减毒的人-牛嵌合副流感病毒(piv)疫苗的制作方法

专利名称：：减毒的人-牛嵌合副流感病毒(piv)疫苗的制作方法减毒的人-牛嵌合副流感病毒(PIV)疫苗本申请为国际申请日2000年6月15日、国际申请号PCT/US00/17066于2002年1月9日进入中国国家阶段、申请号00810120.5、发明名称"减毒的人-牛嵌合副流感病毒(PIV)疫苗"的分案申请。相关申请的相互参考本发明要求由Bailly等于1999年7月9日申请的美国临时专利申请60/143,134的优先权。
背景技术：
：人副流感病毒类型3(HPIV3)是幼儿和1岁以下儿童严重下呼吸道感染的一般诱因。它是仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)的、导致该年龄段儿童因病毒性下呼吸道疾病入院的诱因(Collins等，B.N.FieldsVirology,pl205-1243，3rded.，vol.1.,Knipe等编辑，Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia,1996;Crowe等，Vaccine13:415-421.1995:Marx等,J.Infect.Dis.176:1423-1427,1997,在此引用作为参考)。该病毒的感染使3岁以下儿童发生显著病症。HPIV1和HPIV2喉气管支气管炎(哮吼)的主要病因，也能引起严重肺炎和细支气管炎(Comns等，1996,同上)。在为期20年的长期性研究中，发现HPIV1、HPIV2禾BHPIV3分别占因呼吸道疾病入院总数的6.0、3.2禾n11.5%,三者的总和占入院总数的18%，因此，需要有效的疫苗。(Murphy等，VimsRes.11:1-15，1988)。也发现副流感病毒占儿童中耳炎患者中病毒诱发的中耳积液的诱因的很大比例(Heikkinen等，N.Engl.J.Med.340:260-264,1999,在此引入作为参考)。因此，需要发展一种抗这些病毒的疫苗，以预防严重的下呼吸道疾病和伴随HPIV感染的中耳炎。HPIV1、HPIV2和HPIV3是不同的血清型，不诱导显著的交叉保护性免疫。PIV的主要保护性抗原是介导病毒附着、穿透和释放的血凝素(HN)和融合(F)糖蛋白。抗再次感染的保护主要由病毒中和抗体介导。尽管对发展抗HPIV的有效疫苗疗法进行了大量的努力，仍然没有获得预防HPIV相关疾病的被认可的疫苗制剂。目前最有前景的是活的减毒疫苗病毒，因其用于非人灵长类动物中时，即使在被动转移抗体存在时(一种实验，模拟具有由母体获得的抗体的幼儿的状况)也有效(Crowe等，1995，同上；Durbin等，J.Infect.Dis.179:1345-1351,1999a:分别在此引入作为参考)。两个活的减毒PIV3候选疫苗，野生型PIV3JS株的温度敏感性(ts)衍生物(命名为PIV3cp45)和一个牛PIV3(BPIV3)株，正在进行临床检测(Karron等，Pediatr.Infect.Dis.J.15:650-654.1996;Karron等，1995a，同上；Karron等，1995b，同上；分别在此引入作为参考)。BPIV3候选疫苗是在幼儿和儿童中减毒的、遗传上稳定，并具有免疫原性的。第二个PIV3候选疫苗(JScp45)是HPIV3JS野生型(wt)株的冷适应突变体(Karron等，1995b，同上；和Belshe等，J.Med.Virol.10:235-242,1982a;分别在此引入作为参考)。这种活的、冷传代(cp)的PIV3候选疫苗具有温度敏感(ts)、冷适应(ca)、和减毒(att)的表型，在体内实验病毒复制后是稳定的。cp45病毒在实验动物中可保护个体免受人PIV3的攻击，并且在血清反应阴性的幼儿和儿童中是减毒、遗传上稳定，并具有免疫原性的(Belshe等，1982a，同上；Belshe等，Infect.Immun.37:160-165,1982b;Clements等，J.Clin.Micrbiol.2^:1175-1182,1991;Crookshanks等，J.Med.Virol.13:242-249,1984:Hall等，VirusRes.22:175-184,1992;Karron等，1995b，同上；分别在此引入作为参考)。由于这些PIV3候选疫苗是生物学来源的，没有可靠的方法调节其减毒水平，而这正是广泛临床应用所需的。近来，重组DNA技术促进PIV3候选疫苗的发展，使从cDNA得到感染性负链RNA病毒成为可能(综述参见Conzelmann,J.Gen.Virol.22:381-389，1996;Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.21:11354-11358,1996;分别在此引入作为参考)。文中报道了在必需病毒蛋白存在时，从cDNA编码的反基因组RNA中拯救的一些重组病毒，这些病毒包括感染性呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病病毒(RaV)、猿猴病毒5(SV5)、牛瘟病毒、新城疫病毒(NDV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、腮腺炎病毒(MuV)、和仙台病毒(SeV)(参见，如，Garcin等，EMBOJ.li:6087-6094,1995;Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:4477-4481,1995;Radecke等EMBOJ.14:5773-5784,1995;Schnell等，EMBOJ.U:4195-4203，1994;Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.22:8388-8392，1995;Hoffman等J.Virol.21:4272-4277,1997;Kato等GenestoCells1:569-579,1996;Roberts等，Virology247:1-6,1998;Ba觀等，J.Virol.71:1265-1271,1997;国际公开WO97/06270;Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:11563-11567,1995;1997年7月15日的US专利申请08/892，403(相应于公布的国际申请WO98/02530和优先权US临时申请1997年5月23日的60/047,634，1997年5月9日的60/046,141，1996年7月15日的60/021,773);1999年4月13日的美国专利申请09/291,894;1999年4月13日的美国临时专利申请60/129,006;1999年7月9日Bucholz等的美国临时专利申请60/143,097;Juhasz等，J.Virol.21:5814-5819,1997;He等，Virology237:249-260,1997;Peters等，J.Virol.21:5001-5009，1999;Whitehead等，Virology247:232-239,1998a;Whitehead等，J.Virol.22:4467-4471，1998b;Jin等，Virology2il:206-214,1998;Bucholz等，J.Virol.21:251-259，1999:Whitehead等，J.Virol.73:3438-3442,1999;Clarke等，J.Virol.M:4831-4838,2000;为各种目的在此分别全文引用作为参考)。在特别与本发明有关的方面，近来发展了一种获得具有来自cDNA的wt表型的HPIV的方法，用于回收感染性的重组HPIV3JS株(参见，如，Durbin等，Virology235:323-332,1997a;1998年5月22日的美国专利申请09/083,793;1997年5月23日的美国临时专利申请60/047，575(相应于国际申请WO98/53078)和1997年9月19日的美国临时专利申请60/059,385;在此分别引用作为参考)。此外，这些发现使可以进行病毒cDNA克隆的遗传操作，以确定生物学突变体表型变化的遗传基础，如，在HPIV3cp45中那些特异于ts、ca和att表型的突变，以及那些特异于其减毒表型的BPIV3的基因或基因组区段。此外，这些和一些相关的发现使可以构建具有大量不同突变的新PIV候选疫苗，并估计其减毒、免疫原性和表型稳定性水平(参见1999年7月9日Bailly等的美国临时专利申请60/143,134;和1999年7月9日Durbin等的美国专利申请09/350,821，在此分别引用作为参考)。因此，现在可从cDNA中获得感染性野生型重组PIV3(r)PIV3，以及其多种ts衍生物，并使用反向遗传系统产生具有确定的减毒突变的感染性病毒，以及研究现存疫苗病毒减毒的遗传基础。例如，发现在cp45L基因中的三个氨基酸替代，单独或组合，决定ts和减毒的表型。其它ts和减毒突变存在于PIV3cp45的其它区域。此外，利用cDNA拯救系统，通过在L中带有这三个减毒突变的全长cDNA中，将PIV3HN和F读码框(ORF)替换为PIV1的，制备嵌合PIV1候选疫苗。衍生自该cDNA的重组嵌合病毒定名为rPIV3-l.cp45L(Skiadopoulos等，^Virol.22:1762-1768,1998,Tao等，J.Virol.22:2955-2961，1998;Tao等,Vaccine17:1101-1108,1998，在此引用作为参考)。rPIV3-l.cp45L在仓鼠中是减毒的，并能对PIV1的攻击诱导高水平抗性。获得了一个定名为rPIV3-l.cp45的重组嵌合病毒，其具有cp45中15个突变的12个，即，不包括发生于HN和F的突变，并且在仓鼠上下呼吸道中是高度减毒的(Skiadopoulos等，Vaccine18:503-510,1999a)。与HPIV3抗原性相关的BPIV3提供了一种开发活的HPIV1、HPIV2、HPIV3减毒疫苗的其它方法。第一种用于人的疫苗(被认为是来自牛的活的减毒疫苗)由Jenner在200年前为控制天花而发明。在接下来的两个世纪中，痘苗病毒成功地控制了这种疾病，并且对天花的最终消灭起了重要作用。在疫苗发展的"Jetmer氏"方法中，使用抗原性相关的动物病毒作为人疫苗。可以很好地适应其天然宿主的动物病毒经常在人中不能有效复制，因此使之减毒。目前，对于这种宿主范围限制的遗传基础还无清楚的理解。哺乳动物或鸟类病毒的演化导致其核苷酸和氨基酸序列与相关人类病毒相应序列有显著的分歧。这些包含许多序列差异的分歧序列决定了宿主范围减毒表型。具有基于大量序列差异的减毒表型是所希望的疫苗病毒性状，因其有助于动物病毒在人体复制后减毒表型的稳定。目前许可的四价轮状病毒是Jenner氏方法发展疫苗的一个范例，发现一种非人的轮状病毒株(猕猴轮状病毒，RRV)在人体内减毒，并且产生对抗与其抗原性高度相关的人血清型3的保护(Kapikian等，Adv.Exp.Med.Biol.327:59-69,1992)。由于需要对四种主要人轮状病毒血清型中任何一种都能诱导抗性的多价疫苗，对Jenner氏方法进行了修改，即，利用传统的基因重排遗传技术在组织培养过程中构建三种重排列病毒。每一个单基因重排列的病毒含有10个RRV基因和一个单个的人轮状病毒基因(编码血清型1、2或4的主要中和抗原(VP7))。目的是制备具有猿猴病毒减毒特点，以及人轮状病毒血清型l、2或4的中和特异性的单基因替代物RRV重排列体。基于猿猴RRV在人体内宿主范围限制的四价疫苗在幼儿和儿童中高效性地抗人轮状病毒感染(Perez-Schael等，N.Engl.J.Med.337:1181-1187,1997)。不过，该疫苗病毒在较大的、缺乏母体抗体的血清反应阴性幼儿中具有轻微的反应原性，因此发展了一种基于牛轮状病毒UK株的二代Jenner氏疫苗，以替代RRV疫苗(Clements-Mann等，Vaccine17:2715-2725,1999)。Jenner氏方法也被研究用来发明1型副流感病毒和甲肝病毒的疫苗(其在非人灵长类动物中为减毒且具免疫原性的)(Emerson等，^Infect.Dis.173:592-597,1996;Hurwitz等,Vaccine15:533-540，1997)。Jenner氏方法曾被用于发明A型流感病毒的活的减毒疫苗，但没有获得用于人体的持续减毒的疫苗(Steinhoff等，J.Infect.Dis.1^:1023-1028，1991)。另一个例子，具有来自人A型流感病毒的编码血凝素和神经氨酸酶表面糖蛋白的两个基因区段，和来自鸟A型流感病毒的6个剩余基因区段的重排列病毒，在人中是减毒的(Clements等，J.Clin.Microbil.22:219-222,1989;Murphy等，J.Infect.Dis.111:225-229,1985;禾。Snyder等，J.Clin.Microbiol.23:852-857,1986)。这表明鸟病毒的6个基因区段中的一个或多个使鸟-人A型流感病毒在人体中减毒。利用具有减毒鸟A型流感病毒的单个基因区段和剩余来自人病毒株的基因的重排列病毒确定定位减毒的遗传决定簇。发现非结构(NS)、聚合酶(PB1，PB2)和M基因参与鸟A型流感病毒在人体中的减毒表型(Clements等，J.Clin.Microbiol.1^:655-662,1992)。另一项研究中，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)在猩猩中复制的严格宿主范围限制，在将BRSV的F和G糖蛋白替代为其HRSV对应物时只有小部分的改变。这表明F和G参与宿主范围限制，但还有一个或多个另外的牛RSV基因参与(Buchholz等，丄Virol.74:1187-1199,2000)。结果说明多于一个基因可能以一种不可预知的方式，参与哺乳动物或鸟类病毒在灵长类动物中的宿主范围限制表型。本发明提供了使用作抗HPIV疫苗的野生型或突变的亲代病毒减毒的基础，其中减毒完全或部分的基于宿主范围效应，该嵌合病毒的至少一个或多个主要中和和保护性抗原决定簇与该疫苗针对的病毒是同源的。BPIV3的HN和F蛋白与其相应的HPIV3蛋白在氨基酸序列上有80。/。的相关性(Suzu等，NucleicAcidsRes.15:2945-2958,1987，在此引用作为参考)，抗原分析有25%相关性(Coelingh等，J.Virol.姓3833-3843，1990;Coelingh等，J.Virol.祉90-96，1986;vanWykeCoelingh等.J.Infect.Dis.157:655-662,1988，分别在此引用作为参考)。之前的研究表明BPIV3的两个毒株，堪萨斯(Ka)和运输热(SF)原型在猕猴的上下呼吸道中是减毒的，其中之一，Ka，在猩猩中是减毒的(vanWykeCoelingh等，1988，同上，在此引用作为参考)。Ka病毒免疫非人灵长类诱导对HPIV3反应的抗体，诱导对猴上下呼吸道中人病毒复制的抑制(同上)。