专利名称：：一种利用体细胞转染制备高表达人乳铁蛋白转基因山羊的方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程及转基因动物领域，特别涉及一种乳腺特异性表达融合基因，含该基因的载体和细胞，乳汁可高效表达rhLF的转基因山羊，以及一种制备乳腺生物反应器的方法。
背景技术：
：人乳铁蛋白(HumanLactoFerrin,hLF)是一种铁离子结合糖蛋白，在人体内分布很广，于人乳的初乳中含量最丰富，浓度可达6g/L，在哺乳期乳汁中浓度为12g/L，它还存在于泪液、汗液、唾液、肠粘液、鼻和生殖器等分泌物中，以及成熟的中性粒细胞颗粒中。人乳铁蛋白是一种多功能蛋白质，具有广谱抗菌作用，能调节体内铁的平衡，调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长，还具有免疫调节作用，因此人乳铁蛋白在治疗、营养补充、食品及化妆品和药品的防腐等方面有着广阔的应用前景。人们曾经尝试用哺乳动物细胞、昆虫细胞培养和微生物发酵等传统方法表达重组人乳铁蛋白(rhLF)，但均因蛋白表达量低或生产成本高或纯化过程复杂等缺点，未能实现大规模的工业化生产。目前，rhLF在转基因动物和植物中得到了成功表达。其中，转基因哺乳动物乳腺生物反应器(MammaryGlandBioreactor)具有产量高、成本低、纯化简单等优点，倍受重视。利用乳腺特异性表达载体来获得乳腺特异表达的蛋白己有诸多研究，如Simmons，J.P.etal.(1987)Nature328:530-532报道了利用显微注射的方法制备含山羊(3-乳球蛋白的转基因小鼠；含od-抗胰蛋白酶的转基因绵羊(Simmons，J.P.,etal.(1989)Bio/Technology6:179-183);含大鼠P-酪蛋白的转基因小鼠等(Lee,eta1.(1988)Nucl.AcidsRes.l6:1027-1041.)。另外，一些与乳腺特异性表达外源蛋白有关的专利也相继出版，如PCTNo.WO88/00239描述了乳清蛋白特异性启动子调控凝血因子IX的表达等。PCTNo.6140552详细全面的阐述了采用不同乳蛋白调控区调控外源蛋白的组合表达情况。该专利中，采用16kb的牛as15调控区及8kb的牛as13调控区及人乳铁蛋白cDNA的组合，获得了rhLF最高表达量为0.2mg/ml的转基因小鼠；采用同样的调控区来调控人乳铁蛋白基因组DNA，获得了rhLF最高表达量为8.7mg/ml的转基因小鼠，采用8kb的牛BLG5调控区来调控人乳铁蛋白基因组DNA的表达，获得了rhLF最高表达量为27mg/ml的转基因小鼠。从该专利可知人乳铁蛋白基因组DNA相比乳铁蛋白cDNA，更有可能获得较高的表达量。迄今为止，可利用转基因动物生产有生物活性的重组人乳铁蛋白已有共识。在利用转基因小鼠进行调控框架研究的基础上，荷兰的Pharming公司首次获得了人乳铁蛋白表达量为lg/L的转基因牛。2005年中国农业大学李宁教授利用含人乳铁蛋白基因组的BAC获得表达rhLF的转基因牛，最高达3.4g/L。然而，利用转基因牛生产rhLF尚存在一些缺陷,如繁殖速度慢(初配年龄在1.52岁，孕期达280天)和存在潜在的安全性问题(如可能携带有感染人的疯牛病病毒，能够引起儿童过敏反应)等。反之，山羊作为载体的优点有(1)繁殖速度快(57月龄即可性成熟，孕期150天)；(2)产乳量大(单只年产奶量达750L);(3)圈养方便和安全性高等。至今尚无山羊瘙痒病毒传染人的报道,且转基4因山羊乳汁中表达的蛋白己有被批准为人用药物的先例。因此，目前还有必要进一步研究利用山羊乳腺生物反应器高表达rhLF的方法，以及制备乳腺高表达乳铁蛋白的动物，以期进一步提高乳铁蛋白的产量，降低乳铁蛋白生产成本。
发明内容本发明的目的在于提供-种乳腺特异性表达融合基因，含该基因的载体和细胞，乳汁可高效表达人乳铁蛋白的转基因山羊，以及制备乳腺生物反应器的方法。在本发明的第一方面，提供一种乳腺特异性表达融合基因，该融合基因从5至3依次包含以下操作性相连的元件山羊e-酪蛋白基因(e-casein)5调控序列，人乳铁蛋白(hLF)基因序列，牛生长激素多聚A(BghPA)序列，山羊(3-酪蛋白基因3序列。在一个优选例中，所述的人乳铁蛋白基因序列(也称为小基因序列)包含人乳铁蛋白cDNA序列，人乳铁蛋白内含子15序列。在另一优选例中，所述的人乳铁蛋白小基因序列具有(a)SEQIDNO:l中第3824-7125所示的基因序列；或(b)在严格条件下与(a)限定的DNA序列杂交且编码人乳铁蛋白的基因序列。在另一优选例中，所述的人乳铁蛋白具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。在一个优选例中，所述的山羊P-酪蛋白基因5调控序列(3.8kb)从5至3依次包含山羊P-酪蛋白基因5侧冀序列，和外显子l、外显子2非编码序列；或所述的山羊e-酪蛋白基因3序列(3.2kb)包含山羊P-酪蛋白外显子6-9序列。在另一优选例中，所述的山羊e-酪蛋白基因5侧冀序列包含山羊P-酪蛋白基因转录起始位点上游-3817-l(kb)位。在另一优选例中，所述的山羊P-酪蛋白基因5调控序列具有(i)SEQIDNO:l中第1-3817位所示的基因序列；或(ii)在严格条件下与(i)限定的DNA序列杂交且具有与(i)的序列相同调控作用的基因序列。在另一优选例中，所述的5调控序列如下制备以SEQIDNO:4，和SEQIDNO:5为引物，以山羊基因组为模板PCR扩增克隆至pGEM-TEASY载体上，HindIII，Xhol双酶切回收约3.8kb产物。在另一优选例中，所述的山羊e-酪蛋白基因3序列具有(l)SEQIDNO:l中第8598-11819位所示的基因序列；或(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且具有与(l)的序列相同调控作用的基因序列。在另一优选例中，所述的山羊e-酪蛋白基因3序列包含山羊e-酪蛋白基因1003813259(kb)位。在另一优选例中，所述的3序列如下制备以SEQIDNO:6，和SEQIDNO:7为引物，以山羊基因组为模板PCR扩增，收集约3.2kb产物。在另一优选例中，所述的牛生长激素多聚A具有(A)SEQIDNO:1中第7134-7365位所示的基因序列；或(B)在严格条件下与(A)限定的DNA序列杂交且具有与(A)的序列相同调控作用的基因序列。在另一优选例中，在牛生长激素多聚A序列和山羊(3-酪蛋白基因3序列之间还包含一抗性标记基因。在另一优选例中，所述的抗性标记基因是新霉素(Neo)抗性基因。在另一优选例中，所述的抗性标记基因具有SEQIDNO:1中第7769-8550位所示的基因序列。在另一优选例中，所述的融合基因基本上由山羊P-酪蛋白基因5调控序列，人乳铁蛋白小基因序列，牛生长激素多聚A序列，抗性标记基因，山羊(3-酪蛋白基因3序列构成。各元件之间可以存在用于连接的序列，如酶切位点的序列。在本发明的第二方面，提供一种表达载体，该载体含有所述的融合基因。在本发明的第三方面，提供一种细胞，所述的细胞含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的融合基因。在本发明的第四方面，提供一种制备高产人乳铁蛋白的转基因动物的方法，它包括步骤(a)将所述的融合基因转染体细胞，获得基因组中整合有融合基因的转基因细胞；(b)将(a)获得的转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得可高产rhLF的动物。在另一优选例中，步骤(a)中，所述的体细胞为动物胎儿成纤维细胞。在另一优选例中，所述的动物为山羊、绵羊、牛、猪、兔。更佳的，所述的动物为山羊。在本发明的第五方面，提供一种生产rhLF的方法，它包括步骤-培养所述方法制得的转基因动物，从动物乳腺分泌的乳汁中分离纯化出表达的rhLF。另一方面，还提供一种转基因动物的乳汁，它含有浓度5-100mg/ml的rhLF，更特别的含有浓度为10-50mg/ml的rhLF。图l是载体pBSK-BC的构建流程图。图2是人乳铁蛋白小基因(hLFmini)的构建流程图。图3是人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体pBSK-BC-hLF-Neo的构建流程图。图4是人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体的主要结构图。图5是转染后筛选弁123号细胞克隆的PCR分析图。泳道l、2、3为LF123细胞克隆分别用引物F8152和R9552、F6806和R8260、F6082和R7269扩增出1.4kb，1.4kb，1.2kb的条带；泳道4、5、6是正常羊以同样引物扩增结果，为阴性对照；泳道7,8，9是载体pBSK-BC-hLF-Neo以同样引物扩增结果，为阳性对照。图6是转染后筛选弁123号细胞克隆的Southern杂交图。箭头所指为#123细胞基因组经Xhol酶切后，用hLF小基因进行杂交，结果出现3.3kb的条带，另一条带为质粒经XhoI酶切后杂交所得阳性对照。图7是LF123克隆羊初乳的SDS-PAGE电泳图。其中，l为标准蛋白Marker，2为正常羊乳，3为5ug的乳铁蛋白标准品，4-10分别为产后每隔2天的羊乳经20倍稀释后上样，每孔上样2ul。图8是LF123克隆羊及正常羊乳的SDS-PAGE电泳图。其中，l为标准蛋白Marker，2为正常羊乳，3为5"g的乳铁蛋白标准品，4-10分别为产后第5天起，每3天收集一次的羊乳，经20倍稀释后上样，每孔上样2ul。图9是LF123克隆羊羊乳的Western-blot检测图。其中，l-4为原奶稀释400倍后取4nL、3pL、2nL和l^L上样；5-8为400ng、300ng、200ng和100ng的hLF标准品上样。图10为LF123克隆羊羊乳ELISA标准曲线图。图ll为离子交换柱纯化重组人乳铁蛋白时的梯度洗脱图。其中，A为盐浓度梯度洗脱时的峰形图，l为盐浓度变化图，2为光吸收值；B为所收集的各样品SDS-PAGE结果，样品1为乳清，2为峰1处收集液，3为峰2处收集液；C示nhLF与B中样品3的Western-blot结果。图12为质谱法测rhLF分子量。图13为等电聚焦法测rhLF的等电点。图14为rhLF去糖基处理后分子量变化。其中，泳道1和3是糖苷酶处理前，rhLF和nhLF的分子量；泳道2和4是糖苷酶处理后，rhLF和nhLF的分子量。图15为nhLF及rhLF的铁结合特性。图16为nhLF及rhLF的铁释放特性。图17为rhLF的铁释放可逆性。图18为铁结合释放后乳铁蛋白SDS-PAGE电泳结果及WESTERN-BLOT检测结果。A为SDS-PAGE结果，25依次为rhLF、铁结合rhLF、铁释放rhLF和天然hLF。B为Western-blotting结果，样品依次为天然hLF、铁释放rhLF、铁结合rhLF和rhLF。图19为rhLF对四种临床分离菌株的抑制率图。图20为乳腺特异性表达载体pBCl-hLF主要结构图。图21为乳腺特异性表达载体pBLG-hLF主要结构图。具体实施例方式本发明人经过广泛的研究，意外地发现将依次包含山羊e-酪蛋白基因5调控序列、人乳铁蛋白小基因序列、牛生长激素多聚A(BghPA)序列、山羊(3-酪蛋白基因3序列的融合基因转染到细胞中，将该转基因细胞作为核供体制备转基因动物，可获得乳汁中高表达rhLF(达到或高于20mg/ml)的转基因动物。并且，表达的rhLF与天然人乳铁蛋白大小一致，具有相同或相似的免疫学及生物学活性。如本文所用，所述的"可操作地连接"是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如山羊e-酪蛋白基因5调控序列和3序列被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得目的基因的转录或表达受到该区域的调控。如本文所用，所述的"高表达rhLF"是指转基因动物的乳汁中rhLF的含量高于一般的动物。作为本发明的优选方式，所述的"高表达rhLF"是指乳汁中rhLF的含量高于5mg/ml;较佳的高于10mg/ml;更佳的高于20mg/ml。如本文所用，术语"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由构成"、"基本上由构成"、和"由构成"。7由于乳铁蛋白基因组长度约28kb左右，再加上调控区的序列，使得整个基因构件操作起来较为困难。为了获得乳汁中高表达rhLF的转基因动物，本发明人反复比较了各种预计可用于调节hLF表达的功能性元件，最终找到了较佳的元件组合。该元件组合为以山羊e-酪蛋白基因5调控序列为乳腺特异表达的调控序列，以人乳铁蛋白小基因序列为编码基因，以牛生长激素多聚A序列为加尾信号，这些元件被可操作性地相连接。较佳地，在牛生长激素多聚A序列和山羊(3-酪蛋白基因3序列之间还包含一抗性标记基因，用于抗性筛选。