专利名称：：一种抗病毒蛋白质及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及蛋白质，具体地说，涉及一种用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV，humanimmunodeficiencyvirus)禾口/或乙型肝炎病毒(HBV，hepatitisBvirus)感染的抗病毒蛋白质，以及这种抗病毒蛋白质的应用。
背景技术：
：APOBEC家方矣(apolipoproteinBmRNAeditingenzyme-catalyticpolypeptidefamily,载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽家族)是近年来新发现的一种具有胞嘧啶脱氨酶活性的蛋白质分子，可以使胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶(C—U)，其家族成员包括hAPOBECl(即人APOBECl)、hAPOBEC2(即人APOBEC2)、hAPOBEC3A(即人APOBEC3A)、hAPOBEC3B(即人APOBEC3B)、hAPOBEC3C(即人APOBEC3C)、hAPOBEC3D(即人APOBEC3D)、hAPOBEC3E(即人APOBEC3E)、hAPOBEC3F(即人APOBEC3F)、hAPOBEC3G(即人APOBEC3G)、hAPOBEC3H(即人APOBEC3H)、hAPOBEC4(即人APOBEC4)、rAPOBECl(即大鼠APOBECl)、活化诱导的脱氨酶(activation-induceddeaminase,AID)等十余禾中(APOBEC國mediatedviralrestriction:notsimplyeditingTrendsBiochemSci(生化禾斗学进展)2007;32(3):118-128;禾口APOBECfamilyproteins:novelantiviralinnateimmunity.IntJHematol(国际血液学杂志)2006;83(3):213-216)。APOBEC家族最重要的结构特征是它们都具有保守的、依赖锌离子的胞嘧啶脱氨酶活性结构域(CloningandmutagenesisoftherabbitApoBmRNAeditingprotein.Azincmotifisessentialforcatalyticactivity,andnoncatalyticauxiliaryfactor(s)oftheeditingcomplexarewidelydistributed.JBiolChem(生物化学杂志)1994;269(34):21725-21734)。多数APOBEC家族成员只有一个胞嘧啶脱氨酶结构域，而hAPOBEC3B、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G分子各包含两个胞嘧啶脱氨酶结构域。目前发现APOBEC成员具有很强的抗病毒活性，能够抑制逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV，simianimmunodeficiencyvirus)、马传染性贫血病毒(EIAV，equineinfectiousanemiavirus)、鼠白血病病毒(MLV，murineleukaemiavirus)和乙型肝炎病毒(HBV)的复制。对HIV等逆转录病毒而言，APOBEC的胞嘧啶脱氨酶结构域可以使胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶(C—U)，C—U的转变进一步引发三种不同的后续反应(1)含有U的单链cDNA被尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)识别并移去U，产生无嘌呤嘧啶的位点，再被DNA碱基切除修复酶(核酸内切酶)作用，导致DNA降解(DNAdeaminationmediatesinnateimmunitytoretroviralinfection.Cell(细胞)2003;113(6):803-809);(2)过多的U碱基可以干扰正链合成的起始(IncorporationofuracilintominusstrandDNAaffectsthespecificityofplusstrandsynthesisinitiationduringlentiviralreversetranscription.JBiolChem(生物化学杂志)2003;278(10):7902-7909);(3)负链中12%的C可以被脱氨转变为U，大量的C—U突变会导致正链中出现G—A高频突变，以至于不能编码功能性的病毒蛋白，或者因为提前形成终止密码子而产生截短的无功能产物。上述三种后续反应最终导致逆转录病毒不能完成整个复制周期。对HBV而言，APOBEC主要通过抑制病毒前基因组RNA的包装和核衣壳化来实现其抗病毒功能(InhibitionofhepatitisBvirusreplicationbyAPOBEC3G.Science(科学)2004;303(5665):1829)。但是，APOBEC家族无法在细胞外发挥抗病毒功能，这大大限制了它在医疗上的应用。为了使APOBEC家族发挥抗病毒功能，需要将其导入细胞内。在细胞生物学和临床药学研究领域，将多肽、蛋白质或寡核苷酸等导入细胞内，目前普遍采用的手段有物理方法，如显微注射、电穿孔等；化学方法，如脂质体包裹法、洋地黄皂苷处理法等；生物方法，如病毒载体法等。但上述方法分子导入率低，易造成细胞损伤甚至死亡，使得许多无生物膜通透性且易降解的亲水性多肽、蛋白质及寡核苷酸在药学领域的应用大大受限。近年来研究发现,生物体中有一类蛋白及多肽能够以一种无受体介导、不耗能、非经典内吞的方式进入细胞浆或细胞核(Proteintransports:thenonclassicalinsandouts.CurrBiol(当代生物学)1997;7(5):R318-320)。这些具有细胞膜穿透能力的蛋白或多肽被称为穿膜肽(membranepenetratingpeptides，MPPs，又称为细胞膜穿透肽)，包括单纯疱疹病毒衣壳蛋白VP22，人类免疫缺陷病毒Tat蛋白、果蝇同源异型转录调节蛋白(antennapedia，Antp)和一些人工合成的多肽(ThethirdhelixoftheAntennapediahomeodomaintranslocatesthroughbiologicalmembranes.JBiolChem(生物化学杂志)1994;269(14):10444-10450;禾口Intercellulartraffickingandproteindeliverybyaherpesvirusstructuralprotein.Cell(细胞)1997;88(2):223-233;和Cellularuptakeofthetatproteinfromhumanimmunodeficiencyvirus.Cell(细胞)1988;55(6):1189-1193)，尽管它们在氨基酸序列、细胞内定位及穿膜潜能等方面存在不同，但均能有效地将多肽、蛋白质或DNA片段导入多种哺乳动物细胞。穿膜肽介导的物质转运过程具有很多优势，例如它与细胞膜亲和性高、穿膜速度快，最重要的是对细胞膜没有破坏性；此外，穿膜肽的穿膜过程还可以逆向进行，也就是说，它还可以从细胞内穿过细胞膜进入基质，或者从一个细胞转移到另外一个细胞；穿膜肽分子量往往比较小，不易被肝和脾吞噬细胞消除，甚至有的穿膜肽在血浆存在的情况下也具有转染细胞的能力；由于穿膜肽不经受体介导的内吞途径进入细胞，避免了内吞后进入溶酶体降解，因此在细胞内的作用时间相对延长。另外，APOBEC分子量较大，免疫原性较强，直接应用于人体可能会诱导较高的抗体水平而降低其抗病毒效果。