Ka毒株在人体的后续评估表明该病毒在血清反应阴性型幼儿中有满意的减毒效果，并且在完全敏感的幼儿和儿童中，其在复制后仍保持减毒的表型(Karron等，1996，同上；Karron等，1995a，同上；分别在此引用作为参考)。因此，其主要优势在于其对于完全敏感的血清反应阴性幼儿和儿童有满意的减毒效果，并且在人体复制后仍保持减毒的表型。不过，在血清反应阴性接种者(接种了BPIV3Ka毒株105()组织培养感染剂量so(TCID)50)血清中诱导产生的、HPIV3反应性、抑制血凝作用的抗体水平为l:105，比接种活减毒HPIV3疫苗的相同接种者低3倍(Karron等，1995a，同上；Karron等，1995b，同上；分别在此引用作为参考)。BPIV3诱导的人病毒抗体的低水平主要反映了HPIV3和BPIV3之间抗原性差异(Karron等，1996，同上；Karron等，1995a，同上；分别在此引用作为参考)。仍然没有对在人体中抗HPIV3的Ka候选疫苗的效力进行确定，但可能这种HPIV3反应性抗体的低水平会表现为保护性效率的降低。尽管己知BPIV3有在猕猴、猩猩和人呼吸道中限制复制的宿主范围基因，但仍然不知道哪个牛蛋白或非编码序列决定这种复制的宿主范围限制。或许任一BPIV3的蛋白或非编码序列都可能赋予一种宿主范围表型。不可能预先确定哪个基因或基因组区段会赋予减毒表型。这只能通过将BPIV3的编码或非编码序列用HPIV3的对应部分系统替代，并在血清反应阴性的猕猴或人中评估获得的HPIV3/BPIV3嵌合病毒来完成。尽管在发展抗PIV血清型1、2和3的有效疫苗中有许多进展，本领域仍然需要另外的工具和方法，工程化安全和有效疫苗以减轻PIV导致的严重的健康问题，特别是HPIV感染导致幼儿和儿童的疾病。目前遗留的问题包括需要其它工具以产生用于不同临床背景的、适当减毒的、具免疫原性和遗传稳定性的候选疫苗。为达到这一目标，现存的检测并在重组疫苗毒株中包含减毒突变的方法需要扩展。此外，设计抗人PIV疫苗的方法和组合物，也可以用于发展新的兽用候选疫苗。本发明令人惊讶地满足这些需要，并提供了以下所述的其它优点。发明简述本发明提供了在人体和其它哺乳动物中感染性且减毒的人-牛嵌合副流感病毒(PIV)。在相关方面中，本发明提供了设计和生产减毒、人-牛嵌合PIV的新方法，所述PIV可以各种组合物形式在对PIV感染敏感的宿主中产生期望的、抗PIV的免疫应答。本发明这些方面中包括新的经分离的多核苷酸分子和包含该分子的载体，所述多核苷酸分子包含一个嵌合PIV基因组或反基因组，其包括组合或整合了另一种PIV的一个或多个异源基因或基因组区段的部分或完整人或牛PIV"背景"基因组或反基因组。本发明中也提供了具有用于预防和治疗PIV感染的人-牛嵌合PIV的方法和组合物。因此，本发明包括一种开发基于HPIV和BPIV3间嵌合体的活减毒PIV候选疫苗的方法。嵌合体通过一种基于cDNA的病毒回收系统获得。从cDNA中获得的重组病毒独立复制，并以与生物学来源的病毒同样方式增殖。本发明嵌合的人-牛PIV经工程化重组，同时包含来自人和牛PIV株的核苷酸序列以产生感染性、嵌合病毒或亚病毒颗粒。以这种方式，候选疫苗病毒经工程化重组，在对PIV感染敏感的哺乳动物宿主(包括人和非人灵长类动物)中诱导抗PIV的免疫应答。根据本发明，嵌合的人-牛PIV可以被工程化诱导抗特定PIV的免疫应答，如抗HPIV3，或诱导抗多个PIV的多特异性应答，如抗HPIV1和HPIV3。可以依据此处所述方法设计其它嵌合病毒，作为非PIV病原抗原的载体，例如，作为呼吸道合胞病毒(RSV)和麻疹病毒的载体。本发明人-牛嵌合PIV的例子包括一个嵌合PIV基因组或反基因组(含有人和牛多核苷酸序列，以及一种主要核壳(N)蛋白、一种核壳磷蛋白(P)和一种大的聚合酶蛋白(L)。其它PIV蛋白可能在各种组合中包括，以提供从感染性亚病毒颗粒，直到完整病毒或含有额外蛋白、抗原决定簇或其它附加成分的病毒颗粒。本发明嵌合的人-牛PIV包括部分或完全的"背景"PIV基因组或反基因组，其来自或其构建依据一种人或牛PIV毒株或病毒亚型，与另一种PIV病毒或病毒亚型的一个或多个异源基因或基因组区段，形成人-牛嵌合PIV基因组或反基因组。本发明的一些优选方面中，嵌合PIV包括组合了牛PIV的一个或多个异源基因或基因组区段的，部分或完全的人PIV背景基因组或反基因组。典型的，部分或完全的背景基因组或反基因组作为一种人或牛PIV对应物的异源基因或基因组区段的受体骨架或载体。人或牛PIV对应物的异源基因或基因组区段代表与背景基因组或反基因组组合或替换至其中的"供体"基因或多核苷酸，产生表现新表型特征的人-牛嵌合PIV，这种新表型在其来源的一个PIV或在二者中不存在。例如，异源基因或基因组区段在一个选择的受体PIV株中的附加或替代，与未修饰的受体和/或供体相应的表型相比，可能导致减毒、生长变化、改变的免疫原性或其它希望的表型变化。可用于本发明嵌合人-牛PIV中异源替代或添加的基因和基因组区段包括，编码PIVN，P，C，D，V，M，F，SH(如适合)，HN禾口/或L蛋白或其一部分的基因和基因组区段。此外，编码非PIV蛋白(如腮腺炎和SV5病毒中的SH蛋白)的基因和基因组区段可能也包括在本发明人-牛PIV中。调节区域(如基因外3'前导区或5'非转录尾区、基因起始、终止区、基因间隔区或3'或5'非编码区)也可用作异源替代或附加。本发明优选的人-牛嵌合PIV候选疫苗，在一个或多个BPIV3基因或基因组区段的替代或附加导致减毒的背景中，带有HPIV3的一个或多个主要抗原决定簇。尽管其它蛋白可能也参与保护性免疫应答，PIV的主要保护性抗原是其HN和F糖蛋白。一些实施方案中，背景基因组或反基因组是HPIV基因组或反基因组(如HPIV1、HPIV2、或HPIV3背景基因组或反基因组)，其中加入或替代性加入一个或多个BPIV基因或基因组区段，优选BPIV3。在以下描述的一个实施方案实例中，BPIV3N基因ORF替代了HPIV的。另外的，背景基因组或反基因组可以是BPIV基因组或反基因组，其组合有一个或多个编码HPIV3、HPIV2或HPIV1糖蛋白、糖蛋白结构域或其它抗原决定簇的基因或基因区段。与本发明的方法一致，任何BPIV基因或基因组区段，单独或与一个或更多其它BPIV基因组合，可以与HPIV序列组合产生人-牛嵌合PIV候选疫苗。任何HPIV，包括特定HPIV血清型(如HPIV3)的不同株，是使BPIV基因减毒的合理受体。一般，被选择包括在用作抗人PIV疫苗的人-牛嵌合PIV中的HPIV3基因或基因组区段，将包含一个或多个HPIV保护性抗原，如HN或F糖蛋白。本发明的一些范例方面中，带有一个或多个牛基因或基因组区段的人-牛嵌合PIV表现高度的宿主范围限制，如在人PIV感染的哺乳动物模型(如非人灵长类)的呼吸道中。在范例的实施方案中，人PIV的减毒是通过对部分或完整人PIV(如HPIV3)背景基因组或反基因组进行附加或替代一个或更多的牛基因或基因组区段。一个例子中，HPIV3N基因被BPIV3N基因替代，产生新的人-牛嵌合PIV候选疫苗。优选的，本发明人-牛嵌合PIV候选疫苗产生宿主范围限制的程度，与各自的BPIV亲代或"供体"株的宿主范围限制程度是相当的。优选的，这种限制应有一种真实的宿主范围表型，g卩，应该特异于研究的宿主，而且在合适的细胞系中不限制其复制和疫苗的体外制备。此外，带有一个或更多的牛基因或基因组区段的人-牛嵌合PIV，在对PIV感染敏感的宿主中诱导高水平抗性。因此，本发明提供了使抗PIV活病毒疫苗减毒的新基础，其基于引入来自异源PIV(如HPIV3和BPIV3之间)的一个或更多基因或基因组区段而产生的宿主范围效果。本发明的相关方面，人-牛嵌合PIV带有一个或更多的编码HPIVHN和/或F糖蛋白的异源基因。另一些，嵌合PIV可能带有一个或更多的编码胞外域(或胞质结构域和/或跨膜结构域)、或HPIVHN和/或F糖蛋白的免疫原性表位的基因组区段。这些免疫原蛋白、结构域和表位在人-牛嵌合PIV中特别有用，因为它们在免疫化的宿主中产生新的免疫应答。特别的，此处的HN和F蛋白、以及免疫原结构域和表位，提供了主要保护性抗原。本发明的一些实施方案中，人PIV亚型或株的一个或更多免疫原基因或基因组区段，对牛背景或受体基因组或反基因组的附加或在其中替代产生一种重组、嵌合的病毒或亚病毒颗粒，其可以产生抗该人供体病毒(包括一个或更多人PIV亚型或株)的免疫应答，而牛骨架赋予的减毒表型使该嵌合体成为发展疫苗的有用候选物。一些范例的实施方案中，一个或更多人PIV糖蛋白基因(如HN和/或F)加入或替代到部分或完全的牛基因组或反基因组中，产生一种减毒的、具感染性的人-牛嵌合体，可在敏感宿主中诱导抗-人PIV的免疫应答。其它一些实施方案中，人-牛嵌合PIV附加地具有来自多种人PIV株的一个编码免疫原蛋白、蛋白结构域或表位的基因或基因组区段，如编码分别来自不同HPIV(如HPIV1或HPIV2)的两个HN或F蛋白或其免疫原部分的基因或基因组区段。或者，第一个HPIV只提供一个糖蛋白或免疫原决定簇，第二个糖蛋白或免疫原决定簇由第二个HPIV，通过不在该基因组或反基因组中加入额外的编码糖蛋白或决定簇的多核苷酸的替代提供。HPIV糖蛋白或免疫原决定簇的替代或附加可能通过在重组病毒或亚病毒颗粒中构建编码嵌合糖蛋白的基因组或反基因组得以实现，例如第一个HPIV的免疫原性表位、抗原区或全部胞外域与异源HPIV的胞质结构域融合。例如，编码HPIV1或HPIVHN或F糖蛋白的糖蛋白胞外域的异源基因组区段，在背景基因组或反基因组中，可以与编码HPIV3HN或F糖蛋白的相应胞质结构域或胞内结构域的基因组区段相连。另一些实施方案中，人-牛嵌合PIV的基因组或反基因组可能在重组病毒或亚病毒颗粒中编码替代、附加或嵌合的糖蛋白或其抗原决定簇，产生同时具有人和牛糖蛋白、糖蛋白结构域或免疫原性表位的病毒重组子。例如，编码人PIVHN或F糖蛋白的糖蛋白胞外域的异源基因组区段，在背景基因组或反基因组中，可以与编码相应的PIVHN或F糖蛋白的胞质结构域或胞内结构域的基因组区段相连。或者，人PIVHN或F糖蛋白或其部分，可以与编码另外PIV株或血清型的HN或F糖蛋白或其部分的基因组区段相连。因此，根据本发明的方法，人-牛嵌合PIV可以通过以异源基因或基因组区段替代部分PIV背景基因组或反基因组中的对应的基因或基因组区段进行构建。或者，异源基因或基因组区段可以额外基因或基因组区段加入，并与完整(或部分，如另一基因或基因组区段缺失)PIV背景基因组或反基因组组合。例如，可能包括两个分别来自HIPV2和HIPV3的人PIVHN或F基因或基因组区段。经常，异源基因或基因组区段加入接近部分或完整PIV背景基因组或反基因组中的基因间隔区位置。或者，该基因或基因组区段可以位于该基因组的其它非编码区，如，位于5'或3'非编码区，或部分或完整基因组或反基因组中非编码核苷酸的其它位置。一方面，非编码调节区具有有效复制、转录、翻译所必须的顺式作用信号，因此是通过导入异源基因或基因组区段，或在此所述的其它突变，修饰这些功能的作用靶点。本发明更详细的方面，减毒突变导入顺式作用调节区域，以产生如(l)组织特异性减毒(Gromeier等，J.Virol.21:958-964,1999;Zimmerma皿等.J.Virol.71:4145-4149,1997)，(2)对干扰素的增强的敏感性(Zhnmermann等，1997，同上)，(3)温度敏感性(Whitehead等，1998a，同上)，(4)复制水平的一般限制(Men等，J.Virol.70:3930-3937,1996;Muster等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:5177-5181,1991)，和/或(5)复制的宿主特异性限制(Cahour等，Virology207:68-76,1995)。这些减毒突变可以多种方式达到，产生本发明的人-牛嵌合PIV，如通过点突变、相关病毒序列的交换或核苷酸突变。在这里提供的另一些其它方法中，部分或完整PIV背景基因组或反基因组中，异源基因或基因组区段可以被加入或替代到相应于其对应物的野生型基因位置的位置上。一些实施方案中，背景基因组或反基因组中，异源基因或基因组区段可以在比其对应的基因或基因组区段的野生型基因位置更加接近或远离启动子的位置加入或替代，分别可以增强或降低该异源基因或基因组区段的表达。本发明的一些一般方面，牛基因或基因组区段被加入或替代到人PIV背景下，形成减毒的人-牛嵌合PIV。或者，嵌合体可以由一个或多个人基因或基因组区段在牛PIV背景下加入或替代，形成减毒的PIV候选疫苗。文中，嵌合PIV基因组或反基因组由部分或完整牛PIV背景基因组或反基因组与来自人PIV的异源基因或基因组区段组合而成。优选方面中，一个或多个牛基因或基因组区段替代了人PIV背景基因组或反基因组中对应的基因或基因组区段。其它一些实施方案中，一个或多个人PIV糖蛋白基因，如HN和/或F或编码人PIV糖蛋白细胞质区、跨膜区、胞外区或免疫原性表位的基因组区段，替代了牛PIV背景基因组或反基因组中对应的基因或基因组区段。例如，人PIV糖蛋白基因HN和F二者都可能替代牛PIV背景基因组或反基因组中HN和F糖蛋白基因的对应部分。以相同方式，本发明人-牛嵌合PIV可被容易地设计为"载体"，以包含来自不同病原的抗原决定簇，包括来自超过一种的PIV株或组(如，人PIV3和人PIV1二者)、呼吸道合胞病毒、麻疹和其它病原(参见，如1999年12月10日Murphy等的美国临时专利申请60/170,195，在此引用作为参考)。在本发明更详细的方面，人-牛嵌合PIV含有组合了来自人PIV的一个或多个异源基因或基因组区段的部分或完整BPIV背景基因组或反基因组。这些方面中，一个或多个HPIV糖蛋白基因HN和F，或一个或多个编码人PIV糖蛋白HN和/或F基因的细胞质区、跨膜区、胞外区或免疫原性表位的基因组区段，可能加入BPIV背景基因组或反基因组，或替代BPIV背景基因组或反基因组中对应的基因或基因组区段，产生嵌合的构建体。经常，HPIV糖蛋白基因HN和F二者都可能替代BPIV背景基因组或反基因组中HN和F糖蛋白基因的对应部分，如以下所述重组嵌合病毒rBPIV3-FHHNH的范例。这是很好的构建体，因其组合了人PIV抗原决定簇和牛PIV的宿主范围限制元件。结合本发明人-牛嵌合PIV中宿主范围表型效果，通过引入可增加或降低该嵌合病毒减毒性的附加突变来调节减毒表型是需要的。因此，在本发明附加方面，得到了嵌合基因组或反基因组被进一步修饰的减毒的人-牛嵌合PIV，这种修饰是通过引入决定产生的病毒或亚病毒颗粒中的一种减毒表型的一个或多个减毒突变来进行的。包括RNA调节序列或编码蛋白中的突变。这些减毒突变可以在体外产生，并根据合理设计的诱变策略检测减毒效果。或者，减毒突变可以在现存的生物学来源的突变体PIV中检出，此后被包括于本发明人-牛嵌合PIV中。将减毒和其它期望的表型特异性突变引入本发明人-牛嵌合PIV可通过将异源基因或基因组区段(如编码L蛋白或其部分的)转移入牛或人PIV背景基因组或反基因组完成。或者，突变存在于选择的背景基因组或反基因组中，而引入的异源基因或基因组区段不具有突变，或具有一个或多个不同的突变。