专利名称：：一种用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及肾移植急性排斥反应早期病人尿液中出现的三种标志物候选蛋白，即a-1抗胰凝乳蛋白酶(alpha-l-antichymotrypsin,AACT)、锌-a2糖蛋白(ChainA，Zn-Alpha-2-Glycoprotein,ZAG)和月中瘤排斥抗原gp96(tumorrejectionantigengp96,也称GRP94)。利用针对上述三种蛋白的特异抗体可以制备肾移植急性排斥反应早期诊断试剂盒，该试剂盒可以用于临床早期诊断肾移植急性排斥反应。
背景技术：
：肾移植急性排斥反应(简称急排)仍然是妨碍移植肾存活率的主要因素，发生急排时的成功救治要求早期诊断并且及时给予充分治疗。通常诊断发生急性排斥反应的指标有患者临床表现、各项生化指标和组织活检。前两项不是绝对可靠的，主要依赖于临床医生的临床经验来判断。血清中肌酐水平的增高通常是诊断移植肾衰竭(allograftdysfunction)的一个非常有效的指标，但这项指标是非特异的，并且不能反映早期肾功能的改变。被认为是诊断肾移植排斥反应的"金标准"是组织活检，但据报道，用组织活检确诊的病人中，只有不到30%被成功挽救。而且组织活检花费大，属创伤性检查常伴随并发症，包括疼痛，血尿，肾血肿，移一直物血纟全症，败血症，休克和移植物衰竭等。近些年诊断肾移植急性排斥反应的发生，一直朝着寻找非侵入性的4企测方向努力。主要有以下方面1、一企查血液中的可溶性粘附分子，细胞因子，尿激酶，纤溶酶原激活受体，淋巴细胞表达的细胞因子，perforin,granzymeB和FAS酉己体；2、才t观'J尿液中的IL—2，沣占附分子，补体C4d,尿激酶，纤溶酶原激活受体；3、其他，包括分析尿液纟田月包中granzymeB，perforin,granulysinandCD103的mRNA的表达水平，还有用免疫组化的方法4企测各种T细胞标志物。然而这些检测方法由于特异性和敏感性等问题而都没有被临床广泛应用。尿液来源简单方便无损伤，病人容易接受，无不适感，没有禁忌症。与组织活一企相比，尿液可以反应肾脏的整体情况，可以更及时准确地反应肾脏的生理状态和功能水平。鉴于以上原因，选择尿液作为寻找排斥反应标志物的研究对象，寻找肾移植患者尿液中蛋白标志物来作为早期诊断急性排斥反应发生的指标，进而研制早期诊断急性排斥反应的试剂盒将会产生极大的市场价值。
发明内容发明人经过大量的实验研究发现，肾移植急性排斥反应病人在急性排斥反应期间尿液中会出现一些特异性蛋白，而且还出现特征性的量的变化。在急性排斥反应期间有些蛋白含量出现先升高，再降低，或者先降低，然后逐渐恢复到最初水平，有这种变化趋势的蛋白，可能对排斥反应过程的监测是有意义的。发明人通过实验发现，oc-l抗胰凝乳蛋白酶(AACT)，锌-a2糖蛋白(ZAG)和肺瘤排斥抗原gp96(GRP94)在肾移植急性排斥反应过程中呈现出上述趋势。鉴于以上原因，发明人不仅通过实验验证了上述蛋白作为肾移植急性排斥反应患者尿液中的蛋白标志物的可行性，而且利用这些蛋白标志物进一步开发用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒。a-1抗胰凝乳蛋白酶(AACT)属于serpin超家族，是存在于人血清中的一个糖蛋白。它可以在体内抑制胰凝乳蛋白酶样的蛋白酶和体内的细胞毒性T淋巴细胞活性，这个蛋白具有调控免疫和炎症过程的活性，还可作为胂瘤标志物。锌-cx2糖蛋白(Zn-Alpha-2-Glycoprotein,ZAG),在氨基酸序列和结构域上与MHC抗原密切相关，与组织相容性1类抗原有着高度的序列同源性。有证据显示这个蛋白属于免疫球蛋白基因超家族。锌-a2糖蛋白可能是被剪切后的分泌性MHC相关分子，并且可能在免疫应答过程中发挥作用。肺瘤排斥抗原gp96也称GRP94是热休克蛋白(HSP)家族成员，具有抗原处理和递呈的功能，它可结合其他新生或异常蛋白质分子，起着分子伴侣作用。本发明的目的是提供一种用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒,使用该试剂盒能够特异识别肾移植急性排斥反应早期出现的蛋白标志物，因此可以用来跟踪肾移植术后病人的进展，并能够早期诊断肾移植急性排斥反应。本发明的另一目的是提供上述蛋白标志物在制备用于肾移植急性排斥反应早期诊断的特异抗体的用途，利用其特异抗体可以制备用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒。本发明的技术方案如下一种用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒，包含至少一种检测试剂和捕捉试剂，所述捕捉试剂能够特异识别a-1抗胰凝乳蛋白酶和/或锌-oc2糖蛋白。上述用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒还可以含有特异识别肿瘤排斥抗原gp96的捕捉试剂。上述捕捉试剂优选单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体或抗体片段等特异抗体，所述特异抗体可以针对a-l抗胰凝乳蛋白酶和/或锌-cc2糖蛋白，也可以是针对a-1抗月夷凝乳蛋白酶、《辛-a2^f唐蛋白和肿瘤排斥抗原gp96。上述抗体可通过商业途径获得，还可以通过抗体制备的常规方法来完成，如通过重组方法制备的杭体，如噬菌体展示抗体，从转基因动物(如小鼠)中分离的抗体，用转入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体。此外，也可以通过表达和纯化上述人源的标志物蛋白，用其免疫动物以获得免疫血清，再用常规的方法纯化血清中的抗体而获得。上述捕捉试剂还可以是能够和a-l抗胰凝乳蛋白酶、锌-a2糖蛋白和/或肿瘤排斥抗原gp96特异识别的其它化学试剂，应该说这些化学试剂能够通过生化反应特异识别上述标志物蛋白，而不限于抗原4元体i口、别方式。上述4企测试剂包含可4全测的标记成份，所述标记成^f分包括酶，辅基，荧光物质，发光物质，生物发光物质、放射活性物质中的一种。通过上述可4企测的标记物成份可以定性或定量测定样品中的标志物蛋白。如上所述，酶可以是辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，beta-半乳糖酶或乙酰胆碱醋酶；辅基的例子包括链霉菌抗生物素蛋白/生物素蛋白和抗生物素蛋白/生物素蛋白；荧光物质的例子包括伞形酮，荧光素，荧光素异硫氰酸醋，若丹明，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括发光氨，生物发光物质的例子包括但不限于荧光素酶，荧光素和水母发光蛋白；放射活性物质包括1251，35S,14C,3H，或Mg52。上述才全测试剂可以和捕捉试剂分装，也可以和捕捉试剂偶联。本发明的纟企测样品为肾移植术后病人的尿液；上述冲全测试剂盒还含有必要的检测所需的稀释试剂或緩冲试剂。制备本发明检测试剂盒，可以通过市场商业途径获得试剂盒中的捕捉试剂、检测试剂和必要的稀释緩冲液，其中本发明的实施例中的捕捉试剂采用的是商业来源的特异抗体，当然也可以按常规抗体制备的方法制备得到。上述试剂盒的各组分只需常规使用，无需特别操作，可以按照各组成试剂使用说明来进行或按照常规实验方法操作，本领域技术人员能够结合样品的特点正确使用^f企测试剂盒。上述标志物蛋白的识别检测载体不限于试剂盒的方式，其它检测载体如蛋白芯片、检测试纸等也可以被用来检测上述蛋白标志物。上述标志物蛋白具有制备用于肾移植急性排斥反应用作早期诊断的特异抗体的用途，利用其特异抗体可以制备用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒、蛋白芯片或检观'J试纸等检测产品。本发明的检测试剂盒是利用生物化学试验来分析肾移植术后病人早期尿液中的特异蛋白标志物，达到早期诊断肾移植急性排斥反应的目的，检测方法独特，特异性高，因此具有极大的市场前景。图1为肾移植病人发生急性排斥反应的三个阶段，图中l指反应的第一阶段-7至-l天，2指反应的第二阶段0至13天，3指反应的第三阶段14至21天。图2为CQ病人急性排斥反应前、中、后三期尿液2-DE图谱。CQ(-7),CQ(-2)，CQ(-l)代表CQ患者发生急性排斥反应前7天，前2天和前1天，CQ6,CQ13,CQ20分别代表发CQ患者生急性排斥反应后第7天，第14天和第21天。箭头所指的是鉴定出的16个蛋白点，其中用小方框标记的分别为AACT(左上方框)、ZAG(左下方框)和GRP94(右上方框)三种蛋白。图3为LYX病人急性排斥反应前、中、后三期尿液2-DE图谱。LYX(-7),LYX(-2),LYX(-1)代表LYX患者发生急性排斥反应前7天，前2天和前1天，LYX6,LYX13,LYX20分别代表LYX患者发生急性排斥反应后第7天，第14天和第21天。箭头所指的是鉴定出的16个蛋白点，其中用小方框标记的分别为AACT(左上方框)、ZAG(左下方框)和GRP94(右上方框)三种蛋白。图4为AACT蛋白光密度变化趋势。根据急性排斥反应三期，利用PDQuest软件分析各蛋白点光密度在2-DE图中的累积光密度百分比而绘制的变化趋势图。图5为GRP94蛋白光密度变化趋势。