更佳地，所述的抗性标记基因是新霉素抗性基因。在目的基因的选择方面，本发明人发现，内含子对乳铁蛋白的转基因表达具有重要作用，其可能会含有增强子元件或其它顺式调控序列，能够同转录因子结合而有效提高转录的起始和延伸，或者其可能存在转录后依赖剪接的增强表达机制。本发明人意外地发现，在人乳铁蛋白的cDNA中插入乳铁蛋白的内含子15，可有效起到提高乳铁蛋白表达量的效果。本发明提供了利用山羊P-酪蛋白相似的调控区调控乳铁蛋白小基因及cDNA的对照，发现在相似的调控区作用下，利用人乳铁蛋白cDNA的表达量远低于发明所构建的小基因的表达量。较佳的，所述的人乳铁蛋白小基因序列具有SEQIDNO:l中第3824-7125位所示的核苷酸序列，编码具有SEQIDNO:3所示序列的蛋白。本发明还涉及SEQIDNO:l的变异体，其编码SEQIDNO:3的蛋白或该蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。在乳腺特异性表达调控区的选择方面，本发明人发现山羊l3-酪蛋白基因有很强的表达活性，因此选择其调控区来调控hLF表达。较佳的，所述的山羊P-酪蛋白基因5调控序列从5至3依次包含山羊P-酪蛋白基因5侧冀序列，和外显子l、外显子2非编码序列。其中，所述的山羊p-酪蛋白基因5侧冀序列包含山羊e-酪蛋白基因转录起始位点上游-3817-lkb的序列。本发明中采用上述约3.8kb的5调控序列是获得高表达一个较为重要的因素。所述的山羊p-酪蛋白基因3序列包含山羊P-酪蛋白外显子6-9序列，即山羊卜酪蛋白基因第1003813259位序列。本发明人还采用了牛生长激素PolyA来提高转录后乳铁蛋白分子的的稳定性。牛生长激素多聚A具有保护mRNA的稳定性，增强翻译活性的作用。一般乳腺特异性表达载体中功能基因的PolyA常来自于功能基因本身的PolyA或乳蛋白调控区的3侧翼序列。而本发明中，选择将牛生长激素PolyA加在人乳铁蛋白功能基因之后，从而起到增强人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体转录后mRNA的稳定性的作用，增强翻译功能，为高表达提供了又一可能因素。本发明还涉及与上述的人乳铁蛋白编码序列(或山羊e-酪蛋白基因5调控序列、或牛生长激素多聚A序列、或山羊p-酪蛋白基因3序歹!])杂交且两个序列之间具有至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与所述各多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指(l)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2XSSC，0.1%SDS，6(TC;或(2)杂交时加有变性剂，如50。/。(vA0甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42。C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性8至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。'本发明还提供了含有前面所述的融合基因的重组表达载体。用于构建所述重组表达载体的原始载体没有特别的限制，例如是pBluescriptIISK载体。本发明还提供了一种细胞，所述的细胞含有所述的重组表达载体，或其基因组中整合有所述的融合基因。优选的，所述的细胞是动物胎儿成纤维细胞。本发明还提供了一种制备高产人乳铁蛋白的转基因动物的方法，包括(a)将所述的融合基因转染体细胞，获得基因组中整合有融合基因的转基因细胞；(b)将(a)获得的转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得可高产人乳铁蛋白的动物。作为本发明的优选方式，所述的细胞为动物胎儿成纤维细胞。所述的动物可以为山羊、绵羊、牛、猪、兔；较佳的是山羊。作为一个优选的实施方式，所述方法包括(l)构建含有上述融合基因的乳腺特异性表达载体；(2)将表达载体通过电转染的方法导进动物胚胎成纤维细胞；(3)抗性筛选获得整合阳性细胞克隆；(4)确证阳性细胞中整合外源基因的完整性；(5)转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转基因克隆动物；(6)转基因克隆动物自然泌乳，获得乳汁中高表达外源蛋白的转基因动物。在转基因动物的生产方法方面，最常用的是将获得的合适的外源调控组合元件通过显微注射受精卵的方法制备转基因动物。但显微注射的整合率极低，而且由于整合位点的不明确，可能会导致转入基因不表达或极低水平表达。本发明通过将外源基因调控组合转染胎儿成纤维细胞，在细胞中加入抗性基因筛选。只有抗性基因正常表达的细胞克隆才能生长，而抗性基因的表达至少可以说明含包含抗性基因的基因构件整合于常染色质区，能被正常转录和翻译，是功能基因得到表达的前提。同时，在细胞水平上进行整合检测，确保外源基因完整的整合到细胞基因组中。最后将经过抗性筛选，整合检测无误的细胞用于核移植，得到的克隆动物外源基因的整合率为100%，大大提高了转基因效率。同时，本方法还可以控制原代转基因动物的性别，选择雌性胎儿来制备动物细胞，得到的含外源基因的克隆动物即为母羊，可尽早进行催乳以了解转基因动物中外源基因的表达情况，縮短高表达动物的扩群周期。更具体地，本发明人首先构建了hLF的乳腺特异性表达构件pBSK-BC-hLF-Neo。该构件包含山羊e酪蛋白基因的5'调控序列、含内含子15的乳铁蛋白小基因序列和牛生长激素的polyA加尾信号序歹U，Neo抗性基因和e酪蛋白基因的3序歹ij。为了获得整合有hLF的细胞，用限制性内切llNotl将pBSK-BC-hLF-Neo中的人乳铁蛋白的乳腺特异表达框架切出，电穿孔方法转染雌性山羊胎儿成纤维细胞，G418筛选出抗性单克隆细胞株，再通过PCR和基因组Southern-blot的双重鉴定，获得含人乳铁蛋白的转基因细胞。再用含hLF的转基因细胞作为供核，山羊的卵母细胞作为供质，进行体细胞克隆。获得了l头成活克隆羊，经PCR和Southern-blot分析，表明该羊为人乳铁蛋白的转基因山羊，该羊命名为LF123。对LF123转基因山羊产羔后所产羊奶收集后进行分析，获得的乳汁经SDS-PAGE和Western-blot分析表明人乳铁蛋白在这头山羊的乳汁获得了高效表达，分子量与天然人乳铁蛋白的分子量相当，约78kD。定量分析表明，LF123乳汁中人乳铁蛋白的表达量大于20mg/ml。对LF123与正常奶山羊配种所获6只后代进行检测，其中有两只整合有外源基因，整合率为33%，符合孟德尔遗传规律，说明转入外源基因可经生殖系稳定遗传。本发明人采用山羊(3-casein5调控序列调控人乳铁蛋白小基因的表达，获得了稳定表达量大于20mg/ml的转基因山羊。而采用相似P-casein调控序列来调控人乳铁蛋白cDNA的表达，获得表达量为0.576mg/ml与0.311mg/ml的转基因山羊，远低于采用基因组DNA及小基因DNA为功能基因时的表达量。本发明人的研究结果显示利用含乳铁蛋白第15内含子的乳铁蛋白小基因为功能基因可获得与乳铁蛋白基因组DNA相似的效果，远远高于cDNA作为功能基因时的表达量。经鉴定，转基因山羊乳腺表达的rhLF表现出与nhLF同样的铁结合、铁释放特性，表明rhLF不仅在乳腺中进行了正确的翻译后折叠，而且保持完整的N端、C端环状结构，此外，纯化过程也不会改变其结构。抑菌试验表明，转基因山羊乳腺表达的rhLF具有强抑菌活性，且具有广谱的抑菌效果。本发明还提供了由采用前述方法制备的转基因动物的乳汁，它含有浓度5-100mg/ml的rhLF，更特别的含有10-50mg/ml的rhLF。人乳铁蛋白可从所述的乳汁中通过适当的蛋白分离纯化方法获得。所述的分离或纯化可采用本领域技术人员熟知的技术。例如可采用离子交换、亲和层析等技术。可通过常规的SDS-PAGE电泳分析纯化各步的纯化效果。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例l:乳腺特异性表达载体pBSK-BC的制备基因构建过程如图l所示，所构建的为山羊P-酪蛋白调控的乳腺特异性表达构件。1.各部分元件的来源(1)山羊(3-酪蛋白5调控区山羊(3-酪蛋白((3-Casein)5侧翼序列和外显子1，2非编码序列部分用常规方法制备本地萨能奶山羊基因组DNA。设计并合成如下引物BC5GTCGACTGCTCCTCATTCAGGGTTAT(SEQIDNO:4)，BC5CTCGAGGGCTCTCGATTCCTGTGAA(SEQIDNO:5)。通过PCR(94°C5min;94。Clmin;60°C45s;72°C4min，30个循环)扩增P-Casein5片段。扩增产物克隆至pGEM-TEASY载体(Invitrogen)上，命名为TA5。(2)山羊P-酪蛋白3调控区山羊J3-酪蛋白外显子6-9序歹iJ。设计如下引物BC3s，CTCGAGAGGAACAACAGCAAACAGAGG(SEQIDNO:6)，BC3a，GGTACCTTGCCATATTTCCAGTCGCAG(SEQIDNO:7)，以本地山羊基因组DNA为摸板，用PCR法(94°C，5min;94°C，lmin;60°C45s;72°C3min，30个循环)扩增3.2kb的(3-Casein3区。将该片段克隆至pGEM-TEASY载体上，命名为TA3。2.pBSK-BC载体构建将TA-5用HindIII(扩增产物内部)及Xhol酶切，回收3.8kb片段，载体10pBluescript-SK(Invitrogen)用HindIII及SalI双切，回收载体，片段与载体以l:3混合后连接，筛出重组克隆pBSK-BC5。将TA-3用XhoI及KpnI酶切，回收3.2kb片段，载体pBSK-BC5用XhoI及KpnI酶切，回收载体后连接，筛选出重组克隆pBSK-BC。实施例2:重组人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体pBSK-BC-HLF的构建含有人乳铁蛋白cDNA的载体(pGEM-T(Easy)-hLFcDNA)，其中人乳铁蛋白的cDNA序列如SEQIDNO:2所示，编码具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列的蛋白。用EcoRV和Ndel酶切该载体，收集hLF片段并插入到pET-30a(+)(获自Novagen)中，获得pET-30a(+)-hLF片段。人乳铁蛋白内含子的扩增，设计引物HLFIa:GCCTGCGACATACTGTGGTC(SEQIDNO:8)，HLFIs:AAGGATTTGAAGCTGGCAGAC(SEQIDNO:9);以人基因组DNA为模板，扩增1.5kb人乳铁蛋白基因第15内含子及部分外显子15和16，插入到pGEM-T载体中，获得pGEM-T-hLF内含子。用Bgll和Ndel从pGEM-T-hLF内含子中切出hLF内含子并插入到pET-30a(+)-hLF片段中相应的酶切位点中，获得pET-30a(+)-hLFl载体。用EcoRV和Ndel酶切pET-30a(+)-hLFl载体，并将获得的hLF外显子和内含子片段插入到pGEM-T-hLFcDNA的EcoRV/Ndel位点中，得载体pGEM-T-hLF(含hLFcDNA及第15内含子序列)。实施流程见图2。其中的人乳铁蛋白小基因具有SEQIDNO:1中3824-7125所示的核苷酸序列，编码具有SEQIDNO:3所示序列的蛋白。牛生长激素PolyA(bghPA)的扩增，设计引物BGHPAs:CTCGAGTGCTAGAGCTCGCTGAT(SEQIDNO:10)，BghPAa:AAGCTTAAGCCATAGAGCCCAC(SEQIDNO:11);以pcDNA3(获自Invitrogene)为模板，扩增0.27kb的牛生长激素PA(bghPA)。将产物克隆至pGEM-TEASY载体上，命名为TA-PA。Neo基因阅读框的扩增，设计引物NEOs':AAGCTTAAAGTCCCCAGGCTCC(SEQIDNO:12)，NEOa,:GTCGACAGTCCCGCTCAGAAGAA(SEQIDNO:13);以pcDNA3为模板，扩增出neo基因阅读框。将产物克隆至pGEM-TEASY载体上，命名为TA-Neo。将TA-PA用Xhol及HindIII酶切后，回收0.27kb片段，将psp72(购自Promega)经Xhol及HindIII酶切后，回收2kb载体，连接，转化后筛选得阳性克隆，命名为psp72-bghPA。将TA-Neo用HindIII及Sail酶切后，回收lkb片段，将psp72-pA经HindIII及Sail酶切后，回收2.3kb载体，连接，转化后筛选得阳性克隆，命名为psp72-bghPA-Neo。