专利名称：人血清白蛋白与人胰岛素c肽的融合蛋白及其制备的制作方法
技术领域：
人血清白蛋白与人胰岛素c肽的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。
背景技术：
人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是血浆中的主要蛋白成分，在血浆中的浓度为40 mg/mL (Phillip P. Minghettis et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 1986 261:6747-6757)，它除了 具有维持血浆渗透压功能外，还能结合内源性和/或外源性配体，包括激素、有毒代谢产物、药物等。通过 结合这些配体,HSA可以调节激素活性、内源性和域外源性物质的毒性和药物的利用度(Ji-SookHaetal.， Biochimica et Biophysica Acta, 20031640:119-128)。 David S. Park等构建的Half HSA(截取HSA的前297个氨 基酸残基)具有野生型HSA相应区类似的二级结构，同时保留了野生型HSA结合甲状腺素和甲状腺素类似物 的能力(David S. Parketal.，IUBMBZz/e, 1999 48:169-174)，细胞中刚翻译出来的人血清白蛋白具有典型 的pre-pro-protein结构，包括18个氨基酸残基的信号肽和6个氨基酸残基前肽的原肽。信号肽和前肽在转运 和分泌的过程中被切除，成熟的HSA由585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa。通 常情况下，HSA为非糖基化蛋白，然而有的突变体中也存在N—连接糖基化(见Uniprot中的protdn ALBU—HUMAN)。 Peters的观点认为进化出大分子蛋白的优点是减小其在内循环时经肾排泄(Peters T. Jr., A/v.iVoto'"Cfe亂，1985 37:161-245)。 HSA的分子量相对较大，在正常情况下，不易被肾小球滤过，其 血浆半衰期在20天左右。
胰岛素C肽(C-P印tide，CP)是胰岛素原分子中连接胰岛素A链与B链的连接肽，由31个氨基酸组成，分子 量为3020Da，是胰岛素原转变为胰岛素过程中的裂解产物，与胰岛素等分子从胰岛j3细胞分泌。胰岛素C 肽通过与细胞膜上G蛋白耦联的受体结合，使C通道开放，激活>^+《+^丁？酶活性和一氧化氮合酶的活 性，扩张血管，增加血流量，改善红细胞变形能力，减少肾小球尿白蛋白的排泄量增加神经传导速率，从 而改善糖尿病患者的肾脏、神经、微血管病变，使胰岛素C肽在糖尿病并发症中的潜在作用价值越来越受 到广泛重视。正常人基础血浆胰岛素C肽水平约为0.4nmol/L，半衰期为20min，这些特性给胰岛素C肽的药 物化进展造成了很大的障碍，研究胰岛素C肽的药物化，首先要改善它的稳定性，提高其生物利用度。为 了克服上述缺点，可以对胰岛素C肽加以修饰，以延长其半衰期。主要方法有做成缓释剂型、利用化学手 段修饰(如用PEG，葡聚糖修饰)、利用基因工程手段将其与其它大分子蛋白融合。本发明将把胰岛素C 肽和HSA进行融合表达，通过研发人胰岛素C肽的长效化技术，改善胰岛素C肽体内药代动力学性状，研发 出一种具有自主知识产权的长效新药。
发明内容
本发明的目的是提供一种人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白的制备方法及产品。本发明的融合 蛋白在保持了人胰岛素C肽的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。
本发明的技术方案人工合成CPcDNA;通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSAcDNA;利 用同框酶切连接原理，连接HSA cDNA和CP cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-CP cDNA融 合基因插入到克隆载体pBlu2KSP中保存；HSA-CP cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主细 胞中进行表达。CPcDNA的克隆，HSAcDNA的克隆，含HSA cDNA和CP cDNA融合基因的克隆载体的构建，融 合蛋白HSA-CP的重组酵母构建和融合蛋白HSA-CP的表达的步骤详见实施例。
用上述方法制备的人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白，包括与人血清白蛋白至少85%序列同 源的第一区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列的第一区和与人胰岛素C肽至少85%序列同源的第二区； 所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人胰岛素C肽同源的第二区位于融合蛋 白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人胰岛素C肽同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述 与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
优选的是所述融合蛋白包括与人血清白蛋白至少95%序列同源的第一区和与人胰岛素C肽至少95% 序列同源的第二区。
