专利名称：编码一种癌症新标记的基因的制作方法
编码一种癌症新标记的基因本申请是申请日为1999年3月11日，申请号为99806169.7，发 明名称为"编码一种癌症新标记的基因"的发明专利申请的分案申请。本发明涉及编码包含一表位即癌相关抗原的蛋白和衍生自该蛋 白的肽的基因，该表位可用作不限于先前定义的癌组织学类别的标记。 抗原肽可用作治疗和预防癌症的疫苗，且适合于制备新的、特异性的 单克隆抗体。反义分子在药用组合物中是有用的，且可用于诊断和治 疗。发明背景癌症("癌症是一种恶性胂瘤；"其中"肿瘤"是异常的组织块， 它不一定为恶性的；"赘生物"是新生长物的一种形式。)是全世界男 性和妇女的主要死因；仅在美国，每年诊断出超过一百万的新病例， 且每年报道有超过五十万人死亡(Landis等，1998)。在历史上，部分地 基于其中发生例如乳癌、结肠癌和肺癌等等的组织，将肿瘤分类并治 疗。然而，例如在肺癌中，已充分地认识到这些肿瘤是一组异质性高 的赘生物。在其他组织中出现的肿瘤也是如此。在某种程度上，因为 这异质性，有了用于人类肿瘤的复杂且不一致的分类系统。先前的治 疗癌症的尝试已被两方面所阻碍，即l)对在特定组织中出现的肿瘤的 任意分类，以及2)通过使用基于这些肿瘤外表怎样的显微方法(组织学 分类)。虽然现存的对不同肿瘤类型的分类有一些预测伯、值，但几乎所 有的分类法不能预告治疗的反应性和治愈的可能性或疾病的进程。为 了有效改变癌症患者的生存统计，需要基于这些赘生物的生物学组成 的、改进的分类系统。解决这些问题的一种方法是确定对肿瘤特异性 的分子的位置，优选分子中作为癌细胞标记的抗原。(在本文中，"标 记"定义为能纟皮用于区别癌症组织与正常组织且能一皮用于识别癌症与 其他疾病状态的任何特性。)于是，标记的存在成为分类的基础。通常在小鼠中用体细胞杂交技术制备的单克隆抗体(MCA)是探测和区别细胞抗原的有用分子探针，因此有探测癌相关抗原的巨大潜力。 这些抗体结合到特定的抗原上且该结合是可用众所周知的方法探测 的。当发生结合时，则作出存在特定的抗原的推断。那些暴露于细胞 表面或在癌块中发现的癌相关抗原是宿主免疫系统(包括宿主抗体)的分子靶。近来的发现暗示具有4元胂瘤抗体的癌症患者，比没有建立 这种类型免疫应答的那些患者的情况好些(Livingston等，1994)。因此， 天然的、诱导的或被给予的抗体是有希望的治疗手段。非人类的MCA的人源化(将非人类的MCA反应位点穿梭到克隆内和在离体的应用中不丧失它们的特异性结合。在活体内，MCA可用 作成像剂、诊断试剂，并可用于治疗(Radosevich等，1988, 1990; Rosen等，1988)。疫苗疗法是充分确认的、针对诱发免疫应答而不会暴露于疾病或 病征的病原体的方法。例如，在宿主中许多疫苗可用于激发对细菌因 子和病毒因子的反应。疫苗中的肿瘤相关抗原(标记)的应用能预防原 发性癌症的发生，并同样能提供子贞防该疾病复发的方法。基因疗法是通过其修饰细胞的遗传组成来表达所关注基因的方 法。基因疗法的形式有多种，包括基因取代、反义抑制疗法和替代 物基因表达。发现编码癌相关抗原的基因，最好发现编码癌特异性抗 原(标记)的基因，以打开对癌细胞增生进行基因干涉之门。区分癌组 织和正常组织的癌标记的准确与连贯的使用，不仅具有诊断潜力，而 且对治疗和预测也是所希望的；因此，已寻找了这样的标记。近来的研究已显示，在有些人的腺癌细胞系中和在原发性肝细胞 癌中，编码人天冬氨酰P-轻化酶(HAAH)的酶^皮过量表达，因此，该酶 可能是一种标记。已克隆并测序了编码HAAH的所述基因(Gronke等, 1989, 1990; Wang等，1991; Jia等，1992, 1994; Korioth等，1994; Lavaissiere等，1996)。可是在人的肿瘤中，有关HAAH的表达大体上几乎是一无知(Lavaissiere等，1996)。该HAAH酶的研究产生自与其牛的相应物的研究(Gronke等, 1989, 1990; Wang等，1991; Jia等，1992)。 牛天冬氨酰(3-羟化酶是细胞 内的糖基化蛋白，定位于粗糙内质网上。已报道该蛋白有三种主要的 分子85千道尔顿的形式和分子量分别为56千道尔顿与52千道尔顿 的两种活性形式(Lavaissiere等，1996)。使用标准的生化方法，已纯化了牛天冬氨酰P-鞋化酶(bAAH)并对 其进行了特征鉴定(Gronke等，1990; Wang等，1991)。已显示该酶的活 性与纯化的52千道尔顿和56千道尔顿的种类相互关联。免疫学上， 也观察到分子量较高的相关形式(85-90千道尔顿)。作为纯化的 一部分， 使bAAH结合到ConA琼脂糖凝胶上，这与该酶被糖基化的结论相一 致。(随后的关于DNA序列的报告显示了三个可能的糖基化位点，一 个位点非常接近于已知的活性酶结构域。)在性质上该蛋白的酸性很 强，且不需要去垢剂溶解该活性部分。该酶的活性位点依赖于在生化 分离的牛蛋白(bAAH)的675号位存在组氨酸(Jia等，1994)。已获得了 HAAH的部分氨基酸序列。