根据急性排斥反应三期，利用PDQuest软件分析各蛋白点光密度在2-DE图中的累积光密度百分比而绘制的变化趋势图。图6为ZAG蛋白光密度变化趋势。根据急性排斥反应三期，利用PDQuest软件分析各蛋白点光密度在2-DE图中的累积光密度百分比而绘制的变化趋势图。图7为利用本发明检测试剂盒检测AACT蛋白。图8为利用本发明检测试剂盒^r测ZAG蛋白。图9为利用本发明冲全测试剂盒冲全测GRP94蛋白。图10为AACT、ZAG和GRP94三种蛋白在肾移;险急性排斥反应三个阶段根据试剂盒检测结果绘制的光密度百分比柱形图。具体实施方式为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及有益效果，以下结合附图及较佳实施例，详细说明肾移植急性排斥反应病人尿液中出现的特异标志物蛋白，以及应用免疫化学方法识别标志物的实验结果，从而更好的解释本发明提出的用于肾移植早期病人的样本中的蛋白标记物识别的检测试剂盒的技术方案。下面通过实验说明选择尿液作为寻找排斥反应标志物的研究对象，寻找肾移植患者尿液中蛋白标志物来作为早期诊断急性排斥反应发生的指标。一、实验方法1、病例筛选与重庆市新桥医院肾移植中心和重庆市西南医院肾脏科合作，留取病人肾移植术后尿液标本。入选标准移植病人术后的治疗方案一样，术后3天曱强龙+环磷酰氨，第二天下午或第三天当患者肌肝水平达到300以下、根据胃肠道功能情况给予CsA环孢素(赛斯平)+骁悉胶嚢+强的松(pred)。当病人发生急性排斥反应时用曱强龙冲击3-5天，如果激素沖击无效后，用ATG治疗一个周期。临床表现突有高烧，寒战，全身不适，烦躁，移植肾处胀痛，伤口渗液或腹腔引流液增多，尿量锐减或有血尿；实-验室检查血清肌酐急剧升高超过原有水平30%,彩超检查提示移植肾血管阻力升高、锥体长大，并排除梗阻、血管栓塞等外科并发症；用大剂量曱强龙O.5-1.Og/d冲击治疗症状緩解；移植肾穿刺活检证实为急性排斥反应。如图1所示本实验以确诊病人发生急性排斥反应当天为0天，分为三个阶段第一阶段发生急排前的7天；第二阶段发生急排当天即0天到第13天；第三阶段第14天到第21天。2、标本收集从肾移植病人术后第一天开始，每天上午8:00收集肾移植病人中段尿20-30ml，4'C条件下，3000rpm/min离心20分钟，留取上清液，-80。C保存。4个月内共收集了17例病人超过450份标本，根据入选标准乂人中筛选了2例共22份标本。3、尿液的处理本实验抽取第一阶段(7天)、，第二阶段第6、13天和第三阶段第19，20,21天的尿液作为实—睑标本。从-80。C取出标本，置于4。C融化，取20ml超速离心2h(4。C，200,000g)，去沉淀，上清用等体积丙酮沉淀过夜，沉淀物经15000rpm/min离心30min(4°C)，丙酮沉淀并重复上述过程2次，留取沉淀加500ulIPGLysisBuffer(7Murea(ICNBiomedicals,USA),2Mthiourea(Fluka),2%CHAPS(Sigma),0.4%DTT(Sigam),0.5%Pharmalyte3-10(AmershmBiosciences,catNO.17-0456-01)and0.5%Pharmalyte6-11(AmershamBiosciences,catNO.17-6001-78)4。C4展摇过^^。4、2D-PAGE电泳分析将4展摇过4复的样本经3000rpm/min离心10min(4°C),Bradford法蛋白定量。.各蛋白样品都用固化PH胶条(18cm,linear,PH4-7，BioRad)进行分析。200ug蛋白样品在重泡胀液(7M/Lurea(ICNBiomedicals,USA)，2mol/Lthiourea(ICNBiomedicals,USA),4。/。CHAPS(Sigma)，30mmol/LDTT,0.5%IPGLysisBuffer,痕量溴酚蓝)中重悬，被动水化过夜(12-16h)。之后进行双向电泳(一向IEF;二向12%SDS-PAGE电泳)，才艮据Bio-Rad双向电泳实—睑指南进4亍。EquilibrationbufferI(6Murea,2%SDS(Serva)，30%Glycerol(Sigma)，50mMTris-HCl(Sigma)pH8.8,1%DTT(Sigma)。EquilibrationbufferII(4%SDS(Serva),10%v/vp-mercapthoethanol，23%v/vGlycerol,24%v/vTrisbuffer(76.7gTris-Base(Sigma)and1.6gtris-Base(Sigma)。