所述融合蛋白的第一区可以由人血清白蛋白部分结构域组成、或经结构域重排后的人血清白蛋白组 成，包括所有HSA天然存在的多态型外，还包括HSA的部分片段，如EP322094中所述名为HSA (l-n)， n为369-419。
所述融合蛋白包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人胰岛素C肽氨基酸残基序列 相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或 加入得到的多肽。
宿主系统是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞等。优选的宿主系统是酵母。优选的酵母是 毕赤酵母。优选的毕赤酵母是毕赤酵母GS115和KM71。 本发明的另一内容是提供表达融合蛋白编码区的宿主。
由于CP基因较短，且其序列中GC碱基含量较高，采用人工合成获得CPcDNA。 HSAcDNA可以通 过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得。获得的HSA cDNA插入到克隆载体pBlu2KSP中，测序。利用 同框酶切连接的原理连接CP cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来 的融合蛋白稳定性和免疫原性方面的问题，构建含CP cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆载体 pBlu2KSP-HSA-CP。
CPcDNA和HSAcDNA融合基因可以在多个宿主系统中表达，如细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、 植物细胞，及生物体(如脊椎动物、昆虫)等。在这些表达系统中目的基因被整合到宿主的染色体中或插 入到质粒中。本发明优选的是酵母表达系统，该系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要 求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。 更优选的是毕氏酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕氏酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具 有明显的优势。毕氏酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化 带来的免疫源性问题。
毕氏酵母表达系统分泌型表达载体主要有pPIC9K， pHIL-Sl， pPICZa， pYAM75P6;胞内型表达载体 主要有pPIC3K, pPICZ， pHWO10,pGAPZ，pGAPZa (invitrogen)等，优选的是毕赤酵母分泌型表达载体 pPIC9K，它是酵母整合载体，带有His缺陷型的选择性标记基因HIS4、 A0X1启动子、MF a分泌信号肽 和G418抗性基因(可作为筛选重组子的标记)等元件。AOX1启动子是一个强启动子，可以高效的启动 目的基因的表达。在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶AOX1和AOX2，细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活 力是由A0X1提供。在甲醇为唯一碳源培养的细胞中，该酶可占细胞总蛋白的30%以上。AOX2与AOXl的同源性虽然高达97%,但酶活很低。当AOXl基因缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧化酶活力 丧失，细胞利用甲醇能力降低，细胞在甲醇为唯一碳源的培养基上生长很慢。
带有融合cDNA的表达载体可以通过转化锂盐法、PEG法、原生质体法或电穿孔法转化宿主系统。成 功转化的细胞，即带有本发明构建的DNA的细胞，可以通过本领域熟知的方法加以鉴定，如收集细胞， 裂解后提取DNA，然后进行Southern杂交和PCR鉴定，也可在诱导表达后用HSA抗体和/或CP抗体检 测培养液上清。
本发明的有益效果-
利用同框酶切连接原理，连接HSA cDNA和CP cDNA，操作快捷方便，中间不加入任何连接肽，以 避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性(避免针对连接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的问题。
优选的酵母表达系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点 外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕赤酵母表达系 统，和酿酒酵母表达系统相比，毕赤酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕赤酵母自 身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。
可以通过培养带有本发明构建的DNA的宿主系统，来生产本发明的融合蛋白。宿主系统培养优选在 生物反应器上进行，培养分两个阶段，第一阶段主要用于宿主系统生长，第二阶段主要用于产物合成。可 以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如盐析、沉淀、 超滤、层析、制备电泳等技术及这些技术的组合。
图1.质粒pPIC9K-HSA-CP结构 图2.质粒pPIC9K-HSA-CP构建 图3. HSA-CP融合基因的琼脂糖电泳分析