用从该氨基酸序列推断出的 DNA探针(DNA探针是在某些条件下具有能结合到特定的核苷酸序列 上的核普酸序列的分子)筛选了牛cDNA文库(Jia等，1992)。(一个 cDNA文库包含编码基因产物例如相对于基因组DNA的肽的DNA片 段)。在该文库中的几个重叠的cDNA序列包含一764个氨基酸的、预 期编码一 85千道尔顿蛋白的可读框(ORF)序列。另外两个可能的起始 密码子，即编码开始的位置，也存在于该ORF序列中。 一个核糖体结 合位点位于最靠3，端的起始密码子之前。具有该序列的克隆的翻译产 生大约85千道尔顿的蛋白。生产针对人MG-63细胞的细胞膜成分的 抗血清，并用该抗血清免疫篩选从MG-63细胞制备的cDNA文库。报 道了关于一个克隆的资料，该克隆能编码一 757个氨基酸的蛋白；通 过序列分析，发现其与bAAH具有强烈的N-末端同源性(Korioth等， 1994)。当将该克隆用于体外翻译系统(一种用于将mRNA转译成蛋白质的正常细胞细胞质的人造混合剂)时，产生56千道尔顿的蛋白。有 人提议这是由于翻译后的切割。该HAAH酶负责对蛋白的表皮生长因子样结构域中的特定天冬 氨酸残基进行修饰。已假定这些净皮修饰的天冬氨酸残基使得表皮生长 因子样结构域变成4丐结合域(Gronke等，1989, 1990; Wang等，1991; Jia 等，1992, 1994; Korioth等，1994; Lavaissiere等，1996)。首先研究了与HAAH相关的酶天冬氨酰P-羟化酶(AHH),因为 它特异性地修饰一组生物学上重要的蛋白中的选定的天冬氨酸残基或 天冬酰胺残基，所述重要的蛋白包括依赖维生素K的凝血因子VII、 IX 和X。象C、 S和Z的其他蛋白也有这种修饰(Gronke等，1989, 1990; Wang等,1991; Jia等，1992, 1994; Korioth等，1994; Lavaissiere等, 1996)。已显示在包含表皮生长因子样结构域的蛋白中，由HAAH修饰 天冬氨酸残基和天冬酰胺残基。(3 -羟基天冬氨酸残基和p -羟基天冬 酰胺残基的功能是未知的，可是，已推测对于选定蛋白的表皮生长因 子(EGF)样结构域中钙的结合，需要这种修饰。生产针对人肝细胞癌FOCUS细胞的抗体(Lavaissiere等，1990)。 一种MCA与一种在肝细胞癌中高度表达的抗原起反应(Lavaissiere等, 1996);用这种抗体和Xgtll HepG2文库的免疫筛选导致分离出一不完 全的cDNA，随后用该cDNA分离一较大的克隆。报道了称为A549的人腺癌细胞系具有非常高水平的HAAH活性 (Lavaissiere等，1996)。生产针对人腺癌细胞系A549(ATTC保藏号CCL 185)(Radosevich等，1985)的称为MCA 44-3A6 (美国专利号4,816,402) 的小鼠单克隆抗体。该抗体识别一细胞表面的、非糖基化的抗原蛋白， 该蛋白具有40千道尔顿的、估计的表观分子量。用A549细月包表达该抗原，且发现该抗原为一好的腺癌标记，即 在组织学检查时看上去象腺癌的癌频繁地表达该抗原(Radosevich等, 1990a; Lee等，1985)。 MCA44-3A6是独一无二的，因为它是第一个具 有这种结合特异性的单克隆抗体。来自 一关于肺癌的国际专题讨论会的结果证实了发表的有关MCA 44-3A6的其他相关的研究结果(Stahel, 1994)。称为MCA44-3A6的抗体具有临床用途，因为它区别与腺癌相关 的抗原。该抗原在正常组织和月台儿组织的分布限定于某些腺组织 (Radosevich等，1991)。检测可以发生在福尔马林固定的石蜡包埋的组 织上(Radosevich等，1985, 1988, 1990a, 1990b, Lee等，1985, 1986; Piehl 等，1988; Combs等，1988b， 1988c; Banner等，1985)。该抗体在人肺肿瘤 中具有有限的结合方式(Lee等，1985; Banner等，1985; Radosevich等, 1990a, 1990b)。在一项超过二百位肺癌患者的研究中，发现MCA44-3A6既与全 部试验的腺癌、许多大细胞癌起反应，又与各种中间神经内分泌性小 细胞肺癌、分化良好的神经内分泌性小细胞癌、类癌瘤而不是间皮瘤 的各个亚组起反应。MCA 44-3A6与鳞状细胞癌、支气管肺泡癌或小 细胞癌不反应(Lee等，1985)。 MCA 44-3A6在区别转移到胸膜的腺癌 和间皮瘤方面是有用的(Lee等，1986)。该抗体在各种腺癌中和在大细 胞癌方面具有选定的反应性(Piehl等，1988; Radosevich等，1990b)。在一项超过40个肺癌病例的、比较细胞学和组织学研究的研究 中，发现MCA44-3A6在细胞学诊断方面是有用的，且与组织学的研 究结果一致(Bamer等，198》。组织学研究的是组织(由细胞构成的)。 细胞学研究的是已从通常称为组织的组织范围移出的细胞。从组织移 出的细胞的表现不总是同它们在得到它们的组织中一样。幸运地是， 由MCA 44-3A6检测的、在组织中腺癌细胞中表达的抗原，其表现如 同其在从组织中移出的腺癌细胞里的一样。这在诊断上是很重要的特 性。