专利名称：：一种刺五加有效组分及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属中药提取物，具体地说涉及从刺五加中提取的有效组分，及其制备方法，以及该有效组分在制备治疗、预防肿瘤药物中的应用。技术背景肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。目前业内对恶性肿瘤的治疗主要还是以手术、放疗、化疗为主，但许多化学抗癌药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞，造成严重的副反应。植物药的遗传毒性不明显，中草药在抗癌抗突变方面有独特的优势和广阔的应用前景，而且中药在对肿瘤的辅助治疗中也起到不容忽视的作用。紫杉醇即是典型的从植物中获得的具有良好抗癌活性的天然化合物，现已开发为抗肿瘤药物。目前我国危害性最为严重的肿瘤为肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病及淋巴瘤等。特别是肝癌的发生率近年来有所增加。值得重视，这些肿瘤的病因学、发病学及其防治，均为我国肿瘤研究的重点。寻找高效低毒的抗癌药物以及抗癌辅助药物是当前肿瘤研究的重要内容。我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药先导化学物，开发新药的天然宝库。目前，我国从天然产物中提取活性物质，用于开发成治疗肿瘤疾病、安全性好、毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活性物质，开发成具有抗肿瘤疗效的新药，具有重要应用价值和广阔发展前景。刺五力口为五力口禾斗植物刺五力口Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim.)harms的干燥根及根茎或茎。在我国，刺五加作为药物被广泛应用已有悠久的历史，《神农本草经》将其列为上品。主要分布于我国东北，华北地区，尤己黑龙江省野生资源丰富，蕴藏量大。刺五加中含有紫丁香苷(刺五加苷B)等多种五加苷，此外还含金丝桃苷，苦杏仁苷，木脂素，多糖及多种微量元素等物质。刺五加提取物具有抗肿瘤活性，能增强化疗药物的抗癌效应且降低其毒性(郑虎古等，中药现代研究与应用(第三巻)，1998，2734)，对血小板聚集有明显的抑制作用(杨秋生等，首都医学院学报，1991，12(3):171)，刺五加多糖具有免疫调节功能，能促使荷瘤小鼠巨噬细胞数显著增加(张明溪等，时珍国药杂志，1998，9(1):37)等。
发明内容本发明的目的是提供一种刺五加有效组分，该有效组分主要含有化合物A:Anhydrochiisanogenoicacid，化合物B:OplopanaxogeninA，其中化合物A的含量为50~70°/。，化合物B的含量为20~40%。优选A的含量为55~65%，B的含量为2535。/。。A的结构式为-B的结构式为:OH本发明的另一目的是提供该刺五加有效组分的制备方法，通过以下步骤实现将刺五加药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液，将提取液浓縮成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液n，将洗脱液II浓縮干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，收集溶液，溶液经浓縮干燥后得到有效组分。优选的刺五加有效组分制备方法，包括下列步骤将刺五加药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.81.2)，加热回流0.81.2小时，提取1~3次，合并滤液得提取液，将提取液浓縮成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(4753:1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(813:1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓縮干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件-色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9llml/min，柱温为室温，收集溶液，溶液经浓縮干燥后得到有效组分。最佳的刺五加有效组分制备方法，包括下列步骤将刺五加药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加热回流l小时，提取2次，合并滤液得提取液；将提取液浓縮成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(10:1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓縮干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下O分钟时，流动相为80%的水溶液和20%的乙腈溶液；5分钟时，流动相为80%的水溶液和20%的乙腈溶液；19分钟时，流动相为50%的水溶液和50%的乙腈溶液；60分钟时，流动相为5%的水溶液和95%的乙腈溶液；64分钟时，流动相为5%的水溶液和95%的乙腈溶液；流速为10ml/min，柱温为室温；样品用100%乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段32.0~36.0min收集溶液，溶液经浓縮干燥后得到有效组分。本发明的再一个目的是提供该刺五加有效组分在制备治疗、预防肿瘤药物中的应用。本发明的刺五加有效组分可以作为活性成分，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。本发明的刺五加有效组分还可以作为活性成分之一，加入其他抗肿瘤药物，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、胶囊剂、胶丸剂。包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。本发明的有益效果为1.本发明的提取分离工艺中使用了正相硅胶柱，能有效地除去糖、蛋白质、氨基酸等杂质，提高有效成分的含量，同时采用了制备色谱，能快速准确的得到有效成分。2.本发明提供的刺五加有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。3.本发明提供的方法首次从刺五加中得到A、B等几个成分的组合物，并首次将其在多种肿瘤细胞株上进行药效筛选，得到较好的药理活性。