发明内容本发明所要解决的技术问题是将穿膜肽技术和APOBEC的抗病毒活性有机结合，提供一种抗病毒蛋白质及其应用，这种抗病毒蛋白质具有细胞膜穿透活性，能够在细胞之间进行自由穿梭，并以一种非受体、非能量依赖的方式进入细胞内，并且能够有效抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)和/或乙肝病毒(HBV)的复制。采用的技术方案如下一种抗病毒蛋白质，其特征在于它是融合蛋白质，包含穿膜肽结构域和至少二个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域，穿膜肽结构域和各胞嘧啶脱氨酶结构域形成串联体。优选上述抗病毒蛋白质包含至少三个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域；抗病毒蛋白质中胞嘧啶脱氨酶结构域的数量增多，有助于提高其抗病毒效果。更优选上述抗病毒蛋白质中的胞嘧啶脱氨酶结构域来自三种不同的APOBEC家族成员，例如一种抗病毒蛋白质包含三个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域，其中第一个胞嘧啶脱氨酶结构域来自hAPOBEC3G，第二个胞嘧啶脱氨酶结构域来自hAPOBEC3B，第三个胞嘧啶脱氨酶结构域来自hAPOBEC3F。由于不同APOBEC家族来源的胞嘧啶脱氨酶结构域在氨基酸组成方面存在一定差异，这会导致其在抗病毒过程中发挥不同的功能，因此来自三种不同APOBEC家族成员的胞嘧啶脱氨酶结构域的联合使用，能够增强抗病毒蛋白质抑制病毒增殖的效果。进一步，优选上述抗病毒蛋白质包含至少四个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域；抗病毒蛋白质中胞嘧啶脱氨酶结构域的数量增多，有助于提高其抗病毒效果。更优选上述抗病毒蛋白质中的胞嘧啶脱氨酶结构域来自至少三种不同的APOBEC家族成员，例如一种抗病毒蛋白质包含四个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域，其中第一二个胞嘧啶脱氨酶结构域来自hAPOBEC3F，第三个胞嘧啶脱氨酶结构域来自hAPOBEC3G，第四个胞嘧啶脱氨酶结构域来自hAPOBEC3B;另一种抗病毒蛋白质包含四个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域，其中第一个胞嘧啶脱氨酶结构域来自hAPOBEC3G，第二个胞嘧啶脱氨酶结构域来自hAPOBEC3B，第三个胞嘧啶脱氨酶结构域来自hAPOBEC3F，最后一个胞嘧啶脱氨酶结构域来自rAPOBECl。由于不同APOBEC家族来源的胞嘧啶脱氨酶结构域在氨基酸组成方面存在一定差异，这会导致其在抗病毒过程中发挥不同的功能，因此来自至少三种不同APOBEC家族成员的胞嘧啶脱氨酶结构域的联合使用，能够增强抗病毒蛋白质抑制病毒增殖的效果。构成上述穿膜肽结构域的序列可以是下述具有穿膜肽活性的序列中的一种来源于HIVTat蛋白(transactivator,人类免疫缺陷病毒Tat蛋白)的GRKKRRQRRRPPQ序列；来源于HIVTat蛋白的RKKRRQRRR序列；来源于单纯疱疹病毒衣壳蛋白VP22的DAATARGRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD序列；来源于果蝇同源异型转录调节蛋白Antp(antennapedia)的RQIKIWFQNRRMKWKK序列；转运子(transportan)序列GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL;两亲性模式肽KLALKLAALKAALKLA;连续的精氨酸RRRRRRRRR;基于信号序列的多肽GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV;基于信号序列的多肽AAVALLPAVLLALLAP。构成上述穿膜肽结构域的序列可以发生合理的、不影响其生物学活性的改变，例如，非核心作用氨基酸的缺失、非核心作用氨基酸的插入、非核心作用氨基酸的替换、多种具有穿膜肽活性的序列的组合等，但这些改变的核心目的应该是引导抗病毒蛋白质有效地穿透细胞膜或核膜。上述穿膜肽结构域在抗病毒蛋白质中的位置应能够保证它有效发挥穿膜活性，可以位于抗病毒蛋白质的N端(即氨基端)、C端(即羧基端)或中间区域，优选N端。优选上述来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域所具有的核心基序是H-X-E-(X)23-28-P-C-(X)2-4-C，其中H为组氨酸，E为谷氨酸，C为半胱氨酸，P为脯氨酸，X代表任意氨基酸。优选上述抗病毒蛋白质中的胞嘧啶脱氨酶结构域是来源于APOBEC家族中的hAPOBEC3G、hAPOBEC3F、hAPOBEC3B和rAPOBECl这四种蛋白质分子的胞嘧啶脱氨酶结构域，也就是说，在选择抗病毒蛋白质中胞嘧啶脱氨酶结构域的来源时，优先考虑选择这四种蛋白质分子的胞嘧啶脱氨酶结构域，这四种蛋白质分子所含的胞嘧啶脱氨酶结构域共有下述七种来自hAPOBEC3G的N端的胞嘧啶脱氨酶结构域，来自hAPOBEC3G的C端的胞嘧啶脱氨酶结构域，来自hAPOBEC3F的N端的胞嘧啶脱氨酶结构域，来自hAPOBEC3F的C端的胞嘧啶脱氨酶结构域，来自hAPOBEC3B的N端的胞嘧啶脱氨酶结构域，来自hAPOBEC3B的C端的胞嘧啶脱氨酶结构域，来自rAPOBECl的胞嘧啶脱氨酶结构域。对于hAPOBEC3G、hAPOBEC3F、hAPOBEC3B这三种蛋白质而言，每个蛋白质分子中都具有两个胞嘧啶脱氨酶结构域，分别位于N端和C端。胞嘧啶脱氨酶结构域的位置和氨基酸组成方面的微小差异可能决定了它们在抗病毒过程中发挥不同的功能，因此，更优选抗病毒蛋白质既包含来自hAPOBEC3G、hAPOBEC3F或hAPOBEC3B的N端的胞嘧啶脱氨酶结构域，又包含来自hAPOBEC3G、hAPOBEC3F或hAPOBEC3B的C端的胞嘧啶脱氨酶结构域。上述胞嘧啶脱氨酶结构域可以处于抗病毒蛋白质的N端(即氨基端)、C端(即羧基端)或中间区域。为了使抗病毒蛋白质中串联的每一个胞嘧啶脱氨酶结构域在空间结构上都能相对独立并有效发挥其功能，保持良好的生物学活性，优选抗病毒蛋白质中各结构域之间用柔性连接肽连接，具体地说，穿膜肽结构域和胞嘧啶脱氨酶结构域之间、相邻两个胞嘧啶脱氨酶结构域之间用柔性连接肽连接。柔性连接肽必须有足够的柔韧性与灵活度，因此构成柔性连接肽的氨基酸多为非极性且侧链较短的氨基酸，如甘氨酸(G)和丝氨酸(S)，也就是说，柔性连接肽富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)。优选柔性连接肽是GGGG、GSSSG、GSGGSG、GGGGS、(GGGGS)2和(GGGGS)3中的一种或者任意多种的组合。过短的连接肽可在分子内部造成空间位阻，影响蛋白的正确折叠；过长的连接肽则可能增加蛋白的免疫原性，因此更优选柔性连接肽是(GGGGS)2、GGGGGSSSG、GSSSGGSGGSG、GSGGSGGGGGS、GGGGGSGGSG、GSSSGGGGGS或GGGGGGGGS。为了利于制备抗病毒蛋白质时对抗病毒蛋白质进行纯化，同时有利于检测抗病毒蛋白质应用后的分布和表达情况，优选上述抗病毒蛋白质含有蛋白质纯化标签。蛋白质纯化标签可以是任何一种商业化标签，优选6xHis标签(即由六个组氨酸His组成的序列HHHHHH)或GST标签(谷胱甘肽巯基转移酶)。蛋白质纯化标签可以位于抗病毒蛋白质的N端或C端；也可以在抗病毒蛋白质的N端和C端各有一个蛋白质纯化标签。在本发明的一个实施方案中，公布了这种抗病毒蛋白质用镍粒子亲和层析进行纯化的方法。由于这种抗病毒蛋白质在N端和C端各有一个组蛋白标签(即6xHis标签)，因此在用凝血酶将这种抗病毒蛋白质N端包括蛋白质纯化标签在内的17个氨基酸切除后，获得的抗病毒蛋白质同样能够用镍粒子亲和层析法纯化，并且由于减少了部分氨基酸序列，其穿膜活性会进一步得到提高而抗病毒活性不会降低。上述抗病毒蛋白质可以用原核表达系统、酵母表达系统或昆虫细胞表达系统进行表达，也可以通过将其编码基因连入腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺相关病毒载体或疱疹病毒载体在体内获得表达，也可以通过将其编码基因通过基因枪、脂质体转染、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺或壳聚糖介导等方式进入体内而获得表达。上述抗病毒蛋白质在制备治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的药物中的应用，即上述抗病毒蛋白质可用于制备治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的药物。上述抗病毒蛋白质在制备治疗乙肝病毒(HBV)感染的药物中的应用，即上述抗病毒蛋白质可用于制备治疗乙肝病毒(HBV)感染的药物。