一种自组装短肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

专利名称：一种自组装短肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于自组装短肽领域，特别涉及一种自组装短肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
自组装短肽是一种新型的纳米生物材料，自20世纪90年代问世以来，受到了人们 的广泛重视，得到了快速的发展，己合成出多种不同结构的自组装短肽，并在细胞三维 培养及制备疏水药物载体、止血药物、烧伤治疗药物、抑菌药物等方面应用。但是，制 备出更多的自组装短肽、扩大自组装短肽的应用范围仍然是科技工作者关注的问题。癌症是影响人类健康的主要疾病之一，每年约有七百万患者死于癌症，约占全世界 死亡人口的12.5%。专家预测，至2020年，每年癌症患者将增至一千六百万(见World Health Organization: Cancer, www.who.int/cancer/en/ Accessed February, 2007)。 因it匕，吸 引了不同领域的科技人员加入到癌症治疗相关的研究中。然而过去50年以来，尽管人 们付出了巨大努力，癌症治疗所取得的进展却不尽人意。在癌症治疗的最早阶段，人们普遍采用手术切除和放射性治疗，但往往不能达到有 效根除肿瘤，同时在治疗过程中所产生的副作用，使患者承受了巨大的生理和精神痛苦 (见Chabner BA & Roberts Jr. (2005) Nat Rev Cancer 5, 65-72.)。在此情况下，化疗 逐步成为癌症治疗的主要手段。但是，绝大多数抗癌药物在体内是处于自由扩散状态， 这一方面导致药物不能在病灶区达到治疗所需浓度，致使疗效减弱；另一方面，抗癌药 物的自由扩散也势必对机体的其它正常组织器官造成一定的副作用(见Sinha R， Kim GJ， Nie S, & Shin DM (2006) Mol Cancer Ther 5, 1909-1917. LerouxJ -C, Allemann E, De Jaeghere F, Duelker E & Gurny K(1996;) J Control Release30,"9-50.)。2001年，Shin S.Y.等人公开了一种短肽S18 (见Shin S, Lee S, Yang S， Park E， Lee D， Lee M, Eom S, Song W, Kim Y， Hahm K, W a/. (2001) J尸五iTi 五S 58， 504-514.即为该文 献中的P18肽段)，根据文献记载，S18短肽具有杀伤肿瘤细胞K562、 Jurkat、 MDA-MB-3 61的特性，且对正常细胞NIH 3T3的杀伤作用很弱。但文献中仅报道了该肽段在体外 细胞水平上的抗肿瘤作用，没有进行体内动物实验。发明内容本发明的目的在于提供一种抗肿瘤自组装短肽，此种短肽通过自组装作用聚集在肿瘤病灶区，而不在体内自由扩散，从而提高其在肿瘤病灶区的浓度，增强对肿瘤细胞的 杀伤力。本发明所述自组装短肽，命名为R418，由抗肿瘤活性肽段S18、自组装肽段 RADA16-I和连接肽段组成，抗肿瘤活性肽段S18位于自组装肽段RADA16-I的羧基端， 二者之间通过连接肽段连接，其分子模型如图3A所示，其氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO.l所述，其分子量为4344.9 (见图2)。所述自组装肽段RADA16-I是一种离子互 补肽，有16个氨基酸，分子长度大约为5nm，其组成出现极性和非极性氨基酸残基交替； 侧链分为两部分， 一个为极性的，另一个为非极性的；内部的非极性残基通过疏水作用 形成分子间的相互作用，带正、负电荷的残基通过离子互补键在分子间也形成相互作用， 从而最终自组装形成纳米纤维(见Zhang S. Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly. Nature biotechnology. 2003, 21: 1171-1178.)。普遍而言，物质的结构决定物质的功能，首先采用原子力显微镜和透射电镜观察到 R418分子在溶液中通过自组装形成纳米纤维结构，而单独合成的S18分子没有相应的 纳米结构，从而证明R418分子具备自组装和分子聚集的能力，而S18分子则缺乏相应 的自组装能力(见实施例4、实施例5)。体外细胞实验表明，本发明所述自组装短肽R418很明显地引起肿瘤细胞K562、 Jurkat、 MDA-MB-435S的死亡，而对NIH 3T3细胞的细胞毒性较低(见实施例6)。针 对K562细胞的进一步研究，验证了自组装短肽R418对K562具有很强的杀伤力(见实 施例7、实施例8)。动物实验表明，本发明所述自组装短肽R418与短肽S18相比，抑制K562肿瘤细 胞的效果更好，对肿瘤细胞具有更强的杀伤力(见实施例9)。小动物活体成像实验表明，本发明所述自组装短肽R418与短肽S18相比，R418自 组装后，在体内肿瘤区域的局部浓度保持时间远远长于S18局部浓度保持时间(见实施 例10)。本发明所述自组装短肽R418可以通过添加药学上可接受的载体或赋形剂，制成适于临床使用的抗肿瘤药物。 本发明具有以下有益效果1、 实验表明，本发明所述自组装短肽R418很明显地引起肿瘤细胞的死亡，而对 NIH 3T3细胞的细胞毒性较低。2、 实验表明，本发明所述短肽R418具备自组装和分子聚集的能力，能长时间在体 内肿瘤区域保持较高浓度，而不自由扩散。3、 本发明所述自组装短肽R418不仅能在体内抑制肿瘤的生长，而且与短肽S18相比，抑制肿瘤的效果更好。4、 本发明为癌症的治疗提供了一种有效的新药品，具有明显的社会效益和经济效显。