具体实施方式本发明结合下面实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。实施例一刺五加有效组分的制备将200g刺五加药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.8)，加热提取1次得提取液，将提取液浓縮成浸膏7.8g，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(53:1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(13:1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓縮干燥后得样品2.6g;用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱。样品用100%乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段32.036.0min收集溶液，浓縮干燥后得到有效组分0.16g。实施例二刺五加有效组分的制备将500g刺五加药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:1.2)，加热回流0.81.2小时，提取3次，合并滤液得提取液，将提取液浓縮成浸膏15.1g，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(47:1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(8:1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓縮干燥后得样品5.8g;用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9llml/min，柱温为室温。样品用100%乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段32.036.0min收集溶液，浓縮干燥后得到有效组分0.33g。实施例三刺五加有效组分的制备取刺五加药材250g，将其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液。将提取液浓縮成浸膏得8.0g，将浸膏和硅胶拌样，用正相硅胶柱进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作为流动相，得洗脱液I，然后改换氯仿和甲醇(10:1)作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得2.8g样品。用制备液相色谱继续分离得到的样品。制备色谱的分离条件色谱柱为Agient制备柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下O分钟时，流动相为80%的水溶液和20%的乙腈溶液；5分钟时，流动相为80%的水溶液和20%的乙腈溶液；19分钟时，流动相为50%的水溶液和50%的乙腈溶液;60分钟时，流动相为5%的水溶液和95%的乙腈溶液；64分钟时，流动相为5%的水溶液和95%的乙腈溶液；流速为10ml/min，柱温为室温。样品用100%乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段32.0~36.0min收集溶液，浓縮干燥后得到有效组分0.18g。实施例四刺五加有效组分HPLC-ELSD分析色谱条件色谱柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mmxl50mm,5pm);采用梯度洗脱，流动相A相为0.2。/。冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.2n/。冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下O分钟时，流动相A为90%的0.2%冰醋酸水溶液、流动相B为10%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；10分钟时，流动相A为50%的0.2%冰醋酸水溶液、流动相B为50%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；30分钟时，流动相A为5%的0.2%冰醋酸水溶液、流动相B为95%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；35分钟时，流动相A为5%的0.2%冰醋酸水溶液、流动相B为95%的0.2%冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mL'min人检测波长全波长；柱温3(TC。ELSD参数氮气流速2.0L/min;漂移管温度105°C。供试品溶液的制备称取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。测定方法精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，依色谱分析条件测定，即得。本发明中，A的结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本发明中，B的结构式为:实施例五刺五加有效组分制剂取实施例三的刺五加有效组分0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至68t:液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。实施例六刺五加有效组分制剂取实施例三的剌五加有效组分0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水lml，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装500支，即得。实施例七刺五加有效组分制剂取降香油L5g，加入到13ml饱和的羟丙基P-环糊精中，搅拌溶解，滤过，滤液低温干燥，得降香油和羟丙基P-环糊精的包合物粉末。除上述降香油合羟丙基P-环糊精的包合物粉末外，再取实施例三的刺五加提取物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，分装300支，即得。实施例八刺五加有效组分制剂取实施例三的刺五加有效组分适量用4(TC注射用水溶解，加入适量药用载体等渗剂，调节溶液的pH值为7.0-8.0，加注射用水至全量，用超滤器超滤除热源，测定pH值后，用膜过滤，分装后，高压灭菌，检验、包装，即得。