(脾、淋巴结及可能的其它免疫组织)样品收集时，细胞可分成三个样品组，第一组用于TCRVii分析，第二组在液氮中冷冻，用于随后的复苏，而将第三组连续转移(停放)入别的受体动物中(该第三组是任选的)。在已鉴定了保护性TCRVii组库之后，通过分析样品2和3帮助鉴定TCRVα的方法。2.Va分析一旦知道保护性TCRVii，则可使用TCRVii家族特异性抗体通过荧光激活细胞分选术(FACS)分离冷冻的或“停放的”细胞，从而提供受限的起始细胞群。如果“保护相关”TCRVii序列的数目是低的(<3)，那么有可能使用引物来鉴定所有与该群体有关的TCRVa，并使用随后的配对转染法来鉴定合适的TCRViiTCRVa配对。或者，可通过FACS来分选合适的TCRVii+细胞并作为单细胞沉积入微量滴定板的孔中。然后可通过单细胞RTPCR来直接分析细胞，或者通过抗原特异性触发或非特异性刺激诸如板结合的抗CD3或促分裂原来扩增细胞。可通过传统的T细胞克隆方法来扩增细胞(最佳地，使用自T细胞缺陷型动物衍生的抗原呈递细胞)。通过经典的克隆及在混合的抗原制备物上体外维持而衍生的T细胞可直接用于抗原筛选(见下一节)。该分析起始于从克隆孔(单细胞或单克隆扩增)中鉴定合适的TCRVβ序列；这可能需要多于一轮的PCR，尤其是单细胞。第一轮RTPCR和PCR可包括使用TCRVa、TCRCa和TCRVi3、TCRCi3序列中保守的、简并的或特异性的引物，或基于单条引物的线性扩增(3，5)或类似方法来产生足够产物用于随后PCR反应分析(6，21)。一旦鉴定了合适的细胞，则RTPCR法可用于鉴定自同一细胞衍生的TCRVα序列。TCRVα分析的第一步是通过标准技术来扩增TCRVa(该扩增步骤可以与TCRVβ扩增同时进行)。在表达“正确的”TCRVii的细胞中存在的TCRVa的身份可采取简单PCR办法的形式，其使用简并的或特异性的引物，例如那些之前描述的(3，5)。或者，可设计别的TCRVa引物并应用于该分析。可将PCR产物克隆入合适的载体中并用于转染大肠杆菌，之后使用标准的DNA测序方法对多个菌落中的质粒测序。一种替代的办法包括最初鉴定在线性或非特异性扩增样品中存在的正确的TCRVa或TCRVii，这使用包括将样品应用于固相结合的TCRVii特异性寡核苷酸并检测结合的样品的方法来进行。该检测系统可包括在扩增步骤中掺入生物素化核苷酸或以其它方式标记的核苷酸并使用酶的、基于荧光染料的或其它类似的技术进行检测(例如9，12，17，29)。一旦鉴定了正确的TCRV家族，则特异性PCR引物可与原始样品的等分试样一起用于产生TCRVα或TCRVβ⑶R3序列，然后可对序列直接测序，或者将其克隆入合适的载体中并转化入大肠杆菌中，之后进行菌落选择和测序。可将TCR转染入任何会在抗原呈递至转染的TCR后导致发信号的报道细胞系统。可通过标准技术来实现TCR转染(2，4，7，13，18，25，30)。受体细胞可以是杂交瘤(11，14)，或胸腺瘤(诸如来自ATCC的s49.1胸腺瘤)。如果受体细胞是⑶4-ve和⑶8-ve(诸如D011-10的TCR缺陷型衍生物)，那么⑶4或⑶8需要靠含TCR的载体转染(25)。业已使用逆转录病毒载体证明了转染的TCR的功能性(23)。转基因动物如果TCRa链更难于分离，那么可使用TCRVβ序列来创建表达合适的TCRVβ的转基因小鼠，并且这些会在转基因小鼠的胸腺中在发育期间与TCRVa相结合。在TCRVβ基因座处运转的等位基因排斥现象会戏剧性地限制内源性TCRVii表达，并且可从这些小鼠中分离合适的TCRa链或者细胞可具有保护性/有效能力，而不知TCRVα链。在后一种情况中，可直接使用来自TCRii转基因小鼠的细胞。可用标准转基因方案(10)或使用制成将转基因靶向TCRii基因座的敲入系统的ES细胞(8，19)来产生转基因动物。最终的报道系统可以以TCRa和TCRi^链双重转基因形式制成并在RAGl-/-或RAG2-/-背景上回交。