专利名称：一种提取植物dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取DNA的方法。
背景技术：
DNA是分子生物学研究的主要对象之一，在进行分子生物学操作过程中, 基因组DNA的质量好坏是影响其成败的关键因素。例如，在PCR过程中多糖、 多酚和色素等都会严重的影响DNA聚合酶的活性，干扰引物与模板的结合导 致扩增失败。
植物尤其是一些林木中含有大量的多糖物质，多糖是提取植物DNA的主 要干扰物质,由于它与核酸的物理性质非常相似，在提取过程中多糖物质通常 与DNA共沉淀下来，非常难与DNA分开，因此严重地影响了所提取的DNA 的质量。目前，国内外在提取植物基因组DNA过程中，为了去除多糖采用以 下几种方法①用低浓度乙醇去除多糖法在DNA提取液中加入无水乙醇至 终浓度10% 30%，再通过酚/仿抽提去除多糖，或者是先用浓度为100mmol/L 的NaAc溶解DNA沉淀，再用低浓度乙醇抽提分离出多糖；②CTAB法CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)比SDS (十二烷基硫酸钠)去除多糖类物质的效果 好，适当地提高CTAB和0 -巯基乙醇的含量(不低于1%)可有效地去除多糖等 次生物质；但是此方法中如果CTAB浓度过高，在保温时提取材料与CTAB缓 冲液难以充分混匀，这就需要延长保温时间，也同时增加了 DNA降解的机率； ③在去除多糖时采用先加不含CTAB的缓冲液抽提多糖，在通过离心除去多糖 的方法；④高盐沉淀多糖法认为缓冲液中含有高浓度的NaCl将有助于去除 多糖。
但是目前的这几种去除多糖提取植物DNA的方法都只对含有少量多糖的 植物提取材料有效，而对于多糖含量高的植物(如白桦)或部位(如老叶
片)基本无效，因此目前尚未有一种普遍有效的去除植物材料中多糖，保证所
提取DNA质量的DNA提取方法，特别是缺乏有效的、针对多糖含量高的植 物的DNA提取方法。发明内容本发明的目的是为了解决目前植物DNA提取方法都只对含有少量多糖的 植物提取材料有效，对多糖含量高的植物或部位基本无效的问题，而提供的一 种提取植物DNA的方法。提取植物DNA按以下步骤进行 一、植物提取材料用液氮研磨成粉末， 然后取0.15 0.25g研磨粉末转入lmL提取缓冲液I中在温度为45士1'C的条 件下水浴10min，再在10000g条件下离心10min; 二、取步骤一离心沉淀物转 入0.5 lmL提取缓冲液II中在温度为65土rC的条件下水浴10min，之后加入 0.5 lmL氯仿在12000g的条件下离心5min;三、取步骤二离心上清液并加 入上清液等体积的异丙醇，混匀后在10000 12000g条件下离心10min，再用 体积浓度为75%、体积为0.5mL的乙醇洗涤离心沉淀2次，然后室温气干， 即得到植物提取材料的DNA;其中步骤一中的提取缓冲液I由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl和去离子水组成，提取缓冲液I中乙二胺四乙酸的浓度为50 mmol/L、 NaCl的浓度为0.16mol/L;步骤二中的提取缓冲液II由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、 巯基乙醇和去离子水组成，提取缓冲液II中乙二胺四乙酸的浓度为50 mmol/L、 NaCl的浓度为lmol/L、十六烷基三甲基溴化铵的浓度为2.5gA00mL、十二烷 基肌氨酸钠的浓度为0.1g/100mL、巯基乙醇的浓度为1 mL/100mL。本发明方法步骤一中在45士rC的条件下进行水浴可以使多糖和RNA完全 溶解在提取缓冲液I中，而DNA则与蛋白形成复合物DNP沉淀出来(DNP 在提取缓冲液I中溶解度极低)，因此通过离心即可将DNA与多糖及RNA分 开。本发明方法步骤二提取缓冲液II中CTAB的浓度提高到2.5g/100mL，同 时还加入了另一种去污剂十二垸基肌氨酸钠(SLS)，促进DNA与蛋白质的分 离，并提高了DNA在提取缓冲液II中的溶解。本发明方法是一种可以广泛使 用的植物DNA提取方法，它不受植物提取材料多糖含量的影响，在DNA提 取过程中可将植物中的多糖彻底去除，提高了 DNA提取的效率、纯度和质量。
图1是具体实施方式
六所提取的DNA的凝胶电泳图，图2是采用现有 CTAB法所提取的DNA的凝胶电泳图。
具体实施方式
具体实施方式