实施例九刺五加有效组分制剂取实施例三的刺五加有效组分与花生油按2:18的比例水溶式不锈钢搅拌灌中，同时加入适量明胶和甘油混合，放出再用胶体磨磨浆，磨出的混合液搅拌，制成药液；将甘油与蒸馏水在40-50。C温度下搅拌混溶，再将甘油液温至80-90°C，取明胶加入其中混合搅拌，直至全部溶化成胶液，然后在60'C温度下使胶液静置4小时，用制板机制成胶板供制丸工序使用；将上述制成的药液和胶板送入压丸机制丸，然后在22-25'C温度下吹风4小时作滚筒定型，又在25-30'C温度下吹风干燥16-20小时，检选合格胶丸，用95%乙醇清洗，在25-30'C下吹风干燥4小时，即得。实施例十剌五加有效组分制剂取实施例三的刺五加有效组分适量与微晶纤维素混合均匀，加3%聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，60。C干燥l小时，整粒，加入滑石粉适量，混匀，压片，即得。实施例十一刺五加有效组分的药理实验药理模型HL60肿瘤细胞细胞培养与种板细胞培养使用RPMI1640(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90%，胎牛血清(四季青)10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/。混合培养HL60细胞，密度需低于1(^个/mL。计算需要细胞总量NT=pcell，mL"xVT(P=2xl04个/mL)，其中Vf0.1mLx孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10pL，加10pL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数Nl，则离心管中的细胞数N为Nl/4x10、2xV个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V，mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2mL加入到细胞槽中，使V^Nt/NxV,。在细胞槽中再加入Vt-V2mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入10(HiL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100)iLPBS，以减少培养液的蒸发。给药方案刺五加有效组分用DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150pL。在新的96孔板中加入220]iL/孔的培养液，将吸取0.88pL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50pL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50ng/mL。孵育48h。每个浓度设4个平行复孔，每板设空白组(blank,只加培养液，不含细胞)，及阴性对照组(negative,细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200|iL的培养液，将吸取0.88pLDMSO加入混匀)。SRB染色细胞培养结束后，取出培养板，每孔加入40%(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)10(HiL固定细胞，室温放置5min，4"C冰箱中放置1h。培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去除TCA。在空气中干燥后，每孔加0.4。/。的SRB100pL(1%色谱纯乙酸溶解)，室温下放置20min，弃去各孔内液体后用1%乙酸洗涤5遍，去除未结合的染料，空气中干燥后用lOmmoI/LTrisl50ioL/孔溶解，振荡5min，使用酶标仪(ELx800)测定，所用波长为490nm。抑制率的计算抑制率按如下公式计算抑制率(％)=药物歸-空白歸xl00%阴性对照组^值一空白组j值药效结果见表l。根据HL60肿瘤细胞抑制率结果，刺五加有效组分对抑制HL60肿瘤细胞增殖有非常显著效果。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.2药理模型K562肿瘤细胞细胞培养与种板细胞培养使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氢钠]90%，小牛血清(赛乐)10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/。混合培养K562细胞。计算需要细胞总量NT-pcdl'mL"xVT(p-8x103个/mL)，其中VT=0.1mLx孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10|iL，加10pL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为NL/4xl04x2xV个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2mL加入到细胞槽中，使V2=NT/NxVl。在细胞槽中再加入VT-V2mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100pL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100pLPBS，以减少培养液的蒸发。给药方案刺五加有效组分加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20。C。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150pL。在新的96孔板中加入220piL/孔的培养液，将吸取0.88pL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50pL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50pg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200ML的培养液，将吸取0.88pLDMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4pg/mL)。SRB染色细胞培养结束后，取出培养板，每孔加入40%(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)70pL固定细胞，4。