专利名称：一种分离纯化糖肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离纯化糖肽的方法，尤 及一种用磁性微粒分离纯化糖肽的方法。
背景技术：
蛋白质的糖基化傲布是最常见、最重要的蛋白质翻译后傲布之一，目前已知哺乳动 物中一半以上的蛋白质是发生糖基化的。糖基f树蛋白质的结构和功會,重要的作用， 蛋白质糖基化的程 1^连结构的异常变化常常是癌症及其他疾病发生的标志。
蛋白质糖謝七禾號和糖基化位点的变化可Mil糖謝七多肽(糖肽)的z变4fc^测出来。 近几年，分离纯化MMf品中糖肽的方法主^^^素法和月射七学法。M^样品如血清 以及细鹏莫总蛋白等。
凑據素法是先用 M素提取分离纯化样品中的糖蛋白，结合双向电泳分离，再酶解
驢接酶解后再 細 驗素提取糖肽，之后质谱鉴定。该方法的主要缺点是》驗素本 身的特异性结^寺性^t自羊品分离纯化的选择性，不同的 素具有结合不同 糖
蛋白的特性，因而单一l^^不能一次提取分离纯化样品中的^ir糖蛋白，m向电泳
工作费时、费力。
月射七学法是用J射七学分离纯化提取糖蛋白，可一次性不选掛也分离纯化几乎所有类
型的糖蛋白膽肽，然后用不同的方 緣次洗脱。比如用糖肽酶(PNGase F)释放N-
糖蛋白/糖肽，M削叙去释放O"糖蛋白膽肽，但该方》去的主要缺点是目前月射七学分
离纯化糖肽时一般4顿的固臓体劍彬嫩交柱，分离速度缓侵，费时、费九有些甚至 还需要离心机^^离设备，其次，鹏1^柱的比表面积较小，所以糖蛋白肝的吸附容 量就较小，样品撤虫反应的机会较小，增大了糖蛋白与鹏MI^柱的偶联时间。
发明内容
本发明的目的在于樹共一种分离纯化糖肽的方法，，其解决了背景技术中月m学方法
分离纯化糖鹏M^，，分离纯化反应时间长的技术问题。 磁性微粒简称磁粒，作为一种新的生物6吁分离纯化的载体，较一隨性载條W^:
的比表面，对蛋白等反isil度快，吸附容量大，磁性分离简對规，巳逐渐应用于细胞、
核酸、蛋白质的分离、亲和层析和鹏寸免疫等生化技术领域。
本发明的技术方案如下
一种分离纯化糖肽的方法，欺mt处在于包括下述步骤
5(1) 制备肼功能化磁粒 3清洗
耳X200毫克环氧化磁粒置于^f瓦中，用水清洗，葡版将蹄悬浮液的M^文至臓 性分离器拙亍磁性分氣去掉上层不含磁粒的清液； b反应働
向^f瓦中加A50新质量分数为5柳勺7jC合肼，将^!瞠于7jC鹏中，向:M瓦中插
入搅拌器，再开启w飄拌使磁粒和水合肼充分混合、腿，将环氧化繊立傲布劍井
功能化磁粒；
(2) 糖肽的分离纯化 a清洗
反应^i^，将肼功能化磁粒用^7K乙醇和水分别清洗，进行磁性分离，去掉上层
不含il粒的清液；再用40S^水重悬，1￡1后将悬液保##用； b糖蛋白氧化
将一定量的蛋白样品溶解^##于偶联缓冲液中，加入高碘勝内至其:ft^浓度10 15 尔，常^显避光反应0.5 1.5小时；
c除高碘,
用G-25除盐柱除掉未反应的歸典勝内； d糖蛋白偶联
将除盐后的蛋白溶液加入到经偶联缓冲液预处aa的肼功能化^f立中，室温振荡偶联
4 24小时，偶联后磁性分离，去上清；用清洗液洗磁粒3 6次，以除去未共价结合的 蛋白；
S酶解得到糖肽
磁粒上的糖蛋白用5毫摩尔pH为7.8的三羧乙 |溶于0.1摩尔的碳 1氨的溶液 中室温还原30 ^H中以上；然后加入碘代乙,安至其最终浓度为8 15 mM，室纖续反 应30射中以上，磁性分离，去上清；用pH为7.8的碳M氨溶液重悬lif立，加入胰蛋 白酶至其最终浓度20毫弥升，37。C振荡酶解4小时，补加相同量的胰蛋白酶，继续酶 解10小时以上；
