专利名称：：一种提高变性重组蛋白质复性产率的方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学相关领域，涉及变性重组蛋白质的体外复性，更具体是涉及一种提高变性重组蛋白质体外复性产率的方法。
背景技术：
：随着医用及工业化重组蛋白质技术在临床及生化研究等方面的应用的逐年增加，重组蛋白质表达体系的发展日新月异，目前原核生物大肠杆菌表达系统仍是最为简单、廉价的蛋白质表达体系。大肠杆菌蛋白质表达体系的突出优点在于操作简单、传代时间短、蛋白质产量高且成本低廉。而其显著缺点则在于许多大量表达的重组蛋白质不能正确折叠成具有生物活性的天然构象，以致聚集形成无活性的包涵体。包涵体是大肠杆菌在大量表达目的蛋白质过程中，重组蛋白质表达速率过快或表达温度过高等条件下，未能在细胞内及时折叠成为正确构象的蛋白质折叠中间体通过分子内大量暴露的疏水区域之间的相互作用而导致的聚集。将包涵体以高浓度盐酸胍或脲等变性剂作用下溶解即形成可溶的变性重组蛋白质。因此，改善蛋白质表达的温度、诱导剂浓度等外界条件可以在一定程度上改善可溶蛋白质的表达，但探索更为有效的变性重组蛋白质复性方法则是世界上许多实验室的研究热点。常规的变性重组蛋白质的复性过程，通常是在非常低的蛋白质浓度和较低的温度条件下将变性或重组蛋白用透析或稀释等手段除去变性剂，使目的蛋白质自发折叠形成具有生物活性的三维构象。复性所需的时间和产率随蛋白质种类、变性方法和温度等因素而各有不同。然而蛋白质的复性产率依赖于正确折叠与形成错误聚集体之间的竞争，许多变性重组蛋白质在稀释或透析过程中由于分子间的相互作用可能形成大量的错误聚集而减少活性蛋白质的产率。因此，实际操作中通常将变性重组蛋白质以较低的速度缓慢稀释于复性缓冲液中，或以梯度变性剂浓度将变性重组蛋白质分级透析，以缓慢降低变性剂的浓度避免因变性剂浓度变3化过快而导致聚集。近年来，随着分子伴侣的发现及深入研究，添加一定的分子伴侣也可以帮助变性重组蛋白质复性和稳定折叠过程中间体，在一定程度上减少聚集的发生。此外，还可通过在复性缓冲液中添加一定浓度的表面活性剂、L-精氨酸、硫酸铵等小分子以影响分子间疏水区域的相互作用从而减少蛋白质聚集的发生。细胞内是由蛋白质、多糖、核酸等多种性质各异的生物大分子共同组成的一个浓度高达80-400g/l的拥挤环境，细胞容积的10-40%都被大分子占用。由于大分子的不可穿透性使得任何一个大分子的实际可及空间大大减少，这样的生物大分子活动环境被称为"大分子拥挤环境"。大分子拥挤对生物大分子行为的影响用比较准确的术语描述就是"排斥容积效应"。概括而言，这是一种由于空间排斥而引起的纯物理性质的非特异性效应。1981年Minton首先提出了"排斥容积效应"理论。在￡^;^r/c/'aco/z'的类核中DNA的平均浓度估计为30-100g/1，与真核细胞分裂间期核中的DNA浓度相似。在细胞外介质中有高浓度的多糖，血液中含有约400g/1的蛋白质。目前在中国专利网中，涉及蛋白质复性的专利仅十余项。其中塞尔蛋白质股份有限公司专利号02826228发明涉及将取代的咪唑鎗盐用于蛋白质复性、降低其聚集并可能增加其热稳定性；中国科学院过程工程研究所专利号为02156513涉及一种采用渗透质和疏水层析的组合系统复性蛋白质的方法，将变性蛋白质采用高浓度盐和变性剂梯度吸附到疏水层析柱上，然后用一定浓度的渗透质洗脱，使蛋白质在洗脱过程中逐渐复性，正确折叠而形成天然活性蛋白质。
发明内容本发明目的是在于提供了一种提高变性重组蛋白质复性产率的方法，方法简单，操作方便，本发明采用含有混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液，使得目标蛋白质在类似细胞环境的较为温和的条件下折叠成天然构象，因此更有利于变性重组蛋白质形成活性的天然构象。本发明涉及的材料试剂相对低廉，能显著提高变性重组蛋白质的复性产率，有利于工业或医用放大生产。为实现上述目的，本发明采用将变性剂溶解的变性重组蛋白质(如变性重组溶菌酶和变性重组肌酸激酶)稀释于含有大分子拥挤试剂的复性缓冲液中的方法使之实现有效复性并提高其复性产率；以多糖(包括多聚葡萄糖及多聚蔗糖如Fico1170、Fico11400、dextran70)或聚乙二醇(如PEG2000、PEG3350、PEG20000)、蛋白质(如牛血清白蛋白BSA)及核酸(如小牛胸腺DNA)等生物大分子物质配制成一定浓度的混合大分子拥挤试剂，模拟细胞内真实存在的拥挤环境，将以变性剂(6M盐酸胍或8M尿素)变性的重组蛋白质缓慢加入含混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中使之复性，实验结果显示混合大分子拥挤试剂能有效提高变性重组蛋白质(如变性重组溶菌酶、变性重组肌酸激酶)的复性产率。具体来说，包括以下步骤-A.将重组包涵体蛋白质(如溶菌酶和肌酸激酶)以含变性剂(6M盐酸胍或8M尿素)的复性缓冲液溶解；B.