1: DNA Marker 2000; 2:用HSA上游引物和PC2的从重组质粒pBlue-HSA-CP中扩增的HSA-CP 基因；3:用PC1和PC2扩增CP基因；4.用HSA上游引物和PC2从pBlue-HSA中无扩增条带；5.:用 PC1和PC2从pBlue-HSA中无扩增条带
图4重组质粒pPIC9k-HSA-CP的限制性酶切分析
1: DNA Marker (XDNA/HindlII/EcoRI); 2:五co及I禾卩Atol双酶切的pPIC9k-HSA-CP; 3:五coi I酶切的pPIC9k-HSA-CP;4: 酶切的pPIC9k-HSA-CP; 5: ￡coi I酶切的pPIC9k 图5.融合蛋白的SDS-PAGE分析
LaneM:低分子量蛋白质标准；Lane 1-8:不同重组菌GS115/pPIC9K-HSA-CP的发酵液上清
图6.高表达量重组菌发酵液上清SDS-PAGE
M:低分子量蛋白质标准；高表达量重组菌发酵液上清
图7.融合蛋白的CP抗体和HSA抗体检测(Western blot)
M:低分子量蛋白质标准；Lanel:HSA-CP与HSA抗体杂交；Lane2: HSA-CP与和CP抗体杂交 图8. CP对人胚肾293细胞生长的影响
具体实施方法实施例l: CPcDNA的克隆
由上海海毅生物技术服务有限公司人工合成CPcDNA (93bp),将其克隆到载体pMD18T上，插入位 点为五co及V，受体菌为大肠杆菌DH5a菌株。 实施例2: HSAcDNA的克隆
利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSAcDNA，所用的引物为 PH1: 5，-CAGCGAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3' PH2: 5，-CACCGCGGCCGCTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3' PH1下划线部分为￡co/ I酶切位点，PH2下划线部分为Afert酶切位点
PCR反应体系10nmol/L的PH1和PH2引物各1.5nL， 2.5mmol/L的dNTP 4W,， 10xpfu Buffer 5pL， 5U/^iL的pfuDNA聚合酶0.5 ^L，人胎肝cDNA文库l吗，加双蒸水补齐50 pL。 PCR反应程序95°C 预变性5min; 94'C变性lmin, 60'C退火lmin， 72。C延伸3min,循环30次；72。C延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的 目的片断。纯化好的目的片断和载体pBlu2KSP分别经￡coJ I和7Vo/1双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR 片段胶回收试剂盒回收目的片断。T4 DNA连接酶连接经双酶切的HSA cDNA和载体pBlu2KSP，连接产 物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、 IPTG和100 ng/mL氨节青霉素的LB琼脂 平板，37'C培养过夜。挑取白色菌落，接种于20mL含100ng/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37。C培养 过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。采用PCR扩增，五coi I和Afe〃双酶切鉴定阳性克隆，并对重组 质粒￡co/ I和Wo I双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20%甘油的LB中，冻于 -80°C。重组质粒命名为pBlu2KSP-HSA，阳性重组子命名为DH5o/pBlu2KSP-HSA。
实施例3:含HSA cDNA和CPcDNA融合基因的克隆载体的构建
(1) 构建的pBlu2KSP-HSA载体在HSA基因的C末端含有Sa"/1和WW I的酶切位点，可通过用在 CP基因的上下游引物中分别引入Sa"/1和7Vo I酶切位点，设计使CP基因经1和7Vo/1双酶切后与 经I和Wof I双酶切的pBlu2KSP-HSA同框连接。
(2) CPcDNA的PCR扩增，所用引物如下
PC1: 5' GAAACCCTTAGGCTTAGAAGCTGAGGACTTGCAAGTTGGTC 3' PC2: 5' GTTGCGGCCGCTTATTGAAGAGAACCTTCCAAAGCCA 3' 其中Pel下划线部分为i酶切位点，Pc2下划线部分为MjZ i酶切位点
PCR反应体系10 nmol/L的PC1和PC2引物各1.5 ^L， 2.5 mmol/L的dNTP 4 |xL， 10xpfu Buffer 5 ^L， 5U/nL的pfuDNA聚合酶0.5 pL，质粒模板pMD18T-CP lng，加双蒸水补齐50 ^L。 PCR反应程序95°C 预变性5min; 94'C变性30s， 65'C退火30s, 72'C延伸lmin,循环30次；72。C延伸10min。 (3 )同框酶切连接HSA cDNA和CP cDNA融合基因
琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在lOObp地方出现目标片段，用PCR片段胶回收试剂盒纯化PCR扩 增得到的CP基因。用Saw/ I和Afez I双酶切纯化的PCR产物和pBlu2KSP-HSA载体，用PCR片段胶回收 试剂盒回收CP基因和pBlu2KSP-HSA载体。用T4 DNA连接酶连接两回收片段后转化大肠杆菌DH5a, 转化物涂布于含有X-gal、 IPTG和100pg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，37"C培养过夜。挑取白色菌落， 接种于20 mL含100 ng/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37'C培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。 采用PCR扩增，￡coW I和I双酶切鉴定阳性克隆，并对重组质粒5co及I和WW I双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20%甘油的LB中，冻于-80'C 。重组质粒命名为pBlu2KSP-HSA-CP， 阳性重组子命名为DH5o/pBlu2KSP-HSA-CP。
实施例4: HSA-CP重组酵母表达系统构建及融合蛋白的表达 (1)融合蛋白HSA-CP酵母表达系统的构建
取一支冻存的DH5o/pBlu2KSP-HSA-CP，接种到20 mL含100 ng/mL氨苄青霉素的LB培养基中37 'C培养过夜，提取质粒，提取的质粒pBlu2KSP-HSA-CP和酵母表达载体pPIC9K，分别经￡coi I和I 双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收。取双酶切后纯化好的pBlu2KSP-HSA-CP 片段5pL, pPIC9K5nL,加入2 pL 1 (ligation buffer, 0.4pLT4连接酶，加双蒸水补齐20pL， 15。C反应 过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化物涂布于含100 ng/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板， 37'C培养过夜；挑取若干个长出的菌落，接种于20mL氨苄青霉素(100 pg/mL)的LB培养基中37'C培 养过夜，用常规方法提取质粒；通过PCR,及&oi I和AWI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳 性重组子保存在含有20X甘油的LB中，冻于-80'C;重组质粒命名为pPIC9k-HSA-CP，阳性重组子命名 为DH5o/pPIC9k-HSA-CP。
提取DH5o/pPIC9k-HSA-CP中的质粒，经SM酶切后，电击转化毕赤酵母GS115,转化物涂布于含有 1 mo/L山梨醇的MD平板上，于30'C,培养3—6天。每块平板上用2 ml灭过菌去离子水洗涤，收集洗 涤液。取部分收集到的洗涤液，分别涂布含有lmg/mL、 2mg/mL、 3mg/mL、 4mg/mLG418的YPD平板， 于3(TC，培养3 6天。挑取在最高浓度G418的YPD平板上的长出菌落，接种于20 mL MD培养基中， 30。C培养24小时，用常规方法提取重组毕赤酵母基因DNA，通过PCR,琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性重组 子命名为GS115/pPIC9k-HSA-CP。
(2) HSA-CP融合蛋白的表达
将GS115/pPIC9k-HSA-CP接种至装有100mLBMGY (100mM磷酸钾，pH6.0、 1.34%无氨基酸的酵 母氮基、4xl0-5%生物素、1%甘油)500mL三角瓶中，250rpm, 29。C培养至A6o^值为2 6，离心收集 菌体。将收集到的菌体接种至装有20mLBMMY U00mM磷酸钾，pH6.0、 1.34%无氨基酸的酵母氮基、 4><10-5°/。生物素、1%甲醇)的100mL三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度1X(V/V)，诱导3天。离心 收集上清，过滤除菌，进行SDS-PAGE验证，Westem杂交鉴定融合蛋白HSA-CP分子的CP的免疫源性及HSA 免疫源性。
实施例5:融合蛋白HSA-CP的生物活性检测
SRB法检测HSA-CP对人胚肾293细胞的促生长作用人胚肾293细胞用含10%小牛血清的DMEM 培养，培养条件为5%<:02， 37°C。细胞按照10S个/mL铺在96孔板内，100 细胞悬液/孔。培养一天后， 低血清饥饿培养24小时，实现细胞生长的同步化。换含有不同浓度CP标准品和HSA-CP样品的10%小 牛血清的DMEM细胞培养液200 nL/孔。对照组不加CP和HSA-CP，每个条件设置4个重复，培养48h。 吸去培养液，每孔加入100^50%三氯乙酸，静置5min后移入4。C冰箱静置l小时。用去离子水洗净后， 每孔加P/。乙酸配制的4X的SRB 100pL，染色30min后，倒掉染液。用1%乙酸洗去未结合的染料，室 温干燥后加入pH 10.5 Tris碱液150 pL，平板振荡器上振荡5 min，酶标仪上测定各孔在540nm处的吸光 值。
权利要求
1. 人血清白蛋白(HSA)与人胰岛素C肽(CP)的融合蛋白。其特征是包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第一区和与人胰岛素C肽至少85％序列同源的第二区；所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人胰岛素C肽同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人胰岛素C肽同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