与RAG-/-回交是有利的，因为尽管在TCRii基因座处发生等位基因排斥，但是其不会在TCRa基因座处发生，因此没有这种背景(其停止了所有TCR和Ig重组)，内源重排的TCRa可能会成问题。保护性/有效T细胞群鉴定的体内确认为了检验T细胞的鉴定和保护性/有效能力，可进行来自之前鉴定的“受到保护的”和“未受到保护的”个体的细胞的连续过继转移。该方法基本上如为使用蠕形艾美球虫(Eimeriavermiformis)所描述的来进行。简言之，将细胞从所有受到保护的和一些(3-6只)未受到保护的小鼠转移到至少5只受体小鼠中，然后用病原体再攻击以在平行分子分析下评估持续的细胞效力。这些动物中的细胞还可用作在之前章节中概述的细胞研究的材料来源，并代表了另外的扩增细胞群，其可提供用于通过平行分子分析鉴定的下游研究的存档材料(冷冻细胞、DNA和RNA)。已知的保护性/有效TCR基因作为抗原筛选的用途该系统的目的在于鉴定与保护或效果有关的T细胞受体，从而容许实质性精炼对合适抗原的下游搜寻。TCR的分子鉴定容许创建T细胞转染子或产生TCR转基因动物，作为用于标准抗原筛选的细胞来源。具体的系统取决于所研究的病原体/疾病及T细胞子集，但基于在刺激T细胞的抗原的学术性和商业性筛选中常规使用的技术。非常简单的说，该系统使得筛选能鉴定用于在疫苗或免疫治疗计划中包括的合适且有效的抗原。该筛选可包括分级复杂抗原混合物，使用表达文库或使用基于组合化学的肽文库(在此情况下寻找模拟肽)。更详细地抗原筛选1.TCR识别为了确定TCR识别哪种抗原，需要由合适的MHC分子来呈递抗原决定簇(通常是肽，但可以是修饰的肽或甚至基于非肽的模拟物)。TCR在T细胞或另一合适的细胞诸如转染子(见上文)上表达，并且活化测定法可用作报道系统(例如测定细胞因子生成)。一项考虑是呈递至TCR需要的呈递途径。对于大多数TCRaβT细胞，TCR限于MHCI类(CD8+T细胞)或MHCII类(CD4+T细胞)。MHCI类呈递途径呈递自胞质溶胶衍生的内源加工抗原，而MHCII类途径呈递自细胞外部衍生并在专门化的内体中加工的外源抗原。就有些细胞类型诸如树突细胞而言，可发生一种称为交叉敏化的现象，藉此外源抗原驶入内源途径中并加载到MHCI类上。对于大多数应答检测T细胞测定法(或TCR识别)，抗原需要由合适的抗原呈递细胞经正确途径呈递到响应T细胞。对于⑶8+Τ细胞，抗原经胞质溶胶途径呈递入MHCI类途径中。这可通过将抗原编码序列转染入表达正确MHCI类分子的靶细胞中以实验来实现。由于几乎所有细胞都能经MHCI类呈递途径加工，因此靶细胞的选择是广泛的(只要应答细胞被恰当武装来应答即可(可能需要考虑多条招募幼稚和响应T细胞的规则))。CD8+T细胞可通过细胞因子生成、细胞表面标志物改变、细胞分裂或杀死靶细胞能力得以测定。这可能类似于或涉及转染子或杂交瘤系统中还可包括合适的标志物/报道系统的其它系统。通常，TCR转染子或T细胞杂交瘤就好像它们业已部分活化且具有较不严格的活化要求(例如无需预敏化)的那样运转。用于筛选⑶8+Τ细胞相关TCR的方法可包括例如a)在具有正确的MHC的细胞中建立潜在抗原的胞质溶胶表达文库(可通过转染至靶细胞来提供)。b)使用来自靶抗原的肽(可以是预测的或随机重叠的)，然后用于脉充带有正确MHC的细胞，以这样的一种方式将肽置换到表面表达的MHC上。c)在具有可溶性重组MHC分子的环境中使用肽(通常以多聚体试剂例如四聚体形式存在)，然后可通过TCR驱动的功能或通过FACS来测定(四聚体试剂可以这样使用)。四聚体可涉及来自随机库的重折叠测定法，之后与带有克隆TCR的细胞起反应并接着被分离，再衍生肽，并通过蛋白质测序方法和/或质谱术来确定肽的序列。d)使用肽负载或可溶性MHC方法并联合组合肽文库(这不会找到病原体肽但能找到模拟物)。e)使用添加到合适细胞(例如DC)的全抗原，这可介导交叉敏化并在MHCI类途径中呈递(这样用于筛选MHCII类响应细胞的方法可适用于MHCI类)(例如见下文方法)。