用细胞学制备的肺癌细胞块，以及用存在于来自全身其他部位体 液中的AC,也显示出相似的相互关系(Lee等，1985; Spagnolo等，1991; Combs等，1988c)。同样，MCA44-3A6结合到肺癌以外位置的腺癌上。 在原发性损害和转移性损害中也报道了该抗原的表达(Combs等, 1988a)。也提到了在人的乳房组织中该单克隆抗体在区别癌与良性损害方面的效用(Duda等，1991)。已确定了由MCA44-3A6检测的该抗原在细胞中的位置。通过用 活细胞放射免疫分析(一种目的为确定抗体与活细胞结合的放射性抗 体试验)、免疫荧光和活细胞荧光激活细胞分类器(FACS)分析，已显示 由MCA 44-3A6检测的该抗原在该细胞的外表面上(Radosevich等, 1985)。使用免疫金电子显微术和FACS分析的另外研究已表明，这种 抗原是非调节的(当被抗体结合时不被癌细胞内化)，并在原生质膜的 细胞外表面上表达，且不是细胞周期特异性的，即该细胞在它正经历 着细胞复制的过程和在它还不分裂时， 一直制造着该蛋白(Radosevich 等，1991)。在正常血清或肿瘤病人的血清中没有发现该抗原，且该抗 原不被阳性细胞系脱落到培养基中(即已知癌细胞起泡脱掉(to bleb off) 它们的部分细胞膜并将其释放到周围的液体中)(Radosevich等，1985)。 近来发现在27个一皮随机试验的腺癌病人中，有3位有了自然产生的针 对该抗原的抗体。另外，在棵鼠中，用放射性标记的MCA44-3A6确 定了 A549肿瘤生长的位置。阿霉素(douxorubicin)免疫缀合的MCA 44-3A6在体外是有选择性毒性的(Sinkule等，1991)。测定由MCA44-3A6检测的抗原的核甘酸序列和氨基酸序列将 增强这种抗原在癌症诊断、治疗和预防方面的实用性。发明简述现在将如在背景中描述的由抗体MCA 44-3A6检测的抗原称为 "迷路蛋白(Labyrinthin)"。分离并特征鉴定其特征为编码由MCA 44-3A6检测的抗原的独一无二的核芬酸序列的基因(称为迷路蛋白基 因(/W,/w欲/w)、缩写为标志/aZ)表示核酸DNA/RNA的形式， "Lab"标志是指由/a6 DNA/RNA编码的蛋白。本文描述的发明用抗体MCA 44-3A6作为克隆编码Lab的基因的 工具。另外，在由该克隆表达的Lab蛋白上针对MCA 44-3A6的表位(在该抗原上发现的必需的抗体结合位点)鉴定为PTGEPQ (氨基酸的标准 缩写)。所述表位代表重要的免疫显性序列，即当将其注射到动物体中 时，所述动物容易产生对这种序列的抗体。本发明的一个方面是以有义(其中从3'端进行到5'端的DNA序列 的正常转录，从DNA的有义链产生一mRNA链；该mRNA互补于该 DNA)表达方式将DNA用于如下方面l)用核苷酸探针标记人类肿 瘤；2)检测在细胞和组织中的DNA和mRNA表达；3)将细胞转化 成腺样细胞的类型；4)在体内产生用于免疫的Lab抗原；5)为了免疫 产生抗体，离体表达Lab;以及6)在体外生产Lab。本发明的另一方面义分子抑制迷路蛋白基因(/^3^7"f/n力)表达(癌)细胞的生长。本发明的一个方面是包括DNA分子的一种载体，所述DNA分子 具有编码至少一种Lab抗原表位的核苷酸序列和允许在宿主细胞中表 达的合适调节序列。本发明的另一方面是从基因的蛋白编码区推断的氨基酸序 列。通过免疫学方法找到该序列的选定区域，以产生不但与来自自然 存在的(癌细胞)产物、化学产生的(合成产生的肽)产物的效应相 一致的 效应，而且产生与克隆的/"6基因的表达产物的效应相一致的效应。本发明的另一方面是使用推断的Lab的全部氨基酸序列、衍生自 Lab的肽、或化学生产的(合成的)Lab肽、或这些分子的任何组合，供 制备预防人类癌症和/或治疗癌症患者的疫苗之用。为了本发明的目 的，"癌症患者，，是在其细胞中有检测到的Lab抗原的那些人。这些 制剂也可在肺瘤首次发生前用来防止病人患这些肿瘤。针对Lab蛋白或抗原组份或Lab蛋白衍生物的单克隆抗体，对于 检测Lab和其他的目的是有用的。以与Lab抗原反应的种类以外的种 类制备的单克隆抗体，可用许多分子克隆的方法修饰，使得它们保留 其与迷路蛋白肽的结合，而在人类中又无免疫原性(Sastry等，1989;Sambrook等，1990)。简言之，通过用非人类的所关注的单克隆抗体结 合位点序列取代克隆的人抗体基因的结合位点序列而达到这一点。这 些"人源化"单克隆抗体在体内、离体和在体外 f皮用作治疗剂和诊断 试剂。在癌症诊断分析方面，Lab蛋白或从其衍生的抗原肽的应用是监 视病人血液或其它体液或组织中具有的抗体的存在和抗体量的一种方 法。这种检测不限于先前明确表示的一类癌或多类癌，而是可用于有 Lab标记抗原的癌细胞。可以用血清转化的程度来监控治疗的效果， 该血清转化的程度用本领域技术熟练人员已知的技术测定[例如 ELISA (Engrail和Perlmam, 1971)]。用药用组合物中/a6的反义分子或Lab的抗体的疗法是治疗其癌 细胞中或癌细胞上有Lab的病人的一种方法。附图筒述