本发明抗病毒蛋白质中，穿膜肽结构域使抗病毒蛋白质具有穿膜能力，能够在细胞之间进行自由穿梭，并以一种非受体、非能量依赖的方式进入细胞内；来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域使得抗病毒蛋白质在进入细胞之后，能够有效抑制fflV和/或HBV的复制，并且，由于去除了APOBEC家族蛋白质分子中的非必需序列，因而不仅保留了APOBEC家族蛋白质分子的抗病毒活性，而且降低了抗病毒蛋白质的免疫原性，并提高了抗病毒蛋白质的穿膜效率；各结构域之间的柔性连接短肽可以保证各结构域能够不受影响地发挥其各自特有的功能；蛋白质纯化标签能够方便抗病毒蛋白质的纯化或检测。图1是实施例1中抗病毒蛋白质的原核表达载体构建过程示意图2是实施例1中抗病毒蛋白质的表达和纯化结果示意图3是实施例2中抗病毒蛋白质的Westernblot检测结果示意图4是实施例3抗病毒蛋白质的细胞内定位结果的照片(由荧光显微镜获得)；图5是实施例4中抗病毒蛋白质对细胞培养上清中核衣壳相关HBV-DNA的影响的检测结果示意图6是实施例4中抗病毒蛋白质对细胞浆中核衣壳相关HBV-DNA的影响的检测结果示意图7是实施例4中抗病毒蛋白质对细胞浆中包裹于衣壳内的HBV前基因组RNA的影响的检测结果示意图。具体实施例方式实施例1抗病毒蛋白质的制备本实施例抗病毒蛋白质的氨基酸序列为<sequence>seeoriginaldocumentpage11</sequence>这种抗病毒蛋白质包含一个穿膜肽结构域<sequence>seeoriginaldocumentpage11</sequence>和三个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域(这三个胞嘧啶脱氨酶结构域依次是来自hAPOBEC3G分子N端的胞嘧啶脱氨酶结构域HisProGluMetArgPhePheHisTrpPheSerLysTrpArgLysLeuHisArgAspGlnGluTyrGluValThrTrpTyrlleSerTrpSerProCysThrLysCys、来自hAPOBEC3G分子C端的胞嘧啶脱氨酶结构域HisAlaGluLeuCysPheLeuAspValIleProPheTrpLysLeuAspLeuAspGlnAspTyrArgValThrCysPheThrSerTrpSerProCysPheSerCys、来自hAPOBEC3F分子C端的胞嘧啶脱氨酶结构域HisAlaGluArgCysPheLeuSerTrprProCysProGluCys)，穿膜肽结构域和各胞嘧啶脱氨酶结构域形成串联体，穿膜肽结构域和胞嘧啶脱氨酶结构域之间、相邻两个胞嘧啶脱氨酶结构域之间用柔性连接肽(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)连接，抗病毒蛋白质的N端和C端各有一个蛋白质纯化标签(HisHisHisHisHisHis)。按下述步骤制备上述抗病毒蛋白质一、hAPOBEC3G全长cDNA(互补DNA，DNA为脱氧核糖核酸)和hAPOBEC3F全长cDNA的克隆对人外周血用淋巴细胞分离液进行处理，获得单个核细胞，用PMA(乙酰肉豆蔻佛波醇)处理后，再用Trizol法提取总RNA，利用随机引物法和AMV逆转录酶合成cDNA;然后分别以A3G-F和A3G-R、A3F-F和A3F-R为引物对，PCR(polymerasechainreaction,聚合酶链式反应)扩增，得到hAPOBEC3G全长cDNA和hAPOBEC3F全长cDNA;其中各引物具体设计如下A3G-F是5，画CGAAAGCTTATGAAGCCTCACTTCAGAA-3，A3G-R是5，画TTAGGTACCTCAGTTTTCCTGATTCTG-3'A3F-F是5，-GCTAAGCTTATGAAGCCTCACTTCAGA-3，A3F-R是5，-TATGGTACCTCACTCGAGAATCTCCTG-3，上述A3G-F、A3G-R、A3F-F和A3F-R中的下划线部分为HindIII酶切位点(AAGCTT)或KpnI酶切位点(GGTACC)。上述二种PCR产物(即hAPOBEC3G全长cDNA和hAPOBEC3F全长cDNA)用HindIII和KpnI双酶切，然后与经HindIII和Kpnl双酶切并纯化的商业化pcDNA3质粒连接，得到阳性质粒，得到的阳性质粒进一步测序验证，分别命名为pcA3G质粒和pcA3F质粒。pcA3G质粒带有hAPOBEC3G全长cDNA;pcA3F质粒带有hAPOBEC3F全长cDNA。二、抗病毒蛋白质的原核表达载体的构建设计的各引物如下(1)Tat-MF:5'-GA3CCTGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCGGAGGCGGATCCGTCGACC-3':其中GATC(波浪线)是Tat-MF禾nTat-MR引物配对后悬挂出来的碱基，GGCGGAGGC(单下划线)是引入的柔性连接肽序列的编码序列，GGATCCGTCGAC(双下划线)为引入的Bamffl和Sail酶切位点；(2)Tat-MR:5'-TCGAGGTCGACGGATCCGCCTCCGCCTTGAGGAGGTCTTCATCGCTGTCTCCGCTTCTTCCTGCCA-3，；其中TCGA(波浪线)是Tat-MF和Tat-MR引物配对后悬挂出来的碱基，GCCTCCGCC(单下划线)是引入的柔性连接肽序列的编码序列，GTCGACGGATCC(双下划线)为引入的Sail和Bamffl酶切位点；(3)A3G-NF:5'-GGCAGATCTGGCGGAGGCGGATCACACCCAGAGATGAG-3';其中AGATCT(单下划线)是BglII酶切位点，GGCGGAGGCGGATCA(双下划线)是引入的柔性连接肽序列的编码序列；(4)A3G-NR:5'-TATCTCGAGGTCGACGGATCCGCCTCCGCCACACTTTGTGCAG-3，；其中CTCGAG(波浪线)是Xhol酶切位点，GTCGACGGATCC(双下划线)是引入的Sail和Bamffl酶切位点，GCCTCCGCC(单下划线)是引入的柔性连接肽序列的编码序列；(5)A3G-CF:5'-GGCAGATCTGGCGGAGGCGGATCACATGCAGAGCTGTGCTT-3';其中AGATCT(双下划线)是BglII酶切位点，GGCGGAGGCGGATCA(单下划线)是引入的柔性连接肽序列的编码序列；(6)A3G-CR:5'-TATCTCGAGGTCGACGGATCCGCCTCCGCCACAGCTGAAGCA-3';其中CTCGAG(波浪线)是Xhol酶切位点，GTCGACGGATCC(双下划线)是引入的Sail和Bamffl酶切位点，GCCTCCGCC(单下划线)是引入的柔性连接肽序列的编码序列；(7)A3F國CF:<sequence>seeoriginaldocumentpage14</sequence>，；其中AGATCT(双下划线)是BglII酶切位点，GGCGGAGGCGGATCA(单下划线)是引入的柔性连接肽序列的编码序列；(8)A3F-CR:<sequence>seeoriginaldocumentpage14</sequence>;其中CTCGAG(波浪线)是Xhol酶切位点，GTCGACGGATCC(双下划线)是引入的Sail和Bamffl酶切位点，GCCTCCGCC(单下划线)是引入的柔性连接肽序列的编码序列；首先，Tat-MF和Tat-MR引物对经过退火形成双链后，连入经Bamffl和Xhol双酶切的商业化pET-28a载体，得到含Tat穿膜肽结构域编码序列的pTM质粒。然后，在pTM质粒的基础上，采用同尾酶法连续插入多个APOBEC来源的胞嘧啶脱氨酶结构域，其具体步骤是(1)以带有hAPOBEC3G全长cDNA的pcA3G质粒为模板，A3G-NF和A3G-NR为引物，PCR扩增，得到hAPOBEC3G分子N端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列；然后利用Bamffl和BglII、Sail和Xhol互为同尾酶的特点，将该PCR产物(即hAPOBEC3G分子N端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列)经BglII和Xhol双酶切后，连入经BamHI和Sail双酶切的pTM质粒，得到pTM-N质粒。得到的pTM-N质粒，其酶切连接部位的BamHI和Bgin、Sail和Xhol位点会同时丧失，但被人为引入的BamHI位点和Sail位点(该Bamffl位点和Sail位点紧邻hAPOBEC3G分子N端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列的末端)仍然存在。