用于筛选⑶4+T细胞相关TCR的方法可包括例如对于⑶4+T细胞相关TCR，抗原通常由MHCII类途径呈递，并且如果涉及细胞，那么该细胞需要表达合适的MHC(可通过转染来改造)且应当具有合适的途径用于以结合MHCII类的形式(在全抗原暴露的情况中)保存抗原。a)可使用一系列标准的分子分离方法包括层析(例如阴离子交换)、凝胶过滤、制备性电泳或其它分离方法来分离来自病原体各阶段的蛋白质制备物。然后将抗原制备物的级分应用于合适的抗原呈递细胞，并通过暴露于表达感兴趣TCR的细胞(很可能还需要⑶4+)来评估应答。b)创建能分泌感兴趣抗原的克隆表达文库，并接着可在使用合适的抗原呈递细胞(APC)和报道细胞的测定法中测试上清液。c)在自表达抗原的克隆获得裂解产物的情况中，创建克隆表达文库，然后将这些作为外源抗原应用于APC和报道细胞。d)使用具有合适的MHCII类结合特征的组合肽文库。e)使用肽预测来鉴定来自病原体基因组内的潜在的肽，合成肽并使用MHCII类+APC和报道细胞进行筛选。f)使用具有物理连接至MHCII类分子(2)的肽文库(15，22，24，26_28)使系统适应人源化小鼠上文概述的研究容许鉴定已知的保护性/有效T细胞受体及鉴定已知有效地刺激这些T细胞的抗原/肽。保护的生物学是这样的以至于多种特征决定任何抗原行使保护的能力。这些包括在适当时候于病原体中表达，对于免疫应答的可得性及免疫应答加工并呈递抗原的能力。虽然抗原生物学的许多方面通过该核心技术得以解决，但是此系统的一个方面可通过构建两种表达人MHC组分以代替鼠MHC组分的转基因小鼠加以改进。近来已表明(Pajot等(2004)EurJImmunol34:3060-9)当在缺乏内源性MHC分子的情况中小鼠表达人MHC分子时，应答的精确肽特异性与在具有那些MHC分子的人应答用丙型肝炎病毒攻击中所见的相同(并不仅仅在相同的抗原方面)。人源化系统需要的两种小鼠品系是⑴在小鼠MHCI和II类缺陷型背景中具有人源化MHCI和II类的供体小鼠；和(i)受体小鼠，与供体相同，但处于T细胞缺陷型背景(例如TCR或RAG敲除、SCID或裸)上。更详细地人源化小鼠为了本发明的目的，通过直接将转基因靶入鼠基因组的特定部分中以产生对小鼠MHC系统组分的直接置换，从而可将已知的人源化MHC小鼠(16)制得更有用。供体小鼠供体小鼠是在内源性β2m和内源性MHCII类缺陷的小鼠背景[称为hMHCtsgmMHCK0]上人MHCΙ_β2πι类和MHCII类分子转基因的。最佳的(但并非唯一的)策略是通过靶向诱变(在用于产生小鼠的ES细胞中通过敲除/敲入策略的基因置换)来靶向人MHC转基因入相关的小鼠β2m和MHCII类基因座中。这戏剧性地简化了维持及产生所需集落必需的繁殖策略。例如，人MHCI类分子/人β2m杂合分子可被靶入小鼠β2m基因座(由此除去所有内源性小鼠MHCI类分子)。类似地，人MHCII类基因可被靶入小鼠MHCII类基因。受体小鼠受体小鼠与供体小鼠在人和小鼠MHC基因状况中相同，但在T细胞缺陷型或T和B细胞缺陷型背景(例如SCID、裸、RAGl、RAG2、TCRi3或TCRPxδ)上繁殖。为了说明该系统的目的，将这些小鼠称为[Τ缺陷-hMHCtsgmMHCKO]以标识它们。人源化小鼠中的保护系统用所选择的病原体感染供体[hMHCtsgmMHCKO]小鼠以刺激强免疫应答。自合适的器官(通常是淋巴结或脾)衍生的T细胞可被分选以提取各细胞群(例如CD4+或CD8+或者“活化的细胞”)，之后稀释成合适的细胞数目并施用于受体[T缺陷-hMHCtsgmMHCKO]小鼠。以对标准系统相同的方式处理受体动物，即通过感染/免疫接种/暴露来刺激细胞扩增，并在大约1-2个月后用所研究的感染(或其它攻击系统)进行攻击。随后的对“受到保护的”和“未受到保护的”动物和在这些动物中存在的细胞的分析遵循上文和实施例中描述的标准方法。