典型的，牛或人背景或"受体"基因组或反基因组在相应于异源病毒(如异源的牛或人PIV，或非PIV的负链RNA病毒)突变位点的一个或多个位点被修饰，以含有或编码供体病毒中发现的相同或保守地相关的突变(如一个保守性氨基酸替代)(参见2000年4月12日的PCT/US00/09695和其优先权1999年4月13日的美国临时专利申请60/129,006，在此引用作为参考)。在一个模式实施方案中，牛或人背景或"受体"基因组或反基因组在相应于HPIV3JScp45中突变的一个位点处的一个或多个位点被修饰，如以下所述，以具有或编码？p45"供体"中发现的相同或保守地相关的突变。检测并在本发明人-牛嵌合PIV中引入减毒突变的优选突变PIV株包括冷传代(cp)、冷适应(ca)、宿主范围限制(hr)、小噬菌斑(sp)、和/或温度敏感(ts)突变体，例如JSHPIV3cp45突变株。在模式实施方案中，一个或多个减毒突变发生于聚合酶L蛋白中，如在相应于JS野生型HPIV3的Tyr942、Leu992、Thr^8的位置上。或者，N蛋白的减毒突变可被选择并引入人-牛嵌合PIV中，如在相应于JS残基Val96、Ser389处的氨基酸替代。其它或附加突变可能编码C蛋白中的氨基酸替代，如在相应于JS的11e96处，或编码M蛋白中的氨基酸替代，如相应于Pro则处(如Pro则到Thr的突变)。调节本发明人-牛嵌合PIV减毒的其它突变也存在于F蛋白，如在相应于JS残基Ile42Q或Ala45o处，在HN蛋白，如在相应于JS残基Val^4处。引入本发明人-牛嵌合PIV中的、来自生物学来源的PIV突变体的减毒突变也包括在PIV基因组或反基因组非编码部分的突变，例如在3'前导序列。文中的突变范例可在重组病毒3'前导序列(相应于JScp45核苷酸23、24、28或45)工程化。其它的突变范例可在重组病毒N基因起始序列工程化，如通过改变N基因起始序列一个或多个核苷酸，如相应于JScp45核苷酸62位置处。从JScp45和其它生物学来源的PIV和非PIV突变体，得到了减毒突变的大"菜单"，其中每个突变都可以与其它突变组合，调节具有人和牛基因或基因组区段嵌合体的基因组或反基因组的重组PIV的减毒水平。例如，本发明重组PIV内的突变包括一个或多个，优选两个或更多JScp45突变。期望用于疫苗的本发明人-牛嵌合PIV经常有至少两个，有时三个或更多突变，以获得满意的可广泛用于临床的减毒。优选的，重组人-牛嵌合PIV具有一个或多个突变，通过决定于该突变的密码子中的多核苷酸替代使其稳定。其它可以采用并转入本发明人-牛嵌合PIV的突变可在非PIV非区段化负链RNA病毒中发现，并引入本发明PIV突变体。这通过将发现于异源负链RNA病毒的突变定位于受体PIV基因组或反基因组的相应同源位点，并使受体现存序列突变为该突变体表型(相同或保守突变)，可以容易地获得，在2000年4月12日的PCT/US00/09695和其优先权1999年4月13日的美国临时专利申请60/129,006中有说明，在此引用作为参考。除了重组人-牛嵌合PIV，本发明还提供了相关的cDNA克隆、载体和粒子，均包含HPIV和BPIV序列，并且任选地包括一个或多个附加的表型特异性突变。根据此处描述的方法，这些以选择性组合引入其是重组cDNA基因组或反基因组的分离的多核苷酸，产生表达时稳定减毒的感染性病毒或亚病毒颗粒。这一过程，与常规表型评价一起，提供了具有期望特性(如减毒、温度敏感、改变的免疫原性、冷适应、小噬菌斑、宿主范围限制、遗传稳定性等)的人-牛嵌合PIV。特别的，选择候选疫苗，其是减毒的但仍然带有足以在被免疫的哺乳动物宿主中诱导保护性免疫反应的免疫原性。在本发明其它方面中，具有或没有额外突变(如来自生物学来源的减毒突变病毒)的人-牛嵌合PIV，构建使其具有额外的核苷酸改变，以产生所期望的表型、结构或功能的改变。典型的，所选择的核苷酸改变应特异于一种表型变化，如生长特性、减毒、温度敏感、冷适应、小噬菌斑、宿主范围限制或免疫原性的改变。本文中的结构变化包括在编码cDNA的PIV中引入或消除限制性位点，使操作和检出更容易。在优选的实施方案中，人-牛嵌合PIV基因组或反基因组的核苷酸改变包括，部分或完全缺失一个基因，或降低或消除(剔除)其表达。这些改变可以引入人或牛背景基因组或反基因组，或通过进入异源基因或基因组区段(此处是添加或替代)，引入嵌合基因组或反基因组。文中突变的靶基因包括任何PIV基因，包括核壳蛋白N、磷蛋白P、大聚合酶亚基L、基质蛋白M、血凝素-神经氨酸酶蛋白HN、小疏水蛋白SH蛋白、(如适用)融合蛋白F和C、D、V读码框(ORF)的产物。在重组蛋白保持活性和感染性时，这些蛋白的任何一个可以被选择性缺失、替代或重排，整体或部分，单独或与其它期望的修饰组合，以获得新的缺失或剔除突变体。例如，C、D和/或V基因的一个或多个可能整体或部分缺失，或其表达降低或消除(如，引入终止密码子、RNA编辑位点突变、改变了起始密码子特异氨基酸的突变或在靶读码框中的移码突变)。一个实施方案中，可以在编辑位点制造突变，因此抑制了编辑消除了RNA编辑产生的mRNA的表达(Kato等，EMBOJ.16:578-587,1997和Schneider等，Virology227:314-322,1997，分别在此引用作为参考)。或者，C、D和/或V读码框的一个或多个可能整体或部分缺失，改变所产生的重组克隆的表型，改善了生长、减毒、免疫原性或其它期望表型特征(参见1999年7月9日Durbin等的美国专利申请09/350,821，在此引用作为参考)。本发明人-牛嵌合PIV的其它核苷酸改变包括，重组基因组或反基因组中的一个被选择基因的顺式作用调节序列的缺失、插入、添加或重排。和其它在此描述的改变相同，这些改变可以引入人或牛背景基因组或反基因组，或通过进入异源基因或基因组区段(此处是添加或替代)，引入嵌合基因组或反基因组。一个范例中，一个PIV基因的顺式作用调节序列被改变为与异源调节序列相应，其可以是不同PIV相同基因的对应顺式作用调节序列，或不同PIV基因的顺式作用调节序列。例如，一个基因末端信号可以转化或替代为相同PIV株的不同基因末端信号。其它一些实施方案中，核苷酸修饰可能包括重组基因组或反基因组中翻译起始位点的插入、缺失、替代或重排，如消除一种蛋白质所选择形式的翻译起始位点。此外，各种其它的遗传改变可以在人-牛嵌合PIV基因组或反基因组中产生，单独或和一个或多个来自生物学来源的突变PIV的减毒突变组合。例如，非PIV来源的基因或基因组区段可以整体或部分插入。或者，可以改变基因排列顺序，或一个PIV基因组启动子用其反基因组的对应部分替代。在这种重组基因组或反基因组中的不同或额外的改变有利于操作，如在各种非编码区或其它位置插入唯一的限制性位点。非翻译的基因序列可以被去除以增加插入外源序列的能力。在另一些方面，编码人-牛嵌合PIV基因组或反基因组的多核苷酸或载体可以被修饰，以编码可在目的宿主中诱导保护性免疫的非PIV序列(如细胞因子、T辅助表位、限制性位点标记)或微生物病原(如病毒、细菌、寄生物或真菌)。在这种实施方案中，构建了含有呼吸道合胞病毒(RSV)基因或基因组区段的人-牛嵌合PIV，例如含有编码RSV抗原蛋白(如F或G蛋白)、免疫原结构域或表位的基因。本发明的相关方面，提供了产生分离的感染性人-牛嵌合PIV的组合物(如具有Piv编码cDNA的分离的多核苷酸或载体)和方法。本发明的这些方面中包括了具有人-牛嵌合PIV基因组或反基因组的新的分离的多核苷酸分子和载体。也提供了具有编码N、P、L蛋白的一个或多个分离的多核苷酸分子的相同或不同的表达载体。这些蛋白也可以直接由基因组或反基因组cDNA表达。载体优选在细胞或无细胞裂解液中表达或共表达，从而产生感染性人-牛嵌合PIV病毒颗粒或亚病毒颗粒。以上产生人-牛嵌合PIV的方法和组合物产生感染性病毒颗粒或亚病毒颗粒，或其衍生物。重组感染性病毒相当于天然的PIV病毒颗粒，并有同样的感染性。可直接感染新鲜细胞。感染性亚病毒颗粒典型的是病毒颗粒的一个亚成分，在适当条件下可引发感染。例如，具有基因组或反基因组RNA和N、P、L蛋白的核壳是亚病毒颗粒的一个范例，当其进入细胞质中，可以引发感染。本发明提供的亚病毒颗粒包括缺少一个或多个蛋白质、蛋白质区段或其它感染所非必须病毒成分的病毒颗粒。其它实施方案中，本发明提供了含有一个具有包含上述人-牛嵌合PIV基因组或反基因组的多核苷酸分子的表达载体，和具有包含编码PIVN、P、L蛋白的一个或多个分离的多核苷酸分子的(与前一个相同或不同的)表达载体的细胞或无细胞裂解液。这些蛋白质的一个或多个也可以从基因组或反基因组cDNA表达。表达后，基因组或反基因组和N、P、L组合产生感染性人-牛嵌合PIV病毒颗粒或亚病毒颗粒。本发明的人-牛嵌合PIV以各种组合物形式用于在对PIV敏感的宿主中产生期望的抗PIV免疫反应。人-牛嵌合PIV的重组子能在感染的哺乳动物宿主中诱导保护性免疫应答，且足够地减毒，不会在免疫化宿主中引发严重呼吸道疾病的不可接受的症状。此外，该人-牛嵌合PIV的重组子在体外应该能有效复制，使疫苗的制备可行。减毒的病毒或亚病毒颗粒可能存在于细胞培养物的上清中，从培养物中分离，或部分或完全纯化。病毒也可以冷冻干燥，根据需要与多种成分组合以储藏或给药宿主。本发明进一步提供了新疫苗，其包含一种生理上可接受的载体和/或佐剂，以及分离的减毒人-牛嵌合PIV病毒颗粒或亚病毒颗粒。优选实施方案中，该疫苗包含具有至少一个，优选两或多个额外的突变或以上所述的其它核苷酸修饰的人-牛嵌合PIV，使减毒和免疫原性达到合适的平衡。疫苗配制为每剂10、1(^PFU的减毒病毒。病毒可能具有诱导抗单PIV株或抗PIV多株或组的减毒人-牛嵌合PIV。这方面，人-牛嵌合PIV在制剂中可与其它PIV疫苗株，或其它病毒疫苗病毒如RSV组合。在相关方面，本发明提供了在哺乳动物中刺激免疫系统，以诱导抗PIV免疫应答的一种方法。该方法包括以足够的免疫量，给药存在于生理上可接受的载体和/或佐剂中的人-牛嵌合PIV的制剂。一个实施方案中，免疫原组合物是包含具有至少一个，优选两或多个额外的突变或决定以上所述表型的其它核苷酸修饰的人-牛嵌合Piv疫苗。疫苗配制为每剂103-107PFU的减毒病毒。该疫苗可能具有减毒人-牛嵌合PIV病毒，其可诱导抗单PIV，或抗多PIV(如HPIV1和HPIV3)或抗一个或多个PIV和非PIV病原如RSV的免疫应答。文中，人-牛嵌合PIV可诱导抗单PIV的单特异性免疫应答，或抗多PIV，或抗一个或多个PIV和非PIV病原如RSV的多特异性免疫应答。或者，具有不同免疫原特性的人-牛嵌合PIV可组合于疫苗混合物中，或在协调治疗方案中单独给药，以诱导抗单PIV，或抗多PIV，或抗一个或多个PIV和非PIV病原如RSV的更加有效的保护。优选的，免疫原组合物通过例如喷雾、滴剂或气雾剂给药于上呼吸道。附图简述图1图示了牛PIVKa或SF株的N编码序列克隆于HPIV3中，即将BPIV3毒株Ka或SF的编码区克隆进HPIV3背景中。在图1A-C中，BPIV3N的读码框(ORF)替代了全长rJS反基因组cDNA中的对应HPIV3序列(Durbin等，1997a，同上)。BPIV3Ka和SFN基因首先用标准分子生物学技术通过RT-PCR从毒粒RNA中扩增，作为1.9kb片段亚克隆进pBluescript中，分别得到pBS-KaN或pBS-SFN。HPIV3rJSN基因作为1.9kb的MluI/EcoRI片段克隆进来自具有rJSHPIV3反基因组5'端的质粒pUC119中(Durbin等，1997a，同上；1998年5月22日的美国专利申请09/083,793;1997年5月23日的美,临时申请60/047,575(相应于国际专利申请WO98/53078)，和1997年9月19日的美国临时申请60/059,385;分别在此引用作为参考)，得到pUC119JSN。图1A---进行诱变，在N的起始和终止密码子处创建限制性位点。每个N基因通过定点诱变修饰，分别在转录起始和终止位点引入Ncol和AflII的切点。Ka和SFN基因的转录起始和终止位点相同，因此可以在这两种BPIV3N基因进行相同的如图1A所示的诱变反应。图1B-—Ncol/Aflll消化后，来自代表BPIV3N编码区的pBS-KaN或pBS-SFN的1.5kb片段导入Ncol/Aflll消化过的HPIV3N亚克隆pUC119JSN-NcoI/Afin，代替其对应于HPIV3的部分。图lC---进行诱变，恢复起始和终止密码子。每个嵌合的亚克隆进行定点诱变，恢复HPIV3rJS在翻译起始密码子之前或终止位点密码子之后的序列，以及紧挨起始密码子之后或终止位点密码子之前的BPIV3的编码序列。获得pUC119B/HKaN和pUC119B/HSFN，用于将BPIV3N基因引入HPIV3cDNA克隆，在图2说明。图1，A组CAAAAATGTTG(SEQIDNO.10);GCAACTAATCGA(SEQIDNO.11);TAACCATGGTGA(SEQIDNO,12);GCACTTAAGCAC(SEQIDNO.13)。图1，C组TAACCATGGTGA(SEQIDNO.12);GCACTTAAGCAC(SEQIDNO.13);CAAAAATGTTGA(SEQIDNO.14);GCAACTAGTCGA(SEQIDNO.15)。图2图示了HPIV3/BPIV3(Ka或SF株)的嵌合N基因插入HPIV3反基因组cDNA中，即将BPIV3N编码区克隆进HPIV3反基因组cDNA中。图2A，侧翼为HPIV3序列的BPIV3Ka或SFN的ORF以来自pUC119B/HKaN或pUC119B/HSFN的MluI/EcoRI片段进行亚克隆，插入pLeft+2G(Durbin等，1997a，同上)。质粒pLeft+2G带有HPIV3rJS反基因组T7启动子后nt1-7437(基因组意义)的5'部分。在T7启动子和HPIV3序列中插入以提高转录的两个G残基定位以星号显示。图2B——个pRight的XhoI/NgoMI片段(Durbin等，1997a，同上；1998年5月22日的美国专利申请09/083,793;1997年5月23日的美国临时申请60/047,575(相应于国际专利申请WO98/53078),和1997年9月19日的美国临时申请60/059,385;分别在此引用作为参考)，其具有侧翼为丁型肝炎(S肝炎)病毒核酶和T7终止子的HPIV3反基因组3端，克隆进经修饰的pLeft质粒的XhoI/NgoMII窗口中，产生pB/HPIV3KaN和pB/HPIV3SFN。这些嵌合构建体每个都含有HPIV3反基因组RNA的完全正义序列，但不含有被其BPIV3Ka或SF对应部分替代的N编码区。图3提供了本发明HPIV3、BPIV3和嵌合病毒的N起始密码子(A)和终止密码子(B)附近核苷酸序列。单个ORF的位置分别说明于BPIV3Ka在Genbank弁AF178654;BPIV3SF在弁AF178655禾口弁Z11515，在此引用作为参考。N起始密码子(A)和终止密码子(B)(下划线标出)的侧翼序列(正义)在亲代重组HPIV3JS(rJS)，亲代生物学来源的BPIV3Ka和SF病毒(Ka禾口SF)，以及嵌合的cKa和cSF病毒中显示。cKa和cSF病毒序列中的宿主特异性残基及其在rJS(起始密码子之前和终止密码子之后)和Ka或SF中的对应物(起始密码子到终止密码子，并二者包括在内)均以黑体表示。