图1是本发明所述自组装短肽R418的高压液相色谱(HPLC)图谱。 图2是本发明所述自组装短肽R418的质谱图,。图3是模型示意图，图中，A为本发明所述自组装短肽R418的分子模型示意图，B 为本发明所述自组装短肽R418形成的自组装纳米纤维模型示意图。图4是原子力显微镜(AFM)图谱，图中，A、 C为本发明所述自组装短肽R418 形成的纳米纤维的AFM图谱(其中，A为5X5um区域内R418的纳米纤维AFM图， C为2X2um区域内R418的纳米纤维AFM图)；E为C图中黑色线段标注处的R418 纳米纤维截面图；B、 D为自组装肽段RADA16-I形成的纳米纤维的AFM图谱(其中， B为5X5um区域内RADA16-I的纳米纤维AFM图，D为2X2"m区域内RADA16-I 的纳米纤维AFM图。)；F为D图中黑色线段标注处的RADA16-I纳米纤维截面图； G、 H为抗肿瘤活性肽段S18的AFM图谱(其中，G为5X5um区域内S18的AFM 图，H为2X2um区域内S18的AFM图)。图5是本发明所述自组装短肽R418的透射电镜(TEM)图像。图6是R418、 S18及RADA16-I三种肽溶液对细胞的毒性实验MTT测定图，图中， A是R418、 S18及RADA16-I三种肽溶液对K562的毒性实验MTT测定图，B是R418、 S18及RADA16-I三种肽溶液对Jurkat的毒性实验MTT测定图，C是R418、 S18及 RADA16-I三种肽溶液对MDA-MB-435S的毒性实验MTT测定图，D是R418、 S18 及RADA16-I三种肽溶液对MDA-MB-231的毒性实验MTT测定图，E是R418、 S18 及RADA16-I三种肽溶液对NIH 3T3的毒性实验MTT测定图。图7是对照溶液(Control) H20及肽溶液(R418、 S18、 RADA16)作用K562细胞的 荧光显微图。图8是对照溶液(Control) H20及肽溶液(R418、 S18及RADA16)作用K562细胞 的流式细胞分析图,图中，A为对照溶液(Control)流式细胞分析图，B为R418肽溶液流 式细胞分析图，C为RADA16-I肽溶液流式细胞分析图，D为S18肽溶液流式细胞分析图。 图9是对照溶液(Control) H20及肽溶液(R418、 S18)对K562细胞裸鼠移植瘤的作 用效果图，图中，A为动物形貌对比图，B为肿瘤大小对比图，C为瘤重对比图，D为肿瘤组织切片对比图。图10是短肽R418和S18分子的小动物体内活体成像图，图中，A为裸鼠成瘤图， B为低浓度(0.4mM) R418和S18分子的体内活体成像对比图，C为高浓度(4mM) R418和S18分子的体内活体成像对比图。具体实施方^实施例l:自组装短肽R418的制备1、 试剂PyBOP (六氟磷酸苯并三唑-l-基-氧基三吡咯烷基磷)、Boc-Phe-Merrifieldresin 树脂、六氢吡啶、二甲基吡啶、TFA(三氟乙酸)、HPLC甲醇、保护氨基酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH 、 Fmoc-Ala-OH 、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc-His(Trt)-OH 、 Fmoc-Phe陽OH、 Fmoc-Pro-OH 、 Fmoc-Ile-OH 、 Fmoc-Trp-OH 、 Fmoc誦Gly-OH 、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Arg(Pmc)隱OH.IPE)、 thioanisole (茴香硫醚)、EDT (乙 二硫醇)、TIS (甲乙硫醚)、HOBT (l-羟基苯并三唑)为Merck公司产品；DMF (二 甲基甲酰胺)为韩国三星公司产品；NMM (甲基玛菲林)购自Sigma公司；DCM(二 氯甲烷)、苯酚、三乙胺为中国医药(集团)上海化学试剂公司产品；甲醇为上海 振兴化工一厂产品；四氢呋喃为上海化学试剂站中心化工厂产品。2、 仪器431A型多肽合成仪为Applied biosystems产品；高效液相色谱为安捷伦1100色谱 仪，制备色谱仪为WATERS600E;冷冻干燥机(FREEZE DRYER 18)为LABCONCO 产品；质谱仪为FinniganLCQ。