本发明现在将通过实施例得以进一步描述，实施例意在帮助本领域普通技术人员实施本发明，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。实施例实施例1-体内T细胞组库的限制肠顶复门(apicomplexan)原生动物艾美球虫代表了一组重要的家畜病原体。艾美球虫在种系发生上与包括疟原虫(引起疟疾)、鼠弓形体和肠寄生虫小球隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)在内的多种人病原体有关。艾美球虫寄生虫的基因组为大约60Mbp，并且估计顶复门寄生虫基因组编码7，000-10，000种基因产物，它们都是潜在的抗原。艾美球虫寄生虫感染诱导针对再攻击感染的免疫，它特别强且时间长。由于依赖于T细胞杀死胞内病原体的能力，因此针对许多顶复门寄生虫的保护性和/或有效应答的性质是非常确实的。此实验研究在蠕形艾美球虫(小鼠的一种天然寄生虫)感染期间保护性/有效且响应T细胞组库的性质。如通过TCRVii扩增及⑶R3长度多态性评估(通过免疫扫描(immunoscope))所判断的，认为针对此病原体的响应组库的性质是高度复杂且多克隆的。为了研究此组库内的有关特异性，本发明人已开发了一种方法，籍此给予T细胞缺陷型受体小鼠以来自致敏供体动物的受限淋巴细胞组库。该规程将不同数目的细胞过继转移入大约6-10只小鼠的各组中并用蠕形艾美球虫感染受体两次。蠕形艾美球虫系统的一个特征是感染是自我受限的且寄生虫的最大复制能力在寄生虫基因组内编码。该生物学的这一方面容许攻击高度免疫缺陷的动物而不产生严重的临床后果(在其它系统中，这种致敏处理可用各种方案来实现，例如通过使用药物终止)。感染期间产生的寄生虫的数目是免疫程度的直接结果，而且在第一次攻击期间对该系统测试赋予免疫需要多少细胞。首次感染还刺激转移细胞的扩增，使得当动物被再次攻击时(1或2个月后)，免疫程度与不同TCR(即组库)的数目有关，而不是与转移细胞的数目有关。该实验策略描绘于图1中。从首次用于实验的或主动响应的(首次感染后10天；dppi)或从自感染恢复的(30dppi)C57BL/6小鼠中转移脾和肠系膜淋巴结细胞混合物。通过物理破坏来自没有接受感染的原始C57BL/6(6-8周龄，雌性)小鼠、用50个蠕形艾美球虫成孢子卵囊10天dppi或用50个蠕形艾美球虫约30dppi恢复的小鼠的脾和肠系膜淋巴结获得单细胞悬浮液。通过用无菌蒸馏水“急骤裂解”来除去红血球污染并使用台盼蓝排斥用显微镜评估活淋巴细胞数目。以合适的浓度制备细胞等分试样并通过腹膜内注射(200μ1/小鼠)施用入TCR((βχδ)-/-受体小鼠(7-10只受体/组)。转移后一周，用50个蠕形艾美球虫卵囊攻击小鼠并根据标准方法(31)通过粪便卵囊输出的显微镜分析监测感染。[监测此感染以确保感染所有小鼠，这并不是有效组库的分析。首次感染用来扩增能响应蠕形艾美球虫抗原的T细胞数目]。通过在第一次感染后约30天受体小鼠的第二次攻击感染(50个卵囊)给予有效组库的测试。通过如之前所描述的(31)粪便卵囊输出计数来监测感染的程度。在评估组库的时候(受体小鼠的第二次攻击)，在IxIO5个细胞的转移细胞数目(TCN)下那些接受幼稚细胞的受到良好保护，而转移IO4个细胞的则未受到保护(图1)。与此相反，自主动响应的小鼠转移IO2个细胞赋予针对攻击的免疫，指示惊人的保护性T细胞组库的扩增。凭借采自恢复小鼠的细胞，保护受体动物所需要的细胞容量介于来自首次用于实验或主动响应的小鼠所需要的数目之间，数目更接近首次用于实验的动物。这是因为响应细胞群的缩小及细胞的记忆库的建立。就抗原鉴定而言这3组中最感兴趣的是从主动响应小鼠接受低数目细胞的组。在此实验中，在至少有些个体中看见保护所需要的数目介于100和1000个细胞之间。清楚的是，每一供体个体都是不同的，并且基于免疫应答中天然存在的多种随机事件，在个体之间保护性细胞的准确水平可以是不同的。虽然如此，能赋予保护的介于1000和100个细胞之间的数目戏剧性地不同于在小鼠中存在的T细胞的正常数目(大约1亿个)。