psp72-bghPA-Neo经Xhol及Sail酶切后，回收bghPA-Neo片段，将pBSK-BC经Xhol单酶切后，回收载体，连接，转化后筛选，并鉴定正反向，得插入方向正确的阳性克隆，命名为pBSK-BC-PA-Neo。将pGEM-T-hLF经Xhol酶切后，回收3.2kb乳铁蛋白小基因片段，将pBSK-BC-PA-Neo经XhoI酶切后，回收载体，连接，转化后筛选，并鉴定正反向，得插入方向正确的阳性克隆，命名为pBSK-BC-hLF-Neo，其中含有SEQIDNO:1所示序列。上述构建的实施流程见图3。获得的构建物的主要结构如图4所示。实施例3:乳腺特特异性表达载体pBSK-BC-HLF转染山羊胚胎成纤维细胞1.山羊胚胎成纤维细胞的制备取怀孕35天的萨能奶山羊，剖腹手术无菌取出胎儿，将胎儿在超净台中剪成糊状后，加入含10。/。(v/v)FBS，1XNEAA，10ng/mLbFGF,1000u/mlhLIF的GMEM培养，两日后冻存部分原代细胞，部分用于传代供转染用。2.细胞转染NotI酶切pBSK-BC-hLF-Neo，回收线性化的载体DNA15wg，转染羊胎儿成纤维细胞，具体参数如下细胞密度为107细胞/ml;细胞体积为0.5ml;转染的DNA为NotI线性化的pBSK-BC-hLF-Neo载体；DNA浓度为15ng/3(^l;电转介质为BasicGMEM;CuvetteGap为0.4cm;电压为0.4kV;电容为500)tiF;TC为19.9msec。电击后，静置10分钟，用GEF完全培养液洗出细胞，均匀接种在10个100mm细胞培养皿中，置于37'C、5%(302培养箱中培养；次日换液一次。转染48小时后更换GEF选择培养液，此后每隔两天更换选择培养液一次，直至形成明显的细胞克隆。3.克隆的筛选与挑取克隆形成后，显微镜下选择边缘界限清晰的克隆做上标记；去除培养液，PBS洗两遍；取灭菌克隆环，取适量硅胶润滑油，放到选好的克隆上，将克隆圈起。如此法圈起板中所有选中克隆；每个克隆环内加胰蛋白酶溶液50nl，消化10-30s;加培养液10(Hil终止消化，吹打均匀后将细胞转入96孔板中；每孔追加100pl培养液，置培养箱培养；待细胞贴壁后更换培养液一次；接下来，所有的克隆都按照从96孔板到48孔、24孔、12孔和6孔板顺序依次传代，当细胞在6孔板长满后冻存其中的一半(冻存密度5X105细胞/0.5ml)，另一半接入60mm培养皿中继续培养，用于抽提基因组DNA。4.克隆的鉴定(1)PCR鉴定细胞克隆外源基因整合情况分别在5调控区上及乳铁蛋白基因上设计如下引物hLFF60825TACGCTGTTTCCTCATCTTCC3(SEQIDNO:14)hLFR72695GCAGCCACTTCCTCCTCACTT3(SEQIDNO:15)hLFF68065CAGACGAGGCTGAAAGGGACG3(SEQIDNO:16)hLFR82605CAGGCAGTGATGGCAACAAGG3(SEQIDNO:17)hLFF81525TGCCCAGAGTGTCAACAAGAA3(SEQIDNO:18)hLFR95525CCTACTCAGACAATGCGATGC3(SEQIDNO:19)鉴定结果见图5，泳道l、2、3为LF123细胞基因组DNA分别用引物F8152和R9552、F6806和R8260、F6082和R7269扩增出1.4kb,1.4kb，1.2kb的条带；泳道4、5、6为正常羊以同样引物扩增结果，为阴性对照；泳道7，8，9为质粒以同样引物扩增结果，为阳性对照。5.Southern杂交鉴定外源基因整合情况抽提弁123细胞基因组DNA，以hLF作为探针，按常规方法来进行杂交，结果见图6，其中箭头所指为弁123细胞(LF123细胞)基因组经XhoI酶切后，用HLF小基因进行杂交，结果出现3.3kb的条带，另一条带为质粒经XhoI酶切后杂交所得阳性对照。实施例4:体细胞核移植1.卵母细胞制备与受体羊的同步挑选出作为卵母细胞供体的母羊肌注PGO.lmg/头，间隔10-14天后注射第二次PG，在第二次注射PG10-13天后开始超排，即首先肌肉注射FSH,分6次，2次/日，用量为三天中，第一天100IU两次，第二天80IU两次，第三天80IU两次。在最后一次注射FSH的同时，注射一次PG(0.1mg/头)，间隔24小时后时注射LRH，25pg/次，注射LRH后26-28小时回收卵母细胞。为与提供卵母细胞的供体羊同步，受体羊间隔9-ll天分两次肌肉注射PG，在供体羊超排注射PG后24小时，受体也同时注射PG,受体注射LRH的时间及剂量同供体。手术暴露输卵管，用F-10营养液冲卵、体视镜下检卵。透明质酸酶消化颗粒细胞，M16洗4-5次，置M16方杯中培养，备用。2.供核细胞的饥饿处理把待饥饿的细胞W23接种于35mm平皿内。待细胞丰度达70%-75%左右时，吸去培养液，加入含0.5。/。FCS的DMEM液，饥饿5天后，常规法消化收集细胞。然后放于-85'C冰箱内保存。在核移植实验前6天，取出2小管复苏并接种于4孔板内。再培养2天或3天后饥饿，饥饿方法同前。3.重构卵的制备与激活卵母细胞在M16-Hepes(含Hepes2.8mg/ml，CB7.5吗/ml)液中洗涤3次，在M16-Hepes(含7.5吗/mlCB)中处理10min;同时将培养的细胞用胰酶消化、分散成单个细胞。将卵母细胞与供核体细胞同时移入置于灭菌玻片上的lmlM16-Hepes(含CB)中，在显微镜下去核并吸入供核细胞，将之从原来的切口注射到卵周隙内，使其紧贴于胞质膜，采用电刺激的方法进行融合，融合基质为含0.3mM甘露醇、0.05mM氯化钙、0.1mM硫酸镁、0.5%BSA的溶液，融合条件为DC600-610v/cm，脉冲持续时间80ps，连续刺激3次。融合后的胚胎于M16中培养5小时后，在含5^iM离子霉素(ionomycin)、7.5pg/mlCB的M16液中处理5min，再在含2mM6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)以及7.5吗/mlCB的M16液中处理5小时后移到M16培养液中培养，待包埋或移植。4.重构卵的包埋、回收与发育胚胎的移植用P/。的Agarose包埋重构卵，并移植入输卵管内，体内培养5天后将胶条冲出，将胶条内的胚胎剥离出来，选择发育至桑椹和囊胚期胚胎，移植到受体羊子宫内。移植后的受体在胚胎发育至1-2月龄时用B超进行妊娠检查，出现孕囊判定为怀孕，妊娠足月分娩。实施例5:LF123羊奶中rhLF的检测一、材料乳铁蛋白转基因山羊，正常萨能奶山羊均来自上海转基因研究中心南汇实验牧场，所有常规生化试剂均购自Sigma，人乳铁蛋白标准品购自Sigma，人乳铁蛋白单抗购自Abcam，兔抗人乳铁蛋白多抗购自DAKO，HRP标记的羊抗免购自DAKO。二、实验方法1.SDS-PAGE电泳13羊奶样品处理将产奶后两周内样品及一个月内样品各稀释20倍，然后取2nl，加入2ul上样缓冲液，变性后上样电泳(120V)，电泳结果见图7，图8。图7所示l为标准蛋白Marker，2为正常羊乳，3为5ug的乳铁蛋白标准品，10-4分别为产后每2天的羊乳，即产后第2，4，6，8,10,12,14天的羊奶经20倍稀释后上样,每孔上样2"1.可见LF123羊乳中清晰的分子量为80kDa左右的的rhLF条带，乳汁中rhLF的含量在产后最初一周内呈下降趋势，之后保持在一个较稳定的水平。图8所示l为标准蛋白Marker,2为正常羊乳，3为5ug的乳铁蛋白标准品，4-10分别为产后第5天起每5天收集一次的羊乳，即产后第5,10,15，20,25，30,35天的羊奶经20倍稀释后上样，每孔上样2ul。可见LF123羊的羊乳中清晰的分子量为80kDa左右的rhLF条带，rhLF的表达量维持在一个比较稳定的水平。2.Western-Bolt检测羊奶中rhLF。将LF123羊乳经分别稀释400倍后分别上样4nL、3pL、2nL和lpL进行电泳(分别对应泳道l-4);泳道5-8分别为400ng、300ng、200ng和100ng的hLF标准品用作对照。电泳后转膜，封闭。依次加入l:3000的兔抗人乳铁蛋白多抗，1:2000稀释的HRP标记的羊抗兔抗体反应后，加入底物液显色，结果见图9。图9中l-4为羊乳稀释400倍后分别上样4pL、3pL、2pL和lnL进行电泳后与乳铁蛋白多抗结合；5-8分别为400ng、300ng、200ng和100ng的hLF标准品用作对照。可见重组人乳铁蛋白可与免抗人乳铁蛋白多抗特异地结合。3.双夹心ELISA定量检测羊乳中rhLF含量以lug/ml人乳铁蛋白单抗包被酶标板，封闭后加入倍比稀释的nhLF(同时设两个平行递度)，以制备标准曲线。向酶标板中加入随机抽样的LF123羊乳(稀释200万倍)，并设正常羊奶，PBS分别为阴性和空白对照。nhLF及LF123羊乳分别与兔抗人乳铁蛋白多抗,HRP标记的羊抗兔抗体反应后，加入底物液，反应终止后读取OD49o值。结果见表l(正常羊奶，PBS未显色)。表]<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>取中间6组数据制定标准曲线，得线性，将样品OD值代入其中，分别得到稀释后的产品溶度及稀释前的浓度，见表l。图10为标准人乳铁蛋白经双夹心ELISA获得的标准曲线图。将LF123克隆羊羊乳检测结果代入其中，可得出羊乳中rhLF的含量大于20mg/ml。三、结论1.由LF123羊乳的SDS-PAGE电泳结果可以看出，LF123转基因羊乳中较正常羊乳多出一条80KDa左右的蛋白条带，其含量大于20mg/ml。2.由LF123羊乳的WESTERN-BLOT结果可以看出，该蛋白条带可特异的与人乳铁蛋白单抗结合，为重组人乳铁蛋白。3.由LF123羊乳的双夹心ELISA结果可以看出，rhLF可特异的与人乳铁蛋白单抗结合，rhLF的含量大于20mg/ml。实施例6:转基因羊乳中rhLF的纯化1.取新鲜乳汁或刚融解的低温存放的乳汁5mL(rhLF浓度约34.0mg/mL)，于4'C条件下10000g离心30min,3层脱脂纱布过滤，除去脂肪和杂质成分。滤液用稀释液(40mmol/LPBS,0.8mol/LNaCl,pH7.5)2倍稀释后用lmol/LHCl调至pH4.6，37。C温育30min后同样离心30min过滤去除。用lmol/LNaOH调至pH7.5后再次离心、过滤。所得乳清即可用于蛋白的精细纯化。2.阳离子交换柱梯度洗脱(1)用平衡液将离子交换柱平衡5柱体积，使其光吸收平稳于基线处。(2)以2mL/min流速将乳清泵入交换柱，以相同流速用平衡液冲洗柱子，去除未结合于介质以及结合力较弱的杂蛋白，约3柱体积后吸光度可平稳于基线。(3)在平衡液中加入洗脱液形成盐浓度梯度用于洗脱结合于介质的蛋白，条件流速1.0mL/min，盐浓度范围0.41.0mol/LNaCl，200min达到最大盐浓度。收集所有洗脱峰。(4)利用7.5n/。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot检测各峰中的蛋白组分。(5)柱的还原与保养待高盐溶液清洗层析柱之后，用0.2mol/LNaOH清洗柱子，使介质上结合较紧的蛋白被变性洗出，并防止微生物留于柱内进行繁殖。用无菌去离子水冲洗5柱体积后用20%乙醇封柱，保存于4'C。(6)利用离心超滤管将蛋白的缓冲液替换成0.15mol/LNaCl溶液，于-80'C保存。3.Western-blot检测。将以上收集的洗脱溶液进行SDS-PAGE检测，根据分子量大小初步判断出hLF，并取其进行Western-blot检验，以标准品hLF(nhLF)为阳性对照。(1)转膜利用SEMI-DRYTRANSFERCELL将凝胶中蛋白转印至PVDF膜，恒流60mA，转印时间70min。(2)封闭4'C下于水平摇床上用封闭液I封闭2hr。(3)第一抗体的结合用封闭液I将Rabbitanti-HumanLactoferrin稀释3000倍至10mL，4t下于水平摇床上结合2hr。用漂洗液洗涤滤膜3次，每次10min。(4)第二抗体的结合用封闭液III将Goatanti-RabbitImmunoglobulins/HRP稀释3000倍至10mL，4'C下于水平摇床上结合lhr。用漂洗液洗涤滤膜3次，每次10min。(5)显色反应取10nL30。/。过氧化氢加入10mL显色液中,将滤膜浸没于其中，待膜上显示出条带即可取出并用去离子水漂洗，吸干水分后即可拍照保存。另取未纯化的转基因山羊脱脂乳清、正常山羊脱脂乳清、本发明纯化的rhLF和gLF(山羊LF)进行Western-blot实验，检测各种LF的免疫反应性。结果梯度洗脱时，色谱柱中的乳清经平衡液冲洗去除后，在0.41.0mol/LNaCl的线性洗脱范围内只出现了单一的光吸收峰。本实施例中的hLF抗体用于羊乳铁蛋白(goatLactoFerrin，gLF)的免疫印迹时未能使其显色，说明该抗体同gLF之间不具有特异性的抗体抗原反应。通过SDS-PAGE(如图1lB)和Western-blot(如图11C)可以确定梯度洗脱的光吸收峰处蛋白为rhLF(如图llA)。