噬菌斑纯化的嵌合病毒从毒粒RNA中RT-PCR扩增，用TaqDye脱氧终止循环试剂盒(ABI，FosterCity，CA)测序。确定预期的序列确实存在于每个嵌合病毒中。图3A.RJS，GGAACTCTATAATTTCAAAAATGTTGAGCCTATTTGATAC(SEQIDNO.16)。图3A.cKa和cSF，GGAACTCTATATAATTTCAAAAATGTTGAGTCTATTCGACAC(SEQIDNO.17)。图3A.Ka禾卩SF，GAAATCCTAAGACTGTAATCATGTTGAGTCTATTCGACAC(SEQIDNO.18)。图3AA(SEQIDNO.19)。图3B.cKa和cSF，TCAGTGCATTCGGAAGCAACTAGTCGAATCAACATTTTAA(SEQIDNO.20)。图3B.Ka禾BSF，IDNO.21)。图4描述了本发明BPIV3/HPIV3嵌合病毒的结构，以及利用病毒RNA的RT-PCR产物的Taql消化进行确认，即通过TaqI消化来确定潜在的BPIV3/HPIV3嵌合体的特征。在图4A示意嵌合的cKa和cSF病毒相对于其亲代BPIV3和HPIV3病毒(但不按比例)的基因组。Ka和SF特异的区域分别用浅和深阴影表示。rJS基因组上方箭头表示为进行Taql消化而RT-PCR扩增嵌合和亲代病毒所使用的引物的位置。这些引物导向BPIV3和HPIV3间的保守区域，使其可以用于扩增HPIV3、BPIV3和嵌合的BPIV3/HPIV3病毒。在图4B显示了每种病毒Taql消化的预期产物大小，用图4A.中引物对从RNA中扩增的为1898bp的PCR产物。该PCR产物在图4B的顶端表示，NORF表示为填充的矩形。Taql片段对每个病毒都是唯一的，因此可用于病毒的鉴定，用星号表示。图4C显示了含有侧翼为亲代BPIV3和HPIV3病毒序列的嵌合cKa(左)或cSF(右)的PIV3N编码序列的PCR产物的Taql消化图。诊断病毒独特性和与在4B中的相应的唯一性的Taql片段用星号表示。并表示了DNA凝胶条带的计算长度(bp)。图5提供了亲代和嵌合病毒在MDBK(A)或LLC-MK2(B)细胞中多周期生长曲线。6孔板的每个孔(每孔9.6cm勺中单层的牛MDBK(A)或猿猴LLC-MK2(B)细胞分别以0.01感染复数感染亲代和嵌合病毒。样品在指定的时间点采集，-7(TC储存，同时TCIDs。分析其效价。生长曲线用每个时间点采集的3次样品的平均值建立。可检测出的病毒下限为10'5TCID50/ml，以点状线表示。图6A-6G给出了牛PIV3Ka株的正义核苷酸全序列(SEQIDNO.22)。图7A-7G给出了牛PIV3SF株的正义核苷酸全序列(SEQIDNO.23)。图8A示意嵌合病毒rHPIV3-FBHNB和rBPIV3-FHHNH，及其亲代病毒rHPIV3JS和rBPIV3Ka的基因组(不按比例)。F和HN分别用引入M和HN基因序列末端之前的SgrAI和BsiWI位点，在rHPIV3和rBPIV3之间进行单限制性片段互换。图8B显示BPIV3Ka的反基因组cDNA的排列。构建编码BPIV3Ka完全反基因组序列(Genbank弁AF17865)的全长cDNA。这些cDNA来自病毒(v)RNA反转录(RT)和聚合酶链式反应(PCR)扩增得到的亚克隆。测序该反基因组的多个亚克隆，只有吻合BPIV3Ka共有序列的可以用来装配全长克隆，但由于nt21和23以同样频率出现在病毒群体中，却与已发表的序列不同，因此不包括在内。图8C图示了编码HPIV3/BPIV3抗原性嵌合病毒的全长cDNA克隆的产生。其中图8C1.产生HPIV3和BPIV3全长克隆；图8C2.诱变以产生唯一的SgrAI和BsiWI限制性位点；图8C3.克隆F禾卩HN基因进异源全长cDNA中。该图表明亲代和嵌合牛-人PIV基因组的特点。示意了嵌合病毒rHPIV3FBHNB和rBPIV3-FHHNH，及其亲代病毒rHPIV3JS和rBPIV3Ka的基因组(不按比例)。两个唯一的限制性位点，SgrAI和BsiWI，分别引入M和HN基因末端。图8C2中显示带有这些引入的限制性位点的重组HPIV3和BPIV3病毒，定名为rHPIV3和rBPIV3。糖蛋白基因在rHPIV3JS和rBPIV3Ka之间互换。突变了的核苷酸序列显示在每个cDNA构建体下方，指出了每个序列第一个核苷酸的位置。引入的SgrAI和BsiWI限制性位点下画线，而HPIV3禾口BPIV3之间有差异并由此识别了插入基因的来源的核苷酸以黑体表示。图8C，组1，rHPIV3JSTCCACCGGTGCA(SEQIDNO.4)，TAGACAAAAGGG(SEQIDNO.24)。图8C，组1，rBPIV3KaTCCAACATTGCA(SEQIDNO.2)，AAGATATAAAGA(SEQIDNO.25)。图8C，组2，rHPIV3CGCACCGGTGTA(SEQIDNO.5)，TAGACGTACGGG(SEQIDNO.26)。图8C，组2，rBPIV3TCCACCGGTGCA(SEQIDNO.3)，AAGACGTACGGA(SEQIDNO.27)。图8C,组3，rHPIV3FBHNBCGCACCGGTGCA(SEQIDNO.28)，AAGACGTACGGG(SEQIDNO.29)。图8C，组3，rBPIV3-FHHNHAAGACGTACGGG(SEQIDNO.30)，TAGACGTACGGA(SEQIDNO.31)。图9确定了通过对病毒RNA的RT-PCR和EcoRI消化，确定重组病毒的身份。用可同时识别HPIV3和BPIV3F和HN序列任何一端保守区的引物对，对病毒RNA进行RT-PCR获得产物。EcoRI消化在这四种病毒中产生独特的限制性片段图。在左边的示意图中，水平线表示扩增的病毒序列，垂直线表示EcoRI消化切点的位置。线上表示了每个限制性片段的预期大小。线下的数字相应于该序列在HPIV3JS(Genbank#AF178654和弁Zl1515)、BPIV3Ka或指定嵌合衍生物反基因组RNA的位置。右边显示了PCR产物用EcoRI消化后的1%琼脂糖凝胶，确定了亲代和嵌合病毒。星号表示包括由于大小相似产生共迁移的两个限制性片段的胶带。图10显示亲代和嵌合病毒在猿猴LLC-MK2细胞中的多周期复制。三种嵌合病毒rHPIV3-FBHNs、rBPIV3-FHHNH和rHPIV3Nb(也称作cKa)多周期复制(输入的接种量MO^0.01)与其亲代病毒BPIV3Ka和rHPIV3相比。病毒效价以平均1ogK)TCIDM)/ml士三次样品的标准误差表示。该分析检测下限是10TCID5Q，以点状水平线表示。图11记录了感染后的猕猴在整个感染过程中，鼻咽擦拭样品内嵌合和亲代病毒的平均效价。病毒效价以LLC-MK2细胞中平均TCID5。/ml士标准误差(感染同种病毒的4-6只猴子)表示。这显示了与表3中相同的实验。A组，rHPIV3-FBHNB的平均效价与rHPIV3和BPIV3Ka相比。B组，rBPIV3-FHHNH的平均效价与BPIV3Ka和rHPIV3相比，后两个病毒在A组值相同，但分别给出，以便于对比。由于第5天的效价远低于第4和6天(可能由于采样的技术问题)，因此不包括在内。具体实施方案的说明本发明提供了作为人和牛PIV基因组或反基因组序列的嵌合体克隆以产生人-牛嵌合PIV的重组副流感病毒(PIV)。人-牛PIV的嵌合构建体产生在哺乳动物(特别是人)中具感染性的病毒颗粒或亚病毒颗粒，并能产生可用于临床和兽医学的免疫原组合物。本发明也提供了设计和产生减毒人-牛嵌合PIV的方法和组合物，以及预防和治疗PIV感染的方法和组合物。本发明嵌合的人-牛PIV经工程化重组，引入来自人和牛PIV株的核苷酸序列，产生感染性嵌合的病毒或亚病毒颗粒。这一方面，候选的疫苗病毒工程化重组后，在对PIV感染敏感的宿主(包括人和非人灵长类动物)内诱导抗PIV的免疫应答。根据本发明，人-牛嵌合PIV可以诱导针对特定PIV的免疫应答，如HPIV3，或针对多PIV的多特定性免疫应答，如HPIV1和HPIV3。本发明模式的人-牛嵌合PIV包含一个嵌合的PIV基因组或反基因组，其具有人和牛二者的多核苷酸序列，以及主要核壳蛋白(N)、核壳磷蛋白(P)和一个大聚合酶蛋白(L)。其它PIV蛋白可能以各种组合包括在内，提供从各种感染性亚病毒颗粒到完整病毒颗粒，或带有额外蛋白、抗原决定簇或其它附加成分的病毒颗粒。本发明嵌合的人-牛PIV包含部分或全部的"背景"PIV基因组或反基因组，其来自或其构建自组合有另一种PIV株或血清型病毒的一个或多个异源基因或基因组区段的人或牛PIV株或血清型病毒，形成人-牛嵌合PIV基因组或反基因组。本发明的某些方面，嵌合PIV含有组合了牛PIV—个或多个异源基因或基因组区段的人PIV的背景基因组或反基因组。本发明的另一些方面，嵌合PIV含有组合了人PIV—个或多个异源基因或基因组区段的牛PIV(BPIV)的背景基因组或反基因组。典型的，这种部分或全部的背景基因组或反基因组作为受体骨架或载体，在其上加入来自人或牛PIV对应部分的异源基因或基因组区段。来自人或牛PIV对应部分的异源基因或基因组区段代表"供体"基因或多核苷酸，组合有或替代进该背景基因组或反基因组，产生与亲代PIV之一或与全部亲代PIV相比，具有新表型特点的人-牛嵌合PIV。例如，异源基因或基因组区段在一个选择的受体PIV株中的附加和替代，与未改变的受体和/或供体相应的表型相比，可能导致减毒增强或降低、生长变化、改变的免疫原性或其它希望的表型变化。可用于本发明嵌合人-牛PIV中异源插入和附加的基因和基因组区段包括，编码PIVN，P，C，D，V，M，F，SH，(如适合)，HN和/或L蛋白或其部分的基因或基因组区段。调节区域(如基因外3'前导区或5'非转录尾区、基因间隔区)也可用作异源替代或附加序列。部分或完整PIV背景基因组或反基因组中，异源基因或基因组区段可以在相应于其对应物的野生型基因位置上被加入或替代，而其对应的基因或基因组区段被替代或移位(如，移位于离启动子更远的位置)。另一些实施方案中，部分或完整PIV背景基因组或反基因组中，异源基因或基因组区段可以在比其对应的野生型基因或基因组区段的排列位置更接近或远离启动子的位置上加入或替代，分别可以增强或降低该异源基因或基因组区段的表达。产生的人-牛嵌合PIV的异源免疫原蛋白、结构域和表位的引入尤其适用于在免疫化宿主中产生新的免疫应答。来自供体PIV的免疫原基因或基因组区段，对不同株的PIV受体基因组或反基因组的添加或替代产生的免疫应答抗供体亚型或株、受体亚型或株、或针对二者。为达到这一目的，构建表达嵌合蛋白的人-牛嵌合PIV，如特异于一种PIV的免疫原蛋白，其细胞质尾和/或跨膜区，与特异于另一种PIV胞外域融合产生人-牛融合蛋白，或具有两种不同人PIV结构域的融合蛋白。优选实施方案中，人-牛嵌合PIV基因组或反基因组在重组病毒颗粒或亚病毒颗粒中编码同时具有人和牛二者的糖蛋白结构域或免疫原性表位的糖蛋白。例如，编码人PIVHN或F糖蛋白的糖蛋白胞外域的异源基因组区段，可以与编码相应牛PIV3HN或F糖蛋白的胞质结构域或跨膜结构域的多核苷酸序列(即，基因组区段)相连，形成人-牛嵌合PIV基因组或反基因组。其它一些实施方案中，用于疫苗制剂中的人-牛嵌合PIV可容易地被改变，以适应循环病毒的抗原漂移。典型的，改变发生在HN和/或F蛋白中。这可能包括一个或多个点突变的引入；可能包括一种PIV株或组的HN或F全基因，或编码特定免疫原区的一个基因组区段，通过替代不同PIV株或组受体克隆的相应区段，或通过添加该基因的一个或多个拷贝，引入嵌合PIV基因组或反基因组cDNA，产生多抗原形式。修饰后的PIV克隆的子代病毒可以用于抗一些PIV株的疫苗制剂。人PIV的编码和非编码序列(如启动子、基因末端、基因起始、基因间区或其它顺式作用元件)经对应的异源部分替代后，产生具有多种可能的减毒或其它表型的嵌合PIV。特别的，宿主范围和其它期望表型来自用牛或鼠PIV(MPIV)蛋白、蛋白结构域、基因或基因组区段引入人PIV背景中，由于牛或鼠基因在人细胞中不能有效作用(如，由于异源序列或蛋白与生物交互作用的人PIV序列或蛋白(即通常与替代序列或蛋白协作，参与病毒转录、翻译、装配等的)序列或蛋白不相容，或更典型的，与许可和较不许可的宿主间的宿主范围限制有差异的一种细胞蛋白或细胞环境的其它方面不相容)。在模式实施方案中，基于已知的牛和人PIV结构和功能方面，选择牛PIV序列引入人PIV。HPIV3是单负链病毒目副粘病毒科呼吸道病毒属的成员(Collins等，1996，同上)。HPIV3是HPIV的最佳代表，代表HPIV的原型。其基因组为负义的单链RNA，长度为15462个核苷酸(Galinski等，Virology165:499-510,1988;禾QStokes等.VirusRes.25:91-103.1992;分别在此引用作为参考)。PIV3基因组至少编码8个蛋白质核壳蛋白(N)、核壳磷蛋白(P)、未知功能的C和D蛋白、基质蛋白M、融合糖蛋白F、血凝素-神经氨酸酶糖蛋白HN、和一个大聚合酶蛋白(L)(Collins等，1996，同上)。可能也表达包含P基因内VORF的蛋白(Durbin等,Virology261:319-333,1999)。M、HN、F蛋白是包膜相关的，后两个是表面糖蛋白，对每个PIV蛋白一样，是主要的中和和保护性抗原(Collins等，1996，同上)。在各种PIV中可比较的HN或F蛋白的显著序列差异被认为是这种保护免疫特异性的基础(Collins等，1996，同上；Cook等，Amer.Jour.Hvg.22:150-159，1963;Ray等.J.Infect.Dis.162:746-749,1990;分别在此引用作为参考)。除了包含4个ORF(艮卩P、C、D、V)的PmRNA夕卜，HPIV3基因分别以编码单个蛋白的单mRNA转录(Galinski等，VirologyiM:543-550,1992;和Spriggs等，J.Gen.Virol.67:2705-2719,1986;分别在此引用作为参考)。在该mRNA中，P和C从独立但重叠的ORF中翻译。尽管所有的副粘病毒都编码P蛋白，只有呼吸道病毒和麻疹病毒属编码C蛋白。病毒个体在表达的C蛋白数量上不同，在体内和体外病毒复制的重要性方面也不同。仙台病毒(SeV)从CORF不同位点启动，表达出四种蛋白C，、C、Yl、Y2，其翻译起始点以mRNA中的顺序出现(Curran等，Enzyme4^:244-249，1990;Lamb等，TheParamyxoviruses,D.Kingsbury,PP.181-214，白金出版社，纽约，1991;分别在此引用作为参考)，而HPIV3和麻疹病毒(MeV)仅表达一个单独的C蛋白(Bellini等，J.Virol.11:908-919，1985;Sanchez等，Virology147:177-186,1985;和Spriggs等，1986，同上，分别在此引用作为参考)。PIV3D蛋白是P和DORF的融合蛋白，通过共转录RNA编辑加工，从P基因中表达，其在RNA编辑位点处将两个非模板G残基加入了mRNA中(Galinski等，1992,同上；和Pelet等，EMBOJ.辺:443-448，1991，分别在此引用作为参考)。副粘病毒中唯一表达D蛋白的BPIV3，利用RNA编辑表达该蛋白和第二蛋白，V蛋白。