f清洗
磁粒用2摩尔/升氯化钠溶液和^7K乙醇先分别清洗，再用pH为7.8的0.1摩效
升碳,氨溶液洗，直至非糖基化多肽完全去除；
G释放糖肽
用pH为7.8的0.1摩尔/升碳M氨溶液重悬i^立，加入0.5微升的糖肽酶F， 37°C 振荡酶解4小时，添加相同量的糖肽酶F，继续反应4小时以上，完^^肽的释放； 一种分离纯化糖肽的方法，欺寺te处在于包括下述步骤
6(1) 制备,功能化磁粒 a清洗
取200毫克羧S^措凝立置于烧瓶中，置于烧瓶中，用水清洗，，加入0.1摩尔pH为4.75 的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液预处理，清洗后将盛有悬浮液的烧并舫夂到磁性分离器上进行 磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液； b反应傲布
向烧瓶中加入50毫升含l克己二酸二酰肼的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液将烧瓶放入 水浴锅中，插入搅拌器，再开启撤半M拌^機謝七磁粒和己二酸二醐井充分混合、搅 拌中加入0.5克碳二亚胺，继续搅拌反陷小时以上，纟^t割七磁樹針布成翻井功能化磁
粒L
(2) 糖肽的分离纯化 a清洗
反应完鹏，将Hi井功能化石縱立用^7jC乙醇、1.5摩尔/升氯化钠溶液和水分别清洗，
磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；再用40毫升水重悬，重悬后将悬液保絲两。这
里一船新妇次效果即可，水采用不含杂质的超纯7j^者双蒸水效果较佳，常温斜牛下保
存即可，4"C保存效果更佳。 b糖蛋白氧化
将一定量的蛋白样品溶解或稀释于偶联缓冲液中加入高碘勝内至其最终浓度10 15 尔，常温避光反应0.5 1. 5小时； c除高碘,内
用G-25除盐柱除掉未反应的高碘M; d糖蛋白偶联
将除盐后的蛋白溶液加入到经偶联缓冲液预处理过的酉划井功能化磁粒中，室温振荡偶 联4 24小时，偶联后磁性分离，去上清；用清洗液洗^^立3 6次，以除去未共价结合 的蛋白。
6酶解得到糖肽
磁茅M:的糖蛋白用5 tt尔pH为7.8的三羧乙基磷溶于0.1摩尔的碳MS氨的溶液 中室温还原20 ^H中以上；然后加入碘代乙翻安至其最终^l度为8 15 尔，室温继 续反应30力H中以上，磁性分离，去上清；用pH为7.8的碳lMM溶M^悬Mf立，加入 胰蛋白酶至其最终浓度20毫弥升，37'C振荡酶解4小时，补加相同量的胰蛋白酶，继
续酶解10小时以上；
f清洗
磁粒用2摩尔/升氯化钠和3foK乙醇先分别清洗，再用pH为7.8的0.1摩尔/升碳酸 氢氨溶液洗，赶非糖基化多肽完全去除；G释放糖肽
用pH为7.8的0.1摩尔/升碳^S氨溶液重悬磁粒，加入0.5微升的糖肽酶F， 37°C 振荡酶解4小时，添加相同量的糖肽酶F，继续反应4小时以上，完^H肽的释放； 战(2)分离纯化步歡前可包括
1) 定量出悬徵糊井功能化磁粒的^* 船ml悬液烘干后，称重，计算悬液中的肼功能化磁粒含量；
2) 测定肼功能化磁^_^ 团的^
将O.l毫升质量分数为80%的水合1將、别用水做不同倍 #，作为标准11#品； 将0.01毫升各浓度标准月勝品、0.05毫娜磁粒、0.05毫克环氧化繊立，后二者体