3、 制备方法 (1)肽链的合成接肽前树脂处理① 称取200毫克Boc-Phe-Merrifield resin到砂芯过滤反应器中；② 加入二氯甲垸浸泡洗涤6次，每次5毫升，过滤除去洗涤的二氯甲烷；③ 加入10。/。的TFA (二氯甲烷作溶剂)5毫升，室温反应2小时，以除去树脂上氨 基酸N端的BOC保护基④ 加入二氯甲垸浸泡洗涤3次，每次5毫升，然后加入5%的三乙胺(二氯甲烷作 溶剂)5毫升，2次中和PH值后再用二氯甲垸洗涤6次，DMF洗涤5次即可放入仪器 反应器中进行接肽反应。接肽在431A自动合成仪上进行，称取30mg Phe-MerrifieW resin放入反应器中，然后按照多肽的序列顺序从羧基端逐渐加入保护氨基酸(反应过程中加入的保护氨基酸并 不是一次全部加入反应容器，而是按照多肽的序列顺序从羧基端逐渐加入，在加入氨基酸的同时要加入相同摩尔的PyBOP试剂和HOBT试剂)。具体而言，首先加入保护氨基 酸Fmoc-Lys(Boc)-OH、 PyBop、 HOBT、 NMM，反应20分钟后，经DMF洗涤5遍， 然后加入配制好的六氢吡啶，此步用来脱除树脂上的FMOC保护基团，大约10分钟， 在脱除FMOC后，用DMF洗涤树脂5次，把六氢吡啶清洗干净，以确保下一步反应的 顺利进行(参见以下简要步骤)(a) Fmoc-Lys(Boc)-OH 29.52mg(b) PyBOP 123.63mg(c) HOBt+H20 475.20^1(d) NMM 365単(e) 30%六氢吡啶 900W x 2次(f) DMF 900^1 x 5次按照以上接肽实验步骤，重复循环反应以加长肽链，不同之处在于需变换(a)原料，(a)原料的变换顺序与多肽羧基端至氨基端的序列相应，具体而言(a)原料应分别依 次变换为Fmoc-Lys(Boc)隱OH (29.52mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Leu-OH (22.27mg)、 Fmoc-His(Trt)-OH G9.05mg)、 Fmoc-Leu國OH (22.27mg)、 Fmoc-Phe-OH (24,41mg)、 Fmoc-Lys(Boc)-OH (29.52mg)、 Fmoc隱Pro陽OH (21.26mg)、 Fmoc-Ile-OH (22.27mg)、 Fmoc-Lys(Boc)-OH (29.52mg)、 Fmoc國Lys(Boc)隱OH (29.52mg)、 Emoc-Phe-OH (24.41mg)、 Fmoc-Leu-OH (22.27mg)、 Fmoc-Lys(Boc)-OH (29.52mg)、 Fmoc-Trp-OH (26.87mg)、 Fmoc-Lys(Boc)-OH (29.52mg)、 Fmoc-Pro-OH (21.26mg)、 Fmoc-Pro-OH (21.26mg)、 Fmoc-Pro-OH (21.26mg)、 Fmoc-Gly陽OH (18.74mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH (25.93mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Arg(Pmc)-OH.IPE (48.20mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH(25.93mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Arg(Pmc)-OH.IPE (48.20mg)、 Fmoc陽Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH (25.93mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Arg(Pmc)-OH.IPE (48.20mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Asp(OtBu)陽OH(25.93mg)、 Fmoc陽Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Arg(Pmc)陽OH.IPE (48.20mg)、乙酰化 试剂(3ml)。接完多肽的树脂经过甲醇清洗后干燥。然后全部转移至玻璃茄形瓶中，加入60毫升无水甲醇并冰浴到-20度时缓慢的通入氨气，使其温度保持在O度以下，通入氨气时 间为90分钟，然后密封振摇24小时取出，过滤收其滤液并浓縮抽干(这一步是将多肽 从树脂上切下并酰胺化)，再加入事先配好并预冷的切肽试剂5ml (81.5%TFA、 5%thioanisole、 5%phenol、 5%water、 2.5%EDT、 1%TIS)。 25。C下搅拌反应3小时。取 出过滤，收集滤液；树脂用少量三氟乙酸洗3次，将洗涤液与滤液合并，浓縮后冷却， 然后加入10ml冷乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。得粗品约60mg。 (2)肽链的纯化先采用安捷伦1100分析系统确定目标肽，使用C18反相柱子，条件为A相为95% 的水(甲醇配比)，B相为95%的甲醇(甲醇配比)，然后各加O.l 。/。的TFA ，常规条件 在上样品之前先用A相平衡柱子15分钟，然后上样，从A相到B相为25分钟梯度洗 脱。检测波长220nm，流速:lmL/min。收集目标肽，然后做质谱鉴定。再根据目标多 肽的出峰时间来确定本条多肽的最佳洗脱梯度。确定目标肽后，釆用Waters600E纯化系统进行多肽制备使用C18反相制备柱子， 条件为八相为95%的水(乙腈配比)，B相为95。/。的甲醇(乙腈配比)，然后各加0.1% 的TFA ，常规条件从A相到B相为70分钟梯度。检测波长220nm,流速36mL/min， 先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱，收集多肽洗脱峰，然后与分 析仪器配合确定样品的目标峰，所获产物经冷冻干燥即得本发明所述自组装短肽R418, 其氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO.l所述。实施例2:自组装短肽R418的高效液相色谱和质谱检测将实施例1制备的自组装短肽R418采用高效液相色谱(HPLC)检测(检测条件A 相为5%的乙腈+O. 1%的三氟乙酸；8相为95%的乙腈+O. 1%的三氟乙酸；直线梯度为20 分钟)，检测结果见图l，根据图1中的谱峰面积确定其纯度达到了95%。将实施例1制备的自组装短肽R418采用质谱(质谱仪为Finnigan LCQ)检测，检 测结果见图2，根据图2可确定其分子量为4344.9(理论分子量为4344.11)，表明所合成 短肽确为所设计肽。实施例3: R418抗肿瘤自组装短肽的三维分子模型及自组装模型绘制 对实施例1制备的自组装短肽R418采用专业Molsoft. ICM画图软件基于能量最小 化原理绘制三维分子模型示意图，所绘制的三维分子模型示意图见图3A，通过该示意图， 可清楚的知道其氨基酸的空间分布，该示意图显示，抗肿瘤活性肽段S18位于自组装肽段RADA16-I的C端，二者之间通过连接区连接。实施例'l制备的自组装短肽R418在水中可形成自组装纳米纤维，对所述自组装短 肽R418形成的自组装纳米纤维采用专业Molsoft. ICM画图软件基于能量最小化原理绘 制三维分子模型示意图，所绘制的三维分子模型示意图见图3B。该示意图显示，众多 R418分子自组装形成一段纳米纤维。 '实施例4:原子力显微镜检测三种短肽分子的自组装性能1、 实验材料短肽样品R418 (实施例1制备，下同)、S18 (购自上海波泰生物科技有限公司，下同)、 RADA16-I (购自BD Bioscience, Bedford, MA.下同)。主要溶液无菌去离子水H20: 18 Millipore Milli-Q system,高压灭菌后4'C保存备用。(下同)。2、 主要实验仪器原子力显微镜AFM (SPA400, SIINanotechnology， Inc.)3、 实验方法(1) 用去离子水配置RADA16-I、 R418及S18的工作液，其终浓度为100pM。(2) 分别将配置的RADA16-I、 R418及S18工作液5微升均匀涂于新剥光的三片云母片表面。(3) 针对RADA16-I，当涂片完成后约30s，以1000ul去离子水冲洗除去未附着 的短肽。(4) 将上述各短肽工作液涂片在室温中空气干燥。(5) 在气相中对云母片进行AFM扫描，用SPI4000的记录模式收集AFM图像。 使用20um扫描器(400)、 Olympus Si-DF20微悬臂，及弹簧常量为12.00N/m的针(Si，半径10nm，矩形基底200.00um)。悬臂的自由共振频率为127.00kHz。相位图以 512X512像素的解析度记录。为显示自组装短肽的细微纳米结构，对每个样本均采用5 X5um、 2X2um的范围进行扫描。4、 实验结果短肽ADA16-I、 R418及S18工作液的原子力显微(AFM)图像见图4，图4显示， 在短肽RADA16-I和R418溶液中可以观察到纳米纤维(见图4A—D)，而且R418中的纳米纤维比RADA16-I中的纳米纤维宽(图4E、 F);在短肽S18溶液中未观察到纳 米纤维(见图4G、 H)。实验结果表明短肽ADA16-I 、 R418分子具备自组装和分子 聚集的能力，短肽S18分子则缺乏相应的自组装能力。实施例5:透射电子显微镜检测短肽R418分子的自组装性能 1、实验材料短肽样品R418主要溶液去离子水H20PBS溶液(pH7.4): 8.0g/L NaCl + 0.2g/L KC1 + 1.56g/L Na2HP04 -H20 + 0.20g/L KH2P04,用HC1调节溶液的pH值至7.4。 ？BS高压灭菌后4'C保存备用。2、 主要实验仪器透射电子显微镜(TEM,H-600, Hitachi)3、 实验方法(1) 以去离子水或PBS (pH7.4)配制R418至终浓度为100pM的工作液，用于透 射电子显微镜的观察。