呼吸道病毒、麻疹病毒和Rubulavirus属的几乎所有成员都表达V蛋白。唯一确定不表达的是HPIV1，因其缺少完整的VORF(Matsuoka等，J.Virol.M:3406-3410,1991，在此引用作为参考)。VORF的特征是存在高度保守的半胱氨基酸丰富区(Cattaneo等，^:759-764,1989;Park等，J.Virol.^:7033-7039，1992;Thomas等，￡^11M:891-902，1988;和Vidal等，J.Virol.64:239-246,1990;分别在此引用作为参考)。对存在于各HPIV3病毒的VORF测序结果表明该ORF表达并维持病毒功能(Galinski等，Virology155:46-60,1986;Spriggs，1986，同上；禾口Stokes等，1992，同上；分别在此引用作为参考)。一个非模板G残基加入RNA编辑位点后，BPIV3V蛋白表达(Pelet等，1991,同上，在此引用作为参考)。但HPIV3中，两个翻译终止子存在于编辑位点和VORF之间，仍不清楚是否HPIV3是该ORF不表达的另一个例子，或是否其以另一种机制表达。一种可能性是HPIV3编辑还发生在P基因下游的第二处，尽管在细胞培养中没有发现(Galinski等，1992，同上)。或者，可能核糖体通过移码接近VORF。这类似MVP位点的情况。MV表达C、P、V蛋白，但也表达从PORF至UVORF的移码突变所合成的一个新的R蛋白(Liston等，J.Virol.巡:6742-6750,1995，在此引用作为参考)。遗传证据表明HPIV3的VORF是有功能的(Durbin等，1999，同上)。尽管仍不清楚HPIV3表达V的方式，其VORF在不同株之间的极度保守暗示其确实是表达的。V蛋白的功能不十分明确，但V-负型(V-mi皿s)的MV和SeV重组体在体内可以有效复制，但在体外复制降低(Delenda等，Virology211:55-62,1997;Delenda等，J.Virol.,:327-337，1998,同上；Kato等，1997a,同上；Kato等，J.Virol.21:7266-7272，1997b;禾卩Valsamakis等,J.Virol.72:7754-7761,1998;分别在此引用作为参考)。PIV的病毒基因组也具有基因外前导序列和非转录尾序列，包含病毒复制和转录所必须的全部或部分启动子，以及非编码区和基因间隔区。因此，PIV遗传图以3'-前导序列-N-P/C/D/V-M-F-HN-L-5'非转录尾序列表示。一些病毒，如猕猴病毒5和腮腺炎病毒，在F和HN之间编码一未知功能的小疏水蛋白(SH)。转录从3'起始并通过在基因边缘处短的保守结构域指导下的顺序终止-起始机制进行。每个基因的上游末端具有一个基因起始信号(GS)，指导其各自基因的起始。每个基因的下游末端具有一个基因终止信号(GE)，指导其各自基因的多腺苷酸化和终止。对人PIV3JS株(Genbank接入号Z11575，在此引用作为参考)禾口Washington株(GalinskiM.S.,TheParemyxoviruses,Kingsbury,D.W.eds,pp.537-568,白金出版社，纽约，1991;在此引用作为参考)，牛PIV3910N株(Genbank接入号D80487,在此引用作为参考)的模式序列进行了描述。此处所用术语"PIV基因"一般指PIV基因组编码mRNA的部分，典型地，以基因起始信号(GS)开始于上游末端，以基因终止信号(GE)结束于下游末端。术语PIV基因也称为"翻译读码框"或ORF，特别当一种蛋白，如C，表达自附加的ORF而非独特的mRNA。为了构建本发明人-牛嵌合PIV基因，需要整体或部分地缺失、插入或替代一个或多个PIV基因或基因组区段。意味着，整体或部分的缺失、插入或替代包括一个或多个PIV基因或基因组区段的读码框或顺式作用元件。"基因组区段"是指PIV基因组上任意长度的连续核苷酸，可以是ORF、基因或基因外区域、或其组合的一部分。本发明包括一种基于HPIV和BPIV3间嵌合体的、发展活减毒PIV候选疫苗的方法。嵌合体的构建通过一种基于cDNA的病毒回收系统。从cDNA中获得的重组病毒独立复制，并以与生物学来源的病毒同样方式增殖。本发明优选的人-牛嵌合PIV候选疫苗，在一个或多个BPIV3基因或基因组区段的替代或附加导致的减毒的背景下，带有一个或多个人PIV如HPIV1、HPIV2和/或HPIV3的一个或多个主要抗原决定簇。尽管其它蛋白可能也参与保护性免疫应答，PIV的主要保护性抗原是其HN和F糖蛋白。因此，本发明提供使用作抗PIV疫苗的野生型或突变亲代病毒减毒的新基础，这种减毒基于BPIV和HPIV之间一个或多个基因或基因组区段的引入所产生的宿主范围效应。BPIV和HPIV之间有许多核苷酸和氨基酸的差异，并反映为宿主范围效应。例如，HPIV3和BPIV3之间以下蛋白的氨基酸相同率为N(86%)、P(65%)、M(93%)、F(83%)、HN(77。/。)和L(91%)。宿主范围差异例如，HPIV3在猕猴中高度许可地生长，而BPIV3的两个不同株系复制是限制性的(vanWykeCoelingh等，1988，同上)。尽管仍不了解HPIV3和BPIV3之间宿主范围差异的基础，可能包括多个基因和氨基酸的差异。多基因(可能有顺式调节序列)的参与，其中又有多个氨基酸和核苷酸的差异，造成了减毒的广泛基础，这很难通过回复突变实现。这与其它因一个或几个点突变造成减毒的活的减毒HPIV3病毒是相反的。这种情况时单个突变的回复可能导致显著的毒性恢复，或对于单个残基所决定的减毒，导致毒性的完全回复。以下说明的本发明的模式实施方案中，背景基因组或反基因组是HPIV基因组或反基因组，异源基因或基因组区段是来自BPIV3Ka或SF(其氨基酸序列有99%的相关性)的N0RF。HPIV3背景反基因组的NORF由BPIV3NORF的对应部分替代，产生新的重组人-牛PIVcDNA克隆。HPIV3的HPIV3NORF由BPIV3Ka或SF替代产生的蛋白与HPIV3N有约70。/。的氨基酸差异(取决于所涉及的毒株)。N是非常保守的蛋白之一，其它如P之类的蛋白替代(单独或组合)可能导致更大的氨基酸差异。多基因或基因组区段的参与(各具有许多核苷酸和氨基酸的差异)提供了高度稳定、难以回复突变的减毒的基础。这种减毒方式与目前利用一个或更多点突变产生减毒的HPIV候选疫苗截然相反，不会因单个突变的回复导致显著的，或完全的毒性恢复。此外，几种已知的HPIV上的点突变典型地产生温度敏感型表型。与温度敏感相关的减毒存在的一个问题是，该病毒在下呼吸道的复制被过度限制，而在上呼吸道减毒。这是因为呼吸道内的温度梯度，下呼吸道温度高(因此限制性更强)、上呼吸道温度低(限制性低)。减毒病毒在上呼吸道的复制导致复杂症状，包括鼻塞、鼻炎、发热和中耳炎，而在上呼吸道过度的减毒使免疫原性降低。因此，仅通过温度敏感突变产生的减毒是不理想的。相反，本发明人-牛嵌合PIV中的宿主范围突变多数情况下不产生温度敏感性。因此，与其它已知的PIV候选疫苗相比，本发明提供的PIV减毒的新方法遗传上和表型更稳定，更不可能与上呼吸道中残留毒性相关。令人惊讶的是，NORF替代了的HPIV3/BPIV3的Ka和SF嵌合重组体都是活性的。BPIV3Ka或SF株的N蛋白分别与HPIV3JS株的515个氨基酸有70个的差异。因此，未料道有如此大氨基酸差异的牛N蛋白可以与HPIV3RNA，或其它组成功能性复制/转录酶的蛋白相互作用。同样令人惊讶的是，与HPIV3和BPIV3亲代相比，Ka禾卩SF嵌合病毒，在细胞培养中同样有效复制，这显示，嵌合重组体没有表现出在体内限制复制的基因不相容性。这种在体外有效复制的特性很重要，因其许可高效的生物制备。基于以下的研究观察到其它令人惊讶的现象，只带有一个牛基因的HPIV3/BPIV3的Ka和SF嵌合重组体(称为cKa和cSF)，在猕猴呼吸道中表现出和其BPIV3亲本程度相当的宿主范围限制。特别是与HPIV3相比，该cKa和cSF病毒在猕猴上呼吸道中，其复制分别约降低了60和30倍。基于这一结果，本发明人-牛嵌合PIV中的其它BPIV3基因可能赋予期望的宿主范围限制。因此，根据该方法，可在HPIV和BPIV异源基因或基因组区段中发现一系列减毒的决定簇，它们可以以适当的组合在选择用于疫苗的人-牛嵌合PIV提供理想水平的宿主范围限制和免疫原性。在优选的疫苗重组子中，以在PIV对人感染的认可的动物模型(如仓鼠和猕猴)上/下呼吸道中的复制为特征的减毒，与相应的野生型或突变亲本PIV株的生长相比，降低约2倍，经常是约5、10、20倍，优选50-100倍，多至IOOO倍或更高(如，感染后3陽8天检确定了本发明人-牛嵌合PIV提供的未预期的性质和优势，cKa和cSF都能在猕猴呼吸道中诱导高水平的抗HPIV3的保护，尽管这些病毒在人PIV感染和保护的模型中表现复制的极度限制。特别的，这些病毒中任何一个前期的感染，在上/下呼吸道中，都可诱导对rJS感染病毒复制的高水平抗性。与未接种的对照猴相比，cKa对猴的感染诱导高水平的保护，表现为比上呼吸道中野生型HPIV3(rJS)的复制降低300倍，在下呼吸道中降低IOOO倍。感染cSF的猴，与未接种的对照猴相比，比上呼吸道中野生型HPIV3(rJS)的复制降低2000倍，在下呼吸道中降低1000倍。cKa或cSF诱导的保护，与从前感染了牛或人PIV亲本的猴相当。因此，本发明人-牛嵌合PIV的感染在猴的上/下呼吸道中提供高水平的保护，这两个嵌合病毒都是有前景的候选病毒。在其它优选的病毒重组子中，人-牛嵌合PIV的免疫原活性用来平衡减毒水平，以获得候选病毒，典型的标志是攻击病毒复制的降低，如rJS，在上/下呼吸道中降低约50-100倍，100-500倍，优选约500-2000倍，多至3000倍，或更高(如，攻击后3-8天检测)。因此，本发明的重组疫苗病毒保持免疫原活性的同时，也表现复制和生长的降低。这种令人惊讶的表型特征对疫苗的发展是非常有利的。BPIV3两个株系的N基因赋予HPIV3在猕猴中的减毒表型的观察显示，这可能是其它BPIV3株系N基因所共有的性质。相应的，本发明的方法中，BPIV的任何基因或基因组区段，单个，或与一个或多个BPIV基因或基因组区段组合，可与HPIV序列组合产生适合作为疫苗病毒使用的HPIV3/BPIV3嵌合重组病毒。优选实施方案中，所有的HPIV(包括HPIV1、HPIV2、HPIV3和其突变株系)都可以作为减毒的BPIV基因或基因组区段的受体。一般，选择用于HPIV3/BPIV3嵌合病毒中的HPIV基因应包括一个或多个保护性抗原，如HN或F糖蛋白。本发明其它的人-牛嵌合PIV应包括HPIV1或HPIV2的保护性抗原决定簇。例如，可以使HPIV1或HPIV2的HN和/或F基因在减毒的HPIV/BPIV嵌合重组病毒中，以额外的基因表达。或者可以利用HPIV3/HPIV1或HPIV3/HPIV2抗原嵌合病毒(其中HPIV1或HPIV2的HN和/或F基因替代了PIV3中的对应部分)(Skiadopoulos等，1999a,同上；Tao等，1999,同上；1998年5月22日的美国专利申请09/083,793;分别在此引用作为参考)，作为一个或多个异源减毒的牛基因或基因组区段(如Ka或SFN基因或基因组区段)的受体或背景病毒。这种抗原嵌合病毒因牛N基因的存在而减毒，但可诱导对HPIV1或HPIV2病毒的免疫。文中利用PIV3cDNA拯救系统获得了嵌合的PIV1疫苗，艮口，在包含3个L处减毒突变的PIV3全长cDNA上，将PIV3的HN和F的读码框替换为PIV1的。来自此cDNA的重组嵌合病毒定名为rPIV3-l.cp45L(Skiadopoulos等，1999a，同上；Tao等，1998,同上；Tao等，1999，同上)。rPIV3-l.cp45L在仓鼠中是减毒的，并诱导对PIV1攻击的高水平抗性。也得到了另一个定名为rPIV3-lcp45的重组嵌合病毒，带有15个cp45突变中的12个(g卩，不具有HN和F中的突变)，在仓鼠上下呼吸道中高度减毒(Skiad叩oulos等，1999a,同上)。其它HPIV/BPIV嵌合重组体包括两个或多个BPIV基因或基因组区段，以任何组合，甚至包括除了选定的基因、或选自HN或F基因或基因组区段抗原决定簇(来源于HPIV1、HPIV2或HPIV3)外的全部BPIV基因组。本发明其它的实施方案定向于具有其它动物PIV(如鼠PIV1、狗SV5PIV2病毒、或其它鸟类或哺乳动物的PIV)的减毒基因和HPIV骨架(或包括来自HPIV1、HPIV2和/或HPIV3的嵌合HPIV骨架)组合的人-牛嵌合PIV。本发明的其它详细方面，被用作异源病原(包括其它PIV、非-PIV和非病毒性病原)保护性抗原的载体。人-牛嵌合基因组或反基因组包括部分或完全的PIV"载体基因组或反基因组"，其组合了编码一个或多个异源病原的一个或多个抗原决定簇的一个或多个异源基因或基因组区段(参见，如1999年12月10日Murphy等的美国临时专利申请60/170,195，在此引用作为参考)。文中的异源病原可以是异源PIV，该异源基因或基因组区段可被选择编码一个或多个PIVN、P、C、D、V、M、F、SH(如适用)、HN和/或L蛋白，以及蛋白质结构域、片段和免疫原区或表位。构建的PIV载体疫苗可诱导多特异性的免疫应答，并可与其它疫苗制剂同时，或以协同方式给药。本发明的模式实施方案中，人-牛嵌合PIV包括是部分或完全的HPIV基因组或反基因组的载体基因组或反基因组，其组合了，或改变以使其具有，包含一个或多个异源PIV抗原决定簇的一个或多个异源基因或基因组区段(包括来自HPIV1、HPIV2或HPIV3的异源HPIV)。本发明的更详细方面，该载体基因组或反基因组是部分或完全的HPIV3基因组或反基因组，而编码抗原决定簇的异源基因或基因组区段是一个或多个异源的HPIV的。典型的，这种嵌合的基因组或反基因组包含决定减毒的BPIV的一个或多个基因或基因组区段。本发明的模式实施方案中，人-牛嵌合PIV包括在部分或完全的HPIV3载体基因组或反基因组内，编码一个或多个HN和/或F糖蛋白，或抗原结构域、其片段或表位的一个或多个HPIV1或HPIV2基因或基因组区段。在更具体的方面，编码HN和F糖蛋白的HPIV1基因替代对应的HPIV3HN和F基因，形成嵌合HPIV3-1载体基因组或反基因组。这种重组构建体可用于直接生产疫苗病毒，或通过加入或引入编码一个或多个抗原决定簇的一个或多个基因或基因组区段，做进一步修饰。这种用于生产疫苗病毒的构建体典型的包含一个或多个决定减毒的异源BPIV基因或基因组区段，例如，编码减毒BPIV蛋白(如N)的读码框(ORF)。本发明的一些人-牛嵌合PIV，可用做载体，生产抗HPIV2的疫苗，如，含有HPIV2HN基因读码框(0RF)的一个转录单位加入或引入嵌合的HPIV3-1载体基因组或反基因组中，嵌合的构建体因BPIV基因或基因组区段的引入而减毒。本发明的相关方面，载体基因组或反基因组是部分或完全的BPIV基因组或反基因组，编码抗原决定簇的异源基因或基因组区段是一个或多个异源的HPIV的。典型的，抗原决定簇选自HPIV1、HPIV2或HPIV3HN和F糖蛋白，但抗原结构域、其片段或表位也有作用。