2、 根据权利要求1所述的人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白包括 与人血清白蛋白至少95%序列同源的第一区和与胰岛素C肽至少95%序列同源的第二区。
3、 根据权利要求l所述的人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白的第 一区由人血清白蛋白部分结构域组成或经结构域重排后的人血清白蛋白组成。
4、 根据权利要求1所述的人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白包括 与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同第一区和与人胰岛素C肽氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区 的功能等同物。
5、 根据权利要求4所述的人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白。其特征在于所述功能等同物是 在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
6、 根据权利要求1所述的人血淸白蛋白(HSA)与人胰岛素C肽(CP)的融合蛋白的制备。其特征是 人工合成CPcDNA;通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA;同框酶切连接HSA cDNA和 CPcDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-CPcDNA融合基因插入到克隆载体中保存；利用毕赤酵 母分泌型表达载体将HSA-CP cDNA融合基因整合到宿主的染色体中进行表达。(1) CPcDNA的克隆由上海海毅生物技术有限公司人工合成CPcDNA (93bp),将其克隆到载体pMD18T上，插入位点为 5coi V，受体菌为大肠杆菌DH5a菌株。(2) HSAcDNA的克隆利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSAcDNA,所用的引物为 PH1: 5，-CAGCGAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3， PH2: 5，-CACCGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3' PH1下划线部分为￡coi I酶切位点，PH2下划线部分为Afort酶切位点PCR反应体系10 nmol/L的PH1和PH2引物各1.5 2.5 mmol/L的dNTP 4 pL， lOxpfo Buffer 5 pL， 5U/nL的pfuDNA聚合酶0.5 pL，人胎肝cDNA文库1吗，加双蒸水补齐50 jiL。 PCR反应程序95°C 预变性5min; 94'C变性1 min, 60'C退火I min， 72。C延伸3 min，循环30次；72。C延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8 kb 的目的片断。纯化好的目的片断和载体pBlu2KSP分别经五co/ I和双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR 片段胶回收试剂盒回收目的片断。T4 DNA连接酶连接经双酶切的HSA cDNA和载体pBlu2KSP,连接产 物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、 IPTG和100 ^g/mL氨苄青霉素的LB琼脂 平板，37'C培养过夜。挑取白色菌落，接种于20 mL含100 ng/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37'C培养 过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。采用PCR扩增，I和A^I双酶切鉴定阳性克隆，并对重组 质粒I和Afe/I双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20%甘油的LB中，冻于-80°C。重组质粒命名为DH5o/pBlu2KSP-HSA，阳性重组子命名为DH5o/pBlu2KSP-HSA。(3) 含HSAcDNA和CP cDNA融合基因的克隆载体构建① 构建的pBlu2KSP-HSA载体在HSA基因的C末端含有Saw/1和AfeZ I的酶切位点，可通过用在 CP基因的上下游引物中分别引入I和Ato I酶切位点，设计使CP基因经1和WW I双酶切后与 经Sm//1和WW I双酶切的pBlu2KSP-HSA同框连接。② CPcDNA的PCR扩增，所用引物如下-PC1: 5' GAAACCCTTAGGCTTAGAAGCTGAGGACTTGCAAGTTGGTC 3, PC2: 5' GTTGCGGCCGCTTATTGAAGAGAACCTTCCAAAGCCA 3' 其中PC1下划线部分为Sa"/I酶切位点，PC2下划线部分为I酶切位点PCR反应体系10 nmol/L的PC1和PC2引物各1.5 ^L， 2.5 mmol/L的dNTP 4 ^L， 10xpfu Buffer 5 ^L， 5U/nL的pfUDNA聚合酶0.5 nL,质粒模板pMD18T-CP lng，加双蒸水补齐50 ^L。 PCR反应程序95°C 预变性5分钟;94。C变性30s， 65。