一本实施方式提取植物DNA按以下步骤进行 一、植物 提取材料用液氮研磨成粉末，然后取0.15 0.25§研磨粉末转入lmL提取缓冲 液I中在温度为45士rC的条件下水浴10min，再在10000g条件下离心10min; 二、取步骤一离心沉淀物转入0.5 lmL提取缓冲液II中在温度为65土rC的条 件下水浴10min，之后加入0.5 lmL氯仿在12000g的条件下离心5min;三、 取步骤二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后在10000 12000g 条件下离心10min，再用体积浓度为75%、体积为0.5mL的乙醇洗涤离心沉淀 2次，然后空气室温干燥，即得到植物提取材料的DNA;其中步骤一中的提 取缓冲液I由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl和去离子水组成，提取缓冲液I 中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、 NaCl的浓度为0.16mol/L;步骤二中的 提取缓冲液II由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)、十二垸基肌氨酸钠(SLS)、巯基乙醇和去离子水组成，提取缓冲 液II中乙二胺四乙酸的浓度为50 mmol/L、 NaCl的浓度为lmol/L、十六烷基 三甲基溴化铵的浓度为2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸钠的浓度为0.1g/100mL、 巯基乙醇的浓度为1 mL/100mL。本实施方式在提取过程中采用低浓度NaCl溶液去除多糖，效果显著，克 服了本领域技术人员的偏见。本实施方式方法特别适用于多糖含量高的植物材料提取DNA。本实施方式方法操作简单，易于掌握，步骤少，可有效的提高植物DNA 提取效率。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤二水浴 过程中将装有提取缓冲液II和离心沉淀物的离心管颠倒3 10次。其它步骤及 参数与实施方式一相同。本实施方式可以保证反应均匀且充分，提高植物DNA的提取质量。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤三中加入的异丙醇的温度为0 4°C (预冷)。其它步骤及参数与实施方式一相同。 本实施方式可以有效的沉淀DNA，提高植物DNA的得率。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤二中加入氯仿后用振荡器震荡2 3min，然后再进行离心。其它步骤及参数与实施方 式一相同。本实施方式可以保证氯仿作用充分，有效去除杂蛋白，提高植物DNA的 质量。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点是将提取得到 的植物DNA置于TE缓冲液中保藏。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
六本实施方式提取白桦成熟叶片DNA按以下步骤进行一、 白桦成熟叶片用液氮研磨成粉末，然后取0.2g研磨粉末转入lmL提取缓 冲液I中在温度为45。C的条件下水浴10min，再在10000g条件下离心10min;二、 取步骤一离心沉淀物转入0.6mL提取缓冲液II中在温度为65'C的条件下 水浴10min，之后加入0.6mL氯仿在12000g的条件下离心5min;三、取步骤 二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后在12000g条件下离心 10min，再用体积浓度为75%、体积为0.5mL的乙醇洗涤离心沉淀2次，然后 空气室温干燥，即得到白桦成熟叶片的DNA;其中步骤一中的提取缓冲液I 由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl和去离子水组成，提取缓冲液I中乙二胺四 乙酸的浓度为50 mmol/L、 NaCl的浓度为0.16mol/L;步骤二中的提取缓冲液 n由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl、十六垸基三甲基溴化铵(CTAB)、十二 烷基肌氨酸钠(SLS)、巯基乙醇和去离子水组成，提取缓冲液II中乙二胺四 乙酸的浓度为50 mmol/L、 NaCl的浓度为lmol/L、十六烷基三甲基溴化铵的 浓度为2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸钠的浓度为0.1g/100mL、巯基乙醇的浓 度为1 mL/100mL。白桦的组织细胞中含有大量的多糖、多酚，本实施方式提取缓冲液I作用后的上清成粘稠状，说明溶解了大量的多糖；步骤一沉淀呈白色，说明大量的多糖已经在步骤一中去除了。本实施方式所提取的DNA的凝胶电泳图如图1 所示。