积均为0.01毫升，与0.2 S^双辛可宁酸工作试剂混合，37°。振荡反应0.5小时，磁性
分离；
以双辛可宁酸工作试剂作空白，紫外可见分光光度计测各管中上清562纳米处吸光 值；乡雜朋淋示准曲线作参考，用肼磁粒和环氧M^立与双辛可宁膨式剂反应后上清的 562纳米处吸光值^计算磁米4±月瞎团含量。 擅(2)分离纯化步歡前还可包括
1) 定量出悬浮液醐井功能化離的賴
啦ml悬液烘干后，称重，计算悬液中的,井功能化磁粒賴；
2) 测定翻井功能化磁米4±, 团的含量
将己二酸二醐井分别用7jC做不同倍i^f華，作为标准S^解品；
将O.Ol毫升各浓度标准酉划井样品及0.05毫克醐井磁粒、0.05毫克羧割七a^，后二
者体积均为0.01毫升，与0.2毫升双辛可宁酸工作试剂混合，37°C振荡反应0.5小时，
磁性分离；
以双辛可宁酸工作试剂作空白，紫夕阿见分光^^计测各管中上清562纳米处吸光 值；^f明淋示准曲线作参考，用肼磁粒和环氧i^立与双辛可宁酸工作试剂反应后上 清的562纳米处吸光值之差计算磁fiJl月^S^4。
，偶联缓冲液是指pH为5.5的IOO，欲升醋M和150，尔/升氯化钠的溶液。 i^清洗液是指pH为8.3的8摩尔尿素和0.4摩尔碳^a氨的的溶液。 她JC为超船K^双蒸水。 上述磁性分离均在磁性分离器上分离。
本发明具有如下优点
本发明禾,磁粒分离的简单'l^I特点和月m学特异傲布氧化糖的特性，用7jC合鹏針布 环氧化磁粒制得肼功能化1^立，鄉2-(1\1-吗啉)乙磺謝斷 ^七磁粒，制得S^井功能 化磁粒，再分离纯化糖肽，优化了糖蛋白与肼功能化磁茅域的,井功能化繊立偶联斜牛， 分离纯化反应腿、高效。
8图1为本发明水合鹏針布环氧磁拉的结构示意图。
图2己二酸二醐射封f^基化i^立的结构示意图。 图3a为本发明月射七磁粒提取分离纯化糖蛋白的原理。 图3b为本发明朋化^f立提取分离纯化糖蛋白的流程示意图。 图4为本发明采用BCA方法测定肼含量的标准曲线图。 图5为本发明检测1^立量与偶S^率的示意图。 图6为本发明检测在不同温度、时间斜牛下偶軟效率的示意图。 图7为本发明检验三种蛋白与鹏七磁粒偶联瞎况的对照表。 图8为本发明SDS-PAGE电泳检测S射七磁粒提取混合样品特异性的考染图。 图9为本发明RNaseBll月;UI谱图。 具体实魴式
本发明禾,磁粒分离的简单快速特点和月射七学特异斷布氧化糖的特性，用水合月射參 饰环氧化磁粒，审勝肼功能化磁粒，优化了糖蛋白与肼功能化磁粒的偶联斜牛。用标准 蛋白验i蹈井功能化ii立提取糖蛋白的效果，经基质辅助激^A军吸飞行时间质谱
(MALDI-TOF-MS)鉴定出了目的多肽，飽正了肼功能化^^立用于复杂样品中糖蛋白和 糖基化位点的鉴定的可行性。 i微用仪器
陕西北美基因股份有限公司的磁性分离器；上海智城分析仪器制造有限公司的 ZHWY-2101C型叵温i咅养振荡器；G-25除盐柱；美国的紫外可见分光爐计(Aglient); 英国岛津集团克雷托斯分析仪器公司的基质辅助激光解吸飞行时间质谱。
以上^H义器目前市场上都已有出售。 微用试剂