图1是/a6基因的核酸序列(SEQ ID NO: 1)。图2是从基因推断的Lab的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。图3是/W基因的图解以及它与HAAH酶是怎样相关的。发明详述迷路蛋白基因(X^F7》^w)的分子生物学:为了证明MCA 44-3A6 表位(epitope MCA 44-3A6)由 一 蛋白序列编码，分离了来自细胞系 A549的高分子量DNA。将该DNA与质粒(pSVneo)共沉淀(通过4丐)， 并用于转染一种叫做B78H1细胞的小鼠细胞系(Albino等，1985)。这种 小鼠细胞系对于该表位的表达是阴性的，且报道该小鼠细胞系使任何 人DNA序列高频掺入并表达。如果特定的B78H1细胞处于一种吸收 DNA的状态，则预期它既吸收了人DNA，又吸收了该质粒DNA。该 质粒DNA使该细胞抗G418(—种标准的毒药)。因此，如果使对G418 生长抑制剂正常敏感的细胞生长于G418中，则它必须吸收了质粒，并可能也吸收了 一个或更多个A549 DNA序列。在G418选择后(只选 择通过吸收/表达pSVneo质粒上的Neo基因而具有抗性从而在G418 中生长的细胞、并因此代表处在同时吸收其他DNA状态的细胞的一种 方法)，用MCA44-3A6进行免疫选择，大约在1 x 105个克隆中检测到 15个。该研究结果与下述结论相一致，即人A549细胞有编码Lab 的DNA，并具有Lab表达所必需的调节序列。HAAH和迷路蛋白基因a^ wv力甴力)的比较:因为/W的DNA序 列作为本发明的一方面而被测定，所以能比较HAAH和/a6。 HAAH 和的核苷酸序列有某些内部片段的相似性；但在片段的每一边是 不同的，且与不同的产物相关。这个结论部分基于根据已报道的这两 个基因DNA序列的分析和同源性。具体地讲，该/a6的5'区域与HAAH 没有同源性。的蛋白编码区与所提出的HAAH蛋白编码区的一内 部区段有大约99.6 %的同源性。该3'区域与报道的HAAH序列没有同 源性。事实上，比较HAAH和迷路蛋白基因(/^ynW/H力)的所有其他资 料是不相同的，例如l)蛋白的分子量，2)细胞定位，3)染色体定位， 4)在正常组织和肿瘤中的组织学呈现，5)RNA印迹的表达，6)免疫学 的研究结果。虽然的蛋白编码区域与报道的HAAH序列的一内部区域相 同，但HAAH的5'非翻译区是不同的，且在/W克隆中发现的序列缺 失HAAH的5'翻译的蛋白编码区的部分。既根据HAAH，又根据 克隆，能预期所推断的蛋白在性质上酸性非常强，并因此在SDS凝胶 中电泳不规则。如同所预测的，该Lab蛋白在SDS凝胶中迁移不规则。 在本发明中所克隆并公开的物质与在几个细胞系中发现的天然蛋白的 迁移相同。编码由MCA 44-3A6检测的抗原的正确基因片段(mRNA) 已被克隆的令人信服证据是当制备重组蛋白时，该重组蛋白的行为 就同单独的生物学起源的该蛋白 一样(在这种情况下具有表观分子 量)。由克隆提供的Lab具有来自细胞Lab的特征。由HAAH编码的推断的氨基酸序列，需要使用一能产生85-90千ii道尔顿蛋白的可读框，且不考虑有数个起始密码子和其他较短的可读框。该推断的HAAH蛋白是(生化上)糖基化的，且l艮道的序列具有糖 基化位点(Korioth等，1994; Lavaisslere等，1996)。相反的，Lab是非糖 基化的，它也没有预测的糖基化^(立点。该推断的HAAH的氨基酸序列包含与Lab的氨基酸序列共享的、 预测疏水性非常强的区域。为了成为可溶的，Lab需要强的去垢剂； 而HAAH不需要。在广泛地用于克隆及研究的同一细胞系(A549) 中，增加的HAAH的表达(根据酶活性测定)暗示这两种基因产物对 AC表型可能是重要的，且至少A549细胞既产生功能性HAAH，又产细胞生长速率的显著降低。在NIH-3T3细胞(正常鼠成纤维细胞)中有 义构成物的表达导致显著的表型变化，产生一种与AC表型一致的 表型。因此，/aZ)表达和正常细胞转化成癌细胞相关。Lab和HAAH具 有共同的潜在的钙结合域。cDNA文库的构建和克隆:用从活泼生长的A549细胞中分离的 mRNA构建一 cDNA人gtl 1噬菌体文库(Sambrook等，1990)。用EcoRI 接头将该寡聚(dT)引物的cDNA克隆到EcoRI位点中。该文库有大约 83 %清亮的(包含一插入片段)噬菌斑和表示最小量为1.46 x 106个独立 噬菌斑的1.2 x 10"Vml的效价，所述独立噬菌斑通过聚合酶链式反应 而有大小范围从0.6至5千碱基的插入片段。由于Lab为一 40千道尔 顿的膜内在蛋白(一内嵌在原生质膜中的蛋白)，因此，估计理论上全 长的、编码该蛋白且包括一潜在前导序列的mRNA大约为1.1千磁基。 用抗体MCA 44-3A6免疫筛选该文库，分离到八林独立起源的噬菌体 原种(来自同一噬菌斑的相同的噬菌体)，通过免疫筛选/分离的反复循 环，对全部这些噬菌斑进行纯化。凭着对这八种分离物的EcoRI消化， 查看到大约2kb的插入片段。分离到最大的插入片段(2A1A1),并将该 EcoRI片段克隆到pGEM-3Z质粒中。