专利名称：：天然除虫菊酯多克隆抗体的制备方法
技术领域：
：本发明涉及天然杀虫剂除虫菊酯多克隆抗体的制备方法，具体涉及天然除虫菊酯(Ator"ra/p^e^nVw)6禾中单体f尸jref/w7力/、尸,e/Zw/"C/"er/"/、C7"en'"i/"、</asroo///、Jaswo〃"i/^人工抗原及多克隆抗体的制备技术。
背景技术：
：除虫菊(C/w7s朋A柳wmC/"eraraeyZ/,)为菊科多年生草本植物，是目前世界上唯一集约化种植的杀虫植物。除虫菊酯(pjre^7'"s)包括除虫菊酯I(pyrcAn'w/)、除虫菊酯n(p,eAnVj//)、瓜叶菊酯I(b/"en'"/)、瓜叶菊酯II(cf"m'"//)、茉酮菊酯I0&,/;"/)、茉莉菊酯(/^附0/^//)6种活性成分，是从除虫菊干花中提取出来的一种高效、低毒、广谱、低残留的纯天然优良杀虫剂，因其对人、温血动物和环境毒性较小，已成为当今无公害生物杀虫剂的重要研究热点之一。早在19世纪初就有人尝试用除虫菊酯来防治蚊子、跳蚤、蟑螂等家庭卫生害虫。在美国和欧洲，除虫菊酯的产品早有登记。我国除虫菊酯市场一直以来都处于空白状态，仅有1~2家蚊香厂将除虫菊植株用来做蚊香，另有极个别的公司从国外进口天然除虫菊家庭喷雾剂在国内销售且价格昂贵。2000年，农业部颁布的"绿色食品"标准中，天然杀虫剂除虫菊酯列在要求使用农药的首位。2002年，除虫菊产业化研究项目被列入国家高新技术产业化示范工程，并获得2200万元专项支持，同时还被科技部列为国家火炬计划项目。2003年，我国已有数家农药企业取得了天然除虫菊酯农药登记。目前，我国除虫菊产业己经形成规模，特别是由除虫菊干花制取的除虫菊酯农药原药产量己占到全球30%~40%。随着人们健康意识的不断增强，对产品的安全性要求也越来越高，进而对残留量的限制要求也越来越严，特别是入世后，WTO国际市场对发展中国家农产品的农药残留进行严格限制，因此除虫菊酯的残留问题日益受到人们的重视，对其残留检测技术的需求也在不断提高。20世纪50年代以来，国际上出现了大量分析鉴定天然除虫菊酯的方法，美国AOAC标准是最早用于除虫菊酯检测的参考标准。随着色谱技术的发展，先后出现了气相色谱法、液相色谱法及联用技术等简单、快速的检测分析手段，但因仪器分析具有繁琐的净化和前处理步骤，设备要求较高，不适合于现场快速检测的缺点，因此加速了人们对测试费用低、操作简便快速、灵敏度高和特异性强的检测技术的研究。免疫分析方法因其具有测试费用低、可现场快速检测的优点，是近年来迅速发展的检测方法。目前，以美国加州大学Hammock实验室、澳大利亚堪培拉Skerritt实验室为主进行拟除虫菊酯类农药的免疫分析方法建立的研究；并有文献报道己建立免疫分析方法的拟除虫菊酯类农药达ll种，分别为多克隆抗体和单克隆抗体。我国拟除虫菊酯类农药的免疫分析检测也有一些报道，然而，天然除虫菊酯6种单体的分子免疫检测国内外均未见研究报道。在除虫菊酯残留检测的免疫分析中，人工抗原的合成是抗体制备和免疫分析技术建立的最关键步骤。天然除虫菊酯为6种单一小分子物质，本身不具有诱导产生抗体的能力，所以必须设法先将除虫菊酯小分子与载体蛋白质偶联才能制备出人工完全抗原，进而制备天然除虫菊酯的多克隆抗体。但除虫菊酯分子中不含有可以直接偶联的基团，需通过衍生过程在除虫菊酯分子内产生活性功能基团或者在其分子结构上通过化学方法引入活性功能基团。因此，必须首先制备除虫菊酯6种单体的半抗原，进而制备完全抗原，再通过动物免疫，制备出除虫菊酯6种成分的多克隆抗体，为酶联免疫分析技术的建立及除虫菊酯6种单克隆抗体的制备奠定基础。目前，我国农药残留免疫分析已有一些报道，但仍处于缓慢发展阶段，原因之一就是农药人工抗原的合成具有一定的难度和要求，成功制备除虫菊酯6种单体的人工抗原，进而制备多克隆抗体，为开发一种简单、经济、准确、快速，适于天然除虫菊酯残留现场监控的痕量免疫分析方法具有重要的现实意义，进而对提高我国种植业科学用药水平、增强农产品的国际竞争力，推动种植业的可持续发展都有深远的意义。