(2)与步骤(1)类似，以pcA3G质粒为模板，A3G-CF和A3G-CR为引物，PCR扩增，得到hAPOBEC3G分子C端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列；然后将该PCR产物(即hAPOBEC3G分子C端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列)经BglII和XhoI双酶切后，连入经Bamffl和Sail双酶切的pTM-N质粒，得到pTM-NC质粒。pTM-NC质粒同样含有人为引入的BamHI位点和Sail位点，便于进行下一轮的酶切。(3)以pcA3F质粒为模板，A3F-CF和A3F-CR为引物，PCR扩增，得到hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列；然后将该PCR产物(即hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列)经BglII和Xhol双酶切后，连入经BamHI和Sail双酶切的pTM-NC质粒，得到pTM-NCC质粒，完成抗病毒蛋白质的原核表达载体的构建。pTM-NCC质粒含有一个Tat穿膜肽结构域编码序列和三个胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列。最后得到的pTM-NCC质粒同样含有人为引入的BamHI位点和Sall位点，依此类推，还可以得到更多胞嘧啶脱氨酶结构域的串联拷贝。综上所述，采用连续的酶切…-连接…-再酶切…-再连接的方式，一步步将外源DNA片段连入pET-28a原核表达载体。每一次连接后，其连接产物的两端都会失去一些酶切位点，但同时又保留了Bamffl和SalI位点，有利于下一轮酶切和连接过程的。虽然每增加l个拷贝就得做l次克隆，但对于15拷贝的串联基因，实验过程并不复杂。上述抗病毒蛋白质的原核表达载体的构建过程可以用图l表示，其中A3G-N、A3G-C、A3F-C分别表示hAPOBEC3G的N端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列、hAPOBEC3G的C端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列和hAPOBEC3F的C端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列。在相邻的胞嘧啶脱氨酶结构域之间，我们还设计了柔性连接肽序列。它是基于如下的设计思路每一个PCR扩增片段的末端都引入了GCCTCCGCC序列(编码GlyGlyGly)，而每一个PCR扩增片段的前端又被引入了GGCGGAGGCGGATCA序列(编码GlyGlyGlyGlySer);当前一个片段的末端和后一个片段的前端分别经BamHI和Bgin酶切并连接后，用于连接位点处本身会形成GGATCT的序列(编码GlySer);因此当两个片段连接后，连接处就形成了GCCTCCGCCGGATCTGGCGGAGGCGGATCA编码序列，可编码GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer多肽序列，g卩(GGGGS》序列。由于Gly与Ser都是非极性、且侧链较短的氨基酸，具有足够的柔性与灵活度，所以保证了抗病毒蛋白质分子中各活性位点的充分暴露。最终，通过将各个基因片段逐次插入商业化的pET-28a质粒，我们得到了含一个Tat蛋白穿膜肽编码序列和三个不同的胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列的原核表达质粒pTM-NCC，经测序验证表明构建体的读码框架和基因序列完全正确。由于pET-28a本身在插入片段的上下游各有一个组蛋白标签(即6xHis标签)编码序列，所以当该抗病毒蛋白质在原核表达后，其N端和C端会各带有一个6xHis标签编码序列。上述抗病毒蛋白质的全长核苷酸编码序列描述如下ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCTGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCGGAGGCGGATCAGGCGGAGGCGGATCACACCCAGAGATGAGATTCTTCCACTGGTTCAGCAAGTGGAGGAAGCTGCATCGTGACCAGGAGTATGAGGTCACCTGGTACATATCCTGGAGCCCCTGCACAAAGTGTGGCGGAGGCGGATCAGGCGGAGGCGGATCACATGCAGAGCTGTGCTTCCTGGACGTGATTCCCTTTTGGAAGCTGGACCTGGACCAGGACTACAGGGTTACCTGCTTCACCTCCTGGAGCCCCTGCTTCAGCTGTGGCGGAGGCGGATCAGGCGGAGGCGGATCACATGCAGAAAGGTGCTTCCTCTCTTGGTTCTGTGACGACATACTGTCTCCTAACACAAACTACGAGGTCACCTGGTACACATCTTGGAGCCCTTGCCCAGAGTGTGGCGGAGGCGGATCCGTCGACCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA三、抗病毒蛋白质的表达测序正确的pTM-NCC质粒转化BL21(DE3)感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆接种于含氨苄青霉素的2xYT液体培养基中，37℃振荡培养过夜。再以1:100接种量转接到12瓶相同抗性的2xYT液体培养基中，振荡培养至OD600达0.4左右时，其中6瓶加入诱导剂IPTG(isopropylthio-(3-D-galactoside，异丙基-P-D-硫代半乳糖苷)至0.2mmol/L，另外6瓶加入诱导剂IPTG至lmmol/L;再分别按如下条件继续振荡培养37℃4h、37℃6h、30℃4h、30℃6h、25℃4h、25℃6h。即各瓶的诱导和培养条件分别为<table>编号</column></row><row><column></column><column>IPTG浓度</column><column>培养温度</column><column>培养时间1</column></row><row><column></column><column></column><column>0.2mmol/L</column><column>37℃</column><column>4h2</column></row><row><column></column><column>0.2mmol/L</column><column>37℃</column><column>6h3</column></row><row><column></column><column>0.2mmol/L</column><column>30。C</column><column>4h4</column></row><row><column></column><column>0.2mmol/L</column><column>30°C</column><column>6h5</column></row><row><column></column><column>0.2mmol/L</column><column>25°C</column><column>4h6</column></row><row><column></column><column>0.2mmol/L</column><column>25°C</column><column>6h7</column></row><row><column></column><column>1mmoI/L</column><column>37°C</column><column>4h8</column></row><row><column></column><column>1mmol/L</column><column>37°C</column><column>6h9</column></row><row><column></column><column>1mmol/L</column><column>30。