Runningbuffer:0.67%Trisbase(Sigma),1.44%glycine(Sigma),0.1%SDS(Serva).Polyacrylamidegels:(30%Acrylamide(GenomicSolution),0.15%BisN,N'-Methylene-bis-acrylamide(BioRad),14.532%Trisbase(Sigma),4.725%TrisHC1(Sigma),pH=8.8buffer,TEMED(BioRad),10%solutionofammoniumpersulphate(BioRad))。用SyproRuby(MolecularProbes,Oregon,USA)染色，然后进行图像扫描，PDQest7.20图像分析较件分析、寻找差异点。5、蛋白质鉴定(MALDI-TOF-TOF和数据库检索)使用MALDI-TOF-TOF质谱仪分析。筒而言之，先对感兴趣的蛋白质点进4亍月交内月夷酶消"f匕(TrypsinorLysin—Csolution:50mM腿HC03，5mMCaC12and12.5ng/ju1ofTrypsinorLysin-Cat4°C).,然后用MALDI-TOF-TOF获得肽指紋图i普(PeptideMassFingerprint,PMF),这些数据用MASCOTMS/MSion在NCBI数据库枱，索(http://www.matrixscience.com)。检索参数用mammals,trypsindigestion,oxidationofmethioninespossible,onemissedcleavageallowed,noproteinmassandpirestrictions,peptidesmass.tolerance:±50—70ppm，peptidecharge:+1,Monoisotopic.当MascotScore具有统计学意义(p<0.05)时认为该蛋白获得鉴定。6、检测试剂盒分析验证为了验证本发明中筛选的3个标志物蛋白，随机挑选2例急性排斥反应病人(Z和D)，2例稳定移植(W2和W3),肝胆科术后2例(G2和G3)和2例正常人尿液标本T和J。尿样处理同前，将处理好的尿蛋白，用Bradford法蛋白定量后，将蛋白浓度调成一致。10%SDS-PAGE分离，然后将胶上的蛋白转印到聚偏二氟乙烯PVDF膜(美国Milipore公司)。然后用5%的脱脂牛奶封闭过夜。用作本发明的检测试剂盒中的捕捉试剂采用兔抗-AACT(SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC.)，兔抗-ZAG(SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC.)和兔抗-GRP94(CHEMIC0NInternational,Inc.)。才要照抗体使用说明进行抗体稀释，加入上述抗体后室温孵育一'卜时，TBST洗4次每次15分钟。用作本发明的检测试剂是辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG-HRP(SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC.),用SANTA公司显色液在凝胶成像仪中曝光成像。二、实验结果1、急性排斥反应前、中、后三期尿液2-DE图语。如图2和图3所示，经PDQest7.20图像分析软件分析，筛选了50个差异点，鉴定了的16个蛋白点。CQ(-7)~CQ21、LYX(-7)~LYX21分别是两个病人在急性排斥反应3期的尿液2-DE图谱。CQ、LYX为病人代号，CQ(-7)、LYX(-7)代表确诊发生急性排斥反应前7天，CQl、LYX1代表确诊发生急性排斥反应第一天，依次类推。其中用小方框标记的分别为AACT(左上方框)、ZAG(左下方框)和GRP94(右上方框)三种蛋白。2、质谱及数据库检索根据PDQuest分析结果，样品中的同一蛋白点存在2倍以上的光密度差异.则视为具有表达量的差异(p〈0.01)。本实验筛选了50个差异点，鉴定出了16个蛋白点，分属13个蛋白(见表l)。根据蛋白功能检索，从中筛选出AACT、ZAG和GRP94共3个蛋白，并绘制其在急性排斥反应三期图语中光密度的变化趋势图，见图4,5,6。本实验显示，表1中105#蛋白alpha+antichymotrypsin(AACT)oc-l抗胰凝乳蛋白酶在急排前、中、后三个阶段中的含量在总体上逐渐降低(见图4),到第二阶段的7天左右即临床确诊前一天，在2-DE图中几乎消失(如图2,图3),从中我们可以看出在急性排斥反应发生早期这个蛋白的含量已经发生升高，随着抗排斥反应药物的应用，这个蛋白的含量逐渐降低。