序列测定和序列分析:发现称为2A1A1的DNA片段有一长度为2442个碱基对的插入片段(图1)，包舍一5'非翻译区、 一核糖体结合位 点和一个起始密码子，能预期该插入片段编码一 255个氨基酸的蛋白 (图2)。该3'非翻译区在其仅包含四个不稳定性序列ATTTA方面是值 得注意的(Xu等，1997)。另外，有发现于mRNA的极3'末端、导致该 mRNA腺苷酸化的序列(Sambrook等，1990)。该/W序列既包含亚适 宜的多聚腺苷酸化位点(ATTAAA)，又包含最适的多聚腺苷酸化位点 (AATAAA)。这些是发现于mRNA的极3'末端、导致该mRNA腺香酸 化的序列。这项研究结果提供了支持已在本文中概括的细胞和生化资 料的分子资料。(该HAAH的克隆有一多聚腺苷酸(poly A)信号，但没 测定整个3'区的序列。)在Lab氨基酸序列中注意到一钙结合位点基序(图2),可是，它没 有已知的、成为结合位点所需要的邻近结构序列。在这实例中，有钙 限制序列(calcium limiting sequence)， ^旦它不在一 已知的使其作为结合 位点的蛋白序列邻近序列(context)中。注意到和一 EST克隆(称为 #5501)的同源性，EST克隆仅代表3'非翻译区的一部分，并独立地证 实了该部分的序列。也注意到某些内部片段与HAAH的同源性，但该 5'未翻译的和部分5'翻译的区域是不同的(58个氨基酸)，以及在中， 3'编码区的主要部分是缺失的(图3)。基因组DNA克隆和分析:用代表/W的蛋白编码区的一PCR片 段作为探针，筛选一从人肺成纤维细胞细胞系WI-38构建的基因组 XFIXII文库。从大约lxl(^个篩选的噬菌斑里分离出十个原代噬菌斑。 用这十个中的七个作为靶DNA,用蛋白编码区的引物建立聚合酶链式 反应条件，产生一 765个碱基对的片段，即所期望的的蛋白编码 区。通过RNA印迹(用于定性评价mRNA的 一种方法)，仅检测到 一条表明为2.7千石M的带。当用MCA44-3A6进行蛋白质印迹(用于 定性确定蛋白的一种方法)试验时，从该/W克隆产生的重组蛋白的相 对迁移率与由A549细胞产生的Lab蛋白一样。/W基因和HAAH基因在其编码的蛋白方面产生不同的结果。根据RNA印迹分析，HAAH始终如一地产生二条带(2.6和4.3千碱基)， 这暗示2.6千碱基带是由于可变剪接造成的，即该细胞切割并剪接该 mRNA。同样，如果/W和HAAH是同一基因，则在发现Lab的所有 组织和癌细胞系中应该检测到HAAH;可是，在细胞系EMT6或QU-DB 的RNA印迹上没查看到Lab，在这些细胞中也没有免疫反应性，这表 明在这些细胞里没产生Lab mRNA,且不产生Lab蛋白。Lab蛋白在 正常细胞中很少表达，而已才艮道在几乎每种研究过的组织中，既表达 HAAHmRNA,又表达HAAH蛋白。mRNA分析:用cDNA作为探针的、来自A549细胞系的DNA 片段的RNA印迹分析，鉴定出一大约2.7千碱基的单一带。基于所述 cDNA (2442个碱基对)和大约300个碱基对的多聚腺苷酸尾，预期了 这一点。小鼠细胞系EMT6和人的大细胞癌细胞系QU-DB的RNA印 迹分析，证实这些细胞不产生的转录物。这和在这些细胞中 的表达为阴性的免疫分析相一致。反义cDNA和有义cDNA的表达:质粒(pBK-CMV) (Sambrook等, 1990)可以将有义的或反义的全长cDNA /a6运载到A549和NIH 3T3 细胞中去。反义分子例如可以为与有义分子杂交、阻止该有义分子 表达的该有义分子的互补序列。用MTT分析(Siddique等，1992)来评价 表达反义物的A549细胞的生长速率；注意到生长速率显著降低。 反义转染的A549细胞看来有较大程度的接触抑制。在这些反义转染 的细胞中，可检测的Lab量减少。当有义表达发生时，NIH-3T3细胞 从一成纤维细胞样细胞类型形态(大的、薄纺锤形)转变成一种大的、 看来好象腺癌的细胞(很圓的、鼓起的)。染色体定位就/W的染色体定位而言,用全长cDNA作为探针， 通过原位杂交(Sambrook等，1990)，暂定为在染色体2ql2-14上；也许 对染色体4和8有一些反应性。使用同 一探针(/aZ)的全长cDNA序列) 和FACS分类的染色体(Lebo等，1985)，也表明在染色体2上染色；在 染色体4上有弱的染色且在染色体8上无着色。基因组克隆的应用在分辨这些资料方面将具有特殊价j直，因为能用比cDNA所容许的杂交条件更高严格性的杂交条件，从而减少背景信号。这也是已克隆了正 确的基因且该结果不是由于方法的人为现象的另一个证据。在肿瘤的 基因组DNA中可能有突变，且对于本发明，从肿瘤细胞(A549)克隆了 DNA;所以，可能已克隆了一突变的基因。可是，因为来自正常细胞 的基因组DNA (DNA)产生与本文描述的、所克隆的序列相同的序列， 所以，事实并非如此。因此，从A549细胞克隆到正常的基因。在染 色体4和8上的弱信号与一伪基因或一相关基因是一致的。例如，通 过原位杂交，报道了 HAAH存在于染色体8ql2上，因而在染色体8 上的结果可能反映出HAAH和/fl6的序列同源性。