保护要求低数目的细胞表明有可能鉴定相对于未受到保护的动物的受到保护的动物的“受限组库”中存在的T细胞受体。因此，有可能鉴定根据定义识别保护性抗原的有效T细胞受体。实施例2-鉴定与保护有关的TCR磁分选自IOdppi感染的C57BL/6小鼠(主动响应)衍生的⑶4+Τ细胞群并以300-600个T细胞/小鼠将这些细胞过继转移到TCR(i3χδ)-/"受体中。进度表描绘于图2中。在每次实验中，通过用50个卵囊感染致敏单只供体C57BL/6小鼠(雌性，6_8周龄)。通过在IOdppi时纯化MLN淋巴细胞并与抗⑶4缀合的顺磁珠(例如Miltenyi)混合，然后依照厂商说明书用AutoMACs系统(例如Miltenyi)进行正分选，从而获得CD4+T细胞级分。受体动物(ΤΟ[βΧδ]-/_)接受300个分选的细胞并在转移后7天给予第一次“扩增”感染，使之恢复并在约30dppi时给予第二次“测试”感染。通过粪便中卵囊的输出来监测感染。在图3中，测试感染的结果表现为个体小鼠的卵囊输出，使用虚线代表保护的95%置信区间。包括未操作的原始的和TCR(i3χδ)-/"小鼠作为参照。结果表明30只受体小鼠大多产生与没有接受细胞的TCR(βχδ)-/-类似数目的寄生虫(图3)。在此实验中30只小鼠中的3只与其它小鼠相比产生明显更少的寄生虫，因此可被视为针对感染受到保护。在四次独立的实验中，大约10%的接受低数目细胞的小鼠显示保护性表型(见例如图3)。因此，有可能在给予高度受限T细胞组库的小鼠中产生“受到保护的”TCR组库，并且该系统可被操纵以给出约10%受到保护的受体动物。产生约10%受到保护的受体的能力容许比较在受到保护的和未受到保护的个体中存在的T细胞以鉴定那些与保护性免疫有因果联系的TCR(即看见保护性抗原的那些)。实施例3-在警到保护的和未警到保护的“警限组库”警体小鼠中存在相似数目的⑶4+T细胞对于在图3中所证实的结果的一种平凡的解释会是转移的CD4+T细胞仅在3只受到保护的动物中存活。为了检验这一点，可检查所有受到保护的和未受到保护的小鼠中存在的CD4+T细胞群。如图4中所示的，在所有小鼠中可检测到相似比例的CD4+T细胞，与受体小鼠所展示的“受到保护的”或“未受到保护的”表型无关。与27只未受到保护的动物的脾中的1.08士0.11%相比，在受到保护的动物的脾中看到了一群1.12士0.09%⑶4+T细胞。类似地，在受到保护的动物的肠系膜淋巴结(其引流寄生虫感染部位)中所见的CD4+T细胞的百分数为3.31士0.49%，而在未受到保护的动物中为3.50士0.60%。因此，无法通过过继转移的CD4+T细胞生存或扩增不同来解释在针对感染的保护方面受体小鼠的表型。保守估计在分析时CD4+T细胞扩增的水平(仅基于脾和淋巴结中T细胞的数目)应当在300个转移的T细胞到最终的4百万个T细胞数目之间。此计算忽略了这样的事实，即许多“记忆”T细胞位于组织中，主要是固有层，因此必须考虑视为实质性的低估。T细胞的最终数目是转移的细胞扩增的结果，尽管实际数目相对高，但是这些具有300种不同TCR的最大组库。事实上，真实组库要低得多，原因在于供体细胞群中抗原驱动的扩增会导致供体群具有许多重复的表达TCR的细胞。对于“低于300种TCR数值”的第二个原因是并非所有转移的细胞都经受得住过继转移，导致损失额外的TCR并进一步限制受体动物中的组库。在使用来自蠕形艾美球虫的可溶性卵囊抗原制备物和采自“受到保护的”和“未受到保护的”两种小鼠的脾细胞的经典T细胞增殖测定法中，显示这两种小鼠都具有相似水平的抗原特异性增殖(数据未显示)。总之，这些数据显示响应T细胞存在于所有个体中，与“受到保护的”或“未受到保护的”表型无关，由此支持了针对感染的应答大多无关的假设。尽管如此，在应答中存在一种能够保护的TCR组库组分，并且其能与受限组库中的响应T细胞分开。