发明内容本发明的目的建立天然除虫菊酯6种单体人工抗原及多克隆抗体的制备方法。为达上述目的，本发明的具体方案是1.采用专利制备除虫菊酯6种单体的纯品，纯度达99%;所述专利公开号200610054103.1:2.采用合成含羧基半抗原的方法制备除虫菊酯6种单体的半抗原，具体步骤是[1]在有机溶液中，分别加入对肼苯甲酸和除虫菊酯6种单体的纯品，艮P:i>e^7'"/、尸,e/Z^"//、C7"m力/、C7"m'wZT、Josoto/zVj/、/oswo//"_Z/,使之充分混匀；所述有机溶液为无水乙醇或丙酮和乙腈按3:7比例混合；[2]调节溶液pH至4-5;[3]加热回流90min;[4]旋转蒸发直至剩余约5ml溶液；[5]加入乙醚抽提；[6]用水洗涤乙醚抽提物，除去多余的对肼苯甲酸；[7]过Na2S04柱除去水分或加入一定量的Na2S04，离心取上清液；[8]用氮吹仪吹干乙醚，所得白色粉末即为除虫菊酯6种单体的半抗原；结果检测[1]当有半抗原合成时，溶液表现为黄色；[2]称量并计算半抗原的合成产率和效率；3.采用碳二亚胺(EDC)法将合成的半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备除虫菊酯6种完全抗原，具体步骤是[1]称取一定量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺，用PBS磷酸缓冲液生理盐水充分溶解为I液；所述PBS磷酸缓冲液生理盐水由137mMNaCl、2.7mMKC1、8mMNa2HP04和2mMKH2P04组成，pH值为7.58.5;[2]取一定量的除虫菊酯半抗原，用碱性溶液充分溶解为II液；所述碱性溶液为0.2mol/LNaOH溶液；[3]取一定量的牛血清白蛋白(BSA)，用PB磷酸缓冲液充分溶解为m液；所述PB磷酸缓冲液由9.47mMNa2HP04禾口0.53mMNaH2P04组成，pH值为7.58.5;[4]将ll液与m液按高摩尔比70:80:l混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液至最后0.5mL,每加1m1间隔1min;[5]在避光条件下继续搅拌lh，逐滴加入余下的0.5mLI液；[6〗4'C搅拌12h，静置10h;[7]用超纯水充分透析48h以上，每4h换l次水，即得完全抗原，分装并于-20'C或-8(TC的冰箱保存备用；所述超纯水为双蒸水或灭菌的超纯水；结果检测采用紫外分光光度法检测完全抗原的合成；4.采用完全抗原免疫BALB/c小鼠制备抗血清，具体步骤是[1]选择68周龄健康的BALB/c雌性小鼠进行免疫前采血，制备血清备用；[2]使用完全佐剂加等量抗原制备乳化剂，接种BALB/c小鼠，分点注射，即颈部、背部侧面及后腿内侧皮下；所述乳化剂采用快速乳化法制备和鉴定；[3]间隔2周后使用不完全佐剂进行二次免疫，方法同上；[4]再间隔2周后不用佐剂进行第三次免疫，方法同上；[5]710天后眼眶静脉取血测定抗体效价，如抗体效价达到较高水平，则最后加强免疫l次，免疫剂量加倍；[6]710天后采血制备抗血清，即多克隆抗体，-S(TC保存备用；结果检测采用间接酶联免疫分析(EL1SA)检测抗血清效价。采用上述技术方案，本发明的特点表现在[1本发明根据"理想"半抗原的3个条件，结合除虫菊酯小分子本身的免疫特性和特征结构，选择在五元环的酮基上引入羧基的原理制备具有活性的半抗原。根据颜色反应予以初步检测，方法简便可行，产率较高。[2]本发明采用碳二亚胺(EDC)法制备除虫菊酯6种人工抗原，结合紫外分光光度法予与鉴定，方法简便可行，实际意义重大。[3]本发明采用间接ELISA检测除虫菊酯多克隆抗体的效价，结果可靠，为酶联免疫分析技术的建立奠定了基础。图1为天然除虫菊酯6种成分的人工抗原合成路线图(1.亲核加成反应；2.分子内脱水反应；3.分子间脱水反应)。图2为除虫菊酯6种半抗原和BSA及偶联物的紫外吸收光谱图。图3为6只小鼠不同血清浓度的P/N值图。具体实施方式1.试剂准备[ljPBS磷酸缓冲液生理盐水137mMNaCl、2.7mMKC1、8mMNa2HP04、2mMKH2P04,pH值为7.5-8.5;[2]PB磷酸缓冲液9.5mMNa2HP04、0.5mMNaH2P04,pH值为7.5-8.5;[3]碱性溶液0.2mol/LNaOH溶液；[4]有机溶液无水乙醇；其他试剂按常规方法配置。