迷路蛋白基因(X^yn"^力)的蛋白分子的特征鉴定:运用蛋白质印 迹分析(评价抗原的定性分析)的先前的工作已显示Lab抗原为一在 A549细胞中可^r测的40千道尔顿(根据相对迁移率)的蛋白 (Radosevich等，1985)。该表位看来不受凝集素调节或封闭，并在细胞 表面上选择性地表达，初步定位到原生质膜上。(Radosevich等，1985, 1991)。 Lab对蛋白酶是敏感的，但是对脂质或碳水化合物改变反应不 敏感(Radosevich等，1985)。 Lab的生化性质与为膜内在蛋白的Lab是 一致的。由于有了从本发明的/W基因推断的氨基酸序列，因而允许进一 步对Lab蛋白进行特征鉴定。对Lab的广泛的计算机分析已识别出一 真核前导序列样序列和理论上的切割位点、3个十四烷基化序列位点、 一个弱的锚膜域(MAD I)和一个强的锚膜域(MAD II)(图2)。[(在HAAH 序列中，有58个(理论上的)氨基酸，接着是一同源于Lab蛋白编码序 列的序列和一另外的、所述/W序列3'端的445个氨基酸。)]当Lab作为融合蛋白在细菌GST融合表达系统 (pGEMEX-2TXAmereham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey, 08854, USA)中表达并经受使用抗体MCA 44-3A6的蛋白质印 迹分析时，所产生的印迹证明表达的j皮切割的融合蛋白具有和A549细胞中检测到的蛋白一样的相对迁移率。所推断的Lab的分子量为 28.8千道尔顿，且在蛋白质印迹上，它具有和由A549细胞表达的类 型相等的相对迁移率(表观相对迁移率=40千道尔顿)。除了前导序列 和最强的锚膜域(MAD II)外，52个谷氨酸残基和27个天冬氨酸残基(合 起来一共79个残基)几乎遍及该蛋白而均匀分布(总共255个氨基酸， 无前导序列则为228个)。这些资料使人联想到Lab在SDS凝胶中不规 则的迁移。不同于A549的细胞系(例如腺癌DU-145, ATCC#HTB-81; ZR-75-1, ATCC #CRL-1504等等)具有一种用分子量和Lab —样的抗原 检测到的抗原。当用蛋白质印迹探测Lab时，既没有记录到85-90千 道尔顿的分子量种类，也没有记录到52和56千道尔顿的分子量种类。用抗体MCA 44-3A6进行表4立作图和Lab的疫苗可行性:用聚合 酶链式反应和GST融合蛋白系统，构建了该蛋白编码区的亚克隆，并 将MCA 44-3A6的结合通过表位作图定为至代表Lab的117-122号氨 基酸的六个氨基酸(PTGEPQ) ("P"肽)上。为了确定该表位，将整个编 码区分成多个小区，设计聚合酶链式反应引物来扩增各小区，并克隆 聚合酶链式反应的产物，通过用抗体MCA44-3A6的蛋白质印迹分析， 检验该聚合酶链式反应产物随后的表达。然后，进一步细分显示阳性蛋白质印迹结果的DNA片段。制备 出聚合酶链式反应产物并将其克隆、表达，通过蛋白质印迹进行检验。 以这种方式，既从5，末端，又从3'末端制造构成物，并在每一轮减小 氨基酸数的间隔。这导致显示出最后一轮与前一轮一个氨基酸的差异 (在两个方向上)，使得人们能推断MCA 44-3A6的准确结合位点。这 显示至少这六个氨基酸暴露到细胞外表面上。为了进一步证明这点， 克隆了仅编码这六个氨基酸的DNA，且通过蛋白质印迹分析，该融合 蛋白为阳性的。可用MCA44-3A6特异性地检测合成制备的"P"肽。且 在5只试验的小鼠中，该合成肽在5只鼠中具有为免疫原性。用计算 机辅助分析(GCG程序)(Genetics Computer Group, Madison, WI 53703) 的计算机分析/才莫拟，也预示该表位会是极具免疫原性。16疫苗的制备:疫苗为抗原制剂，它一^皮给予宿主，就导致该宿主 产生对该抗原的抗体。该宿主的反应导致该宿主对该疫苗针对的疾病 是免疫的。因此，疫苗处理预防疾病的临床表现，而不会暴露宿主于 致病因子。Lab具有优选的癌疫苗的所有特性。该/a6基因被看来象腺 癌的肿瘤频繁地表达；并被表达在该细胞的外表；在一特定的癌中， 该基因被所有细胞表达；且一直被这些癌细胞表达；并且正常细 胞不常表达该基因。通过运用分子克隆技术的许多方法可生产Lab 蛋白(肽)，并能大量地生产；因而使其成为用作疫苗的实用抗原。在 纯化了该Lab蛋白使得它适合于注射到人体中后，经皮内、皮下或通 过其他途径将其给予个体，以便激发免疫系统产生抗该蛋白(肽)的抗 体。分子模型和计算机辅助分析的GCG程序(Genetics Crystal Group, Madison, WI 53703)的运用，使4寻筌定出 一个分子中略大于一个表位 (蛋白的六至七个氨基酸)的、预期存在于蛋白分子表面的各小部分。 另外，可确定特定序列的疏水性程度或亲水性程度以及该序列在动物 中的免疫原性如何(Genetics Crystal Group, Madison, WI 53703)。在确定 哪一些序列符合这些标准后，合成制备这些肽，或用若干标准方法生 产这些肽。然后，，可配制这些肽的一种或更多种以作为疫苗使用， 并如上略述作为疫苗给予宿主。