^MM4-连续过继转移ilHtT警服T细朐,群呆护能力为了验证该系统，从之前鉴定为“受到保护的”或“未受到保护的”小鼠采集细胞并过继转移到多组免疫缺陷型受体(τα(βχδ)-/-受体小鼠，ο7个淋巴细胞/小鼠)中。然后用100个卵囊攻击受体小鼠以测试所鉴定的τ细胞群的功效，通过卵囊输出定量感染程度。如通过“连续转移”受体小鼠粪便中产生的寄生虫数目所判断的，此“连续转移”实验证实了自“受到保护的”小鼠采集的细胞能够控制感染，而自“未受到保护的”小鼠采集的细胞则无仍然没有能力控制感染(图5)。实施例5-与保护有关的TCR的分子鉴定为了评估保护性和/或有效TCR组库的同一性和复杂性(理论上高达300种TCR，但实际上比此数目少)，采用了简单的两步法。在第一种情况中，从自“受到保护的”和“未受到保护的”受体小鼠采集的脾细胞(或来自其它器官的细胞)提取mRNA，并使用标准技术制备cDNA。然后使用设计成鉴定各TCRVβ家族的的引物通过PCR对cDNA测试不同TCRVβ家族的表达。图6显示了使用设计成鉴定TCRVii4和TCRVii14的引物的该方法的一个实例。呈现了在3只受到保护的和3只所选择的未受到保护的小鼠中TCRViimRNA表达谱的全分析(图6)。所有3只受到保护的小鼠都表达TCRVβ4、Vβ14、Vβ15禾口Vβ19的mRNA，这代表了较3只未受到保护的小鼠中所见的更加受限的TCRVii分布。在每一种TCRVii中，会呈现许多克隆T细胞群，而且鉴定这些克隆群需要鉴定包含TCR之⑶R3区(高变且负责抗原识别特异性的区域)的序列。因此，将TCRVβPCR产物克隆入质粒中并用于转染大肠杆菌。对自至少10个独立的“阳性”菌落衍生的插入物测序。根据所获得不同序列的数目概括每一种TCRVβ的测序结果(各自代表一个T细胞克隆；图7)。自“受到保护的”小鼠获得的TCRVii序列的数目在数目上比自“未受到保护的”小鼠获得的那些低得多。总之，在受到保护的小鼠中检测到6条TCRVii序列，而且这些序列的每一条在所有3只受到保护的小鼠中都有呈现。用TCRVii4获得3条序列，而用Vβ14、Vi315和VM9中的每一个仅获得1条序列，表明了TCRVP单克隆性。凭借“未受到保护的”小鼠完成了序列分析，其中7种TCRVii中的6种在所有3只所选择的小鼠中有呈现，而且这些TCRVii家族中的5种中，序列显示多克隆性(即无论在小鼠中还是在小鼠之间所有序列都是不同的)。针对TCRVii4和TCRVii14的⑶R3靶向PCR编码的氨基酸序列的实例描绘于图8中，并在括号中标明了每条序列的频率。有趣的是，在TCRVii4中，其中用每一只受到保护的小鼠及无一未受到保护的小鼠获得3条序列，所有3只受到保护的小鼠的每条序列的频率都是相似的。对于TCRVii14，用带有CDR3氨基酸序列“RRNI”的3只受到保护的小鼠获得了单克隆CDR3序列。在此实验中与保护相关的TCR组库是相当值得注意的，在这一点上我们能鉴定6条与保护完全有关的TCRViiCDR3序列。在搜寻保护性抗原中这样低数目的“有效”TCR的存在提供了重大优势。参考文献1.Barry,Μ.Α.，D.P.Howell,H.A.Andersson,J.L.Chen,andR.A.Singh.2004.Expressionlibraryimmunizationtodiscoverandimprovevaccineantigens.ImmunolRev199:68-83.2.Boen,Ε.,A.R.Crownover,M.Mcllhaney,A.J.Korman,andJ.Bill.2000.IdentificationofTcellligandsinalibraryofpeptidescovalentlyattachedtoHLA-DR4.JImmunol165:2040-7.3.Currier,J.R.a.R.,M.A.2000.Spectratype/ImmunoscopeanalysisoftheexpressedTCRrepertoire,p.10.28.1-10.28.24.InJ.E.Coligan,Kruisbeek,Α.