C</column><column>4h10</column></row><row><column></column><column>1mmol/L</column><column>30°C</column><column>6h11</column></row><row><column></column><column>1mmol/L</column><column>25°C</column><column>4h12</column></row><row><column></column><column>1mmol/L</column><column>25°C</column><column>6h</column></row><table>完成振荡培养后，分别离心收取诱导后的培养物，PBS(磷酸盐缓冲液)重悬，加入溶菌酶至溶菌酶在培养物中的终浓度为0.5mg/L，并冰浴30min，然后间歇超声3次，每次超声2min。均取100μl超声处理后的悬液，12500g离心10min后，各取沉淀、上清进行15%SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析。SDS-PAGE分析结果显示，IPTG诱导的BL21(DE3)重组菌裂解物在22KD(22千道尔顿)附近有一明显的新增蛋白质条带，此结果与该抗病毒蛋白质的理论推算值相符(抗病毒蛋白质由198个氨基酸组成，理论推算的相对分子质量约22.6KD)。虽然各个温度和IPTG浓度的条件下均能够诱导抗病毒蛋白质的表达，但37℃诱导的抗病毒蛋白质主要以包涵体为主，30℃诱导条件下也有一定量的包涵体，而25℃诱导主要产生可溶性的抗病毒蛋白质。综合分析，选择IPTG浓度0.2mmol/L、25℃6h作为该抗病毒蛋白质的最适表达条件。四、抗病毒蛋白质的纯化利用镍离子亲和层析柱，在非变性条件下纯化重组菌体裂解上清中的可溶性抗病毒蛋白质，其具体步骤为首先，收集诱导后获得的重组菌液500ml，按上述方法超声离心(离心收取诱导后的培养物，PBS重悬，加入溶菌酶至溶菌酶的终浓度为0.5mg/L，并冰浴30min，然后间歇超声3次，每次超声2min，再12500g离心10min)收集上清，经0.45mum滤膜过滤；然后将Ni-NTABind树脂悬于结合缓冲液(50mmol/LNaH2P04、300mmol/LNaCl、10mmol/L咪唑、PH8.0，即每升结合缓冲液含50mmolNaH2PO4、300mmolNaCl、10mmol咪唑)中进行平衡，再吸取过滤后的样品加入此平衡后的树脂，在4'C温度下轻轻振荡lh，使样品和树脂混匀；接着将样品和树脂的混合物转移到层析柱内，待其沉降后，先用洗涤缓冲液(每升洗涤缓冲液含50mmolNaH2PO4、300mmolNaCl和20mmol咪唑，其PH值为8.0)分次洗漆，再用洗脱缓冲液(每升洗涤缓冲液含50mmolNaH2PO4、300mmo1NaCl和250mmo1咪唑，其PH值为8.0)分批洗脱，分管收集洗脱液并进行SDS-PAGE分析；最后将含有目的蛋白质的洗脱液用PBS在4。C温度下透析48h，并参照Bradford法测定蛋白质的浓度，结果见图2中的第5泳道，纯度可达94﹪，得率约为300pg/ml。图2表示抗病毒蛋白质的表达和纯化结果，其中M代表蛋白分子量标准；泳道1.pET-28a质粒转化BL21菌诱导后的上清；泳道2.重组质粒pTM-NCC转化BL21菌诱导后的上清；泳道3.pET-28a质粒转化BL21菌诱导后的沉淀；泳道4.重组质粒pTM-NCC转化BL21菌诱导后的沉淀；泳道5.亲和纯化后的抗病毒蛋白质。实施例2实施例l制备的抗病毒蛋白质的Westernblot检测经过纯化的抗病毒蛋白质以IOpg/ml的终浓度加入到长成单层的HepG2,2.15细胞中(即最终每ml长成单层的HepG2.2.15细胞中含有10吗经过纯化的抗病毒蛋白质)，作为实验组；对照组HepG2.2.15细胞中加入PBS。经过8h后，将细胞裂解提取总蛋白，以抗His标签的小鼠单克隆抗体做Westernblot，利用化学发光法检测。如图3(图3中，M代表蛋白分子量标准；泳道l.对照组HepG2.2.15细胞的Westemblot结果；泳道2.加入抗病毒蛋白质的实验组HepG2.2.15细胞Westemblot结果)所示，实验组细胞在22KD处出现了一明显条带A，与抗病毒蛋白质的分子量相符；而对照组细胞未出现条带。实施例3实施例l制备的抗病毒蛋白质的细胞内定位分析将经过纯化的抗病毒蛋白质以5pg/ml的终浓度加入到长成单层的HepG2.2.15细胞爬片中(即最终每ml长成单层的HepG2.2.15细胞爬片中含有5昭经过纯化的抗病毒蛋白质)，作为实验组；对照组HepG2.2.1518细胞爬片中加入PBS。经过8h后，用4%的多聚甲醛将细胞爬片在室温下固定10min;再加入浓度为0.2G/o的Triton-X100(曲通-X100)，室温下继续固定5min;然后，用抗His标签的小鼠单克隆抗体作为一抗，用Cy3标记的羊抗鼠抗体作为二抗，在荧光显微镜下观察，如图4所示(图4中红色部分显示的是进入细胞桨中的抗病毒蛋白质)，结果发现，抗病毒蛋白质可以进入大多数细胞内，提示它具有很强的穿膜活性；同时，抗病毒蛋白质基本上都位于细胞浆内，与大多数研究所报道的hAPOBEC3G和hAPOBEC3F定位情况相符，提示该抗病毒蛋白质主要在细胞浆中发挥作用。实施例4实施例l制备的抗病毒蛋白质的抗病毒活性检测一、检测抗病毒蛋白质对细胞培养上清中核衣壳相关HBV-DNA的影响实验组HepG2.2.15细胞中加入不同终浓度(分别为0.2pg/ml、0.5|xg/ml、2(ig/ml、5|ig/ml、10|ig/ml、20ng/ml，终浓度指最终加入到每mlHepG2.2.15细胞中的抗病毒蛋白质的总吗数)的抗病毒蛋白质，阴性对照组只加PBS，阳性对照组中加入终浓度20nmol/L的3-TC(拉米夫定)。经过36h后，吸出上清，10000g离心30min，除去沉淀，随后将溶液置于顶层为20%葡萄糖的TNE(10mmol/LTris-HCL、lmmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)、100mmol/LNaCl，PH值为7.4，即每升TNE含lOmmolTris-HCL、lmmolEDTA、100mmolNaCl)上，65000g离心4h。离心后的沉淀经冷PBS重悬后，加入终浓度为10mmol/L的MgCl2，并用200pg/mL的DNaseI(脱氧核糖核酸酶I)和100pg/mL的RNaseA(核糖核酸酶A)在37。C的温度下处理lh。14000g离心lmin后，在上清中加入终浓度为10mmol/L的EDTA、终浓度为1°/。的SDS、终浓度为100mmol/L的NaCl、终浓度为200pg/mL的蛋白酶K，在37'C的温度下处理2h。随后用酚氯仿抽提去除蛋白质，水相中的DNA用酒精沉淀。沉淀下来的DNA再用PH值为8.0的TE(10mmol/LTris-HCL、lmmol/LEDTA，即每升TE中含lOmmolTris-HCL、lmmolEDTA)溶解。利用引物HBV-DF、HBV-DR和SYBRGreenI染料进行实时定量PCR。其中HBV-DF:5，-TCACAATACCGCAGAGTC-3，HBV-DR:5,-AGCAACAGGAGGGATACA-3，如图5所示(图5中，-:阴性对照细胞(只加PBS的阴性对照组)；3TC:拉米夫定(加入拉米夫定的阳性对照组)；ANCC:抗病毒蛋白质(加入抗病毒蛋白质的实验组))，检测结果表明，该抗病毒蛋白质能够降低细胞培养上清中核衣壳相关HBV-DNA的含量，并且随着抗病毒蛋白质浓度的增高，该抗病毒蛋白质抑制HBV的能力也在逐渐增强。二、检测抗病毒蛋白质对细胞浆内核衣壳相关HBV-DNA的影响实验组HepG2.2.15细胞中加入不同终浓度(分别为0.2μg/ml、0.5μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml，终浓度指加入到每mlHepG2.2.15细胞中的抗病毒蛋白质的总μg数)的抗病毒蛋白质，阴性对照组只加PBS，阳性对照组中加入终浓度20μmol/L的3-TC(拉米夫定)。经过36h后，将细胞用冷PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤；洗涤后的细胞再用缓冲液A(10mmol/LHepes-NaOH、1.5mmol/LMgCl2、10mmol/LKC1、0.5mmol/LDTT(二硫苏糖醇)、PH8.0,即每升缓冲液A中含l0mmolHepes-NaOH、1.5mmolMgCl2、l0mmolKCl、0.5mmolDTT)冰上处理15min;再加入浓度为0.5%的NP40(nonidetP-40，非离子型去污剂NP40)涡旋10秒，12500g离心lmin，去除细胞核。