一种疫苗，它包含具有一tt酸序列选自图1的cDNA编码的序列、 该cDNA编码的图2的序列、肽APPEDNPVED (SEQ ID NO: 6) EEQQEWPDT (SEQ ID NO: 7)、 DGPTGEPQQE (SEQ ID NO: 8)和 EQENPDSSEPV (SEQ ID NO: 9)、以及任何其片段或其组合的一种分子。可以一种特定的疫苗给予宿主一次，或可以给予多次。为了使某 些病人识别一特定的疫苗，也可能必需一佐剂和所述肽一起给予。佐 剂是力口强免疫准备状态和帮助宿主从没有可检测出的血清抗体转变成 有^f艮高效价的血清抗体的非特异性免疫刺激剂。正是这种高水平(效价) 的抗体有效地保护该宿主，使其不患所述抗体针对的疾病或病征。功能的研究:对于了解Lab的细胞功能的研究是细胞定位/特征 鉴定研究的延伸(Siddique等，1992)。着手研究对于细胞外暴露于不 同阳离子(Ca^、 MgW、 OT和Fe"^)反应的Lab水平变化。在A549细 胞中的丄W表达仅受Ca^调节。用测定胞质Ca^的高度专一的荧光 Fura-2/AM Ca"方法(Molecular Probes Inc., Eugene, OR 97402), i正明 了 1)在A549细胞中的内部CaW浓度比在QU-DB细胞中的高一些， 以及2) A549细胞系对不同的外部Ca^水平有反应(Siddique等，1992)。 由于pH能调节细胞内游离Ca—水平，因而外部的pH操作应该导致 Lab表达水平的变化。细胞外pH的变化(在存在正常Ca^浓度的情况 下)导致l)细胞内pH的平行变化，该pH用SNARF-1 AM/FACS测量， (Molecular Probes Inc., Eugene, OR 97402); 2) Lab的转录物水平增加 (当通过RNA印迹与GAPDH表达相比时)；以及3) Lab蛋白也增力口(用 蛋白质/狭线印迹分析)。A549细月包的细胞内pH的变化(由于外部变化 引起的)与报道的正常细胞的相应变化是相同的。所增加的的表达 也不是由于细胞的死亡(这一点通过MTT分析测定)(Siddique等， 1992)。另外，重组Lab在不同pH溶液中的温育不改变免疫反应性。 初步的资料提示当用在减少了的Ca^中生长的A549细胞进行这些 实验时，则减弱/a6的诱导表达。在细胞样品中诊断癌细胞的方法用来自 一被试者的生物学样 品，来确定是否有癌细胞存在于该被试者体中。合适样品的实例包括 血液和活组织检查材料。 一种诊断方法是将来自样品中细胞的DNA, 暴露于一标记的、在严格条件下能与该/W基因或其片段杂交的探针， 所述严格条件例如6xssc; 0.05 x blotto; 50%甲酰胺；42°C (Sambrook 等，1990)。当然，根据生物学样品的性质、癌的类型、制备探针的方 法和组织制备的方法，可改变杂交条件以达到最佳灵敏度和特异性。在将该样品与该探针接触后，下一步则是确定该探针是否已和来 自该样品的DNA的核苦酸序列杂交，从该结果推断基因的存在； 所述存在就可诊断为癌症。另 一种诊断方法是获得优选标记的单克隆抗体，所述抗体或者是已经存在的抗体，或者是针对本发明各方面抗原肽的新抗体；并将一 样品与这些标记的单克隆抗体接触以检测Lab抗原。这些单克隆抗体 可用于开发检测Lab抗原的非常专一的分析，并允许以许多不同的形 式进行试验，从而导致在科学和医学方面的更广泛应用。因为本发明描述一种在肿瘤表面表达的、先前没有报道的新基 因，所以本发明是有用的。该基因不是组织特异的，因此将允许无论 胂瘤出现在任种器官均可检测肿瘤。同样地，用该基因生产一种对这 些肿瘤的疫苗，将有非常广泛的用途。诊断试验也将有这种广泛的组 织用途，从而使得可检测Lab〃W;所述1^1)//^即癌的"泛标记"， 特别是对于先前已经指出的腺癌。引用的文献Albino, AP, Graf, LH, Kontor, RRS等，DNA介导的人黑素瘤细胞 表面糖蛋白gpl30的转移通过E玫瑰花试验鉴定转染子Mol. 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ttctacactgaagattttcttcttatttaatgtggtttattttgggctc1904gctctgttgaaaataatcctttgtcagaaaagaaggtagctaccacatca1964ttttgaaaggaccatgagcaaagccataagaagtggtttgatcgatst3t2024taggggtsgctcttgstt.ttgttaacattaagataaggtgsctttttccccctgctttts2084caaagatacttctstatttttatcactatagatcatsgttattatacaat2144gtagtgagtcctgcatgggt3ctcgstgtgtaatgaaacc2204aagaasagcaataat.tttctsaagctgtgctgtcggtgattactcawtt2264tcttcattttgaagctacttcatatttttt2324tsgggaasctaaggagtgacatagsactgatgaatgagtaaaagtsagttttgctggatt2384tttgtagaactctggacgttgaggattcattatgctgtggttaactttaastattttt2"2<2I0>2 <211>255 <212> PRT <213>迷路蛋白<400> 2 Met Vallie Ala Leu Leu Gly Val Trp Thr Ser Val Ala 5 10Val Val 15Phe Asp LeviAsp Ala Asp 35Leu Gly Leu 5020 GlyLysAsp Asp GluTyr G丄yGlu Glu Val Leu Gly Lys 25Asp Phe Asp Val Asp Asp 40Ala 。