Μ.,Margulies,D.H.，Shevack,Ε.M.，Strober,W.(ed.)，CurrentProtocolsinImmunology,vol.2.Wiley,NewYork.4.Fleischer,B.,A.Necker,C.Leget,B.Malissen,andF.Romagne.1996.ReactivityofmouseT—cellhybridomasexpressinghumanVbetagenesegmentswithstaphylococcalandstreptococcalsuperantigens.InfectImmun64:987_94.5.Fox,C.J.a.D.,J.S.1997.MolecularanalysisofmouseTcellreceptorexpressionusingPCR，p.10.27.1-10.27.20.InJ.E.Coligan，Kruisbeek，A.M.，Margulies，D.H.，Shevack，Ε.M.，Strober,W.(ed.)，CurrentProtocolsinImmunology,vol.2.Wiley,NewYork6.Gomes，LI.，R.LSilva，B.S.Stolf，E.B.Cristo，R.Hirata，F.A.Soares，LF.Reis,E.J.Neves,andA.F.Carvalho.2003.ComparativeanalysisofamplifiedandnonamplifiedRNAforhybridizationincDNAmicroarray.AnalBiochem321:244_5L7.Goyarts,E.C.，Ζ.Vegh,Α.Μ.Kalergis，H.Horig，N.J.Papadopoulos，Α.C.Young，C.Τ.Thomson，H.C.Chang，S.Joyce,andS.G.Nathenson.1998.PointmutationsinthebetachainCDR3canaltertheTcellreceptorrecognitionpatternonanMHCclassI/peptidecomplexoverabroadinterfacearea.MolImmunol35:593_607·8.Hanks，M.，W.Wurst，L.Anson-Cartwright，A.B.Auerbach，andA.LJoyner.1995.RescueoftheEn-ImutantphenotypebyreplacementofEn-IwithEn-2.Science269:679_82.9.Hazbon，M.H.，andD.Alland.2004.Hairpinprimersforsimplifiedsingle-hueleotidepolymorphismabalysisofMycobacteriumtuberculosisandotherorganism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QKPHPPLF(SEQIDNO.3)13.依照权利要求12的TCR筛选有效诱导针对艾美球虫感染保护性和/或有效的免疫应答的抗原或抗原决定簇的用途。全文摘要本发明提供了一种用于鉴定针对疾病保护性和/或有效的T细胞受体(TCR)的方法，该方法具有下述步骤i)自供体非人动物获得T细胞；ii)以使得至少一只受体动物针对疾病受到保护但至少一只动物仍然未受到保护的量将T细胞过继转移入多只T细胞缺陷型受体非人动物；并iii)确定仅仅在受到保护的动物中存在的TCR。文档编号C07K14/725GK101970480SQ200780102286公开日2011年2月9日申请日期2007年12月3日优先权日2007年12月3日发明者阿德里安·史密斯申请人:艾西斯创新有限公司