一些实施方案中，在部分或完全的BPIV载体基因组或反基因组中，加入或用之替代编码一个或多个HPIV2抗原决定簇的一个或多个基因或基因组区段。或者，在部分或完全的BPIV载体基因组或反基因组中，加入或导入编码多HPIV抗原决定簇的多个异源基因或基因组区段。本发明的另一些方面，提供了作为广泛非PIV病原载体的人-牛嵌合PIV(参见，如1999年12月10日Murphy等的美国临时专利申请60/170,195，在此引用作为参考)。本发明的这方面使用的载体基因组或反基因组可包含部分或完全的BPIV或HPIV基因组或反基因组，异源病原可选自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒的亚型A和B、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒1型和2型、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、EB病毒、线状病毒、布尼亚病毒、黄病毒、甲病毒和流感病毒。例如，构建本发明人-牛嵌合PIV的BPIV或HPIV载体基因组或反基因组可能包含选自麻疹病毒HA和F蛋白的异源抗原决定簇，或抗原结构域、其片段或表位。模式实施方案中，含有麻疹病毒HA基因读码框(ORF)的一个转录单位加入或引入BPIV或HPIV载体基因组或反基因组中。另外，本发明其它的人-牛嵌合PIV可用作载体，从呼吸道合胞病毒(RSV)中引入异源抗原决定簇，例如，通过引入编码RSVF和/或G糖蛋白或其免疫原结构域或表位的一个或多个基因或基因组区段。文中所述RSVcDNA的克隆及其它在以下文献中作了描述1995年9月27日美国临时专利申请60/007,083;1996年9月27日美国专利申请08/720,132;1996年7月15日美国临时专利申请60/021,773;1997年5月9日美国临时专利申请60/046,141;1997年5月23日美国临时专利申请60/047,634;1997年7月15日美国临时专利申请08/892,403(相应于国际公开WO98/02530);1999年4月13日美国临时专利申请09/291,894;1999年4月13日美国临时专利申请60/129,006;Collins,等，同上；Bukreyev等，J,Virol,70:6634-6641、1996;Juhasz等，1997，同上；Durbin等，1997a,同上；He等，1997，同上；Baron等，1997,同上；Whitehead等，1998a，同上；Whitehead等，1998b，同上；Jin等，1998,同上；Whitehead等，1999,同上；Burkreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:2367-2372,1999;为各种目的在此全文引用作为参考)。根据本发明的这方面，提供了至少包括一个来自异源PIV或非PIV病原抗原决定簇的人-牛嵌合PIV。例如，一个或多个HPIV3的单个基因或基因组区段可被来自人RSV对应的基因或基因组区段替代，或RSV的基因或基因组区段可以额外基因的形式插入或添加。或者，一个被选定的异源基因或基因组区段(如编码RSV糖蛋白细胞质尾、跨膜区或胞外域)替代了HPIV3中相同基因，或HPIV3中不同基因内的对应部分，或者加入HPIV3基因组或反基因组的非编码区，产生嵌合的PIV-RSV糖蛋白。一种实施方案中，人RSVF基因的一个基因组区段替代了对应的HPIV3基因组区段，产生编码嵌合蛋白的构建体，如，PIV的胞质尾和/或跨膜区融合了RSV的胞外域，产生一种新的减毒病毒，禾口/或抗PIV/RSV二者的多价疫苗。如上所述，通过引进可增加或降低减毒，或改变嵌合病毒表型的额外突变，可以调整本发明人-牛嵌合PIV的减毒表型，这是所期望的。作为本发明的附加方面，提供了从cDNA中获得重组PIV的材料和方法的详细描述，以及此处提出的制造和检测全部的突变和核苷酸改变的方法Durbin等，1997a，同上；1998年5月22日美国专利申请09/083,793;1997年5月23日美国临时专利申请60/047,575(相应于国际申请WO98/53078);1997年9月19日美国临时专利申请60/059,385;分别在此引用作为参考。特别的，这些文件说明了诱变、分离和定性PIV以获得减毒突变株(如温度敏感(ts)、冷传代(cp)、冷适应(ca)、小噬斑(sp)、和宿主范围限制(hr)突变株)，及发现决定该减毒表型的遗传变化的方法和步骤。与这些方法一致，这些文件详细说明了，在认可的模型系统中(包括鼠和非人灵长类动物模型系统)，确定生物学来源的和重组产生的减毒人PIV的复制、免疫原性、遗传稳定性和有效保护性的方法。此外，这些文件说明发展和检测用于预防和治疗PIV感染的免疫原组合物(包括单价和二价疫苗)的一般方法。以上引用的文件中也说明了产生感染重组PIV的方法，即，构建和表达编码PIV基因组或反基因组的cDNA并与必需PIV蛋白基因共表达，还包括可用于产生感染PIV病毒克隆的以下模式质粒p3/7(131)(ATCC97990);p3/7(131)2G(ATCC97889);禾Bp218(131)(ATCC97991);依据布达佩斯条约，分别保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801，UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209，USA)，以上提供了保藏号。以上引用的文献中也揭示了构建和评估经修饰的感染性重组PIV，其引入了在生物学来源的PIV突变体中发现的表型特异性突变(如冷传代(cp)、冷适应(ca)、宿主范围限制(hr)、小噬斑(sp)、和/或温度敏感(ts)突变株，如JSHPIV3cp45突变株)。其它减毒突变可能没有辅助的表型标志。在这些突变株中发现的突变可以容易地用于人-牛嵌合PIV。在模式实施方案中，聚合酶L蛋白上有一个或多个减毒突变，如在相应于JScp45的Tyr942、Leu992、1^1558上，优选将这些突变通过生物突变体的相同或保守的氨基酸替代，引入本发明人-牛嵌合PIV中。因此，PIV重组体可能包括一个Tyr942被His替代、Leu992被Phe替代和/或Thns5s被Ile替代的突变。对于这些替代氨基酸保守的替代可用于产生期望的突变表型。来自生物学来源的PIV突变体的其它模式突变包括N蛋白的一个或多个突变，包括在相应于JScp45残基Val96、Ser，处的氨基酸替代。在详细的方面，这些突变代表了Val96到Ala，或Ser^9到Ala，或其保守的替代。本发明重组PIV中有用的氨基酸替代还发生在C蛋白上，如在相应于JScp45的11e96上的突变，优选由11e96的相同或保守的替代突变为Thr。来自生物学来源的PIV突变体的其它模式突变包括M基因的一个突变，如JScp45的Pro199，或F蛋白的多个突变，包括在JScp45上相应于JScp45残基Ile420或Ala450处，优选由Ile420到Val、八1&45()到Thr的替代或保守替代。本发明其它人-牛嵌合PIV采用HN蛋白的一个或多个氨基酸替代，以下为范例，重组PIV采用了相应于JScp45残基Val384处的一个突变，优选由Val384到Ala的替代。本发明这方面的其它例子包括这种人-牛嵌合PIV，其在PIV基因组或反基因组非编码部分(如3'端前导区)具有一个或多个突变。文中的突变范例可在重组病毒3'前导序列(相应于JScp45核苷酸23、24、28或45)的位置上工程化。其它的突变范例可在重组病毒N基因起始序列工程化，如通过改变N基因起始序列一个或多个核苷酸，如在相应于JScp45核苷酸62的位置处。更详细的方面，人-牛嵌合PIV在核苷酸23处由T变为C，在核苷酸24处由C变为T，在核苷酸28处由G变为T，和/或在核苷酸45处由T变为A。在基因外序列中的其它突变的例子是N基因起始序列在相应于JScp45核苷酸62位置处由A变为T。可在本发明人-牛嵌合PIV中工程化的突变范例成功地被工程化，并在重组PIV中恢复，如以下重组PlV:rcp45、rcp45L、rcp45F、rcp45M、rcp45HN、rcp45C、rcp45F、rcp453'N、rcp453'NL禾口rcp453，NCMFHN(Durbin等，1997a，同上；Skiadopolos等，1998,同上；Skiadopolos等，J.Virol.73:1374-1381,1999b;1998年5月22日美国专利申请09/083,793;1997年5月23日美国临时专利申请60/047,575(相应于国际公开WO98/53078);1997年9月19日美国临时专利申请60/059,385;分别在此引用作为参考)。此外，以上引用的文献描述了嵌合重组体PIV(如在部分HPIV3背景基因组或反基因组中，有HPIV1HN和F基因的替代)的构建，进一步改变以带有HPIV3JScp45中发现的一个或多个减毒突变。这种嵌合重组体具有cp45L基因中发现的所有减毒突变。之前显示了所有除异源(HPIV1)HN和F基因外的cp45突变可以引入HPIV3-1重组体，产生减毒的嵌合候选疫苗。从JScp45和其它生物学来源的PIV突变体，得到了减毒突变的大"菜单"，其中每个突变都可以与其它突变组合，调节带有C、D和/或V基因缺失或剔除突变的重组体PIV的减毒、免疫原性和遗传稳定性的水平。文中，本发明许多重组PIV包括一个或多个，优选两个或更多来自生物学来源的PIV突变体的突变，如JScp45中发现的突变之一或组合。优选的本发明重组体PIV具有多个和至多全部JScp45，或其它生物学来源的PIV突变体中发现的突变。优选的，由于在特定于每个突变的密码子处有多个核苷酸替代，这些突变在人-牛嵌合PIV中稳定地抗回复突变。其它可引入本发明人-牛嵌合PIV的突变是存在于异源PIV或更远源的非区段化负链RNA病毒的突变，如减毒突变。特别的，负链RNA病毒中的减毒或其它期望的突变可被"转移"，如通过在人-牛嵌合PIV基因组或反基因组相应位点中引入突变。简要的，一个异源负链RNA病毒中期望的突变被转移到PIV受体(如分别牛或人PIV)。包括在异源病毒中定位该突变，通过序列对比识别受体RSV中相应位点，将PIV受体的天然序列突变为该突变基因型(通过相同或保守突变)，以下文献中作了说明2000年4月12日的PCT/US00/09695，和其优先权1999年4月13日的美国临时专利申请60/129,006，在此引用作为参考。如这些文献所述，优选修饰在突变位点编码改变的受体基因组或反基因组，其保守地相应于异源突变病毒中的改变。例如，如果突变病毒中相对于野生型序列的一个氨基酸替代标记为突变的一个位点，则重组病毒相应残基处可工程化产生一个相似的替代。优选，该替代应包括一个与突变病毒蛋白中替代残基相同或保守的氨基酸。但对于突变蛋白中的替代残基，也可能非保守地改变突变位点的天然氨基酸(如利用其它氨基酸破坏或消弱野生型残基的功能)。在其中发现模式突变并转移于本发明人-牛嵌合PIV中的负链RNA病毒包括其它PIV(如HPIV1、HPIVHPIV2、HPIV3、HPIV4A、HPIV4B、BPIV3)、RSV、仙台病毒(SeV)、新城疫病毒(NDV)、猿猴病毒5(SV5)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒、犬瘟热病毒(CDV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)等。本发明使用的多种突变范例在以上引用的文献中做了说明，包括但不限于RSVL蛋白521处苯丙氨酸替代，其相应于HPIV3L蛋白456处苯丙氨酸(或保守性相关的氨基酸)替代并由此可转移为后者。在标志为缺失或插入的突变中，可以作为相应的缺失或插入，引入在背景基因组或反基因组中，或被引入基因的异源基因或基因组区段中，引入重组病毒。缺失或插入蛋白片段的大小和氨基酸序列不一。本发明中其它的人-牛PIV候选疫苗可以通过将嵌合PIV基因组或反基因组编码的一个类似突变改变为仙台病毒(SeV)中发现的减毒突变来获得。一个例子中，该减毒突变包含sevc蛋白no处苯丙氨酸的一个氨基酸替代。改变该PIV基因组或反基因组，以编码一个保守残基的变动，其与异源SeV突变体中标志该减毒突变的变动保守相关。一个实施方案中，该突变引入重组HPIV3的一个蛋白中，包括HPIV3C蛋白164处苯丙氨酸的一个氨基酸替代。各种靶蛋白可用于在本发明嵌合的人-牛PIV中相应位点上引入来自一个负链RNA病毒的减毒突变。在单负链病毒目中，5个耙蛋白是高度保守的，在特定区域或结构域显示出中等至高度的序列同一性。特别的，该目中所有已知成员都具有同源的五个蛋白核壳蛋白(N)，核壳磷蛋白(P)，非糖基化的基质蛋白(M)，至少一个表面糖蛋白(HN、F、H或G)和一个大的聚合酶蛋白(L)。这些蛋白都代表引入减毒突变的有用靶，即在相应于异源突变病毒中发现的减毒突变位点处，改变重组病毒蛋白的一个或多个保守残基。文中，将异源突变转移到本发明嵌合的人-牛PIV中的方法是基于在第一负链RNA病毒中发现一个减毒突变。该突变，由于其在标志突变位点处氨基酸序列与野生型中的不同而被发现，提供了对作为重组减毒靶点的嵌合病毒中的同源蛋白序列(在背景基因组或反基因组中，或其加入或替代的异源基因或基因组区段中)的比较指标。该减毒突变可以是已知的，或可利用用于产生和表征生物学来源突变病毒的诱变和反向遗传技术来识别。或者，目的减毒突变可通过如定点诱变和传统的筛选技术重新产生和定性。负链RNA病毒中发现的每个减毒突变提供了对一个或多个异源负链病毒中同源蛋白进行序列比较的指标。文中，分析了现有的序列，也利用传统的序列分析方法得到用于分析的序列比较，检出具有减毒突变的蛋白和作为减毒靶重组病毒的不同病毒的同源蛋白之间相应的蛋白区域和氨基酸位点。当标志该减毒突变的一个或多个残基改变了其"野生型"的特征(其在靶人-牛嵌合病毒蛋白的相应位置处是保守的)时，靶病毒的基因组或反基因组被重组地改变，编码氨基酸的缺失、替代或插入，改变靶病毒蛋白的保守残基，从而赋予了该重组病毒同源的减毒的表型。构建减毒重组负链病毒的合理设计的方法中，在一个负链RNA病毒中标志减毒突变的氨基酸位点的野生型的特征残基可以是严格保守，也可以在靶人-牛嵌合病毒蛋白的相应氨基酸位置处保守替代。因此耙病毒蛋白的相应残基与异源突变病毒的减毒突变所改变的野生型残基可以相同，或在氨基酸组的结构和功能上保守性相关。任何一种情况下，可以根据本发明的方法，通过改变靶病毒基因组或反基因组，使其产生改动保守残基的氨基酸缺失、替代或插入，使重组病毒中产生类似的减毒。在本发明中，优选改变所述基因组或反基因组，使其产生编码保守残基变化，其保守性地与标志所述异源突变病毒减毒突变的残基变化相应。例如，如一个氨基酸替代标志一个在突变病毒中与野生型序列差异的突变，则一个替代将在该重组病毒的相应残基处工程化。优选的，该替代应与突变病毒蛋白中被替代残基相似或保守。但至于被替代残基也可能在突变蛋白中非保守地改变突变位点的天然氨基酸，(如利用其它氨基酸破坏或削弱野生性残基的特征和功能)。