C冰箱中放置1h。培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去除TCA。在空气中干燥后，每孔加0.4%的SRB100pL(1%色谱纯乙酸溶解)，室温下放置20min，弃去各孔内液体后用1%乙酸洗涤5遍，去除未结合的染料，空气中干燥后用10mmol/LTrisl50piL/孔溶解，振荡5min，使用酶标仪(ELx800)测定，所用波长为490nm。抑制率的计算抑制率按如下公式计算抑制率(％)=药画-空白歸xl00%阴性对照^值一空白组^值药效结果见表2。根据K562肿瘤细胞抑制率结果，刺五加有效组分对抑制K562肿瘤细胞增殖有非常显著效果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.3药理模型MCF-7肿瘤细胞细胞培养与种板细胞培养使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90%，小牛血清(赛乐)10%，非必需氨基酸(Gibco)P/。混合培养MCF-7细胞。计算需要细胞总量NT-pcell'mL"xVT(p-2x103个/mL)，其中VT=0.1mLx孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10^iL，加l(HiL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为NL/4xl04x2xV个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min,10min)，吸去上清液，加入培养液V1mL,吹打，使细胞混匀，吸取V2mL加入到细胞槽中，使V2-NT/NxVl。在细胞槽中再加入VT-V2mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100pL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100mLPBS，以减少培养液的蒸发。给药方案刺五加有效组分根据所称量的药品的重量，加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20。C。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150^iL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培养液，将吸取0.88^L药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50ML，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50pg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200|iL的培养液，将吸取0.88mLDMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4pg/mL)。MTT比色法测定取出培养板，去除每孔上清，加入培养液一MTT混合溶液(培养液MTT溶液=10:1)lOO[iL，孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150^L的DMSO，振荡10min，550nm酶标仪(Elx800)测定。抑制率的计算抑制率按如下公式计算抑制率(％)=药物^值—空白腺值xl00%阴性对照组^值一空白组^值药效结果见表3。根据MCF-7肿瘤细胞抑制率结果，刺五加有效组分对抑制MCF-7肿瘤细胞增殖有非常显著效果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.4药理模型KB肿瘤细胞细胞培养与种板细胞培养使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90%，小牛血清(赛乐)10%，非必需氨基酸(Gibco)1%混合培养KB细胞。计算需要细胞总量NT-pcellTnL"xVT(p-2xl03个/mL)，其中VT=0.1mLx孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10^iL，加l(HiL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为NL/4x104x2xV个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2mL加入到细胞槽中，使V2=NT/NxVl。在细胞槽中再加入VT-V2mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100^iL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100^PBS，以减少培养液的蒸发。给药方案刺五加有效组分根据所称量的药品的重量，加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20。C。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培养液，将吸取0.88(xL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50^iL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50pg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200^iL的培养液，将吸取0.88pLDMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4pg/mL)。MTT比色法测定取出培养板，去除每孔上清，加入培养液一MTT混合溶液(培养液MTT溶液-10:1)100^L，孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150pL的DMSO，振荡10min，550nm酶标仪(Elx800)测定。抑制率的计算抑制率按如下公式计算抑制率(％)=药物m^值-空自纟Mtxl00%阴性对照乡I^值一空白组^值药效结果见表4。根据KB肿瘤细胞抑制率结果，刺五加有效组分对抑制KB肿瘤细胞增殖有非常显著效果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.5药理模型HepG2肿瘤细胞细胞培养与种板细胞培养使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90%，胎牛血清(四季青)10%，非必需氨基酸(Gibco)1%混合培养HepG2细胞。