实施例7:rhLF的基本生化特性天然的hLF(nhLF)是一种分子量约80kDa，等电点8.0的糖蛋白。利用转基因牛和小鼠乳腺表达的rhLF同hLF的分子量、等电点基本相同。糖基化修饰对LF的分子量影响较大，去除这些糖基会导致蛋白的分子量明显减小，可通过SDS-PAGE检测出。本实施例对rhLF的N端氨基酸序列、分子量、等电点以及糖基化修饰状况做了进一步测定。1.实验材料PNGaseF(P0704S，NEB)，蛋白序列测定系统(ABI491LC，PE)，基质辅助激光解析-飞行时间质谱仪(AutoFlexMALDI-TOF-MS，Bruker)。2.实验方法2.1rhLFN端氨基酸序列、分子量与等电点取制得的rhLF样品，利用Edman降解法测其N端氨基酸序列(10个氨基酸残基)，并通过质谱和双向凝胶电泳分别测定其分子量和等电点。2.2rhLF糖基化取2mg/mL的rhLF与nhLF样品各20nL，在4^iLIOX糖蛋白变性缓冲液中IOO'C煮10min使蛋白变性，之后加入10XG7缓冲液和10n/。的NP-40后混匀。取出12nL向其中加入lnLPNGaseF，37。C温育3hr。用SDS-PAGE(7.5。/o)检测蛋白变化。3实验结果结果显示，该rhLF的N端氨基酸序列为NH2-GlyArgArgArgArgSerValGlnTrpCys-x，同hLF的N端氨基酸序列完全相同。其分子量80187Da，等电点约8.0(图12，13)，与hLF基本一致。糖苷酶处理后，rhLF同nhLF的分子量同比减小(图14)，说明山羊乳腺表达的rhLF与正常人乳汁中的nhLF均发生了糖基化修饰，且其中的糖基含量相近。本研究中rhLF的N端10个氨基酸同hLF完全一致，表明利用转基因山羊乳腺表达的rhLF具有完整的N末端，转基因构件在山羊乳腺中可被正确转录和修饰，切除前导序列，形成成熟的rhLF。研究中所用的纯化方法不会导致rhLF的水解断裂。完整的N末端序列，是hLF对革兰氏阴性菌致死作用的主要原因，其作用脂多糖(LPS)的阳离子区正是位于其分子的N末端。rhLF的分子量及等电点也与hLF基本保持一致，也说明蛋白的修饰程度相近。LF的糖基化修饰及其铁结合情况是影响其分子量的主要原因之一，所以不同来源的LF以及通过不同纯化方法获得的LF之间均可能表现出差异，如hLF糖组分占5.5。/。时其分16子量为80.6kD,rhLF糖组分占2.9。/。时其分子量为78.5kD。按照该rhLF与hLF均为完整蛋白，其糖组分与分子量满足一次现行方程，则两者数量之间满足y=80.8x+76.2y为rhLF的分子量(kDa)，x为糖组分所占比例根据本实验测得的rhLF的分子量为80.187kDa，代入公式可得山羊乳腺中表达的rhLF的糖组分占其分子量的4.9n/。左右，同常规hLF的糖基化修饰程度相近。hLF—级结构中有4个天冬酰氨残基作为潜在的糖基结合部位。本研究中所用的PNGaseF酶也是特异性地切割N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和天冬酰氨残基之间的糖苷键。本研究中糖苷酶的有效切割，表明rhLF的糖基化位点与nhLF是相同的。通常，1分子LF中，含有1516个甘露糖，56个半乳糖，1011个乙酰葡萄糖胺和1个唾液酸，其中，中性糖8.5%，氨基糖2.7%左右。这些多糖的具体作用至今尚无定论，去除这些糖基对LF的功能与特性并无显著影响，但是否影响其对受体的结合尚存在争议。实施例8:rhLF的铁结合与铁释放特性hLF分子呈单链多肽结构，N端和C端各自折叠成1个环状，环内各有4个氨基酸残基(2个酪氨酸残基、l个天冬氨酸残基和l个组氨酸残基)可结合l个F^+，所以LF分子具有结合铁的能力。在低pH环境中，维持其分子构象的力被破坏，结合的F^+得以释放，LF表现出铁释放特性。1997年JanH.Nuijens等利用转基因小鼠乳腺生物反应器，成功表达了rhLF，并研究发现铁结合型nhLF与铁结合型rhLF均在450465nm处具有较强的光吸收。根据LF这一光谱特性，PatrickHCvanBerkel等2002年研究发现，利用转基因牛乳腺表达的rhLF也具有明显的铁结合以及pH介导的铁释放特性。1.实验材料Rabbitanti-HumanLactoferrin(A0186),Goatanti-RabbitImmunoglobulins/HRPP0448均购自DAKO，其余试剂购自Sigma。2.实验方法U)取nhLF及LF123羊乳中纯化rhLF磷酸盐缓冲液(20mmol/LPBS,0.15mol/LNaCl,pH7.5)中于380750nm波长范围内进行吸光度扫描，测其最大光吸收Ax的波长位置(x纳米)，作为后续实验的测定依据。(2)铁结合特性各取400uLnhLF与rhLF(浓度均为5.0mg/mL)，分别同200uL柠檬酸铁溶液(5X10—、ol/L)混合均匀(rhLF:Fe3+=1:4)，取400uL于分光光度计比色杯中测其45min内Ax值的变化。Ax升至平稳表明LF达到铁饱和状态。(3)铁释放特性取(D中制备的铁结合rhLF与铁结合nhLF(浓度均为3.3mg/mL)各70uL,依次加入不同pH值的磷酸盐缓冲液(pH依次为7.5、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0和2.0)中，37'C下孵育12hr，10000rpm离心10min后测各溶液的Ax值，并通过SDS-PAGE实验检测蛋白的完整性。(4)可逆性将(2)中pH2.0处理后的样品缓慢调至pH7.5，观察其Ax的变化趋势。(5)耐酸性取实验(l)中处理12hr的LF123羊乳中重组人乳铁蛋白样品和(2)中pH2.0处理12hr后的重组人乳铁蛋白样品，分别做7.5n/。SDS-PAGE和Western-blotting检测其蛋白完整性和免疫反应性是否发生改变。173.实验结果吸光度扫描结果显示，rhLF与nhLF分别在465.2nm和463.8nm处具有最大光吸收，故可以认为该rhLF同nhLF具有相类似的光谱特性，在465nm处具有特征性光吸收。rhLF在pH7.5和充足FeS+环境(LF:Fe3+=1:4)中，其八465变化情况同nhLF保持相同，在45min内持续升高并最终趋于稳定(如图15),表明此时已形成铁结合rhLF/nhLF。当溶液pH值降低时，以上制备的铁结合rhLF/nhLF的铁结合率会随之而下降(A465值降低)。当环境pH值为6.0时铁结合率开始下降，pH值下降至3.02.0时，八465再次趋于稳定，铁结合rhLF/nhLF基本上停止释放铁离子(如图16)，推测此时铁结合rhLF/nhLF结合的铁离子已经完全释放。当铁释放rhLF/nhLF溶液的pH值缓慢升高至7.0时，其A465会逐渐升高，释放于溶液中的铁离子可重新结合于rhLF，表明rhLF的pH介导的铁释放特性具有可逆性特点(如图17)。分别取实验U)、(2)中的铁结合rhLF和铁释放rhLF进行SDS-PAGE和Western-blotting检测，结果表明经过铁结合、铁释放处理的rhLF未发生明显降解，并保持其免疫反应性(如图18)。实验(4)中所用铁释放-rhLF是经pH2.0处理12hr后的样品，其蛋白完整性和免疫反应性表明该rhLF具有较强的耐酸性。hLF的结构特点决定其具有铁结合与铁释放的特点，此特点赋予了hLF多种重要的生物学功能，如维持肠内菌群平衡、补充人体铁元素、影响机体自由基产生等。利用多种系统如转基因牛、小鼠和水稻等表达的rhLF,都表现出这种特性。本研究中rhLF表现出同样的铁结合、铁释放特性，间接表明rhLF不仅在乳腺中进行了正确的翻译后折叠，而且保持完整的N端、C端环状结构，此外，纯化过程也不会改变其结构。实施例9:rhLF的抗菌活性LF具有强的铁结合特性，能够与微生物竞争其生长所需铁离子，实现抑菌功能。LF结构中有一多肽序列具有更强的杀菌功能。故而LF具有广谱抗菌活性，对生理所需铁的大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等革兰氏阴性菌及金黄色葡萄球菌、杆菌和单细胞李斯特菌等革兰氏阳性菌都表现抑制活性。研究表明，利用转基因山羊乳腺表达的rhLF具有完整的分子组成与结构，并具有较强的铁结合特性。本试验验证rhLF的铁结合能力是否足以达到抑菌作用。实验菌株(金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株，表皮葡萄球菌，表皮葡萄球菌耐甲氧西林菌株，肺炎球菌，链球菌)获自中国药科大学微生物教研室。实验方法1.配制营养肉汤培养基，营养琼脂培养基肉汤培养基称取牛肉膏粉和蛋白胨各10g，氯化钠15g加入1000mL肉浸液中，微温溶解。弱碱性条件下煮沸后过滤，调至pH7.2土0.2，分装后115。C灭菌30min。营养琼脂培养基在配好的营养肉汤培养基中加入1520g琼脂，调节pH值，使灭菌后为pH7.2士0.2，0.11Mpa压力下灭菌30min。2.平板打孔法测定抗菌谱(1)待测液制备取样品液(5mg/mL)lmL加入lmL无菌去离子水，得到l:2的待测液，依次倍比稀释得l:4、1:8待测液。(2)供试液制备本试验选取金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistantStaphylococcusaureus,MRSA)、表皮葡萄球菌(Staph.Epidermidis,SE)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillinresistantStaph,epidermidis,MRSE)各15株与肺炎球菌(Pneumococcus)7株、链球菌(Streptococcus)6株共73株临床分离菌株进行研究。取菌株接种于营养肉汤培养基，过夜活化培养，取菌液3000rpm离心10min，弃上清，加无菌生理盐水5mL混匀，作为供试液备用。(3)抑菌谱实验取3mL供试液加入无菌平板，取15mL营养琼脂培养基，迅速混匀，冷凝后用6mm打孔器打孔，加入供试液40pL，将平板在水平台静置30min后，移入35'C培养箱培养1416hr取出观察结果。3.抑菌率测定(1)供试液制备选取上述平板打孔法检测出的敏感菌株，接种营养肉汤培养基，过夜活化，制备菌悬液，利用麦氏比浊管确定其浓度后做10倍系列稀释至约106CFU/mL，作为供试液备用。(2)待测液制备取rhLF样品分别稀释至lmg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL作为待测液。(3)测定方法取以上制备的供试液0.1mL，分别加入0.9mL各种浓度的待测液，35。C放置2hr。取上述各管样品液，0.5mL加入4.5mL无菌生理盐水，按10倍系列稀释。取稀释后的1(T3、10—4管做活菌计数。以不加样品的各菌株空白菌悬液做同样10倍系列稀释，计数活菌数，按公式IR-(B-A)/BX100。/。计算抑菌率(IR)。式中B为空白组活菌数，A为试验组活菌数。4.结果在敏感性试验中，所用的几种临床分离菌株都对rhLF表现出敏感性，而且这种敏感性表现出rhLF的剂量相关性(如表2)。rhLF对各敏感菌株的抑菌圈大小不一，直径在1625mm之间不等。抑菌率测定实验结果显示，当rhLF浓度为lmg/mL时，对金黄色葡萄球菌的抑制率可高达98%,在较低的浓度(0.25mg/mL)时也高达83.5。/。，表明转基因山羊乳腺表达的rhLF具有较强的抑菌活性，这种抑制效应表现出明显的剂量相关性(如图19)。表2临床分离菌株的rhLF敏感性实验样品敏感率(％)1:21:41:8SA60.0040.0026.67MRSA53.3326.676.67SE53.3300MRSE33.3300Pnsumococcus42.8600Streptococcus50.0000LF可通过竞争性结合微生物生理所需的铁离子而实现抑菌杀菌，所以这种抑菌方式表现出LF剂量依赖关系，并且铁缺失型乳铁蛋白具有更强的抑菌活性，而铁结合率越高则其抑菌活性越低。LF的抗菌多肽的杀菌机制是同菌膜上的脂多糖作用从而破坏细胞膜。所以，LF抗菌多肽主要是作用于革兰氏阴性菌。本研究中选用了几种临床分离的革兰氏阳性菌进行rhLF的抗菌活性研究，表现出的抑菌活性主要是通过rhLF的铁结合实现的。据报道，LF对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为8mg/mL和lmg/mL。而本研究中，当rhLF浓度为lmg/mL时，对金黄色葡萄球菌的抑制率可高达98%，在较低的浓度(0.25mg/mL)下亦高达83.5y。。这表明转基因山羊乳腺表达的rhLF具有强抑菌活性。实施例10:含人乳铁蛋白cDNA的转基因山羊的制备1.载体构建1)将人乳铁蛋白cDNA与乳腺特异性表达载体pBCl(Iiwitrogen)相连，获得人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体pBCl-hLF(cDNA)，相关位点结构见图20。