环氧化磁粒(Epoxy-Mag)购自陕西北美基因股份有限公司；羧謝七磁粒购自陕西北 美基因股份有限公司；核糖核酸酉敏(RNase B )、牛胎球蛋白(Fetuin )、双辛可宁酸 (BCA )、碘乙酰胺以及还原剂三羧乙基磷(TCEP)、基质(名称为CHCA的基质)、 牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司的；牛胰蛋白酶(Tiypsin)、糖肽,(PNGase F)均购自美国；2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)购自美国Amresco公司；碳二亚胺(EDC)购 自Pierce公司，己二酸二S^浙ADH)购自日本KaseiKogyo公司；高碘酸钠(NaI04)、醋 酸邻(NaAc)、氯化钠(NaCL)、碳1^氨(NHtHCCb)、甲醇、尿素、无水乙醇以 勿夂合肼等均为中国产通用分蹄屯。i離用水赵敏艾柯膨feK制水系统处理的越ifoK。以上各^H式剂目前市场上也都已有出售。 实施例h
参见图1和图3，分离纯化糖肽的方法
(1)分离纯化糖肽 (1-1)制备肼功能化磁粒
a清洗
聰00毫克环氧化磁粒置于鹏中，用7jC清洗，清洗后将盛有悬浮液的MS文至臓
性分离器，行磁性么、离，去掉上层不含i^立的清液；可以是普M;Jc，倒顿不含杂质
的7]C效果更好，如超纯7XSI双蒸水(两次蒸馏的水)。 b反应(斷布)
向燃瓶中加A50毫升质量分数为5%的水合肼，将烧并隨于水浴锅中，向傲瓶中插 入搅拌器，再开启^對半觀觉拌使磁粒和水合肼充分混合、反陷小时，将环氧化Mf封斷布 i^井功能化ii立；水辦剐邻驢妇(TC-7(rC，反应的时间也可以超逾小时，但是一般 不宜超M24小时。
(1-2)糖肽的分离纯化
a清洗
反应完i^，将肼功能化磁粒用^7jC乙醇和水分别清洗，进行磁性分离，去掉上层
不含磁粒的清液；再用40毫升7R重悬，重悬后将悬液保絲用。这里一股衞妇次即可，
水采用不含杂质的超纯水或者双蒸水效果较佳，悬^S温斜牛下保存即可，但4'C保存时
间更长。
b糖蛋白氧化
将一定量的蛋白样品溶解或稀释于偶联缓冲液中(100mM (毫摩尔/升)NaAc， 150mMNaCl,pH5.5)，加入高碘勝内(NaI04)至其最终浓度10 15mM，常温避光， 0.5 1. 5小时；
C除高碘麟内雨04
用G-25除盐柱除掉未反应的歸典勝内(NaI04 ); d糖蛋白偶联
将除盐后的蛋白溶液加入到经偶联缓冲液预处理过的肼功能化磁粒中，室温振荡偶联 4 24小时，偶联后磁性分离，去上清；用清洗液(8M尿素/0.4MNH4HCQ3， pH8.3)
洗磁粒3 6次，以除去未共价结合的蛋白。 e酶解得到糖肽
磁茅让的糖蛋白用TCEP (5mM三羧乙基磷溶于0.1M的NH^CCB溶液中，pH7.8) 室温还原20倂中以上；然后加入碘代乙醐安至其最终浓度为8 15mM，室^^赵卖反应30女H中以上，磁性分离，去上清；用pH7.8的NH4HC03溶液S1;磁粒，加入胰蛋白酶 至其最终浓度20mg/L， 3TC振荡酶解4h，补加相同量的酶，继续酶解10h以上； f清洗
磁粒用2 mol/L氯化钠(NaCl)和^;K乙醇先分别清洗，再用pH7.8的0.1 mol/L 碳f複氨(NH4HC03)溶液洗，直至一Ni基化多肽完全去除。 一皿化钠(NaCL)和 ^K乙醇先分别清洗3 5次即可完全去除；
6释放糖肽
用pH7.8的0.1 mol/L碳MS氨(NH^COg)溶^M悬^^立，加入0.5微升的糖肽 酶F (PNGaseF) ， 3TC振荡酶解4小时，添加相同酶量，继续反应4小时以上，完成 糖肽的释放；
参见图2和图3，实施例2: (1-1)制备醐井功能化磁粒
a清洗
敏00毫克羧^f七i^立置于^l瓦中，置于 中，用水清洗，，加入0.1摩尔pH4.75 的2-(N-吗啉)乙磺酸(嫌S)缓冲液预处理，清洗后将盛有悬浮液的烧并舫夂至臓性分离 器，行磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；可以是普M7jC，倒顿不含杂质的水效