现有CTAB法提取相同的白桦成熟叶片取白桦成熟叶片在研钵中加入 -196'C的液氮，将植物组织迅速研磨成粉末，把粉末转入65。C预热的含2mL CTAB的提取缓冲液的离心管中(提取缓冲液中Tris的浓度为100mmol/L; EDTA的浓度为20 mmol/L; NaCl的浓度为1.4 mol/L; CTAB的浓度为2.0g/100mL;巯基乙醇的浓度为2 5mL/100mL)，使之充分混匀，于65。C水 浴保温30min，期间缓慢颠倒离心管数次，保温30min后，使之冷却至室温(室 温应大于15°C，否则CTAB-核酸复合物会发生沉淀)，加入等体积氯仿/异戊 醇(24: 1)进行抽提，缓慢颠倒离心管混匀10min，再12000rpm室温离心 10min，将上清液转入另一离心管中，弃沉淀；(重复抽提2次)在上清液中加 入等体积预冷的异丙醇，轻缓颠倒混合均匀，室温放置10 20min，沉淀DNA12 OOOrpm室温离心10min，弃上清液，用0.5ml的75%乙醇洗涤2次以除去残留 的盐；空气干燥后，将沉淀物溶于20(VL灭菌去离子水中。
CTAB法所得沉淀较多，呈淡黄色，加入的TE缓冲液溶解较困难，呈粘 稠状；提取的DNA的凝胶电泳图如图2所示。
图1和图2凝胶电泳结果进行比较，可以清楚的看出本实施方式提取的 DNA条带明亮、整齐，其带型无降解拖尾现象，DNA得率高，说明本实施方 式所提取的DNA比采用现有CTAB法提取的DNA的质量更为优异。
权利要求
1、一种提取植物DNA的方法，其特征在于提取植物DNA按以下步骤进行一、植物提取材料用液氮研磨成粉末，然后取0.15～0.25g研磨粉末转入1mL提取缓冲液I中在温度为45±1℃的条件下水浴10min，再在10000g条件下离心10min；二、取步骤一离心沉淀物转入0.5～1mL提取缓冲液II中在温度为65±1℃的条件下水浴10min，之后加入0.5～1mL氯仿在12000g的条件下离心5min；三、取步骤二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后在10000～12000g条件下离心10min，再用体积浓度为75％、体积为0.5mL的乙醇洗涤离心沉淀2次，然后室温气干，即得到植物提取材料的DNA；其中步骤一中的提取缓冲液I由乙二胺四乙酸、NaCl和去离子水组成，提取缓冲液I中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、NaCl的浓度为0.16mol/L；步骤二中的提取缓冲液II由乙二胺四乙酸、NaCl、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基肌氨酸钠、巯基乙醇和去离子水组成，提取缓冲液II中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、NaCl的浓度为1mol/L、十六烷基三甲基溴化铵的浓度为2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸钠的浓度为0.1g/100mL、巯基乙醇的浓度为1mL/100mL。
2、 根据权利要求1所述的一种提取植物DNA的方法，其特征在于步骤 二水浴过程中将装有提取缓冲液II和离心沉淀物的离心管颠倒3 10次。
3、 根据权利要求1所述的一种提取植物DNA的方法，其特征在于步骤 三中加入的异丙醇的温度为0 4°C。
4、 根据权利要求1所述的一种提取植物DNA的方法，其特征在于步骤 二中加入氯仿后用振荡器震荡2 3min，然后再进行离心。
5、 根据权利要求1所述的一种提取植物DNA的方法，其特征在于将提 取得到的植物DNA置于TE缓冲液中保藏。
全文摘要
一种提取植物DNA的方法，它涉及一种提取DNA的方法。它解决了目前植物DNA提取方法都只对含有少量多糖的植物提取材料有效，对多糖含量高的植物或部位基本无效的问题。提取方法一、植物提取材料用液氮研磨成粉末，然后转入提取缓冲液I中进行水浴，再离心；二、取步骤一离心沉淀物转提取缓冲液II中进行水浴，之后加入氯仿离心；三、取步骤二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后离心，再用乙醇洗涤离心沉淀，然后干燥，即得到植物提取材料的DNA。本发明方法是一种可以广泛使用的植物DNA提取方法，它不受植物提取材料多糖含量的影响，在DNA提取过程中可将植物中的多糖彻底去除，提高了DNA提取的效率、纯度和质量。
文档编号C07H1/00GK101302509SQ20081006490
公开日2008年11月12日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者刘桂丰, 静 姜, 李慧玉, 杨传平, 王玉成 申请人:东北林业大学