2.多克隆抗体的制备按以下步骤进行[1]采用专利所述的方法制备除虫菊酯6种单体的纯品，专利公开号200610054103.1:[2]在50ml无水乙醇中，按表1加入对肼苯甲酸和除虫菊酯6种单体的纯品；使其终浓度分别为IOmmol/L禾卩4mmol/L;[3]用盐酸调节溶液pH至4-5;[4]加热回流90min;[5]在50'C条件下，旋转蒸发直至剩余约5ml溶液；[6]加入30ml乙醚抽提；[7]用水洗涤乙醚抽提物，除去多余的对肼苯甲酸；〖8]加入0.5gWNa2S04，静置2h，3000rpm离心5min后取上清液；[9]用氮吹仪吹干乙醚，所得白色粉末即为除虫菊酯6种单体的半抗原，得率见表l;表l除虫菊酯6种半抗原的得率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>[10]称取100mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺，用2.5mL10mmol/LPBS磷酸缓冲液(pH=8.0)生理盐水使之充分溶解，即I液；[11]除虫菊酯6种半抗原各取10mg,用2mL0.2mol/LNaOH溶液溶解，即II液；[12]取25mg牛血清白蛋白(BSA)，用3.5ml10mmol/LPBS磷酸缓冲液(pH=8.0)充分溶解，即III液；[13]将II液与m液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液至最后0.5mL，每加lml间隔lmin;[14]在避光条件下搅拌lh，逐滴加入余下的0.5mLI液；[15]4'C搅拌12h，静置10h;[16]用双蒸水充分透析48h以上；每4h换一次水，即得完全抗原，分装并于-2(TC冰箱保存备用。[17]选择68周龄健康BALB/c雌性小鼠7只，1只为对照，进行免疫前采血，制血清备用；[18]除虫菊酯6种人工抗原各取3ml分别与等量完全佐剂和不完全佐剂混合，采用快速乳化法制备免疫原，终浓度为20ng/mL;[19]首次免疫使用完全佐剂加等量抗原，以0.5mL/只即10ng/只的免疫剂量接种BALB/c鼠，分点注射，艮P:颈部、背部侧面及后腿内侧皮下，0.1mL/点；[20]间隔2周后使用不完全佐剂进行二次免疫，方法同[19[21]再间隔2周后不用佐剂进行第三次免疫，方法同[19];[22]710天后眼眶静脉取血测定抗血清效价，若符合要求，最后再加强免疫一次，免疫剂量加倍；[23]710天后采血制备抗血清，即多克隆抗体，-80。C保存备用。结果检测[1]通过特殊的颜色反应初步鉴定半抗原的合成，并计算半抗原合成产率及效率，结果见表l;[2]紫外分光光度法检测完全抗原的合成；以最后一次透析的透析外液为空白对照，将彻底透析的6种偶联物，即/>^/^"/-万&4、P,e/^/w//^&4、C7"en'"/-￡&4、C7"enVj/AS&4、Joswo/Z"/-￡&4、■7oswo//"//-5&4溶液，6种半抗原，即J°yr"/jn'"/、尸yrcAn力//、C7"eW"/、C7"en'"ZT、JoswoZ/"/、《/asmo/z'"//溶液，与BSA溶液分别在190350nm波长下进行紫外扫描分析；6种偶联物透析原液取1ml稀释3倍，半抗原和BSA用10mmol/LPBS(pH=8.0)配置成浓度为0.40mg/ml的溶液。结果如图2，6种半抗原、载体蛋白BSA与6种偶联物的最大吸收波长Ux分别为196(193)nm、278nm、284nm;三者的紫外吸收曲线明显不同，偶联后载体蛋白的吸收峰由278nm移动至284nm，根据UV吸收的加合性可认为除虫菊酯6种完全抗原已发生偶联。[3]间接ELISA检测抗体效价。根据方阵滴定原理，采用阴性血清和混合的6种免疫原作包被抗原，浓度梯度稀释为8.8ng/mL、4.4Hg/mL、2.2ng/mL、1.1pg/mL、0.55pg/mL;HPR标记羊抗小鼠IgG按1:800稀释；由P/N值判定抗血清效价，即P/N^2,OD=405腦大于2倍阴性对照孔的血清最高稀释倍数作为血清的ELISA效价。