5Trp Tyr Lys Vai LeuGly lie 30Ser Thr Ser Glu Pro Ala Val Pro Pro Glu 55 60Glu 65Ala Glu Pro H丄s Thr Glu Pro Glu Glu Gin Val Pro Val Glu7075Glu Pro Gin Asn lie Glu Asp Glu Ala Lys Giu Gin lie8590Leu His Glu Met Val His Ala Glu His 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Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val Met Arg Ser Leu 20 25<210> 5 <211>28 <212> PRT <213>肌钓蛋白-C<400> 5Leu Ala Asp Cys Phe Arg Thr Phe Asp Lys Asn Ala Asp Gly Phe lie 15 10 15Asp lie Glu Glu Leu Gly Glu lie Leu Arg Ala Thr 20 25<210> 6 <211> 10 <212> PRT <213>未知<220><223>未知有机体的描述未筌定的肽 <400> 6Ala Pro Pro Glu Asp Asn Pro Val Glu Asp 1 5 ■ 10<210> 7 <211> 10 <2I2>PRT <213>未知<220><223>未知有机体的描述未鉴定的肽 <400> 7Glu Glu Gin Gin Glu Val Pro Pro Asp Thr 1 5 10<210> 8 <211> 10 <212> PRT <213>未知<220><223>未知有机体的描述未鉴定的肽 <400> 8Asp Gly Pro Thr Gly Glu Pro Gin Gin Glu 1 5 10<210>9 <211>11 <212> PRT <213>未知<220><223>未知有机体的描述未鉴定的肽 <400> 9Giu Gin Glu Asn Pro Asp Ser Ser Glu Pro Val 15 10
权利要求
1.具有图1所示核苷酸序列的分离的cDNA分子。
2. 权利要求1的分离的cDNA分子的区段，其中所述区段在所迷 核苷酸序列中从起始密码子(ATG)延伸至终止密码子TAA,并包含765 个碱基对。
3. 足够编码Lab蛋白中可用抗体MCA 44-3A6检测的表位的、分 离的cDNA的区段。
4. 由权利要求1的cDNA区l殳编码的賓^基酸序列。
5. 标记的、在严格条件下能与/W基因或其片段杂交的探针在制 备用于诊断细胞样品中癌细胞的i^断试剂中的用途。
6. 具有氨基酸序列PTGEPQ的分子。
7. —种肽，选自长度在3-20个氨基酸之间的、排列如图2中氨 基酸的所有序列，其中n个氨基酸的序列的第一个氨基酸的位置选自 由位置1到n-3至n-20。
8. 针对肽的抗体，所述肽具有选自权利要求4-7任一项的序列的 氨基酸序列。
9. 权利要求8的抗体，进一步定义为单克隆抗体。
10. 在哺乳动物中产生的抗体，所述抗体针对由权利要求2或3 的DNA分子编码的氨基酸序列或包含一表位的其片段。
11. 衍生权利要求2的cDNA的分离的基因组DNA分子。
12. 包含权利要求2或3的分离的cDNA分子的载体。
13. 载体，包含编码具有根据权利要求4-7任一项的氨基S吏序列 的分子的cDNA分子。
全文摘要
分离了编码称为迷路蛋白(Lab)之蛋白的cDNA分子，并测定了其核苷酸序列。该蛋白、或从该蛋白衍生出的肽，是可用于确定新的癌症种类的标记。对这些癌症的诊断分析使用抗Lab的抗体，或者使用与lab基因或其片段杂交的核苷酸探针。可用于或者防止Lab(或lab)测试阳性的受治疗者癌症复发、或者预防癌症的初始发生的疫苗，使用得自Lab的蛋白或肽。用经过免疫原性分析的Lab表达来监测癌症治疗的效果。将lab的反义分子用于治疗。在患病的正常细胞例如腺细胞中用lab的有义分子恢复失去的lab功能。
文档编号C07H21/04GK101260401SQ200810003148
公开日2008年9月10日 申请日期1999年3月11日 优先权日1998年3月17日
发明者A·拉多舍维奇 詹姆斯 申请人:伊姆瓦尔克斯公司