2)将人乳铁蛋白cDNA与乳腺特异性表达载体pBLG相连，构建了人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体pBLG-hLF(ZL00115794.9)，相关位点结构见图21。2.转基因羊的制备及外源基因的整合率pBCl-hLF(cDNA)基因共进行了28次试验，投入供体羊115只，总排卵点1457个，平均排卵12.67枚(1457/115);总获卵数1514枚，平均每只供体羊获卵13.2枚(1514/115);在所获卵中，原核注谢781枚，其中注射后存活率为64.9%(507/781)，原核显现率为51.6%(781/1514)。移植受体132只，平均每头受体移植3.8枚(507/132);经B超检査，受体的早期妊娠率为56.8%(75/132);最终44只受体羊妊娠足月分娩，共产羔62只，其中出生后死亡9只，存活53只。对存活的53只应用PCR及Southem杂交检测，最终得到两只整合羊pBC-LF23及pBC-LF85，外源基因的整合率为3.7%(2/53)。pBLG-hLF基因共进行了19次试验，投入供体羊74只，总排卵点数938个，平均排卵12.67枚(938/74);总获卵数991枚，平均每只供体羊获卵13.39枚(991/74);在所获卵中，原核注谢657枚，其中存活率为56.62%(372/657),原核显现率为66.3%(657/991)。移植受体102只，平均每头受体移植3.64枚；经B超检查，受体的早期妊娠率为65.69%(67/102);最终44只受体羊妊娠足月分娩，共产羔69只，其中出生后死亡19只，存活40只羔羊。最终得到一只整合样BLG-LF67，检测结果显示外源基因的整合率为2%(1/50)。3.转基因羊的繁育及后代乳汁中乳铁蛋白的表达量将pBC-LF23、pBC-LF85两只转基因公羊分别与正常的母羊配种后繁殖获得的Fl代羊数分别为24只羊羔(11早，13S)，27只羊羔(9早，18$)。经检测pBC-LF23的Fl代羔羊中有9只(4早，5"携带有hLF基因；pBC-LF85的Fl代羔羊中有H只(4早，7悉)携带有hLF基因。在6月龄时对F1代转基因母山羊催乳并收集泌乳前7天的乳汁。采用双抗体夹心ELISA法检测。结果pBC-hLF(cDNA)显微注射转基因山羊pBC-LF23和pBC-LF85系后代pBC-LF23-6，pBC-LF85-18在羊奶中表达人乳铁蛋白，重组人乳铁蛋白的平均表达量分别为0.576mg/ml与0.311mg/ml。将BLG-LF67与正常的母羊配种后繁殖获得的F1代羊数分别为41只羊羔(27早1420悉)。BLG-LF67的F1代羔羊中有7只(5早2S)携带有hLF基因。但对整合母羊进行催乳检测发现其中无外源基因的表达，羊乳中检测不到人乳铁蛋白。体细胞核移植及显微注射制备含人乳铁蛋白的转基因羊结果比较见表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>上表为体细胞核移植及显微注射制备人乳铁蛋白转基因山羊的对比分析，可以看出，采用体细胞转染，筛选，再进行核移植以获得转基因动物的效率要远远高于显微注射。同时，转染用细胞性别选择可以帮助縮短转基因动物的制备周期，这对于生产周期长，繁殖速度慢的大动物尤为重要。另外，从上表的对比中也可以发现含人第15内含子的人乳铁蛋白小基因可获得高表达，在相似调控区的作用下，其表达量要远远高于乳铁蛋白cDNA为功能基因时的表达量。实施例ll:基因变异体采用常规酶切方法，从pBSK-BC-hLF-Neo载体上切下SEQIDNO:l融合基因序列。然后，采用常规的定点变异方法，将SEQIDNO:l融合基因序列进行变异，构建变异体，如下变异体1(M1):SEQIDNO:1序列第8位由T变为A,且第11813位由A变异为C，且第7139位由G变异为A。变异体2(M2):SEQIDNO:1序列第3832位由T变为A，且第7774位由T变异为A。将前述Ml和M2连接入pBluescriptl1SK载体中，位置与SEQIDNO:l融合基因序列在该载体中的位置相同。获得pBSK-BC-hLF-Neo-Ml和pBSK-BC-hLF-Neo-M2。采用与实施例3-4类似的方法分别将表达载体pBSK-BC-hLF-Neo-Ml和pBSK-BC-hLF-Neo-M2线性化且转染山羊胚胎成纤维细胞，并进行体细胞核移植，并将合适的胚胎移植到受体羊子宫内。结果发现，获得的后代转基因山羊的羊奶中也具有高含量的rhLF。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<"o〉上海杰隆生物工程股份有限公司，上海转基因研究中心<120>—种利用体细胞转染制备高表达人乳铁蛋白转基因山羊的方法<130>080358〈160>19<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>12497〈22>隱<213〉人工序列<221〉misc—feature<223>融合i因<柳〉1aagcttctttctttagtatattgttaaggatttccttgatcaagattttacctacttttc60tggtccaattggtgagagacagtcataagg朋atgctgtgtttattgcacaatatgtaga120gcatcttcctgagaaaataattgaatgggaaggatatgctttcttttgta180ttccmtctgagaaatcagactttttcacctgtggccttggccaccaaaagctaacaaa240taaaggcatatgaagtagccaaggccttttctagttatatctatgacactgagttcattt300catcatttattttcctgacttcctcctgggtccatatgagcagtcttagaatgaatatta360gctgaataatagtagatgUgatttgggttttctaagcaatccaagactt420gtatgacagtaagatgtattacc3tccaacacacatctcagcatgatataaatgcaagga480atattgtgaaga貼aatttttaattatgtc貼agtgcttactttagaaggtcatctatct540gtcccaaagctgtgaatatatatattgaaggtaatgaatagatgaagcta3ccttgtaaa600gtgaaatacaactacagttatgaacatctgggcaaagaaa660cttgaagattgcUUgcgaatgggctcctattaataaaaagtacttttgaggtctggct720cagactctattgtagtacttagggtaagaccctcctcctgtatgggctttcattttcttt780cttgettccctcatttgcccttccatgaatactagctgataaacattgactataaaagat840acttgagctgtcccattttaataaatctgtataaataatatttgttctac900aaaagtattatctaaataaatgttactttctgtcttaaaatccctcaacaaatccccact,atctagagaataagattgacattccctggaatcacagcatgctttgtctgccattatctg1020acccctttctctttctctcttctcacctccatctactcctttttccttgcaattcatgac1080ccagattcactgtttgatttggcttgcatgtgtgtgtgctgagttgcgtctg3Ctgtt3t1140caaccccatgaatgatagtccaccaggctctactgtccatgaaattttccagtcaagaatL200actggagtggattgcatttcctactccatttgattaatttagtgacttttaaatttcttt1260ttccatattcgggagcctattcttcctttttagtctatactctcttcactcttcaggtct1320Mggtatcatcgtgtgcttgttagcttgttactttctccattatagctta〗380actgUcaggttggcatgaaattgtgttctttgtgtggcctgtatatttctgttgtgtat1440tagaatttaccccaagatctcaaageicccactgaatactaaagagacctcattgtggtta1500caataatttggggactgggccaaaacttccgtgcatcccagccaagatctgtagctactg1560gacaatttcatttcctttatcagattgtg3gttattcctgUg8助tgCtccccagaatt1620tctggggac3gaaaaataggaagaattcatttcctaatcatgcagatttctaggaattca1680aatccactattggttttatttcaaaccscaaaattagcatgccattaaatactatatata1740aacagccactaaatcagatcattatccattcagcttctccttcaattcttctcctctact1800ttggaaaaaatggactaggtggtaag肌tctaaaatgtagtcagstataatttcagtgtaattgcttaaatctgctactcatctttatttaaaataaggg18601920tgtttaagataaggtttacactattttcagcagatatgttagtgactata1980aagacttgataaa朋ttatagtgactgcaaatgttttagggatataataa2040cagtggttgctattttctttagc3C3agactagttaacaggctgtattaaaagatctttt2100cttgaattaaata/ttttcaatttgattaaacctacctcagccataaaggc肌gcacattt2160catttatactatagagctatatggggatttcatatttagtgaataattatcaagagataaagagggttgtgctctaccaataggatatatcaaaaagtttatgctatttg22202280aaaggtstttataaaagaagagtatatttatcaaaatttctcagaacatcca朋tttc幼2340gtttatcatttaaattaaagtatcttacaaagaaagtatttatttcaaaattacttggtaatattaaaataaaaaattctagatacatgaaggttggacaaatacagaaggagagtgcca24002460ggaaacaaaa3gt33tgaaaacaatgaaaatggcttaaaaatgtgacctgattggtatatacaggaattaaa朋tgctagtBgctcaaagttataaaatatatagtagtaaac肌aatgc25202580aataatatcctccctacatgtaatgaattctaggtattatgctcttttttgaagtcttga2640caata朋aatttttttagaagtttataggcatcttgaataaagtgaaacaaattaagaat2700tagtatccatgagaaaaatatagaacaattttcctaatttagtttgaaaatctgggattg2760aagatgtgtgtcaagagatgttggtggcaagaacatttttttttcaagaacttataaaBB2820tgcaacaaaacasaccatttaatacattttggtcaaaatcaataatgtattttattttat2880gctccaaggagcataaaattggggactgggcaagaggaactgacaccctggtaaattacc2940aagagataagatgtgagacatacacagttcMggagagattatgtagagagacattaggcatgtggggatagtgtatgatga邓actgggctctaaaatttagagaagaa30003060acaatctaatatgaaacagacagtccaagaagtcttactgaaacatctcgg3肌taa幼gatcagtggaaatatgcataacaaatagaaggacaaaaatt站atgct肌acatgaaaatc31203180acttagtttagcagsgaaaagataaaaataaagtatgaccttcttcatat3C3ttgtttg3240atcatatgcacctcaataaaactgagtctcca3cag肌atgaaacattaatattttgttc3300actgctctaatcccagaatctaagcgatatctggcaataaaaataataaatatatatttt3360ttaataaatgttaatttttctgtaaatatctgt肌cttctcttctgtctt3420tcc肌犯acagttagcagaactcataagtaaacatctgaactgtgaatgatggctggcagg&tgaaa朋gtgaaacatta3gtg犯gtagacttgaaatggatataggcttaagattaat3480354022gagt肌tagtaaatttt肌ccttggccatatgBt肌肌tgttcattBatatttttctaga36003tacagggctttttgtttttgccatgaggtttgcaggatcttggttccctgacc叫gg3t3660ca貼cctgcactcccctggaagcatggagtcttggacatttgtattatacactatctttg3720gttcctttta肌ggg肌gtaattttacttaaat肌g朋肌t8gattgBCB8gt肌tacgc3780tgtttcctcatc"cccattcacaggaatcgagagccctcgagatgaaacttgtcttcct3840cgtcctgctgttcctcggggccctxggactgtgtctggctggccgtaggag肌ggagtgt3900tcagtggtgcaccgtatccc肌cccgaggccacaaaatgcttccaatggcaaaggB8tat3960gag肌gagtgcgtggccctcctgtcagctgcata肌gagagactcccccatccagtgtat4020ccaggccattgcgg肌肌cagggccgatgctgtgacccttgatggtggtttcBtatacg34080ggcaggcctggccccctacaaactgcgacctgtagcggcggaagtctacgggaccgaaag41403C3gCCBCgBactcactattatgccgtggctgtggtg肌g犯gggCggCBgctttcagct4200g肌cgaactgc肌ggtctgaagtcctgccacacaggccttcgcaggaccgctggatggaa4260tgtccctatagggacacttcgtccattcttg肌ttggacgggtccacctg8gcccattga4320ggcagctgtggccaggttcttctcagccagctgtgttcccggtgcagata肌gg肌3gtt4380ccccaacctgtgtcgcctgtgtgCgggg3Cagggg貼朋c8aatgtgccttctcctccca4440ggaaccgtacttcagctactctggtgccttcaagtgtctgagagacggggCtgg8gBCgt4500ggcttttatcgtatgagttaagagagagcacagtgtttgactctgcccagac肌cactcgggacctgtcagacgaggctggaagccagtggacaagttca肌aggg8Cgaaagactgcca45604620tctggcccgggtcccttctcatgccgttgtggcscg肌gtgtgaatggcB8gg3ggBtgC4680catctggaatcttctccgccaggcacaggaaaagtttgga貼ggacaagtcaccgaaatt4740ccagctctttggctcccctagtgggc3g肌agatctgctgttcaaggactctgccattgg4800gUttcgagggtgcccccgaggatagattctgggctgtaccttggctccggctacttcac4860tgccatccagaacttgaggaaaagtgaggaggaagtggctgcccggcgtgcgcgggtcgt4920gtggtgtgcggtgggcgagcaggagctgcgcaagtgt肌ccagtggagtggettgage4980aggcagcgtgaggagaagctacctgctcctcggcctccacgatgccatgagtUggatggcacagaggactgcatcgcccaggatatgtgtacactgcagtggtgctgaagca貼tgtgg50405100tttggtgcctgtcctggcagag朋ct3c肌atcccaacaaagcagtgaccctgatcctaa5160ctgtgtggatsgacctgtgg朋ggatstcttgctgtggcggtggttaggagatcagacac5220tagccttacctgcaggctggtgg肌ctctgtg肌aggcaa肌tatccccatgggcctgctgaagtcctgccacaccgccgcttcaaccagacgggctccttggacaggacgca肌tttga52805340tgaatatttcgtgtattggcagtcaaagctgtgcccctgggacgagcagggtgag朋t肌gtctgacccgagatct肌tcgtgcgtgccc肌cagcaatgtctgtgctctagagatacta54005460cggctacactggggctttccggtgcctggctgsg肌tgctggagacgttgcatttgtgaa55208g3tgtcactgtcttgcagaacactgatgg肌3taacaatg3ggcatgggctaaggattt5580g肌gctggcagactttgcgctgctgtgcctcgatggcaaacggaagcctgtgactgaggc5640tag肌gctgccatcttgccatggccccgaatCBtgCCgtggtgtctcggstggataaggt5700gg肌cgcctgaaacaggtgctgctccaccaacaggtatggaccac汪gggcttctagtgct5760ttcttagctgtgtgggctcatgttaggtgaggagatcacBg叫ctaggtgCBCCBgCCC35820ctcgatcctctctagtcctctacttgaagctcatggtgagagtattggcttC3tgCtgtg5880gcgttgcccagagtgtcaacaagaac肌cagaggcttttgactctgggctttctgggact5940cactccatttctgctgagactctgtgccctggccttgttgccatcactgcctggctcaga6000ggctgtctttttccctcctgctgttcttctggca肌tgaggaagccactgagccttcctc6060ccacstgcBttagtatagtgctttttactcaggtgacatttcctgaacctgggccgagtg6120aacagtgctctaggccaggcctctBa朋CBgca肌ctcagaaggtgccctatagatttag6180ggctctct貼atgtgatttgaacga肌tcccaaaattttctt肌朋tctgggattttatt6240agaacttctatttttatcatataacatcatgtctctgtgtgcttttg肌gaaa3c肌ctc6300agg肌t肌caagactggccaccat肌ctggcctttatggagctcttaacgtgcacacaca6360gtggtgctggtgagagagctgccgtgactgaggggtttgggtctcagtctccccacatgg6420gagcctgggBcagagcaggaactgtgtgaggg叫gc&gggtgaccgacctgcacactgag6480ctggttagtgt8gaatgtccgctgagcctgggttttcctatgagcaattgacttgtgagggcagcctgcctctctagaaggc8gatctca8朋cccctccagetgeatatattgttgcct65406600tgtcacccatBgatggtaggaagaagttgtBtggg肌a8gaggtaggaccagaagtggtggtcacaggttaagaagg肌gtg柳cctggatgctgccca鄉cgggcct66606720gccaccaggagtgtggggtgggggactccBctaaggaggtggaatgactccagaactcag6780ctccttctgccccatggttttctcagggctgttcttgggtgg肌gaaatacccctttgcc6840tcctttaaccgct貼atttgcataaattcctcttttccttggagaaatggatctgactgcagctactcactgtctgccctccggacaagttttgcttatttttgtcgcagccagtctgaa69006960ficc肌aa3ccttctgttcaatgacaacactgagtgtctggccagactccatggcoaaaca7020Bcatatgaaaaatatttgggaccacagtatgtcgcaggcattactaatctgaaaaagtgc7080tcaacctcccccctcctggaagcctgtg肌ttcctcaggaagtaactcgagtgetagage7140tcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccc7200cgtgccttccttgaccctgg朋ggtgccactcccactgtcctttcctaat7260aattgcBtcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcagga7320cagcaagggggflgg8ttggg肌gBC站t3gcBggcatgctggggatgcggtgggctctat7380ggctt肌gctt肌agtccccaggctccccaggCBggCElgBagtatgc肌8geatgeatet7440caattagtcagcaaccaggtgtgga朋gtccccaggctccccagcaggcaga8gtatgC87500aagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcc7560cctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaatttmttattta7620tgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttt7680tggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccatttteggatctga7740tcaagag8cagg3tgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcaegcaggtte7800tccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcBc肌cagacaateggctg7860ctctg&tgcccgacctgtccgccgtgttccggctgtcagcggtgccctgaatgaactgcagcaggggcgcccggttctttggacgaggcagcgcggctatttgtcaagaccgtggctggc79207980cacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggBctg8040gctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccga8100g肌3gtBtCCatcatggctgatgc肌tgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctg8160cccattcgaccacc胆gcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatgg肌gccgg8220tcttgtcgatcaggatgatctggacgaagsgcatcaggggctcgcgccagccgaactgtt8280cgccaggctcBaggCgCgC8tgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgc8340ctgcttgccgaatatcatggtgg肌aatggccgcttttctggattcatcgactgtggccg8400gctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctg朋ga8460gcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattc8520