果更好，如超纟^fokfn双蒸^c (两次蒸馏的水)。
b反应(斷布)
向烧瓶中加入50毫升含l克己二酸二EiKADH)的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓 冲液将Ms:方i(A水浴锅中，插入搅拌器，开启搅拌: #，搅拌中加入0.5克碳二亚胺 (EDC)，继续搅拌反蹈小时以上，^^割七磁樹斷布成酉划射七磁粒。水,的^g保 持在37"效果佳，反应的时间也可以,小时，但是一i!S:不宜^M24小时。 (l画2)糖肽的分离纯化 a清洗
反应完，，将肼功能化磁粒用^7jC乙醇(除杂质)和水分别清洗，进行磁性分离， 去掉上层不含5凝立的清液；再用40毫升水塞悬，重悬后将悬液保存备用。这里^ 凊微
次即可，水采用不含杂质的^^fok或者双蒸水效果较佳，悬M^^^保存即可，但4X:保持
效果更佳。
b糖蛋白氧化
将一定量的蛋白样品溶解或稀释于偶联缓冲液中(100mM NaAc, 150mM NaCl， pH5.5)，加入高碘醱内(NaI04)至其最终浓度10 15mM，常温避光反应0.5 1. 5小 时；
c除高碘勝内雨04
用G-25除盐柱除掉未反应的高碘,(NaI04 );d糖蛋白偶联
将除盐后的蛋白溶液加入到经偶联缓冲液预处理过的醐井功能化^f立中，室温振荡偶
联4 24小时，偶 关后磁性分离，去上清；用清洗液(8 M尿素和0.4 M碳酸氢氨 NH4HC03， pH8.3) f先磁粒3 6次，以除去未共价结合的蛋白。 e酶解得到糖肽
石辦lh的糖蛋白用TCEP (5mM三羧乙WI溶于0.1M的碳^M NH4HC03溶液 中，pH7.8)室温还原20 ^H中以上；然后加入碘代乙S^安至其最终浓度为8 15mM，室 温继续反应30^H中以上，磁性分离，去上清；用pH7.8的碳,氨NH4HC03溶液重悬 磁粒，加入胰蛋白酶至其最终浓度20mg/L， 3rC振荡酶解4h，补加相同量的酶，继续
酶解10h以上；
f清洗
磁粒用2 mol/L氯化钠(NaCL)和^7jC乙醇先分别清洗，再用pH7.8的0.1 mol/L 碳,氨(NH4HC03)溶液洗，赶3^i基化多肽完全去除。 一麟化钠(NaCL)和 无水乙醇先分别清洗3 5次即可完全去除；
g释放糖肽
用pH7.8的0.1 mol/L碳麟氨(NH4HC03)溶縫悬繊立，力口入0.5微升的糖肽 酶F (PNGaseF) ， 3TC振荡酶解4小时，添加相同酶量，继续反应4小时以上，完成 糖肽的释放；
实施例i的(2)分离纯化步mt前还可穿插以下步骤可以定量出肼功能化磁m^i井
基团的^S， #^见图4，具体^^舌
1) 定量出悬徵棚井功能化磁粒的^a
船ml悬液烘干后，称重，计算悬液中的肼功能化磁粒含量；
2) 测定肼功能化磁aill^团的含量
将O.l毫升质量分数为5%的水合1^>别用水做不同倍 #，作为标 H解品； 将0.01毫升各浓度标准肼样品、0.05毫刻井磁粒、0.05毫克环氧化磁粒，后二者体
积均为0.01毫升，与0.2毫升双辛可宁酸工作试剂混合，37°(:振荡反应0.5小时，磁性
分离；
以双辛可宁酸工作试剂作空白，紫外可见分光光度计测各管中上清562纳米处吸光 值；乡魏U月淋示准曲线作参考，用肼磁粒和环氧磁粒与双辛可宁Mi式剂反应后上清的