C退火30s， 72。C延伸lmin，循环30次;72。C延伸10min。③ 同框酶切连接HSA cDNA和CP cDNA融合基因琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在lOObp地方出现目标片段，用PCR片段胶回收试剂盒纯化PCR扩 增得到的CP基因。用Sa"/ I和7VW I双酶切纯化的PCR产物和pBlu2KSP-HSA载体，用PCR片段胶回收 试剂盒回收CP基因和pBlu2KSP-HSA载体。用T4 DNA连接酶连接两回收片段后转化大肠杆菌DH5a， 转化物涂布于含有X-gal、 IPTG和100ng/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，37'C培养过夜。挑取白色菌落， 接种于20 mL含100 pg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37'C培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。 采用PCR扩增，五co及I和I双酶切鉴定阳性克隆，并对重组质粒五co/ I和7VW I双酶切位点间区域进 行DNA测序。阳性重组子保存在含有20%甘油的LB中，冻于-8(TC。重组质粒命名为pBlu2KSP-HSA-CP， 阳性重组子命名为DH5o/pBlu2KSP-HSA-CP。(4) 融合蛋白HSA-CP的酵母表达系统的构建取一支冻存的DH5a/pBlu2KSP-HSA-CP，接种到20 mL含100 pg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C 培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒。提取的质粒pBlu2KSP-HSA-CP和酵母表达载体pPIC9K，分别经 I和Afef I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，用PCR片段胶回收试剂盒回收基因HSA-CP和载体pPIC9K。 用T4 DNA连接酶连接两回收片段，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化物涂布于含100 pg/mL 氨苄青霉素的LB琼脂平板，37'C培养过夜。挑取长出的菌落，接种于20mL含100ng/mL氨苄青霉素的 LB培养基中，37'C培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒。采用PCR扩增，￡coi I和7VW I双酶切鉴定 阳性克隆。阳性重组子保存在含有20。/。甘油的LB中，冻于-80'C。重组质粒命名为pPIC9K-HSA-CP，阳 性重组子命名为DH5a/pPIC9K-HSA-CP。提取DH5a/pPIC9K-HSA-CP中的质粒，经Sa/I单酶切，DNA胶回收试剂盒回收后，电击转化毕赤酵 母GS115，提取重组毕赤酵母基因组DNA, PCR扩增鉴定，阳性重组子命名为GS115/pPIC9K-HSA-CP。 (5)融合蛋白HSA-CP的表达将GS115/pPIC9K-HSA-CP接种至装有10mLBMGY的50mL三角瓶中，250rpm， 30。C培养24小时， 离心收集菌体，将收集到的菌体重悬于3mLBMMY中，于50mL三角瓶中，250rpm， 3(TC继续培养，每 24小时补加一次甲醇至终浓度1%，诱导3天，离心收集发酵液上清，进行SDS-PAGE验证，Westem杂交鉴 定融合蛋白HSA"CP分子的CP及HSA免疫源性。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征是宿主系统是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞表达系统。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征是优选的宿主系统是酵母。
9、 根据权利要求8所述的方法，其特征是优选的酵母是毕赤酵母。
10、 根据权利要求9所述的方法，其特征是优选的毕赤酵母是毕赤酵母GS115和KM71。
全文摘要
人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明将人血清白蛋白(简称HSA)基因的cDNA与C肽基因(简称CP)的cDNA直接连接，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-CP cDNA融合基因在宿主细胞中进行表达；本发明的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人C肽至少85％序列同源的第二区，两区直接连接，中间不加入任何连接肽，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；宿主细胞可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞等。本发明的融合蛋白在保持了人C肽的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。
文档编号C07K19/00GK101280020SQ200810024989
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月23日 优先权日2008年5月23日
发明者敏 储, 周利苹, 张莲芬, 英 李, 坚 金, 蕴 陈 申请人:江南大学