本实验显示，表1中285#蛋白锌-cc2糖蛋白(Zn-Alpha-2-Glycoprotein,ZAG)在排斥反应过程中，总体上表现为先升高后降低的趋势，在第14天达到最高，之后逐渐降低(见图6)。本实验显示，表1中154#蛋白t翻rrejectionantigengp96也称GRP94在发生急排前7天逐渐升高，在临床确诊治疗后，逐渐降低。3、检测试剂盒验证结果;险测试剂盒—验证结果显示AACT和ZAG(图7，8,10)这两个蛋白只在肾移植术后发生急性排斥反应的病人尿液中出现，并且在发生急排第一阶段(D-5，D-3)和第二阶段(D3,D9)含量明显高于第三阶段(D21)和其他组(W2，G3,T),而稳定移植(W2，W3)、肝肠吻合术(G3)后和正常人(T)这2个蛋白几乎没有出现。GRP94(图9，IO)这个蛋白在4组人群中都有出现，在急排病人第二阶段含量明显高于第一，第三阶段和其他组，该蛋白虽然特异性不强，但其在急性排斥反应期间的含量变化明显，其出现具有辅助诊断的意义。根据本实验结果，肾移植急性排斥反应的3个阶段，即急性排斥反应前期、发生期和恢复期，根据AACT和ZAG这两个蛋白的变化趋势和检测试剂盒验证结果，认为这两个蛋白可作为检测急性排斥反应发生的早期检测的标志物蛋白。将针对上述两种蛋白的特异抗体用作捕捉试剂，结合适当的检测试剂可以定性或定量检测这两种标志物蛋白。检测时可以单独使用或将这两个蛋白的特异抗体同时使用，抗体可以和检测试剂偶联使用，以提高检测效率和诊断的特异性。表l差异蛋白质点质谱鉴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>以上所述，仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，因此并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。权利要求1、一种用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒，包含至少一种检测试剂和捕捉试剂，所述捕捉试剂能够特异识别α-1抗胰凝乳蛋白酶和/或锌-α2糖蛋白。2、权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还含有特异识别肺瘤排斥抗原gp96的捕捉试剂。3、权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所述捕捉试剂包含针对oc-l抗胰凝乳蛋白酶和/或锌-a2糖蛋白的特异抗体。4、权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述捕捉试剂包含针对ct-l抗胰凝乳蛋白酶、锌-a2糖蛋白和肿瘤排斥抗原gp96的特异抗体。5、权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述检测试剂包括可检测的标记成份，所述标记成份包括酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质或放射活性物质中的一种。6、权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述检测试剂与捕捉试剂分装或与捕捉试剂偶联。7、权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于应用的检测样品为肾移才直术后病人的尿'液。8、a-1抗胰凝乳蛋白酶、锌-a2糖蛋白和肺瘤排斥抗原gp96在制备用于肾移植急性排斥反应早期诊断的特异抗体的用途。9、权利要求8所述用途，其特征在于所述特异抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体或抗体片段。10、权利要求8所述的用途，其特征在于所述特异抗体的检测载体是试剂盒、蛋白芯片或检测试纸。全文摘要本发明公开了一种用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒，包含至少一种检测试剂和捕捉试剂，所述捕捉试剂能够特异识别α-1抗胰凝乳蛋白酶和/或锌-α2糖蛋白。本发明的检测试剂盒是利用生物化学试验来分析肾移植术后病人早期尿液中的特异蛋白标志物，达到早期诊断肾移植急性排斥反应的目的，检测方法独特，特异性高，具有极大的市场前景。文档编号C07K16/18GK101251539SQ200810006268公开日2008年8月27日申请日期2008年2月4日优先权日2008年2月4日发明者军吴,罗高兴,贺伟峰,贾雄飞申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院