562纳米处吸光值;t^计算繊让月瞎賴。
实施例2的(2)分离纯化步m^前还可穿插以下步骤可以定量出鹏井功能化磁粒及 酉划tt团的含量，参见图4，具体包括
1) 定量出悬浮液醐井功能化繊立的賴
耳X2ml悬液烘干后，称重，计算悬液中的醐井功能化磁粒含量；
2) 观啶醐井功能化M^Jl月瞎团的賴
将己二酸二酉划斧溶液分别用7^故不同倍 释，作为标准MS射羊品；
12将O.Ol毫升各浓度标准醐井样品及0.05毫克醐井磁粒、0.05毫克羧謝七磁粒，后二 者体积均为0.01毫升，与0.2毫升双辛可宁酸工作试剂混合，3TC振荡反应0.5小时， 磁性分离；
以双辛可宁酸工作试剂作空白，紫外可见分光^i^计测各管中上清562纳米处吸光 值；会魏鹏划淋示准曲线作参考，用醐井Mf立和羧謝七磁粒与双辛可宁酸工作淑阪应后 上清的562纳米处吸光值之差计算^aJl醐tt团含量。
M3ii^方法得至啲糖肽可以鉴定糖蛋白和糖基化位点，具体的方法可参考如下; :
1 Zhang Ii Li XJ, Martin DB， Aebereold R (2003) Nat Biotech 21:660~666;
2 Zhou Y, Aebereold艮Zhang H (2007) Anal Chem 79:5826~5837。 该方法中鉴定糖蛋白和糖Si七位点的效果可参见图7、图8和图9。 肼活化磁粒鉴定糖蛋白及糖割七位点的基本原理
糖蛋白中糖的令階基经高碘酸氧化为《，糖蛋白iWM^月射七^ai的月瞎团 形成稳定的腙键而固定至臓禾Ub 一離割七蛋白M:清洗i^立除去，糖蛋白在^^i:得
到分离纯化；磁粒上的糖蛋白经变性、还原、^S化、胰蛋白^Tiypsin酶切及清洗后， 只留下糖肽在i^J:;磁ai:糖肽可^顿PNGase F和(3-消除^^别释方j[N-连接多肽和0 连接多肽。多月JCffiilLC-MSMS与,库新旬t:浏的方法确定糖蛋白并鉴定糖Sf七位点。 该方法对鉴^N-糖基化位点更加有效，因为N-糖基化总是发生^Asn,上，且拥有一 个N-X-SAT的保守序列(其中X代表除脯氨酸以外的倒可MS酸)，可以作为蛋白糖割七 位点和糖蛋白鉴定的指标；并JN-糖蛋白有可以特异性酶解该糖肽键的PNGaseF，酶解 后Asn变^Asp，造淑目对好量增加0.98，起到质量^HBN-糖^I七位点的作用，从而进 一步增加蛋白糖基化位点鉴定的准确性。
参见图5和图6，本发明得到的肼功能化磁M翻井功能化磁拉，测得每克^*効井 约为濯pmolo室温劍牛下，糖蛋白与肼功能化磁米i^醐井功能化磁粒偶联时间应大于4 小时，鶴克肼功能化磁粒或醐井功能化磁粒可提取分离纯化IO Mmol糖蛋白，提取效率 大于80Q/^。 Mt示准蛋白^i正了其对糖蛋白提取的特异性，并用MALDI—TOF-MS检测 出了目标多肽。
1权利要求
1. 一种分离纯化糖肽的方法，其特征在于包括下述步骤(1)制备肼功能化磁粒a 清洗取200毫克环氧化磁粒置于烧瓶中，用水清洗，清洗后将盛有悬浮液的烧瓶放到磁性分离器上进行磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；b 反应修饰向烧瓶中加入50毫升质量分数为5％的水合肼，将烧瓶置于水浴锅中，向烧瓶中插入搅拌器，再开启搅拌器搅拌使磁粒和水合肼充分混合、反应，将环氧化磁粒修饰成肼功能化磁粒；(2)糖肽的分离纯化a 清洗反应完成后，将肼功能化磁粒用无水乙醇和水分别清洗，进行磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；再用40毫升水重悬，重悬后将悬液保存备用；b 