将变性重组蛋白质(如变性重组溶菌酶和变性重组肌酸激酶)缓慢加入含大分子拥挤试剂的复性缓冲液中，在4-25度复性2-48小时；这些大分子拥挤试剂组成包括多糖、蛋白质及核酸在内的大分子物质；大分子拥挤试剂的浓度为80-400克每升；所用的复性缓冲液可以为pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0及该范围内任意缓冲盐体系；具体来说多糖为多聚葡萄糖及多聚蔗糖如Fico1170、Fico11400、dextran70;聚乙二醇如PEG2000、PEG3350、PEG20000;蛋白质为包括牛分子量在5-50kDa的任意蛋白质如血清白蛋白BSA、血红素；核酸为DNA或RNA分子如小牛胸腺DNA;混合大分子拥挤试剂为多糖或聚乙二醇、蛋白质或核酸之间任意比例的混合；将变性重组蛋白质缓慢加入上述混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中，蛋白质复性浓度在O.l、0.25、0.5、l.O毫克每毫升及这一范围内的任意浓度，控制复性在4、10、12、15、20、25度及在这范围内的任意合适温度，在2、4、8、10、12、24、36、48小时及之间的任意时间测定复性产率得到达到最大复性产率的复性时间。本发明采用含有大分子拥挤试剂的复性缓冲液，使得目标蛋白质在类似细胞环境的较为温和的条件下折叠成天然构象，因此更有利于变性重组蛋白质形成活性的天然构象。本发明涉及的材料试剂相对低廉，方法简单且易于操作，能显著促进变性重组蛋白质的复性产率，有利于工业或医用放大生产。图1为变性兔肌酸激酶在不同浓度比例小牛胸腺DNA(CTDNA)和Ficoll70混合大分子拥挤试剂复性缓冲液中的复性产率比较。其中，N表示变性兔肌酸激酶在无混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时的复性产率，Dl+F表示变性兔肌酸激酶在10克每升CTDNA和卯克每升Ficoll70作为混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时的复性产率，D2+F表示变性兔肌酸激酶在20克每升CTDNA和80克每升Ficoll70作为混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时的复性产率。变性兔肌酸激酶在10克每升CTDNA和90克每升Ficoll70作为混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时后的复性产率比无拥挤条件下增加了19%;在20克每升CTDNA和80克每升Ficoll70作为混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时后的复性产率比无拥挤条件下增加6.9%。图2为变性兔肌酸激酶在不同浓度比例CTDNA和dextran70混合大分子拥挤试剂复性缓冲液中的复性产率比较。其中，N表示变性兔肌酸激酶在无混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时的复性产率，Dl+d表示变性兔肌酸激酶在10克每升CTDNA和90克每升dextran70作为混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时的复性产率，D2+d表示变性兔肌酸激酶在20克每升CTDNA和80克每升dextran70作为混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时的复性产率。变性兔肌酸激酶在10克每升CTDNA和卯克每升dextran70作为混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时后的复性产率比无拥挤条件下增加了13%;在20克每升CTDNA和80克每升dextan70作为混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时后的复性产率比比不拥挤条件下增加4%。图3为变性兔肌酸激酶在不同浓度比例CTDNA和PEG2000混合大分子拥挤试剂复性缓冲液中的复性产率比较。其中，N表示变性兔肌酸激酶在无混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时的复性产率，Dl+P表示变性兔肌酸激酶在10克每升CTDNA和卯克每升PEG2000作为混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时的复性产率，D2+d表示变性兔肌酸激酶在20克每升CTDNA和80克每升PEG2000作为混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时的复性产率。变性兔肌酸激酶在10克每升CTDNA和90克每升PEG2000作为混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时后的复性产率比无拥挤条件下增加了13%;在20克每升CTDNA和80克每升PEG2000作为混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中复性3小时后的复性产率比比不拥挤条件下增加3%。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D丄.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982。实施例1变性肌酸激酶在由多糖(Ficoll70或Fico11400)及核酸或蛋白质组成的混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中的复性。以3M盐酸胍1mMEDTA的50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)溶解变性60(^M兔肌酸激酶(MM-CK)样品；将变性兔肌酸激酶用复性溶液快速稀释50倍开始复性，盐酸胍的终浓度为60mM，MM-CK的终浓度为1.2^iM。