(2) 取少量工作液用1%磷钨酸负染用洁净的吸头吸取一滴(约10-30pL)样品 滴于洁净的载玻片表面，用镊子小心地夹取一块由Formvar膜覆盖的TEM铜网，在样 品滴上轻轻蘸取少量样品溶液，静置数秒，待样品与铜网充分结合后，再用铜网蘸取少 量1%的磷鸭酸，对已吸附的肽溶液进行负染色。(3) 用滤纸吸干铜网上多余的溶液，在空气中静置数分钟待铜网干燥。(4) 以TEM (H-600, Hitachi)扫描铜网，直接观察铜网上的短肽自组装结构。4、 实验结果短肽R418溶液的透射电子显微镜(TEM)图像见图5，图5显示，在短肽R418 溶液中可以观察到纳米纤维。实验结果表明R418分子可以在水溶液中自组装成纳米纤维。实施例6: MTT细胞毒性实验1、实验材料(1)短肽样品R418水溶液(无菌去离子水H20配置，下同)；S18水溶液(无菌去离子水H20配置，下同)；RADA16-I水溶液(无菌去离子水H20配置，下同)。(2) 细胞株白血病细胞株，K562 (ATCC序号CCL-243 ,下同)和Jurkat (ATCC序号 TIB-152 ,下同)；乳腺癌细胞株，MDA-MB-435S (ATCC序号HTB-129 ,下同) 及MDA-MB-231 (ATCC序号HTB-26 ,下同)；对照细胞，NIH 3T3 (ATCC序号 CRL-1658TM，下同)。(3) 主要溶液PBS(pH7.4): 8.0g/L NaCl + 0.2g/L KCl + 1.56g/L Na2HP04 .H20 + 0.20g/L KH2P04, 用HC1调节溶液的pH值至7.4。 PBS高压灭菌后4'C保存备用。MTT溶液称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml PBS在电磁力搅拌机上搅拌 30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4'C保存备用，两周内有效。溶解液含有0.01M HC1的10%的SDS溶液。2、 主要实验仪器(1) 细胞操作用生物安全柜(NUAIRE， CLASS II )(2) 离心机(BECKMAN COULTER, AllegraTMX-22R Centriflige)(3) 倒置相差显微镜(OLYMPUS, 1X71)(4) C02培养箱(Thermo，HEPACLASS 100)(5) 酶联免疫检测仪(Gene Company limited, P Quant)3、 实验方法(1) K562细胞培养条件(下同)完全培养基的配制RPMI 1640培养基+抗生素(100 units/mL penicillin G ，100 u g/mL streptomycin), 90%;胎牛血清，10%。(上述试剂购自Invitrogen公司) 培养温度37°C。空气要求5%C02。(2) Jurkat细胞培养条件(下同)完全培养基的配制RPMI 1640培养基+抗生素(100 units/mL penicillin G ,100" g/mL streptomycin), 90%;胎牛血清，10%。(上述试剂购自Invitrogen公司) 培养温度37°C。空气要求5%C02。(3) MDA-MB-231细胞培养条件(下同)完全培养基的配制Leibovitz's L-15培养基+抗生素(100 units/mLpenicillin G ，100 y g/mL streptomycin), 90%;胎牛血清，10%。(上述试剂购自Invitrogen公司) 培养温度37°C。空气要求无<302。(4) MDA-MB-435S细胞培养条件(下同)完全培养基的配制Leibovitz's L-15培养基+抗生素(100 units/mL penicillin G ,100 yg/mLstreptomycin)十胰岛素(0.01 mg/ml)， 90%;胎牛血清，10%。(上述试剂购自 Invitrogen公司)培养温度37°C。空气要求无C02。(5) NIH3T3细胞培养条件(下同)完全培养基的配制RPMI 1640培养基(Invitrogen)十抗生素(100 units/mL penicillin G, 100 ug/mL streptomycin), 90%;胎牛血清，10%。(上述试剂购自Invitrogen公司) 培养温度37'C。空气要求5%C02。(6) MTT细胞毒性实验步骤a. 接种细胞向96孔板的微孔中加入含有新鲜完全培养基(见上述各细胞培养条 件)的细胞悬浊液lOOpl，其中K562细胞接种量为5xl0S个/ L, Jurkat细胞接种量为2 X 104个/孔，NIH 3T3、 MDA-MB-435S及MDA-MB-231细胞接种量均为1X 104个/孔。b. 在相应细胞的培养条件下孵育24小时。c. 加药(短肽溶液)分别添加10pl不同浓度的R418, S18,RADA16-I溶液至不同 的已接种细胞的微孔中(最终体系的肽浓度梯度为20^M、 10pM、5nM、2.5pM、 1.25pM)， 实验在相同条件下进行三个复孔的测量。在相应细胞的培养条件下孵育48小时。d. 加MTT溶液向每孔添加20pMTT反应液(5mg/mlMTT溶于PBS)， 37'C孵育 4小时。