糖蛋白氧化将一定量的蛋白样品溶解或稀释于偶联缓冲液中，加入高碘酸钠至其最终浓度10～15毫摩尔，常温避光反应0.5～1.5小时；c 除高碘酸钠用G-25除盐柱除掉未反应的高碘酸钠；d 糖蛋白偶联将除盐后的蛋白溶液加入到经偶联缓冲液预处理过的肼功能化磁粒中，室温振荡偶联4～24小时，偶联后磁性分离，去上清；用清洗液洗磁粒3～6次，以除去未共价结合的蛋白；e 酶解得到糖肽磁粒上的糖蛋白用5毫摩尔pH为7.8的三羧乙基磷溶于0.1摩尔的碳酸氢氨的溶液中室温还原20分钟以上；然后加入碘代乙酰胺至其最终浓度为8～15mM，室温继续反应30分钟以上，磁性分离，去上清；用pH为7.8的碳酸氢氨溶液重悬磁粒，加入胰蛋白酶至其最终浓度20毫克/升，37℃振荡酶解4小时，补加相同量的胰蛋白酶，继续酶解10小时以上；f 清洗磁粒用2摩尔/升氯化钠和无水乙醇先分别清洗，再用pH为7.8的0.1摩尔/升碳酸氢氨溶液洗，直至非糖基化多肽完全去除；e 释放糖肽用pH为7. 8的0.1摩尔/升碳酸氢氨溶液重悬磁粒，加入0.5微升的糖肽酶F，37℃振荡酶解4小时，添加相同量的糖肽酶F，继续反应4小时以上，完成糖肽的释放。
2. —种分离纯化糖肽的方法，其特征在于包括下述步骤(1) 制备醐井功能化磁粒a清洗鹏00毫克羧Sf七磁粒置于^f瓦中，置于^f玩中，用水清洗，，力口入0.1摩尔pH为4.75 的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液预处理，清洗后将盛有悬浮液的烧)^文到磁性分离器i^行 磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液； b反应微尔向烧瓶中加入50毫升含l克己二酸二酰肼的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液将烧瓶放入 7K浴锅中，插入^#器，开启搅拌^l微半，，對半中加入0.5克碳二鹏安，继续搅拌反陷 小时以上；(2) 糖肽的分离纯化 a清洗反应完^，将酉划井功能化S^立用^7K乙醇、氯化钠溶液和水分别清洗，进行磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；再用40毫升水重悬，重悬后将悬液保^^用。这里一股衞妇次即可，水細不含杂质的超船域者双蒸水效果更佳，悬液常温保存即可，但4。C保存效果更佳。 b糖蛋白氧化将定量的蛋白样品溶解mf希释于偶联缓冲液中加入高碘勝内至其最终浓度10 15 尔，常温避光反应0.5 1. 5小时； c除高碘酸邻用G-25除盐柱除掉未反应的歸典M; d糖蛋白偶联将除盐后的蛋白溶液加入到经偶联缓冲液预处敏的醐井功能化磁粒中，室温振荡偶 联4 24小时，偶联后磁性分离，去上清；用清洗液洗fflt3 6次，以除去未共价结合 的蛋白。e酶解得到糖肽磁米4Jl的糖蛋白用5毫摩尔pH为7.8的三羧乙ffll溶于0.1摩尔的碳MM氨的溶液 中室温还原20 ^H中以上；然后加入碘代乙Sfci安至其最终浓度为8 15 0尔，室溢逢 续反应30 5H中以上，磁性分离，去上清；用pH为7.8的碳隨氨激體悬^f立，加入 胰蛋白酶至其最终浓度20毫弥升，3TC振荡酶解4小时，补加相同量的胰蛋白酶，继 续酶解10小时以上；f清洗石辦立用2摩尔V升氯化钠和^^乙醇先分别清洗，再用pH为7.8的0.1摩尔/升碳酸氢氨溶液洗，旌3離割七多肽完全去除；G释放糖肽用pH为7.8的0.1摩尔/升碳隨氨溶液重悬磁粒，加入0.5微升的糖肽酶F， 37°C 振荡酶解4小时，添加相同量的糖肽酶F，继续反应4小时以上，完^M肽的释放。