复性缓冲液为50mMTris-HCl，1mMEDTA，lmMDTT(pH7.5)，以及不同浓度的拥挤试剂。所有的复性实验均在25度进行。含混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液配置方法以下表所示比例加入相应的混合大分子拥挤试剂，使其终浓度为100克每升<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>复性3小时后，用pH比色法分析变性兔肌酸激酶的复性样品在不同混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中的复性产率。测活方法参考文献Yao，Q.Z.，&Tsou,C.L,(1981).ThedeterminationofactivityofcreatinekinaseusingpH-colorimetry./Vog.5z'oc/h'附.5z'qp/y^.3，52-56。实施例2变性肌酸激酶在由多糖(dextran70)及核酸或蛋白质组成的混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中的复性。以3M盐酸胍1mMEDTA的50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)溶解变性60fiM兔肌酸激酶(MM-CK)样品；将变性兔肌酸激酶用复性溶液快速稀释50倍开始复性，盐酸胍的终浓度为60mM，MM-CK的终浓度为1.2pM。复性缓冲液为50mMTris-HCl，1mMEDTA，lmMDTT(pH7.5)，以及不同浓度的拥挤试剂。所有的复性实验均在25度进行。含混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液配置方法以下表所示比例加入相应的混合大分子拥挤试剂，使其终浓度为ioo克每升<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>复性3小时后，用pH比色法分析变性兔肌酸激酶的复性样品在不同混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中的复性产率。实施例3变性肌酸激酶在由聚乙二醇(PEG2000、PEG3350或PEG20000)及核酸组成的混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中的复性。以3M盐酸胍1mMEDTA的50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)溶解变性60pM兔肌酸激酶(MM-CK)样品；将变性兔肌酸激酶用复性溶液快速稀释50倍开始复性，盐酸胍的终浓度为60mM，MM-CK的终浓度为1.2jxM。复性缓冲液为50mMTris-HCl，1mMEDTA，lmMDTT(pH7.5)，以及不同浓度的拥挤试剂。所有的复性实验均在25度进行。含混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液配置方法以下表所示比例加入相应的混合大分子拥挤试剂，使其终浓度为100克每升<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>复性3小时后，用pH比色法分析变性兔肌酸激酶的复性样品在不同混合大分子拥挤试剂的复性缓冲液中的复性产率。权利要求1.一种提高变性重组蛋白质复性产率的方法，包括以下步骤A、将重组包涵体蛋白质以6M盐酸胍或8M尿素的复性缓冲液溶解；B、将变性重组蛋白质加入含大分子拥挤试剂的复性缓冲液中，在4-25度复性2-48小时；所述的大分子拥挤试剂组成为包括多糖或聚乙二醇、蛋白质及核酸在内的大分子物质的混合；所述的混合大分子拥挤试剂的总浓度为80-400克每升；所述的复性缓冲液为pH6.0-8.0及该范围内任意缓冲盐体系。2、根据权利要求1所述的一种提高变性重组蛋白质复性产率的方法，其特征在于所述的多糖包括多聚葡萄糖及多聚蔗糖。3、根据权利要求1所述的一种提高变性重组蛋白质复性产率的方法，其特征在于所述的聚乙二醇为PEG2000或PEG3350或PEG20000。4、根据权利要求1所述的一种提高变性重组蛋白质复性产率的方法，其特征在于所述的蛋白质为牛血清白蛋白BSA分子量在10-50kDa。5、根据权利要求1所述的一种提高变性重组蛋白质复性产率的方法，其特征在于所述的核酸为DNA或RNA分子。全文摘要本发明公开了一种提高变性重组蛋白质复性产率的方法。该方法涉及将多糖(包括多聚葡萄糖及多聚蔗糖如Ficoll70、Ficoll400、dextran70)或聚乙二醇(如PEG2000、PEG3350及PEG20000)、蛋白质(如牛血清白蛋白BSA)及核酸(DNA或RNA)等生物大分子物质配制成一定浓度的混合大分子拥挤试剂复性缓冲液，利用混合大分子拥挤试剂对蛋白质复性过程的有利影响，从而有效地提高蛋白质复性产率。本发明涉及的方法简单且易于操作，材料试剂相对低廉，能显著提高变性重组蛋白质的复性产率并获得具有生物活性的蛋白质，有利于工业或医用放大生产。文档编号C07K1/00GK101260139SQ20081004735公开日2008年9月10日申请日期2008年4月17日优先权日2008年4月17日发明者拯周,周兵瑞,芬杜,毅梁,莫重瑛,杰陈申请人:武汉大学