e. 加溶解液向每孔加入100^1包含0.01M HC1的10%的SDS溶液过夜，以溶解兰紫色沉淀。f. 光吸收值(OD值)的测定用酶标仪于570nm处测定吸收光谱。g. 细胞存活率=(给药组光吸收值一空白组光吸收值)/(对照组光吸收值一空白组光fl及收值)xiooy。。备注空白组指不含细胞和肽溶液，只含有相应细胞培养基的平行实验组；对照组 指以无菌去离子水H20代替肽溶液进行实验的平行实验组。 4、实验结果MTT分析显示，48小时作用后，不同浓度的RADA16-I对肿瘤细胞和NIH 3T3细 胞的细胞毒性很低(见图6 A-E)。与RADA16-I相对照，R418和S18很明显地引起肿 瘤细胞K562、 Jurkat、 MDA-MB-435S的死亡(图6 A-C)，而R418及S18对NIH 3T3细胞的细胞毒性较低(图6E)。实施例7:荧光显微镜观察1、 实验材料(1) 短肽样品R418 (无菌去离子水H20配置，下同)； S18 (无菌去离子水H20配置，下同)； RADA16-I (无菌去离子水H20配置，下同)。(2) 细胞株白血病细胞株K562 (ATCC序号CCL-243 ,下同)。(3) 主要溶液PBS溶液(pH7.4):配制同实施例6，高压灭菌后4'C保存备用。Calcein AM : 4 mM in anhydrous DMSO (购自Molecular Probes )Ethidium homodimer-12 mM in DMSO/H20 1:4 (v/v)(购自Molecular Probes )2、 主要实验仪器(1) 细胞操作用生物安全柜(NUAIRE, CLASS II)(2) 离心机(BECKMAN COULTER, AllegraTMX-22R Centrifoge)(3) 倒置相差显微镜(OLYMPUS, 1X71)(4) C02培养箱(Thermo, HEPACLASS 100)3、 实验方法(1) 接种细胞向6孔板中加入含有新鲜完全培养基的K562细胞悬浊液4mL/孔， K562细胞接种量为5xl()4个/mL。(2) 在37'C、 5% C02的培养条件下孵育24小时。(3) 分别加入R418、 RADA16-I和S18短肽溶液400pL至不同的，已接种细胞的 微孔中，使肽溶液终浓度达到2(HiM，将6孔板在37'C、 5% C02的培养条件下继续孵育12小时。
(4) 离心收获K562细胞，用PBS溶液冲洗，去除培养基，最终将细胞混悬于2mL 的PBS溶液中。
(5) 加入calceinAM禾tl EthD-l荧光染料，.使calcein AM的终浓度为2|iM,使 EthD-l的终浓度为4nM，在室温下将反应体系避光作用40分钟。
(6) 将6孔板置于倒置荧光显微镜下观察。
备注对照组(Control)指以无菌去离子水H20代替肽溶液进行实验的平行实验组。 4、实验结果
对照组(Control)和各实验组的荧光显微图像见图7，图7显示，对照组(Control) 和用RADA16-I处理过的K562细胞死亡率很低，用R418和S18处理过的K562细胞死 亡率非常高。实验结果表明R418和S18对肿瘤细胞K562具有很强的杀伤力。
实施例8:流式细胞术测定
1、 实验材料
(1) 短肽样品
R418 (无菌去离子水H20配置，下同)；
S18 (无菌去离子水H20配置，下同)；
RADA16-I (无菌去离子水H20配置，下同)。
(2) 细胞株
白血病细胞株K562 (ATCC序号CCL-243 ,下同)。
(3) 主要溶液
PBS(pH7.4):配制同实施例6，高压灭菌后4'C保存备用。
Vybrant Apoptosis Assay试剂盒# 7 (购自Molecular Probes) <>
2、 主要实验仪器
(1) 细胞操作用生物安全柜(NUAIRE, CLASSII)
(2) 离心机(BEC薩N COULTER, Allegra X-22R Centrifuge)
(3) 倒置相差显微镜(OLYMPUS, 1X71)
(4) C02培养箱(Thermo, HEPA CLASS 100)
(5) 流式细胞仪(FACSAria, BD)
3、 实验方法
(1)在6孔板上每孔接种5X 1(^个/mLM密度的K562细胞悬液4mL。(2) 6孔板在37'C的C02培养箱中孵育24小时。
(3) 分别添加10pl不同浓度的R418, S18, RADA16-I溶液至不同的，己接种细胞 的微孔中，使其终浓度达到20uM。
(4) 继续孵育，使短肽作用时间达到12小时。
(5) 收获，冲洗细胞，将细胞混悬于pH7.4的冷PBS溶液中。
(6) 细胞计数，使细胞的浓度大约为1Xl(T个/mL。
(7) YO-PRO-1和PI避光染色30分钟。
(8) 以流式细胞仪(FACSAria， BD)来分析正常、凋亡或坏死的细胞。
备注对照组(Control)指以无菌去离子水H20代替肽溶液进行实验的平行实验组。 4、实验结果
流式细胞分析结果见图8，图8显示，R418、 S18、 RADA16-I作用的K562细胞以 及对照组(Control) K562细胞都有极小比例(< 2 %)的凋亡细胞。但是，相对于对照组(图 1A， 5.2 %)和RADA16-I组(图8C， 3.2%)， R418作用的K562细胞的坏死比例(图8B， 87.8%)以及S18作用的K562细胞坏死比例(图8D, 80.5%)显著增加。实验结果表 明R418和S18对肿瘤细胞K562具有很强的杀伤力，并且主要是通过促使细胞坏死的 方式致死K562细胞死亡。
实施例9: R418对裸鼠体内K562肿瘤生长的影响
1、 实验动物
4-6周龄的BALB/c裸鼠，平均体重约为20g，雌雄各半，由四川大学由四川大学实 验动物中心获得。词养于无特定病原体(简称SPF)条件下，饮水、标准词料及其他与 动物接触的物品均经高压灭菌处理。
2、 实验材料
(1) 细胞株
白血病细胞株，K562 (ATCC序号CCL-243 ,下同)。
(2) 短肽样品
R418 (无菌去离子水H20配置，下同)； S18 (无菌去离子水H20配置，下同)。
(3) 主要试剂
Matrigel: 购自BD Bioscience, Bedford, MA. RPMI 1640培养基购自Invitrogen公司。3、 主要实验仪器
(1) 细胞操作用生物安全柜(NUAIRE， CLASS II)
(2) 离心机(BECKMAN COULTER, AllegraTMX-22R CentrifUge)
(3) 倒置相差显微镜(OLYMPUS, 1X71)
(4) C02培养箱(Thermo, HEPA CLASS 100)
4、 实验方法
(1) 大量培养K562细胞。
(2) 细胞清洗及收集
A、 将K562细胞连同培养液一并转移到15mL离心管内；
B、 离心1000rpm， 5min;
C、 弃去上清，加入较大体积新的无血清RPMI 1640培养基(15mL/离心管)到离 心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；
D、 再次离心细胞悬液；
E、 弃去上清，加入较小体积新的无血清RPMI 1640培养基(0.2mL/离心管)到离 心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；
(3) 细胞计数调整细胞密度约为lxl()8个/mL。
(4) 细胞接种取lxl()8个/mL的K562细胞悬液与Matrigel 1:1混合成混悬液， 每次取200pl，皮下注射入裸鼠的背部右侧。
(5) 每天观察裸鼠的成瘤情况。
(6) 在观察到实体瘤形成后，将裸鼠随机分成3组(每组七只裸鼠)对照组、R418 组和S18组。
(7) 每隔三天向R418组的各只裸鼠的肿瘤边缘分别注射一次短肽R418溶液(4mM, O.lmL)、向S18组的各只裸鼠的肿瘤边缘分别注射短肽S18溶液(4mM， O.lmL)。对于对 照组，则每次注射0.1mL无菌去离子水。
(8) 自第一次给药12天后处死裸鼠，剥离肿瘤，进行肿瘤质量测量及肿瘤组织切 片HE染色分析。
5、 实验结果
实验结果见图9，图9显示，用药12天后，R418组裸鼠的肿瘤远小于S18组和对 照组(见图9A、 B)，比较实体瘤重量(见图9C)， R418组瘤重为133.23 ± 27.58mg， S18组瘤重为549.06 ± 93.76mg克，对照组瘤重为576.63 ± 54.20mg;在肿瘤组织切片分 析中(见图9D)，与对照组和S18组相比，R418组肿瘤的坏死水平显著提高。实验结果表明，R418不仅能在体内抑制K562肿瘤细胞的生长，而且与S18相比，对K562肿
瘤细胞的抑制效果更好。
实施例10: R418和S18分子的体内活体成像
活体动物体内成像技术是在活体动物体内检测、记录和分析特定细胞和分子的直观 图像，进而为研究者提供传统影像学无法检测到的体内细胞和分子水平的信息，为疾病 发病机理和药物作用机制等研究提供新的技术手段。
1、 实验动物
4-6周龄的雌性BALB/c裸鼠，平均体重约为20g，由四川大学实验动物中心提供。 饲养条件为SPF级别。
2、 实验材料
(1) 细胞株
白血病细胞株K562 ( ATCC序号CCL-243 )。
(2) 短肽样品
荧光染料FITC标记的R418、 S18短肽(分别为FITC-R418和FITC-S18)。
(3) 主要试剂
Matrigel: 购自BD Bioscience, Bedford, MA。
培养基RPMI 1640。
麻醉剂15mg/mL戊巴比妥纳。
3、 主要实验仪器
(1) 细胞操作用生物安全柜(NUAIRE, CLASS II)
(2) 离心机(BECKMAN COULTER, AllegraTMX-22R Centrifoge)
(3) 倒置相差显微镜(OLYMPUS, IX")
(4) C02培养箱(Thermo，HEPACLASSlOO)
(5) 活体荧光成像系统(lightools, LT-99D2 Illumatool Dual Light System)
4、 实验方法
(1) 大量培养K562细胞。
(2) 细胞清洗及收集.-
A、 将K562细胞连同培养液一并转移到15mL离心管内；