3. 根据权利要求1分离纯化糖肽的方法，其特征在于戶腿(2)分离纯化步mt前 还包括1) 定量出悬浮鄉井功能化磁粒的含量 耳X2ml悬液烘干后，称重，计算悬液中的肼功能化磁粒含量；2) 测定肼功能化磁,瞎团的含量将O.l毫升质量分数为80%的水合肼分别用水做不同倍 #，作为标准肼样品； 将0.01毫升各浓度标准肼样品、0.05毫劍井磁粒、0.05毫克环氧化磁粒，后二者体积均为0.01毫升，与0.2新双辛可宁liX作试剂混合，37°C振荡反应0.5小时，磁性分离；以双辛可宁酸工作试剂作空白，紫外可见分光光度计测各管中上清562纳米处吸光 值；会魏朋淋示准曲线作参考，用肼磁粒和环氧磁粒与双辛可宁iti式剂反应后上清的562纳米处吸光值;t^计算磁米MJM团含量。
4. 根据权利要求2分离纯化糖肽的方法，其特征在于戶腿(2)分离纯化步mt 前还包括1) 定量出悬浮液酉划井功能化磁粒的^ft 耳X2ml悬液烘干后，称重，计算悬液中的醐井功能化磁粒含量；2) 测定酉划井功能化^^h酉划tt团的^M将己二酸二翻粉别用水做不同倍M释，作为标准ii井样品；将O.Ol毫升各浓度标准酉划井样品及0.05毫克醐井磁粒、0.05毫克羧割七磁粒，后二者体积均为0.01毫升，与0.2新双辛可宁酸工作试剂混合，3TC振荡反应0.5小时，磁性分离；以双辛可宁酸工作试剂作空白，紫外可见分光光度计测各管中上清562纳米处吸光 值；会魏鹏划射示准曲线作参考，用,井i^立和羧割七磁粒与双辛可宁酸工作试剂反应后上清的562纳米处吸光值;tM计算^^hl^含量。
5. 根据权利要求1 4任一臓分离纯化糖肽的方法，辦征在于鹏禺联缓冲液 是指pH为5.5的100 尔/升醋勝内和150 tt尔/升氯化钠的溶液。
6. 根据权利要求5分离纯化糖肽的方法，其特征在于戶;f^^洗液是指pH为8.3 的8摩尔尿素和0.4摩尔碳,氨的的溶液。
7. 根据权利要求6分离纯化糖肽的方法，辦征在于戶;M7jC为超術J^蒸水。
8. 根据权利要求7分离纯化糖肽的方法，辦征在于臓磁性分离均在磁性分离 器上分离。
全文摘要
本发明一种用磁性微粒分离纯化糖肽的方法。其实现步骤为用水清洗环氧化磁粒置于烧瓶中，将盛有悬浮液的烧瓶放到磁性分离器上进行磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；加入50毫升质量分数为5％的水合肼，将烧瓶置于水浴锅中，向烧瓶中插入搅拌器，充分混合、反应，反应完成后，用无水乙醇和水分别清洗，进行磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；将蛋白样品溶解或稀释于偶联缓冲液中，加入高碘酸钠至其最终浓度，常温避光反应；用G-25除盐柱除掉未反应的高碘酸钠；再用糖蛋白偶联，酶解得到糖肽。本发明优化了糖蛋白与肼功能化磁粒或的酰肼功能化磁粒偶联条件，分离纯化反应快速、高效。
文档编号C07K1/00GK101481402SQ20081001738
公开日2009年7月15日 申请日期2008年1月10日 优先权日2008年1月10日
发明者孙士生, 孙秀璇, 铮 李, 杨刚龙, 婷 王, 邓玮娜, 超 陈 申请人:陕西北美基因股份有限公司