上清中加入终浓度为10mmol/L的MgCl2(即加入MgCl2至MgCl2在上清中的最终浓度为10mmol/L)，并用200pg/ml的DNasel和lOOpg/ml的RNaseA在37℃的温度下处理lh;14000g离心lmin，在离心后的上清中加入终浓度为10mmol/L的EDTA、终浓度为1%的SDS、终浓度为100mmol/L的NaCl、终浓度为200μg/ml的蛋白酶K(即在离心后的上清中，EDTA的最终浓度为l0mmol/L,SDS的最终浓度为1%，NaCl的最终浓度为100mmol/L，蛋白酶K的最终浓度为200μg/ml)，在37℃的温度下处理2h。酚氯仿抽提去除蛋白质，水相中的DNA用酒精沉淀下来，再用PH值为8.0的TE(10mmol/LTris-HCL、lmmol/LEDTA)溶解。利用引物HBV-DF、HBV-DR和SYBRGreen染料进行实时定量PCR。其中HBV國DF:5，-TCACAATACCGCAGAGTC-3，HBV－DR:5'誦AGCAACAGGAGGGATACA-3'如图6所示(图6中，-:阴性对照细胞(只加PBS的阴性对照组)；3TC:拉米夫定(加入拉米夫定的阳性对照组)；ANCC:抗病毒蛋白质(加入抗病毒蛋白质的实验组))，检测结果表明，随着抗病毒蛋白质浓度的增高，该抗病毒蛋白质表现出越来越强的抗病毒能力，位于HepG2.2.15细胞浆中的核衣壳相关HBV-DNA的含量逐步降低。三、分析抗病毒蛋白质对细胞浆中包裹于衣壳内的HBV前基因组RNA(核糖核酸)的影响实验组HepG2.2.15细胞中加入抗病毒蛋白质，使其终浓度为10pg/ml(即每mlH印G2.2.15细胞中含10昭抗病毒蛋白质)，对照组只加PBS。经过36h后，用冷PBS洗涤细胞，再用裂解缓冲液(100mmol/LTris-HCL、l腿ol/LEDTA、l%NP-40、PH8.0,即每升裂解缓冲液含lOOmmolTris-HCL、lmmolEDTA、10mlNP-40)处理15min;14000g离心lmin，上清用抗核心抗原的抗体和Sepharose-A蛋白做免疫沉淀。为了破坏病毒的衣壳，将0.7ml裂解缓冲液(RNeasyKit,Qiagen公司)加入到0.2mlSepharose悬浮物中，剧烈涡旋后离心，去除Sepharose株，RNA用硅胶柱吸附，用无RNase(RNA酶)的DNasel(脱氧核糖核酸酶I)消化。利用引物HBV-RF、HBV-RR和SYBRGreen染料进行实时定量RT-PCR。其中HBV-RF为5，画ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT隱3，HBV-RR为5，-ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA-3'如图7所示(图7中，HBV:带有HBV基因组的HepG2.2.15细胞(对照组)；HBV+ANCC:加入了抗病毒蛋白质的HepG2.2.15细胞(实验组))，检测结果发现，终浓度IO)ig/ml的抗病毒蛋白质能够使HBV感染细胞胞浆中包裹于衣壳内的HBV前基因组RNA的含量降低约IO倍左右。上述对实施例1制备的抗病毒蛋白质的抗病毒活性的第一三项检测表明，实施例1制备的抗病毒蛋白质能够有效抑制乙肝病毒(HBV)的复制，可用于制备治疗乙肝病毒(HBV)感染的药物。在其它实施例中，本发明还提供下述三种抗病毒蛋白质(1)这种抗病毒蛋白质的氨基酸序列是MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArg<formula>seeoriginaldocumentpage22</formula>这种抗病毒蛋白质包含一个穿膜肽结构域(GlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgProProGin)和三个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域(这三个胞啼啶脱氨酶结构域依次是来自hAPOBEC3G分子N端的胞嘧啶脱氨酶结构域HisProGluMetArgPhePheHisTrpPheSerLysTrpArgLysLeuHisArgAspGinGluTyrGluValThrTrpTyrlieSerTrpSerProCysThrLysCys、来自hAPOBEC3F分子C端的胞嘧啶脱氨酶结构域HisAlaGluArgCysPheLeuSerTrpPheCysAspAsplieLeuSerProAsnThrAsnTyrGluValThrTrpTyrThrSerTrpSerProCysProGluCys、来自hAPOBEC3G分子C端的胞嘧啶脱氨酶结构域HisAlaGluLeuCysPheLeuAspVallieProPheTrpLysLeuAspLeuAspGinAspTyrArgValThrCysPheThrSerTrpSerProCysPheSerCys)，穿膜肽结构域和各胞嘧啶脱氨酶结构域形成串联体，穿膜肽结构域和胞嘧啶脱氨酶结构域之间、相邻两个胞嘧啶脱氨酶结构域之间用柔性连接肽(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)连接，抗病毒蛋白质的N端和C端各有一个蛋白质纯化标签(HisHisHisHisHisHis)。(2)这种抗病毒蛋白质的氨基酸序列是<formula>seeoriginaldocumentpage22</formula><sequence>seeoriginaldocumentpage23</sequence>这种抗病毒蛋白质包含一个穿膜肽结构域<sequence>seeoriginaldocumentpage23</sequence>和三个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域(这三个胞嘧啶脱氨酶结构域依次是来自hAPOBEC3G分子C端的胞嘧啶脱氨酶结构域<sequence>seeoriginaldocumentpage23</sequence>、来自hAPOBEC3F分子C端的胞嘧啶脱氨酶结构域<sequence>seeoriginaldocumentpage23</sequence>)，穿膜肽结构域和各胞嘧啶脱氨酶结构域形成串联体，穿膜肽结构域和胞嘧啶脱氨酶结构域之间、相邻两个胞嘧啶脱氨酶结构域之间用柔性连接肽(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)连接，抗病毒蛋白质的N端和C端各有一个蛋白质纯化标签(HisHisHisHisHisHis)。(3)这种抗病毒蛋白质的氨基酸序列是<sequence>seeoriginaldocumentpage23</sequence>HeTyrArgValThrTrpPheHeSerTrpSerProCysPheSerTrpGlyCysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerHisValGluArgCysPheSerTrpPheCysAspAspHeLeuSerProAsnThrAsnTyrGluValThrTrpTyrThrSerTrpSerProCysProGluCysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerHisValGluArgCysSerHeThrTrpPheLeuSerTrpSerProCysGlyGluCysGlyGlyGlyGlySerValAspLeuGluHisHisHisHisHisHis这种抗病毒蛋白质包含一个穿膜肽结构域(GlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgProProGln)和四个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域(这三个胞嘧啶脱氨酶结构域依次是来自hAPOBEC3G分子N端的胞嘧咬脱氨酶结构域HisProGluMetArgPhePheHisTrpPheSerLysTrpArgLysLeuHisArgAspGinGluTyrGluValThrTrpTyrlieSerTrpSerProCysThrLysCys、来自hAPOBEC3B分子C端的胞嘧啶脱氨酶结构域HisAlaGluLeuArgPheLeuAspLeuValProSerLeuGinLeuAspProAlaGinlieTyrArgValThrTrpPhelieSerTrpSerProCysPheSerTrpGlyCys、来自hAPOBEC3F分子C端的胞嘧啶脱氨酶结构域HisAlaGluArgCysPheLeuSerTrpPheCysAspAsplieLeuSerProAsnThrAsnTyrGluValThrTrpTyrThrSerTrpSerProCysProGluCys、来自rAPOBECl分子的胞嘧啶脱氨酶结构域HisValGluValAsnPhelieGluLysPheThrThrGluArgTyrPheCysProAsnThrArgCysSerlieThrTipPheLeuSerTrpSerProCysGlyGluCys)，穿膜肽结构域和各胞嘧啶脱氨酶结构域形成串联体，穿膜肽结构域和胞嘧啶脱氨酶结构域之间、相邻两个胞嘧啶脱氨酶结构域之间用柔性连接肽(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)连接，抗病毒蛋白质的N端和C端各有一个蛋白质纯化标签(HisHisHisHisHisHis)。上述三种抗病毒蛋白质的制备过程可参照实施例1。序列表<110>汕头大学医学院<120>—种抗病毒蛋白质及其应用<160>5<170>PatentinVersion3.3<210>1<211>597<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>CDS<222>(1)...(597)<220><221>misc—feature<222>(13)...(30)<223>N端6xHis标签编码序列<220><221>misc—feature<222>(103)...(141)<223>穿膜肽结构域编码序列<220><221>misc—feature<222>(142)...(171)<223>柔性连接肽结构域编码序列<220><221>misc—feature<222>(172》..(279)<223>hAPOBEC3G分子N端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列<220><221>misc—feature<222>(280)…(309)<223>柔性连接肽结构域编码序列<220><221>misc一feature<222>(310),..(414)<223>hAPOBEC3G分子C端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列<220><221>misc—feature<222>(415)…(444)<223>柔性连接肽结构域编码序列<220><221>misc—feature<222>(445)…(549)<223>hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脱氨酶结构域编码序列<220><221>misc—feature<222>(577)…(594)<223>C端6xHis标签编码序列<400>1atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccat60atggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatctggcaggaagaagcggaga120cagcgacgaagacctcctcsaggcggaggcggatcaggcggaggcggatcacacccagag180atgagattcttccactggttcagcaagtggaggaagctgcatcgtgaccaggagtatgag240gtcacctggtacatatcctggagcccctgcacaaagtgtggcggaggcggatcaggcgga300ggcggatcacatgcagagctgtgcttcctggacgtgattcccttttggaagctggacctg360gaccaggactacagggttacctgcttcacctcctggagcccctgcttcagctgtggcgga420ggcggatcaggcggaggcggatcacatgcagaaaggtgcttcctctcttggttctgtgac480gacatactgtctcctaacacaaactacgaggtcacctggtacacatcttggagcccttgc540ccagagtgtggcggaggcggatccgtcgscctcgagcaccaccaccaccaccactga597<210>2<211>198<212>PRT<213>人工序列<220><221>DOMAIN<222>(5)...(10)<223>N端6xHis标签<220><221>DOMAIN<222>(35)…(47)<223>穿膜肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(48)…(57)<223>柔性连接肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(58)...(93)<223>hAPOBEC3G分子N端胞嘧徒脱氨酶结构域<220><221>DOMAIN<222>(94)…(103)<223>柔性连接肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(104)...(138)<223>hAPOBEC3G分子C端胞嘧瞎脱氨酶结构域<220><221>DOMAIN<222>(139)...(148)<223>柔性连接肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(149),..(183)<223>hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脱氨酶结构域<220><221>DOMAIN<222>(193)...(198)〈223〉C端6xHis标签<400>2MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro151015<sequence>seeoriginaldocumentpage29</sequence><210>3<211>198<212>PRT<213>人工序列<220><221>DOMAIN<222>(5)...(10)<223>N端6xHis标签<220><221>DOMAIN<222>(35)...(47)<223>穿膜肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(48)...(57)<223>柔性连接肽结构域<220><221〉DOMAIN<222>(58)...(93)<223>hAPOBEC3G分子N端胞嘧啶脱氨酶结构域<220><221>DOMAIN<222>(94)...(103)<223>柔性连接肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(104)...(138)<223>hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脱氨酶结构域<220><221>DOMAIN<222>(139)...(148)<223>柔性连接肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(149)...(183)<223>hAPOBEC3G分子C端胞嘧啶脱氨酶结构域<220><221>DOMAIN<222>(193)...(198)〈223〉C端6xHis标签<400>3<formula>seeoriginaldocumentpage31</formula><sequence>seeoriginaldocumentpage32</sequence>人工序列<sequence>seeoriginaldocumentpage32</sequence><sequence>seeoriginaldocumentpage32</sequence><221>DOMAIN<222>(48)...