计算需要细胞总量NT-pcell，mL"xVT(p-2x103个/mL)，其中VT-0.1mLx孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10jxL，加10^iL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为NL/4xl04x2xV个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液VlmL，吹打，使细胞混匀，吸取V2mL加入到细胞槽中，使V2-NT/NxVl。在细胞槽中再加入VT—V2mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100pL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100pLPBS，以减少培养液的蒸发。给药方案刺五加有效组分根据所称量的药品的重量，根据所称量的药品的重量，加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20。C。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150mL。在新的96孔板中加入220ioL/孔的培养液，将吸取0.88|oL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50^iL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50jig/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培养液，将吸取0.88pLDMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4!ag/mL)。MTT比色法测定取出培养板，去除每孔上清，加入培养液一MTT混合溶液(培养液MTT溶液-10:1)100pL，孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150^iL的DMSO,振荡10min，550nrn酶标仪(Elx800)测定。抑制率的计算抑制率按如下公式计算抑制率(％)=药物謹-空白歸xl00%阴性对照组^值一空白组^值药效结果见表5。根据H印G2肿瘤细胞抑制率结果，刺五加有效组分对抑制H印G2肿瘤细胞增殖有非常显著效果。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>权利要求1.一种刺五加有效组分，其特征是该有效组分主要含有化合物AAnhydrochiisanogenoicacid，化合物BOplopanaxogeninA，其中化合物A的含量为50～70％，化合物B的含量为20～40％。化合物A的结构式为id="icf0001"file="S2008100613908C00011.gif"wi="65"he="66"top="88"left="78"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>化合物B的结构式为id="icf0002"file="S2008100613908C00012.gif"wi="75"he="69"top="175"left="72"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2.根据权利要求1所述的一种刺五加有效组分的制备方法，其特征是通过以下步骤实现将刺五加药材粉碎后加入1:0.8L2的乙酸乙酯和乙醇，加热回流0.8-1.2小时，提取13次，合并滤液得提取液，将提取液浓縮成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用4753:1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，再用813:1的氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓縮干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的目的物；制备色谱的分离条件为色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为911ml/min，柱温为室温，收集溶液，溶液经浓縮干燥后得到有效组分。3.根据权利要求2所述的一种刺五加有效组分的制备方法，其特征是所述梯度洗脱程序为0分钟时，流动相为80%的水溶液和20%的乙腈溶液；5分钟时，流动相为80%的水溶液和20%的乙腈溶液；19分钟时，流动相为50%的水溶液和50%的乙腈溶液；60分钟时，流动相为5%的水溶液和95%的乙腈溶液；64分钟时，流动相为5%的水溶液和95%的乙腈溶液。4.根据权利要求2所述的一种刺五加有效组分的制备方法，其特征是色谱分离后，在32.036.0min时间段收集溶液。5.根据权利要求1所述的一种刺五加有效组分在制备治疗、预防肿瘤药物中的应用。6.根据权利要求5所述的一种刺五加有效组分的应用，其特征是所制备的药物还含有制剂允许的药物赋形剂或载体。7.根据权利要求5所述的一种刺五加有效组分的应用，其特征是所制备的药物还含有其他抗肿瘤药物。8.根据权利要求5所述的一种刺五加有效组分的应用，其特征是所述药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂、胶囊剂或胶丸剂。9.根据权利要求8所述的一种剌五加有效组分的应用，其特征是所述药物的给药方式为口服给药或注射给药。全文摘要本发明提供一种刺五加有效组分，主要含有化合物AAnhydrochiisanogenoicacid和化合物BOplopanaxogeninA，其中A的含量为50～70％，B的含量为20～40％。药材通过加热提取，浓缩，硅胶柱分离，洗脱，洗脱液浓缩干燥，再用液相色谱继续分离，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。本发明提供的刺五加有效组分可在制备治疗、预防肿瘤药物中的应用。本发明方法设计合理，能快速准确的得到有效成分，在生产中更易于药物的质量控制。文档编号C07J63/00GK101264113SQ200810061390公开日2008年9月17日申请日期2008年4月25日优先权日2008年4月25日发明者雳刘,水文波,程翼宇,葛志伟申请人:浙江大学