gcagcgcatcgccttct"cgccttcttgacgagttcttctgagcgggactgtcgagccc8580gggcctngggcggatccBgg38C肌C8gC8aacagaggtaatttgttcactBtg8gt8t88640ttttgagaagtattatga幼cat38Cflcataaaaagatttataataattatgttcagtct8700朋gaatggtaatat肌atgtC3gtgt肌g3ttgaca站at8760aacacatttttaaacacataatcaaatttcagagtataga8820actggtatattcattttactaatggtatacctggtttt肌ta肌tgcata8880tt3gtaggaacaattccagactagggactgtgatccccttattct朋tgatggatatgct8940朋tg朋agacBgtagggtgscagtgtggcactaatcctcatttgatcatttatcagctgt90008t朋CCttggctccatgtttctctgtacatcattttcttctgagaatfltt9060cataattacccagagttgatgaactggcacacagtgactattcaatggttttatattata9120tttgatagttttatactcacatttatg肌tgtgtggagttctaaa肌gtatttccattac9180cc8gatgagag3agtgaggtac肌肌caattgBgtBtaC8肌tgtgtgaccataccacat9240agttattaattagcagaac"ttasgg8tttggggBC罪8taaaattcttt9300C3ttat3ttBctcttgtggttctaattgtgBtattt貼gctttcctgttt9360taga8ttgaagattgattgtttggcacttaggcca朋tattttctaagtc9420t3C肌Cttg8tgcctttaaagactcaagattaccaccttctaccaagagaagtagtgcta9480g肌gctggccattgttaaggaactccttgaatta肌加犯gBCtt肌ttt9540ccattaaaacaaacctcagagtaactttttaagtcttttta肌BtBgatc9600tttctttgtt3tatg肌atcagtttggaetattatccaaagtatgtagctaccactctgc9660aggcaactcagga柳ggtggaat肌gtgttgaaatctccEiaaccctgatttcacttgac9720tctctgatttcacttgtgaagg肌gttgggttaatg8g朋3tCCttC8gCgagcatttta9780ctcattagtcttcatatgacttctt肌cta肌cc肌atggaagattttct9840ttctctctcttcactgaatt8tgtttt3朋朋gaggaggat朋ttcatcatgaataacaa9900ttat肌ctggattatggactcaaagattttttttccttctttccaggstgaactccagg39960taaaatccacccctttgcccaggcacagtctctagtctatCCCttC8Ctgggcccatccc10020taacagcctctcctgcctcttactcaaacccctgtggtggtgccgccttt10080ccttcagcctga站taatgggagtcccc站8gtg朋ggagactatggttcct朋gcac朋0140Eig肌atgcccttccctaaatatccagttgagccctttactgagagccag3gcctgactct10200cactgatgttg肌aagctgcaccttcctctgcctctggtccagtcttggatgcaccagcc10260tccccagcctctttctccaaccgtcatgtttcctcctcagtccgtgctgtccctttctca10320gcccaaagttctgcctgttcCCC3g8朋gtagtgccccagagagatatgcccatccaggc10380ctttttgctgtaccaggagcctgtacttggtcctgtccggggacccttccctattcttgt10440ttactaactgtgctgttt朋C"Ctg8tgtttgtatgatatttgagtaat10500taagagccct肌t肌tgaatggttcc肌aataagcatagctgagattaat10560gattctcagcBttagttatagctggaa肌ccttcacctcxcctccacc3C10620cagatctcaatgtctaggcttacccatggagattctgattaactgttctttctatgtaga10680agaaacttattggg肌g咖t朋t3taatggactatgatttaattggtctgttgag肌tt10740tagatgftaggggattaagtt8c肌t肌agcCBga8ttg肌cttgat貼tctcacttggct10800朋cct朋g朋ggtttgctattttct8C朋tt"gaagttttccttatgca10860c肌ttatttcaccacatgactcatttcacctcttgtttttgBtBtatgagcatatgaggg10920C朋船tElCtg肌g3tgcttatttcaatactcaggg肌aattttcttgccaaaaggcaaga10980attgtataattcattcacttattttatUttttaattUt肌ggtctaagBggBtttcaa11040agtgaatgccccctcctcacttttggt肌gctUaggagattggaggC8gactgatcatt11100tUatagttaatatcttttacatttcatcttcctgg&taagcccc肌tagtagcaatttc出60tstcagt3t8CC8gCgt3朋g8tt8gttttaaatttattttcsgtgattgactgttatttU220Bctgacctgaaattatgtatctgttatatttcaaataatgcaaaactgtatatatatggt11280gttgacagatttgattggttttctttcaattgcctatatccttattattgattgtaatca11340tttatagaaaatttcttatacttttatgta肌cctgttagagcttatttt11400a肌gatcaactgcattcacatttctaatctBgtC3ttatgagcttcaattgttttatctc11460tatatattgtcttttaattcat3caatctcacagtccaga11520tatgggactt朋朋ggggaattttg8tattcttaasga朋tacatctttt11580tgtgatcataattcagcagacattttaataaaac肌ttcc肌gtgagccgacacttggtc11640ctagaggaatttttataatcttaagataaggcacagcatggtgtttUgtaat肌gattt11700cttttatgaaaaagtcacBCcaa肌ttgg3aatggggtgagatgaagagt11760朋ctaaatggacatttgttctctattccacag幼ttgactgcgactggaaBtatggc肌t11820<210>2<2U〉2136<212〉舰<213>智人(HomoSapi(us)〈■>2atgaaacttgtcttcctcgtcctgctgttcctcggggccctcggactgtgtctggctggc60cgta卿卿ggagtgttc8gtggtgcaccgtatcccaacccgaggccac朋38tgCttC120gg肌t3tg叫肌gagtgcgtggccctcctgtcagctgcat肌8gagBgac180tcccccatccagtgtatccaggccattgcgga肌acagggccgatgctgtgacccttgat240ggtggtttcatatacgaggcaggcctggccccctacaaactgcgacctgtagcggcgg肌300gtctacgggaccga肌gacagccacg貼ctcactattatgccgtggctgtggtgaag肌g360ggCggC8gCtttcagctgaacgaactgc肌ggtctg貼gtcctgcxacacsggccttcgc420aggaccgctggatggaatgtccctatagggacacttcgtcC3"Cttg肌"ggacgggt480ccacctgagcccattgaggcagctgtggccaggttcttctcagecagetgtgttcccggt540gcagat肌aggacagttccccaacctgtgtcgcctgtgtgcggggacagg600tgtgccttctcctcccaggaaccgtacttcBgctactctggtgccttcaagtgtctgaga660gacggggctggagacgtggcttttatcagagagagcacagtgtttgaggacctgtcagac720gaggctga胆gggacgsgtBtgagttactctgcccagacaacactcggaagccagtggac780fmgttcsaagactgccatctggcccgggtcccttctcatgccgttgtggc8cgasgtgtg840aatggcaagg8ggatgccatctggaatcttctCCgCC8ggC8C3gga朋3gtttgg咖g900gacaagtcacaaggactctgggctccggctcgaaattccaccattgggttacttcactgcgctctttggcttcgagggtgcatccBg肌ctcccctBgtgggcag肌agacccccgaggatagattctggttg柳8咖gtg柳哪Btctgctgttcgctgtaccttagtggctgcc96010201080cggcgtgcgctggagtggctgggtcgtgtgtgagcg肌gggtgtgcggtgcagcgtgaccggcgagcaggBgctgcgcaatgctcctcggcctccaccacgtgtaaccagagagg3Ctgc11401200atcgccctggtgctg肌aggagaagctgatgccatgagtttggatggBggatatgtgtac12603ctgcaggcatigtgaccctggttaggagataatgtggtttatcctaactgcagacactagggtgcctgtctgtggBtagaccttacctggctggCBgagaactacaaatccctgtggaaggatatcttgcaactctgtgaaaggc肌gaaccaacaaagctgtggcggtggtcctgccac132013801440accgccgtggacaggactgcaggctggaatatccccatgggcctgctcttcaaccagacg1500ggctcctgca朋tttg8tgaat8tttcagtC8朋gCtgtgcccctgggtctgacccgaga1560tctaatctctagcaatgagagacgttgcatgtgctctgtggatactacggttgtg肌agatattggcgacctscactgggtgtcactgtcgagcagggtgagaataagtggctttccggtgcctggctgattgcagaacactgatgg肌acgtgcccaacg貼tgctggat肌caatgag162016801740gcatgggcta貼gCCtgtg8aggatttgaactgaggctaggctggcagacaagctgccattttgcgctgctgtgcctcgacttgccatggccccgaatcatggcaaacggtgccgtggtg18001860tctcggatggataaggtggaacgcctgaaacaggtgctgctccaccaacaggctaaattt1920gggagaaatggatxtgactgcccggacaagttttgcttattccagtctgaaaccaa肌ac1980CttctgttC8Btgacaac3Ctgagtgtctggccagactccatggc肌肌cEiacBtatgaa2040aaatatttgggaccacagtatgtcgcaggcattact肌tctgaaaaagtgctcaacctcc2100cccctcctggaagcctgtgaattcctcagg朋gtaa2136<210>3<211>711<212〉PRT〈213〉智人(HomoSapiens)〈400〉3MetLysLeuValPheLeuValLeuLeuPheLeuGlyAlaLeuGlyLeu151015CysLeuAlaGlyArgArgArgArgSerValGinTrpCysThrValSer202530GinProGluAlaThrLysCysPheGinTrpGinArgAsnMetArgArg354045ValArgGlyProProVaiSerCyslieLysArgAspSerProlieGin505560CyslieGinAlalieAlaGluAsnArgAlaAspAlaValThrLeuAsp65707580GlyGlyPhelieTyrGluAlaGlyUuAlaProTyrLysUuArgPro859095ValAlaAlaGluValTyrGlyThrGluArgGinProArgThrHisTyr]00105110TyrAlaValAlaValValLysLysGlyGlySerPheGinLeuAsnGlu115120125LeuGinGlyLeuLysSerCysHisThrGlyLeuArgArgThrAlaGly130135140TrpAsnValProlieGlyThrLeuArgProPheLeuAsnTrpThrGly145150155160ProProGluProlieGluAlaAlaValAlaArgPhePheSerAlaSer165170175CysValProGlyAlaAspLysGlyGinPheProAsnLeuCysArgLeu180185190CysAlaGlyThrGlyGluAsnLysCysAlaPheSerSerGinGluPro195200205TyrPheSerTyrSerGlyAlaPheLysCysLeuArgAspGlyAlaGly210215220AspValAlaPhelieArgGluSerThrValPheGluAspLeuSerAsp225230235240GluAlaGluArgAspGluTyrGluLeuLeuCysProAspAsnThrArg245250255LysProValAspLysPheLysAspCysHisL-euAlaArgValProSer260265270HisAlaValValAlaArgSerValAsnGlyLysGluAspAlalieTrp275280285AsnLeuLeuArgGinAlaGinGluLysPheGlyLysAspLysSerPro290295300LysPheGinLeuPheGlySerProSerGlyGinLysAspLeuLeuPhe305310315320LysAspSerAlalieGlyPheSerArgValProProArglieAspSer325330335GlyLeuTyrLeuGlySerGlyTyrPheThrAlalieGinAsnLeuArg340345350LysSerGluGluGluValAlaAlaArgArgAlaArgValValTrpCys355360365AlaValGlyGluGinGluLeuArgLysCysAsnGinTrpSerGlyLeu370375380SerGluGlySerValThrCysSerSerAlaSerThrThrGluAspCys385390395400lieAlaLeuValLeuLysGlyGluAlaAspAlaMetSerLeuAspGly405410415GlyTyrValTyrThrAlaGlyLysCysGlyUuValProValLeuAla420425430GluAsnTyrLysSerGinGinSerSerAspProAspProAsnCysVal435440445AspArgProValGluGlyTyrLeuAlaValAlaValValArgArgSer450455460AspThrSerLeuThrTrpAsnSerValLysGlyl>ysLysSerCysHis465470475480ThrAlaValAspArgThrAlaGlyTrpAsnlieProMetGlyUuLeu485490495PheAsnGinThrGlySerCysLysPheAspGluTyrPheSerGinSer500505510CysAlaProGlySerAspProArgSerAsnLeuCysAlaLeuCyslie515520525GlyAspGluGinGlyGluAsnLysCysValProAsnSerAsnGluArg530535540TyrTyrGlyTyrThrGlyAlaPheArgCysLeuAlaGluAsnAlaGly545550555560AspValAlaPheValLysAspValThrValLeuGinAsnThrAspGly565570575AsnAsnAsnGluAlaTrpAlaLysAspLeuLysLeuAlaAspPheAla580585590LeuLeuCysLeuAspGlyLysArgLysProValThrGluAlaArgSer595600605CysHisLeuAlsMetAIbProAsnHisAlaValValSerArgMetAsp60615620LysValGluArg匕eulysGinValLeuLeuHisGinGinAlaLysPhe625630635640GlyArgAsnGlySerAspCysProAspLysPheCysLeuPheGinSer645650655GluThrLysAsnLeuLeuPheAsnAspAsnThrGluCysLeuAlaArg660665670LeuHisGlyLysThrThrTyrGluLysTyrLeuGlyProGinTyrVal675680685AlaGlylieThrAsnLeuLysLysCysSerThrSerProLeuLeuGlu690695700AlaCysGluPheLeuArg匕ys705710<210>4<211>26<212>隱<213>人工序列<221>misc_feature<223>引物<400>4gtcgactgctcctcattcagggttat26<210>5<211>25<212>隨<213〉人工序列<221>misc—feature<223>引物<400〉5ctcgagggctctcgattcctgtgaa25<210>6<2U>27<212>DNA<213>人工序列<221>misc—feature<223〉引物<400〉626ctcg3gaggaac肌cagcaaacagagg27<210>7<211〉27<212>■〈213〉人工序列〈221>misc—feature<223>引物<400〉7ggtaccttgccatatttccagtcgcag27<210〉8<211〉20<212>DNA<213>人工序列<221>misc—feature<223>引物<400>8gcctgcgacatactgtggtc20<210〉<211><212><213><221〉<223>921DNA人工序列misc—feature引物—<400>9agctggcagac2123DNA人工序列misc—feature引物—<210><211><212><213><221>〈223〉<400〉10ctcgagtgctagagctcgctgat23<210〉11<211〉22<212>隱<213>人工序列<221>misc—feature<223〉引物<400>11aagcttaagccatagagcccac22<210>12<211>22<212〉隱<213〉人工序列<221>misc_feature<223>引物<400>12aagcttaaagtccccaggctcc22<210〉13<211>23<212>DNA<213〉人工序列<221〉misc—feature<223>引物<400>13gtcgacagtcccgctcagaagaa23<210〉14<211>21<212>DNA<213>人工序列〈221>misc—feature<223〉引物<400>14tacgctgtttcctcatcttcc21<210>15<2U〉21<212>DMA〈213〉人工序列<221>misc一feature<223〉引物<400>15gcagccacttcctcctc&ctt21<210〉16<211>21<212>画<213>人工序列<221>misc_feature<223〉引物<400〉16cagacgaggctgaaagggacg21<210><211><212><213><221><223〉1721醒人工序列misc—featu引物—<400>17caggcagtgatggcaacaagg21<210〉<211><212><213><221><223>1821DNA人工序列misc—feature引物<400〉18tgcccagagtgtcaacaagaa21<210>19<211>21<212>DNA<213〉人工序列<221>misc—feature<223〉引物<400>19cctactcagacaatgcgatgc2权利要求1.一种乳腺特异性表达融合基因，其特征在于，该融合基因从5至3依次包含以下操作性相连的元件山羊β-酪蛋白基因5调控序列，人乳铁蛋白基因序列，牛生长激素多聚A序列，山羊β-酪蛋白基因3序列。2.如权利要求l所述的融合基因，其特征在于，所述的人乳铁蛋白基因序列包含人乳铁蛋白cDNA序列，人乳铁蛋白内含子15序列。较佳的，所述的人乳铁蛋白基因序列具有(a)SEQIDNO:l中第3824-7125所示的基因序列；或(b)在严格条件下与(a)限定的DNA序列杂交且编码人乳铁蛋白的基因序列。较佳的，所述的人乳铁蛋白具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。3.如权利要求l所述的融合基因，其特征在于，所述的山羊P-酪蛋白基因5调控序列从5至3依次包含山羊e-酪蛋白基因5侧冀序列，和外显子l、外显子2非编码序列；或所述的山羊P-酪蛋白基因3序列包含山羊p-酪蛋白外显子6-9序列。较佳的，所述的山羊e-酪蛋白基因5调控序列具有(i)SEQIDNO:1中第1-3817位所示的基因序列，或(ii)在严格条件下与(i)限定的DNA序列杂交且具有与(i)的序列相同调控作用的基因序列。较佳的，所述的山羊P-酪蛋白基因3序列具有(l)SEQIDNO:1中第8598-11819位所示的基因序列；或(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且具有与(1)的序列相同调控作用的基因序列。较佳的，所述的牛生长激素多聚A具有(A)SEQIDNO:1中第7134-7365位所示的基因序列；或(B)在严格条件下与(A)限定的DNA序列杂交且具有与(A)的序列相同调控作用的基因序列。4.如权利要求l所述的融合基因，其特征在于，在牛生长激素多聚A序列和山羊P-酪蛋白基因3序列之间还包含一抗性标记基因。较佳的，所述的抗性标记基因是新霉素抗性基因。5.—种表达载体，其特征在于，该载体含有权利要求1所述的融合基因。6.—种细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求5所述的载体，或其基因组中整合有权利要求l所述的融合基因。7.—种制备高产重组人乳铁蛋白的转基因动物的方法，其特征在于，它包括步骤(a)将权利要求1所述的融合基因转染体细胞，获得基因组中整合有融合基因的转基因细胞；(b)将(a)获得的转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得可高产重组人乳铁蛋白的动物。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述的体细胞为动物胎儿成纤维细胞。9.如权利要求7所述的方法，所述的动物为山羊、绵羊、牛、猪或兔。10.—种生产重组人乳铁蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤-培养权利要求7所述方法制得的转基因动物，从动物乳腺分泌的乳汁中分离纯化出表达的重组人乳铁蛋白。全文摘要本发明公开了一种乳腺特异性表达融合基因，该融合基因从5至3依次包含以下元件山羊β-酪蛋白基因5调控序列，人乳铁蛋白小基因序列，牛生长激素多聚A序列和山羊β-酪蛋白基因3序列。本发明还公开了含有所述融合基因的载体和细胞，以及利用所述融合基因制备高产重组人乳铁蛋白(RecombinantHumanLactoFerrin，rhLF)的转基因动物的方法。本发明获得的转基因动物的乳汁中rhLF的表达量远高于现有水平，并具有与天然人乳铁蛋白(NaturalHumanLactoFerrin，nhLF)相同的生物学活性。文档编号C07K14/435GK101608186SQ20081003915公开日2009年12月23日申请日期2008年6月18日优先权日2008年6月18日发明者俞慧清,刘思国,张爱民,成国祥,陈建泉申请人:上海杰隆生物工程股份有限公司;上海转基因研究中心