对于以缺失或插入为标志的情况，可作为相当的缺失或插入转移到重组病毒，缺失或插入蛋白片段的大小和氨基酸序列不一。本发明其它方面中，异源突变负链病毒中转移的突变可能赋予本发明人-牛嵌合PIV除了期望的减毒表型外(或同时伴随有所期望的减毒表型)的多种表型。因此，病毒重组蛋白中的模式突变除了(或同时伴随有)所期望的减毒表型外，还赋予温度敏感(ts)、冷适应(ca)、小噬菌斑(sp)或宿主范围限制(hr)表型、或生长或免疫原性的改变。引入人-牛嵌合PIV的来自生物学来源PIV和其它非区段化负链RNA病毒中的减毒突变，可以天然产生或可以通过已知的诱变方法引入野生型PIV。例如，不完全减毒亲本PIV株可能通过病毒在细胞培养时添加化学诱变剂而产生，通过选择低于亚适温度时传代的病毒以诱导生长限制突变而产生，或通过选择在细胞培养中产生小噬菌斑的被诱变病毒而产生，方法在以上的引用文献中有述。"生物学来源的PIV"是指任何不通过重组方式产生的PIV。因此生物学来源PIV包括所有天然产生的PIV，包括如具有野生型基因组序列的天然产生的PIV，和具有与参照野生型RSV序列有等位基因差异或突变基因组差异的PIV，例如具有特异于减毒表型的突变的PIV。同样，生物学来源的PIV包括亲本PIV经人工诱变和选择方法获得的PIV突变株。如上所述，可以几种方式产生足够减毒的生物学来源的PIV，其中之一包括细胞培养中部分减毒的病毒在渐低的减毒温度中传代。例如，部分减毒的突变体在细胞培养低于最适温度下的传代而产生。因此调节cp突变体或其它部分减毒PIV突变株，通过在培养中传代而使其在低温培养时有效生长。与部分减毒的亲本相比，选择冷传代突变PIV显著降低了衍生株的任何残存毒性。另外，特定突变可以通过对部分减毒亲本病毒进行化学诱变来引入，如引入ts突变，或当该病毒已是ts突变时，引入额外的ts突变使足以赋予该减毒衍生物更加强的减毒和/或ts表型稳定性。ts突变引入PIV的方法包括，根据已知方法使病毒在诱变剂(如5-氟尿苷)存在时复制。产生减毒的ts突变可产生在任何PIV基因内，尽管其特别可能的靶是聚合酶(L)基因。在本发明使用的模式减毒PIV中，复制的温度敏感性的水平，是通过比较其在许可温度和在几种限制性温度时的复制来确定。将与其在许可温度时相比，复制下降100倍或更多倍的最低温度作为其截止温度。在实验动物和人中，PIV的复制和毒性都与该突变体截止温度相关。JScp45HPIV3被认为具有相对遗传稳定、高免疫原性和满意的减毒性。对这种包含多种所述单个突变和组合突变的生物学来源的和重组病毒的核苷酸序列分析显示，减毒增加的每个水平都与特定核苷酸和氨基酸相关。上述引用文献也公布了如何常规的区分偶发的沉默突变和导致因感染性PIV克隆基因组或反基因组中引入独立或组合形式突变所产生的表型差异的突变。该过程还包括对亲本和衍生病毒的表型特征进行评估，检测出导致如减毒、温度敏感、冷适应、小噬菌斑和宿主范围限制等这些期望性状的突变。这样发现的突变被集结成一个"菜单"，可以按需要以单独或组合形式引入，以调整人-牛嵌合PIV的相关性状，如减毒、免疫原性、对减毒表型回复突变的遗传抗性等。与以上所述相符，从cDNA中得到PIV的能力使可以在人-牛嵌合PIV中引入特定的工程化改变。特别的，用感染性重组PIV来检测生物学来源的减毒PIV株中特定的突变，如特定于ts、ca、att和其它表型的突变。由此识别需要的突变，并引入重组人-牛嵌合PIV疫苗株中。从cDNA中得到PIV的能力使能够将突变单独或以各种选择的组合，常规地引入全长cDNA克隆中，其后可以容易地确定具有这些引入突变的所拯救重组病毒的表型。通过在感染性PIV中鉴定并引入与期望表型(如cp或ts表型)有关的特定的生物学来源的突变，本发明提供了在鉴定的突变处，或位于其紧邻处的其它位点特异性修饰。多数生物学来源的PIV中的减毒突变是单核苷酸改变，但也可利用重组技术将其它"位点特异性"突变引入生物学来源的或重组PIV中。此处所述位点特异性突变包括1-3、多至5-15或更多已改变核苷酸(如与野生型PIV序列、选择的突变PIV株序列或经诱变的亲本重组PIV克隆不同)的插入、替代、缺失或重排。这类位点特异性突变可被引入选择的生物学来源的点突变处，或其区域内。或者，突变可以引入PIV克隆的其它区域，如在顺式作用调控区或编码蛋白活性位点、结合位点、免疫原性表位等的核苷酸序列上或其附近。位点特异性PIV突变体典型的具有一个期望的减毒突变，但也可能表现与减毒无关的其它表型，如增强或扩大的免疫原性、和/或改善的生长。位点特异性突变株的进一步范例包括在决定减毒点突变的密码子处引入额外的稳定的核苷酸突变的重组PIV。如可行，在亲本突变PIV或重组PIV克隆中决定减毒氨基酸变化的密码子处，引入两个或更多核苷酸替代，产生对减毒表型的回复具有遗传抗性的生物学来源的或重组的PIV。其它一些实施方案中，位点特异性的核苷酸替代、添加、缺失或重排被引入靶核苷酸位置的上游或下游(如从1到3、5-10，直到15个核苷酸或更靠近5'或3'的位置处)，构建或消除现有的顺式作用元件。除了单和多点突变和位点特异性突变，此处公布的人-牛嵌合PIV的变化包括一或多个基因或基因组区段的缺失、插入、替代或重排。包含一或多个基因或基因组区段的缺失尤其有用，这种缺失可产生调整本发明人-牛嵌合PIV特性的额外的期望的表型效果。因此，1999年7月9日美国专利申请09/350,821(Durbin等)说明了其方法和组合物，改变PIV基因或基因组，使其具有改变起始密码子编码性排列的突变，或引入一或多个终止密码子的突变，导致一或多个HPIV基因(以C、D和/或VORF为例)的表达被降低或消除。或者，可以整体或部分缺失一或多个C、D和/或VORF，使相应的蛋白部分或全部地失去功能，或破坏蛋白表达。在C、D和/或V或其它非必须基因处有突变的重组PIV具有发展疫苗的良好表型特征。例如，这些修饰可导致一个或多个表型变化，包括(i)细胞培养中改变的生长特性，(ii)哺乳动物上和/或下呼吸道中减毒，(iii)病毒噬菌斑大小改变，(iv)致细胞病变效应改变，(v)免疫原性改变。一个命名为rC-KO的缺乏CORF表达的模式"剔除"突变体可在非人灵长类中诱导抗野生型HPIV3攻击的保护性免疫应答，同时具有良好的减毒表型。因此，本发明更详细方面中，人-牛嵌合PIV具有在C、D和/或VORF中的缺失和剔除突变，其改变或消除了被选定基因或基因组区段的表达。其实现可通过在被选定编码序列中引入移码突变或终止密码子，改变翻译起始位点，改变基因位置或引入上游起始密码子以改变其表达速率，改变GS和/或GE转录终止信号以变化表型，或改变RNA编辑位点(如生长，转录的温度限制等)。本发明更详细方面中提供了这种人-牛嵌合PIV，其中在翻译读码框中引入多个翻译终止密码子，改变起始密码子，或改变了编辑位点，使在该基因或基因组区段没有缺失情况下，其中一个或多个基因(如C、D和/或VORF)的表达在翻译或转录水平被消除。这种形式的剔除病毒在组织培养中常出现生长速率下降和小噬菌斑。因此，这些方法提供了其它新的减毒突变类型，即消除非主要病毒保护性抗原的病毒基因的表达。文中，在没有缺失基因或基因组区段时产生的剔除病毒表型，也可通过诱发缺失突变而产生，以有效的防止可能导致靶蛋白表达恢复的纠正性突变。利用本领域业内人士已知的设计和方法可以获得几种其它C、D和/或VORF缺失的基因剔除和剔除突变体(如Kretschmer等，Virology216:309-316.1996;Radecke等，Virology217:418-421,1996;Kato等，1987a,同上；Schneider等，1997，同上；分别在此引用作为参考)。基于变化的特点(即，可能改变少量碱基以插入或消除一个免疫原性表位或改变一个小基因组区段，而大片段的碱基参与基因或大的基因组区段的添加、替代、缺失或重排)，人-牛嵌合PIV的这些和其它核苷酸修饰可以改动供体或受体基因组或反基因组中少量碱基(如，从15-30个碱基，到35-50个碱基或更多)，大片段的核苷酸(如，从50-100，100-300，300-500，500-1000个碱基或更多)，或几乎全部或全部基因(如，1000-1500，1500-2500，2500-5000个核苷酸或更多)。在相关方面，本发明提供了来自生物学来源的PIV的突变(如cp和ts突变)附加于重组PIV克隆中，在这进一步修饰的PIV克隆中伴随有涉及相同或不同基因的其它类型突变。每个PIV基因的表达水平可被选择性的改变，或整体或部分地，单独地或与其他所希望的修饰组合，添加、替代或重排基因，以获得表现新的疫苗特征的人-牛嵌合PIV。因此，除了来自生物学来源的PIV突变体的减毒突变外，或与之组合，本发明也提供了利用对感染性PIV克隆的重组工程的多种减毒或改变人-牛嵌合PIV表型的其它方法。编码靶基因或基因组区段(包括嵌合PIV基因组或反基因组中的供体或受体)的分离的多核苷酸序列上可产生多种改变，以引入感染性克隆。更特定的，本发明为了在重组PIV中获得期望的结构和表型改变，许可引入使一个或多个选自亲本基因组或反基因组的核苷酸的缺失、替代、引入或重排的修饰，以及缺失、替代、引入或重排人-牛嵌合PIV克隆内整个基因或基因组区段的突变。因此提供了人-牛嵌合PIV中仅改变或消除选定基因表达的修饰，包括，在选定PIV的编码序列中引入终止子，或改变其翻译起始位点或RNA编辑位点，改变一个PIV基因与可操作连接启动子的相对位置，引入上游起始密码子以改变其表达速率，修饰(如，通过改变位置、变动现有序列或用一个异源序列替代现有序列)GS和/或GE转录信号以改变其表型(如生长和转录时的温度限制等)，和其它特异于病毒复制、选定基因的转录或选定RNA的翻译的变化程度和性质的缺失、替代、添加和重排。文中，任何非生长所必须的PIV基因或基因组区段都可以在重组PIV中被消除或改变，以在毒性、病原性、免疫原性和其它表型特征产生期望的效果。对于编码序列，非编码、前导、非转录尾和基因间隔区也可同样被缺失、替代或改变，其表型效果可使用如微复制子和重组PIV容易地分析。此外，PIV基因组或反基因组中也可产生许多其它遗传改变，以单独或与生物学来源的突变PIV来源的一个或多个减毒突变一起，引入人-牛嵌合PIV，调整其生长、减毒、免疫原性、遗传稳定性，或其它有利的结构和/或表性效果。前述的引用文献中也公布了这些其它类型的突变，且其可容易地工程化引入本发明人-牛嵌合PIV。除了这些改变，也可改变人-牛嵌合PIV中基因的排序，PIV基因组的一个启动子被其反基因组的对应部分替代，部分基因被替代或移去，甚至整个基因缺失。制造序列中不同的或额外的改变以有利于操作，如在多个基因间隔区等处插入唯一的限制性位点。可以除去不翻译的基因以增加插入外源序列的能力。引入本发明人-牛嵌合PIV中的其它突变包括直接作用于顺式作用信号的突变，这可以利用PIV微基因组突变分析检测出。例如对前导序列、非转录尾序列和侧翼序列的插入和缺失分析检测出病毒的启动子和转录信号，并提供了一系列与RNA复制或转录下降的各种水平相关的突变。该顺式作用信号的饱和诱变(每个位点轮流改为各种核苷酸)也检测出许多影响RNA复制或转录的突变。此处所述任何突变都可插入人-牛嵌合PIV基因组或反基因组中。以上引用文献中描述的PIV微基因组可辅助用完整的反基因组cDNA对反式作用蛋白和顺式作用RNA序列的评价和操作。本发明人-牛嵌合PIV中的其它突变包括基因组3'末端被其反基因组的对应部分替代，随之改变了RNA复制和转录。一个模式实施方案中，特定PIV蛋白(如保护性HN禾口/或F抗原)的表达水平可因其天然序列被用合成并设计的符合有效翻译的序列替代而增加。文中显示，密码子的使用是哺乳动物病毒蛋白翻译水平的主要影响因素(Hans等,CurrentBiol.6:315-324，1996，在此引用作为参考)。通过重组，使编码PIVHN和F蛋白(二者是主要保护性抗原)的mRNA中使用的密码子最适，可使这些基因的表达增加。另一个模式实施方案中，改变了一个选定PIV基因的翻译起始位点(优选包括-3位置处的核苷酸)周围的序列(单独或同时引入一上游起始密码子)，因决定翻译的上/下调而改变了PIV基因的表达(Kozak等，LMol.Biol.196:947-950,1987)。另外，或与此处所述的其它变动组合，改变病毒任何选定基因的转录GS或GE信号，调节人-牛嵌合PIV的基因表达。其它模式实施方案中，人-牛嵌合PIV的基因表达调节发生在转录水平。一个方面中，将PIV基因图谱中选定基因的位置改为更为接近或远离启动子，从而该基因的表达将分别更高效或更低效。根据这方面，特定基因的表达调节产生比野生型水平降低或增加2倍，更典型的是4倍，上至IO倍或更高的基因表达，同时其交互地位置替代基因表达水平有相当量的下降。这些和其他转位变化，产生具有减毒表型的新的人-牛嵌合PIV，如由于参与RNA复制的选定病毒蛋白表达的下降，或产生具有如抗原表达增加之类的其它期望性状的嵌合PIV。本发明感染性人-牛嵌合PIV也可根据这里公布的方法和组合物进行工程化，增强免疫原性并诱导比野生型PIV或亲本PIV感染的更强的保护。例如，PIV异源株或型源的或如RSV的非PIV来源的免疫原性表位可通过在编码基因组或反基因组的多核苷酸序列上适当的核苷酸变化，被加入重组克隆。另外，本发明重组PIV可被工程化地加入或消除(如通过氨基酸插入、替代或缺失)免疫原、蛋白结构域或与期望或不期望免疫反应相关的特殊蛋白形式。本发明方法中，额外的基因或基因组区段可能被插入人-牛嵌合PIV基因组或反基因组中，或其附近。这些基因可与受体基因受相同的调控，或受一套独立转录信号的调控。目的基因包括以上说明的PIV基因和非PIV基因。目的非PIV基因包括编码细胞因子(如IL-2到IL-18，尤其是IL-2、IL-6、IL-12、IL-18等)，IL-7和富含在T辅助细胞表位中的蛋白的基因。这些额外的蛋白可作为独立蛋白或现存PIV蛋白(如HN或F)的多余拷贝表达。这能够在数量和质量上改变和提高抗PIV的免疫应答。人-牛嵌合PIV中缺失、插入、替代和其它涉及全部病毒基因或基因组区段的改变产生非常稳定的候选疫苗，在免疫抑制个体中尤其重要。这些改变多数导致减毒的疫苗株，其它则导致不同类型的期望表型改变。例如，附属(非体外生长所必须的)基因编码特异地干扰宿主免疫的蛋白，是良好的候选疫苗(参见Kato等，1997a，同上)。疫苗病毒中消除这类基因将降低毒性和致病性，并/或提高免疫原性。本发明其它方面中，提供了生产分离的感染性PIV的组合物(如具有编码人-牛嵌合PIV的cDNA的分离多核苷酸和载体)。利用该组合物和方法，感染性PIV来自一个PIV基因组或反基因组，核壳蛋白(N)，核壳磷蛋白(P)和大的聚合酶蛋白(L)。本发明相关方面中，提供了将前述结构表型改变引入重组PIV中，以产生感染性减毒的疫苗病毒的方法和组合物。可利用多种已知方法，将之前定义的突变引入感染性人-牛嵌合PIV克隆中。关于DNA的"感染性克隆"，是指合成或其它来源的cDNA及其产物，可转录出作为产生感染性病毒或病毒颗粒基因组的模板的基因组或反基因组RNA。因此，可以利用传统方式(例如定点诱变)将定义的突变引入基因组或反基因组的cDNA拷贝。使用基因组或反基因组cDNA的亚片段装配此处所述的完整基因组或反基因组cDNA的优势是，每个区域都可以分别操作(越小的cDNA越易装配)，因此易于装配出完整cDNA。