结果如图3，阴性血清包板的抗体显色为阴性，混合完全抗原包板的抗体显色为阳性。6只免疫的BALB/c小鼠的抗体效价均达到105，由此推断，小鼠经免疫后，在体内产生大量针对除虫菊酯6种完全抗原的特异性抗体；同时证实除虫菊酯6种人工抗原已成功合成。权利要求1.一种天然除虫菊酯6种人工抗原及多克隆抗体的制备方法，其特征在于[1]利用合成含羧基半抗原的方法制备天然除虫菊酯6种单体的半抗原；[2]采用碳二亚胺(EDC)法将合成的半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备除虫菊酯6种完全抗原；[3]利用除虫菊酯6种完全抗原免疫BALB/c小鼠，制备天然除虫菊酯的多克隆抗体。2.—种权利要求1所述的除虫菊酯6种人工半抗原的制备方法，其特征在于[1]在除虫菊酯6种单体的五元环酮基上引入羧基基团；[2]ffl含芳香基团的对肼苯甲酸和纯度99%以上的6种单体分别溶解在无水乙醇或丙酮与乙腈按3:7比例混合的溶液中，并在pH值45条件下发生亲核加成消除反应，此时溶液表现为黄色；[3]再经过旋转浓缩，乙醚抽提和Na2S04脱水，制得6种半抗原，产率可达58%;3.—种权利要求1所述的除虫菊酯6种完全抗原的制备方法，其特征在于[1]取6种羧基半抗原与牛血清白蛋白(BSA)按摩尔比70:180:1混合，力口入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺在pH值7.5-8.5的PB、PBS磷酸缓冲液以及0.2mol/LNaOH溶液中，发生偶联反应；所述PBS磷酸缓冲液生理盐水137mMNaCl、2.7mMKCl、8mMNa2HP04、2mMKH2P04，pH值为7.5-8.5;PB磷酸缓冲液9.5mMNa2HP04、0.5mMNaH2P04,pH值为7.5-8.5;[2]在磁力搅拌和避光条件下充分反应12h，静置10h;然后充分透析48h以上制得完全抗原，分装并于-20'C或-8(TC保存。4.一种权利要求1所述的天然除虫菊酯多克隆抗体的制备方法，其特征在于[1]取除虫菊酯6种完全抗原分别与等量的完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂混合制备免疫原，终浓度为20ng/mL;[2]用6种免疫原混合免疫BALB/c小鼠，首次免疫使用完全佐剂加等量抗原，再次免疫使用不完全佐剂加等量抗原，3次免疫不用佐剂，免疫剂量每次10ng/只，3次免疫后取血清采用间接ELISA检测抗体效价，当效价达到104105时，追加免疫l次，剂量20ng/只，710天后采血制得多克隆抗体；于-8(TC保存；5.根据权利要求l，包括利用类似的方法制备天然除虫菊酯6种人工半抗原和完全抗原，并用于制备天然除虫菊酯多克隆抗体的方法。全文摘要本发明涉及天然杀虫剂除虫菊酯多克隆抗体的制备方法，是专门针对除虫菊酯免疫分析技术中的关键问题而建立起来的一种多克隆抗体的制备方法。首先，采用合成含羧基半抗原的方法在除虫菊酯五元环的酮基上引入羧基制备6种单体的半抗原；其次，采用碳二亚胺(EDC)法将合成的半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联制得除虫菊酯6种人工完全抗原；进而免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。通过颜色反应，紫外光谱分析和间接ELISA检测证实，该方法制备除虫菊酯6种人工抗原及多克隆抗体的技术路线是可行的。合成的6种完全抗原及多克隆抗体为开发一种简单、快速，适于天然除虫菊酯残留现场监控的痕量免疫分析方法具有重要的现实意义。文档编号C07K16/18GK101245102SQ20081006922公开日2008年8月20日申请日期2008年1月10日优先权日2008年1月10日发明者夏玉先,李正国,杨迎伍,伟段,王国民,符勇耀,伟邓申请人:重庆大学