B、 离心1000rpm， 5min;
C、 弃去上清，加入较大体积新的无血清RPMI 1640培养基(15mL/离心管)到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；
D、 再次离心细胞悬液；
E、 弃去上清，加入较小体积新的无血清RPMI 1640培养基(0.2mL/离心管)到离 心管内，用吸管吹打形成细胞悬液； '
(3) 细胞计数调整K562细胞密度约为1x108个/mL。
(4) 细胞接种取lxl()8个/mL的K562细胞悬液与Matrigel 1:1混合成混悬液， 每次取100pl，分别皮下注射入裸鼠的背部左、右两侧。
(5) 每天观察裸鼠的成瘤情况。
(6) 在观察到实体瘤形成后，在裸鼠腹部注射麻醉剂戊巴比妥纳0.1—0.2mL进行
动物麻醉。
(7) 待裸鼠麻醉后，将FITC-R418分子溶液(0.05mL, 0.4mM)皮下注射至裸鼠 右侧背部肿瘤的瘤边，同时将FITC-S18分子溶液(0.05mL， 0.4mM)皮下注射至同一 只裸鼠左侧背部肿瘤的瘤边。
(8) 将裸鼠放置于lightools活体荧光成像系统中(激发波长为470nm，发散波长 为515mn)，通过CCD照相采集R418和S18在不同时间段的体内荧光图像，通过对比 两种分子的体内荧光图像，分析R418和S18在体内肿瘤区域的局部浓度保持情况的差 异°
(9) 平行将高浓度的FITC-R418分子溶液(0.05mL， 4mM)皮下注射至另外一 只裸鼠的右侧背部肿瘤的瘤边，同时将高浓度的FITC-S18分子溶液(0.05mL， 4mM) 皮下注射至该裸鼠左侧背部肿瘤的瘤边。同上步骤8的实验操作，采集高浓度R418和 S18在不同时间段的体内荧光图像，通过对比两种分子的体内荧光图像，分析高浓度 R418和S18在体内肿瘤区域的局部浓度保持情况的差异。
5、实验结果
实验结果见图10 ，图10显示，在0.4mM FITC—R418溶液和0.4mM FITC — S18
溶液的活体荧光成像对比中，肿瘤区域的S18在60分钟的时间点上几乎已完全消失， 但R418则一直在肿瘤区域保持了较高浓度，在250分钟的时间点上，仍然可以很清楚
地在肿瘤区域观察到较高浓度的R418溶液；在4mM FITC—R418溶液和4mM FITC —
S18溶液的活体荧光成像对比中，发现在注射药物后的l一3天内，FITC-S18的荧光减
弱速度快于FITC-R418，在第四天，FITC-S18在肿瘤区域完全消失，而FITC-R418仍
然保持了一定的荧光强度。实验结果表明，R418在体内肿瘤区域的局部浓度保持时间
远远长于S18局部浓度保持时间，进一步阐明了为什么在体内实验中，R418比S18具有更强的杀伤肿瘤细胞的功能。
SEQUENCE LISTING
<iio>四川大学
<120> —种自组装短肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用 <160> 1
<170> Patentln Version 3.2
<210>1
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<222> (1)(38) <223>端基保护
<400> 1
CH3CO-ArgAla Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala
5 10 Arg Ala Asp Ala Gly Pro Pro Pro Lys Trp Lys Leu Phe Lys
15 20 25
Lys lie Pro Lys Phe Leu His Leu Ala Lys Lys Phe- NH2 30 3权利要求
1、一种自组装短肽，其特征在于它的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所述。
2、 权利要求1所述自组装短肽在制备治疗或预防白血病的药物中的应用。
3、 权利要求1所述自组装短肽在制备治疗或预防乳腺癌的药物中的应用。
全文摘要
一种自组装短肽R418，由抗肿瘤活性肽段S18、自组装肽段RADA16-I和连接肽段组成，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所述。通过原子力显微镜和透射电镜的表征，证明R418分子具有在溶液状态下自组装形成纳米纤维的特性。体外细胞实验表明，自组装短肽R418显著地引起肿瘤细胞K562、Jurkat、MDA-MB-435S的死亡，而对NIH3T3细胞的细胞毒性较低。小动物活体成像实验表明，R418自组装后，在体内肿瘤区域的局部浓度保持时间远远长于S18局部浓度保持时间。与小动物活体成像实验相一致，动物肿瘤抑制实验表明，自组装短肽R418与短肽S18相比，抑制肿瘤的效果更好。
文档编号C07K14/00GK101302249SQ20081004477
公开日2008年11月12日 申请日期2008年6月24日 优先权日2008年6月24日
发明者唐成康, 赵晓军 申请人:四川大学