(57)<223>柔性连接肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(58)...(92)<223>hAPOBEC3G分子C端胞嘧徒脱氨酶结构域<220><221>DOMAIN<222>(93)...(102)<223>柔性连接肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(103)...(137)<223>hAPOBEC3B分子N端胞嘧啶脱氨酶结构域<220><221>DOMAIN<222>(138)...(147)<223>柔性连接肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(148)...(182)<223>hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脱氨酶结构域<220><221>DOMAIN<222>(192)...(197)〈223〉C端6xHis标签<400>4MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro151015ArgGlySerHisMetAlaSerMetThrGlyGlyGinGinMetGlyArg202530GlySerGlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgProProGinGly354045GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerHisAlaGluLeuCysPheLeu505560AspVallieProPheTrpLysLeuAspLeuAspGinAspTyrArgVal65707580ThrCysPheThrSerTrpSerProCysPheSerCysGlyGlyGlyGly859095SerGlyGlyGlyGlySerHisAlaGluMetCysPheLeuSerTrpPhe100105110CysGlyAsnGinLeuProAlaTyrLysCysPheGlnIleThrTrpPhe115120125ValSerTrpThrProCysProAspCysGlyGlyGlyGlySerGlyGly130135140GlyGlySerHisAlaGluArgCysPheLeuSerTrpPheCysAspAsp145150155160IleLeuSerProAsnThrAsnTyrGluValThrTrpTyrThrSerTrp165170175SerProCysProGluCysGlyGlyGlyGlySerValAspLeuGluHis180185190HisHisHisHisHis195<210>5<211>246<212>PRT<213>人工序列<220><221>DOMAIN<222>(5)…(10)23>N端6xHis标签<220><221>DOMAIN<222>(35)...(47)<223>穿膜肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(48)…(57)<223>柔性连接肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(58)...(93)<223>hAPOBEC3G分子N端胞嘧啶脱氨酶结构域<220><221>DOMAIN<222>(94)…(103)<223>柔性连接肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(104)...(140)<223>hAPOBEC3B分子C端胞嘧啶脱氨酶结构域<220><221>DOMAIN<222>(141)...(150)<223〉柔性连接肽结构域<220><221〉DOMAIN<222>(151)...(185)<223>hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脱氨酶结构域<220><221>DOMAIN<222>(186)...(195)<223〉柔性连接肽结构域<220><221>DOMAIN<222>(196)...(231)<223>rAPOBECl分子胞嘧啶脱氨酶结构域<220〉<221>DOMAIN<222>(241)…(246)〈223〉C端6xHis标签<400>5<formula>seeoriginaldocumentpage36</formula><sequence>seeoriginaldocumentpage37</sequence>权利要求1、一种抗病毒蛋白质，其特征在于它是融合蛋白质，包含穿膜肽结构域和至少二个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域，穿膜肽结构域和各胞嘧啶脱氨酶结构域形成串联体。2、根据权利要求l所述的抗病毒蛋白质，其特征是所述抗病毒蛋白质包含至少三个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域。3、根据权利要求2所述的抗病毒蛋白质，其特征是所述抗病毒蛋白质中的胞嘧啶脱氨酶结构域来自三种不同的APOBEC家族成员。4、根据权利要求2所述的抗病毒蛋白质，其特征是所述抗病毒蛋白质包含至少四个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域。5、根据权利要求4所述的抗病毒蛋白质，其特征是所述抗病毒蛋白质中的胞嘧啶脱氨酶结构域来自至少三种不同的APOBEC家族成员。6、根据权利要求15任一项所述的抗病毒蛋白质，其特征是所述来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域所具有的核心基序是H-X-E-(X)23-28-P-C-(X)2-4-C，其中H为组氨酸，E为谷氨酸，C为半胱氨酸，P为脯氨酸，X代表任意氨基酸。7、根据权利要求15任一项所述的抗病毒蛋白质，其特征是构成所述穿膜肽结构域的序列是下述具有穿膜肽活性的序列中的一种GRKKRRQRRRPPQ序列；DMTARGRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD序列；RKKRRQRRR序列；GALFLGWLGMGSTMGAWSQPKKKRKV序列；RQIKIWFQNRRMKWKK序列；GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL序列；KLALKLAALKAALKLA序列；RRRRRRRRR序列；AAVALLPAVLLALLAP序列。8、根据权利要求15任一项所述的抗病毒蛋白质，其特征是所述抗病毒蛋白质中的胞嘧啶脱氨酶结构域是来源于AP0BEC家族中的人AP0BEC3G、人AP0BEC3F、人AP0BEC3B和大鼠AP0BEC1这四种蛋白质分子的胞嘧啶脱氨酶结构域。9、根据权利要求15任一项所述的抗病毒蛋白质，其特征是所述抗病毒蛋白质中各结构域之间用柔性连接肽连接。10、根据权利要求9所述的抗病毒蛋白质，其特征是所述柔性连接肽是GGGG、GSSSG、GSGGSG、GGGGS、(GGGGS)2和(GGGGS)3中的一种或者任意多种的组合。11、权利要求110的抗病毒蛋白质在制备治疗人类免疫缺陷病毒感染的药物中的应用。12、权利要求110的抗病毒蛋白质在制备治疗乙肝病毒感染的药物中的应用。全文摘要一种抗病毒蛋白质，其特征在于它是融合蛋白质，包含穿膜肽结构域和至少二个来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域，穿膜肽结构域和各胞嘧啶脱氨酶结构域形成串联体。本发明抗病毒蛋白质中，穿膜肽结构域使抗病毒蛋白质具有穿膜能力，能够在细胞之间进行自由穿梭，并以一种非受体、非能量依赖的方式进入细胞内；来源于APOBEC家族的胞嘧啶脱氨酶结构域使得抗病毒蛋白质在进入细胞之后，能够有效抑制人类免疫缺陷病毒和/或乙型肝炎病毒的复制；由于去除了APOBEC家族蛋白质分子中的非必需序列，因而不仅保留了APOBEC家族蛋白质分子的抗病毒活性，而且降低了抗病毒蛋白质的免疫原性，并提高了抗病毒蛋白质的穿膜效率。文档编号C07K19/00GK101343327SQ20081003022公开日2009年1月14日申请日期2008年8月13日优先权日2008年8月13日发明者衡张,张丹桂,俊曾,李卫中,李康生,王革非,芸苏,岗辛,陈小璇,陈幼莹申请人:汕头大学医学院