因此，该完整基因组或反基因组cDNA,或其任何亚片段可用作寡核苷酸定向突变的模板。通过单链噬菌粒形式介导(如使用伯乐实验室(Richmond，CA)的Muta-gene试剂盒)，或直接用双链噬菌粒做模板(如使用Strategene(LaJolla，CA)的Chameleon诱变试剂盒)，或用包含目的突变的寡核苷酸引物或模板中任何的一个进行聚合酶链式反应。然后可以将一个突变的亚片段装配于该完整基因组或反基因组cDNA中。还有许多已知并可得的产生突变的技术，可用于在PIV基因组或反基因组cDNA中产生目的突变。突变范围不一，可以从单核苷酸改变到包含一个或多个基因或基因组区段的大cDNA片段的替代。因此，在一个作为范例的实施方案中，利用伯乐的Muta-gene噬菌粒体外诱变试剂盒引入突变。简述如下，编码PIV基因组或反基因组一部分的cDNA克隆在质粒pTZ18U中，并转化CJ236细胞(LifeTechnologies)。按生产商的建议制备噬菌粒制剂。通过在该基因组或反基因组的需要位点引入一个改变的核苷酸，设计出用于诱发突变的寡核苷酸。扩增带有遗传改变的基因组或反基因组片段的质粒，突变片段被重新引入该全长基因组或反基因组克隆。本发明感染性PIV的产生是通过在细胞内或无细胞系统中，共表达产生编码PIV基因组或反基因组RNA的一个或多个经分离的多核苷酸分子以及在产生转录复制核壳中必须的病毒蛋白的一个或多个多核苷酸分子。用于共表达产生感染性PIV的病毒蛋白包括主要核壳蛋白(N)、核壳磷蛋白(P)、大的聚合酶蛋白(L)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶糖蛋白(HN)和基质蛋白(M)。PIVC、D和VORF的产物也可用于该目的。构建编码PIV基因组或反基因组的cDNA，使其与必须的病毒蛋白在细胞内或体外共表达以形成感染性PIV。"PIV反基因组"是指作为子代PIV基因组合成模板的分离的正义多核苷酸分子。优选，构建的cDNA是相应于复制中间体RNA的正义PIV基因组或反基因组，以降低其与编码产生转录复制核壳所必须的蛋白的互补序列的正义转录本杂交的可能。本发明的一些实施方案中，重组PIV(rPIV)基因组或反基因组仅需要包含对该病毒或亚病毒颗粒的感染性所必须的基因或其部分。此外，该基因或其部分可以多于一种多核苷酸分子形，式提供，即，一个基因可以通过互补或类似方法来源于单独的核苷酸分子。其它实施方案中，PIV基因组或反基因组编码病毒生长、复制和感染的所有功能，而无需辅助病毒，或质粒或辅助细胞系提供的病毒功能的参与。"重组PIV"是指一种PIV或PIV类的病毒或亚病毒颗粒，其直接或间接来自一个重组表达系统，或从重组表达系统中产生的病毒或亚病毒颗粒中增殖产生。该重组表达系统包含一个可操作地连接的转录单位的重组表达载体，该转录单位具有至少一个对PIV基因表达有调控作用的遗传元件，如启动子、一个可转录为PIVRNA的结构或编码序列，以及合适的转录起始和终止序列。为了从表达cDNA的PIV基因组或反基因组中获得感染性PIV，将该基因组或反基因组与那些在以下情况中必须的PIVN、P和L蛋白共表达，这些情况包括(i)产生可进行RNA复制的核壳；(ii)使子代核壳可进行RNA复制和转录。这种基因组核壳的转录提供了其它PIV蛋白，并引发有效感染。另外，共表达也可提供有效感染所需的其它PIV蛋白。PIV基因组或反基因组与上述病毒蛋白的共同合成也可在体外实现(无细胞系统)，如利用组合的转录-翻译反应，再转染细胞。另外，RNA基因组或反基因组也可在体外获得，并转染表达PIV蛋白的细胞。本发明的某些实施方案中，编码生产可转录和翻译的核壳中必须蛋白的互补序列由一个或多个辅助病毒提供。辅助病毒可以是野生型或突变型。优选，该辅助病毒与PIVcDNA编码的病毒在表型上可区分。例如，希望提供与该辅助病毒免疫反应，而不与PIVcDNA编码的病毒反应的单克隆抗体。这些抗体可以是中和抗体。一些实施方案中，可使用抗体亲和层析，将辅助病毒从重组病毒中分离。可将突变引入PIVcDNA(如在HN或F糖蛋白基因中)，提供与该辅助病毒的抗原性差异，有助于这类抗体的获得(Procurement)。本发明另外的实施方案中，N、P、L或其它期望的PIV蛋白由一个或多个非病毒表达载体编码，其可以与编码基因组或反基因组的表达载体相同或不同。也可根据需要包括其它蛋白，各由自己的载体编码，或由编码N、P、L和其它期望的PIV蛋白中的一个或多个或完整基因组或反基因组的载体编码。由转染质粒的基因组或反基因组和蛋白表达由T7RNA聚合酶启动子控制下的各个cDNA产生，而该T7RNA聚合酶启动子是由T7RNA聚合酶表达系统(如表达T7RNA聚合酶的痘苗病毒MVA株重组子)的感染、转染、转导提供的(Wyatt等，Virology210:202-205,1995，在此全文引用作为参考)。可通过转化哺乳动物细胞或成熟RNA或蛋白的转染获得该病毒蛋白和/或T7RNA聚合酶。构建用于本发明的PIV反基因组，例如通过排列克隆的cDNA区段(其集合代表了完整的反基因组)，PIVmRNA或基因组RNA反转录拷贝的聚合酶链式反应(PCR述于美国专利4,683,195和4，683，202中和PCR方案:方法和应用指导(PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications)，Innis等，学术出版社，SanDiego，1990，分别在此全文引用作为参考)或同类。例如，得到的第一构建体包含具有始于合适的启动子(如T7RNA聚合酶启动子)的反基因组左臂末端的cDNA，该构建体在适当的表达载体中装配，如质粒、装配型质粒、噬菌体或DNA病毒载体。载体可通过诱变和/或合成多连接体的插入而改变，这种多连接体带有便于装配的唯一的限制性位点。N、P、L或其它期望的PIV蛋白可装配于一个或多个载体上以便于制备。反基因组质粒右臂末端可包含需要的其它序列，如侧翼的核酶和串联的T7转录终止子。核酶可以是锤头状的(产生具有单个非病毒核苷酸的3'末端)(如Grosfeld等,J.Virol.69:5677-5686,1995)，也可以是任何其它适合的核酶(如S肝炎病毒的核酶，产生没有非PIV核苷酸的3'末端)(Perrotts等，Nature350:434-436.1995，在此全文引用作为参考)。左手和右手末端经共同的限制位点相连。cDNA构建过程中或构建完成后，可在PIV基因组或反基因组中进行多种核苷酸的插入、缺失和重排。例如，可以合成特定需要的核苷酸序列，利用方便的限制性位点插入cDNA的合适区域。或者可使用如位点特异性诱变、丙氨酸扫描、PCR诱变或其它本领域现有技术将突变引入cDNA。构建编码基因组或反基因组cDNA的其它方法，包括利用改进的PCR条件以使亚单位cDNA成分降低至一或两个的(如，在Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:5695-5699,1994中所述的，在此引用作为参考)进行反转录PCR。其它实施方案中使用不同的启动子(如T3，SP6)或不同的核酶(如S肝炎病毒的核酶)。增殖可使用不同的DNA载体(如装配型质粒)，以更能容纳大的基因组或反基因组。编码基因组或反基因组的分离的多核苷酸(如cDNA)通过转染、电穿孔、机械插入、转导或其它类似方式插入合适的宿主，转染细胞是能够支持有效PIV感染的，如HEp-2、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero细胞。分离多核苷酸序列的转染可通过磷酸钙介导的转染(Wigler等，體14:725，1978;Corsaro禾卩Pearson,SomaticCellGenetics2:603，1981;Graham禾卩VanderEb,VirologyH:456，1973)、电穿孔(Neumann等，EMBOJ.1:841-845,1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等编辑,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Inc.,NewYork,1987)、阳离子脂质介导的转染(Hawley-Nelson等,Focus15:73-79,1993)或商业化试剂如LipofectACE(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)或其它同类物，引入培养细胞中(上述文献在此全文引用作为参考)。如上所述，本发明一些实施方案中，N、P、L和其它期望的PIV蛋白由一个或多个辅助病毒编码，这种辅助病毒在表型上与编码基因组或反基因组的无显著差异。N、P、L和其它期望的PIV蛋白也可以由一个或多个表达载体编码，这种表达载体与编码该基因组或反基因组的载体或其各种组合相同或不同。也可根据需要包括其它蛋白，各由自己的载体编码，或由编码N、P、L或其它期望的PIV蛋白或完整基因组或反基因组的载体编码。通过提供感染性PIV克隆，本发明允许在PIV基因组(或反基因组)中重组产生广泛的改变，使得到决定期望表型改变的确定的突变。"感染性克隆"是指合成的或其它方式产生的可以直接进入感染性毒粒的cDNA或其产物RNA，而该感染性毒粒可以转录成作为感染性病毒或亚病毒颗粒模板的基因组或反基因组RNA。如上所述，许多常规方法(如定点诱变)可将特定的突变引入基因组或反基因组的CDNA拷贝中。此处所述用基因组或反基因组cDNA亚片段装配全基因组或反基因组cDNA的优点在于，每个区域都可以分别操作，小的cDNA比大的cDNA容易操作，并容易装配出全长的cDNA。因此，全基因组或反基因组cDNA，或其选择的亚片段可用作寡核苷酸定点诱变的模板。这可通过单链噬菌粒形式介导(如使用伯乐实验室(Richmond，CA)的MUTA-gene试剂盒)，或直接用双链噬菌粒做模板(如使用Strategene(LaJolla，CA)的Chameleon⑤诱变试剂盒)，或用包含目的突变的寡核苷酸引物或模板中任何一个进行聚合酶链式反应。然后可以将一个突变的亚片段装配于该完整基因组或反基因组cDNA中。还有许多已知并可得的产生突变的技术，可用于在本发明PIV基因组或反基因组cDNA中产生目的突变。因此，在一个作为范例的实施方案中，突变利用伯乐的^4171八^61^@噬菌粒体外诱变试剂盒引入。简述如下，编码PIV基因组或反基因组的cDNA克隆在质粒pTZ18U中，并转化CJ236细胞(LifeTechnologies)。按生产商的建议制备噬菌粒制剂。通过在该基因组或反基因组的需要位点引入一个改变的核苷酸，设计出用于诱发突变的寡核苷酸。扩增带有遗传改变的基因组或反基因组的质粒。突变范围可以从单核苷酸改变到具有一个或多个基因或基因组区段的大cDNA片段的引入、插入或缺失。基因组区段可能相应于结构和/或功能域(如蛋白的胞质内、跨膜或胞外域)、活性位点(如介导与其它蛋白结合或其它相互作用的位点)、表位(如刺激抗体结合和/或体液或细胞免疫的位点)等。这方面有用的基因组区段范围从当基因组区段编码小的蛋白功能域(如表位)时的约15-35个核苷酸，至约50、75、100、200-500和500-1500个或更多核苷酸。在感染性PIV中引入特定突变的能力有许多应用，包括对PIV病原和免疫原机构的操作。例如PIV蛋白(包括N、P、M、F、HN、L和C、D、VORF)的功能可通过引入消除或降低蛋白表达水平或产生突变蛋白的突变进行操作。各种基因组RNA的结构特征，如启动子、基因间隔区和转录信号，也可用本发明的方法和组合物常规的操作。反式作用蛋白和顺式作用RNA序列的效果也容易确定，例如用全反基因组cDNA，在平行分析中利用PIV小基因组(Dimock等，J.Virol.化:2772-2778，1993，在此全文引用作为参考)，其依赖拯救的状态可用于定性那些在独立复制的感染性病毒中过强的抑制使其难以回收的突变体。本发明重组PIV内基因或基因组区段的某些替代、插入、缺失或重排(如编码选定蛋白或蛋白区域的基因组区段替代，如编码胞质尾、跨膜区或胞外域、表位或区域、结合位点或区域、活性位点或具有活性位点的区域等)在结构和功能上，与来自相同或不同PIV或其它来源的现有"对应"基因或基因组区段相关。与野生型或亲本PIV或其它病毒株相比，一些改变产生了具有期望表型变化的新重组子。例如，这类重组子可能表达一个PIV的胞质尾和/或跨膜区与另一个PIV的胞外域融合的嵌合蛋白。这类重组子的其它范例表达重复蛋白区域，如表达重复免疫原区域。此处所述"对应"基因、基因组区段、蛋白或蛋白区域，典型的是异源来源的(如来自不同的PIV基因，或代表不同PIV型或株中的相同(即，同源或等位)基因或基因组区段)。文中选择的典型的对应物具有总的结构特点，如每个对应物可能编码一个相当的蛋白或蛋白区，如胞质结构域、跨膜结构域、胞外域、结合位点或区域、表位或区域等。对应结构域和其编码基因组区段包含许多种的集合，其具有由不同结构域或基因组区段间相同生物活性所限定的不同大小和序列。用于产生本发明重组PIV的对应基因和基因组区段，以及这里公布的其它多核苷酸，常与被选择的多核苷酸"参照"序列(如其它选择的对应序列)具有基本同一性。此处所述"参照序列"是指用作序列比较的已定义的序列，例如全长CDNA的一个区段或基因，或一个完整的cDNA或基因序列。一般参照序列至少为20个核苷酸以上，经常是25个核苷酸以上，更多为50个核苷酸以上。因为两个多核苷酸可能(l)各具有一个彼此相似的序列(即，完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)进一步各包含二者间的差异序列，典型的两个(或更多)多核苷酸的序列比较是通过在"对比窗"上对比两个多核苷酸的序列，以发现并比较序列相似的局部区域。此处所述"对比窗"是指至少20个连续核苷酸位置的概念性区段，其中一个多核苷酸序列可以与至少20个连续核苷酸的一个参照序列相比较，并且与参照序列(不含有添加或缺失)相比较，其中该多核苷酸序列在对比窗的部分，可能包括对两序列的最优对比时20%或更少的添加或缺失(即间隙)。排列对比窗的序列的最优对比可通过以下方法进行Smith和Waterman的局部同源算法(Adv.Appl.Math.2:482.1981;在此引用作为参考)，禾PNeedleman&Wunsch的同源排列算法(J.Mol.Biol.48:443,1970;在此引用作为参考)，对Pearson&1^11^11相似性搜索方法(￡12^Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988:在此引用作为参考)，以及这些算法的计算机应用(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI,在此引用作为参考)，或通过检査，选择出这多种方法产生的最佳对比(即，对比窗上序列相似性最高)。术语"序列同一性"指对比窗上两个多核苷酸序列相同(核苷酸逐个比较)。术语"序列同一性百分比"是比较对比窗上两个最优对比的序列，确定存在于两序列中的一致核酸碱基(如A、T、C、G、U或I)，以产生相符位点的数量，用相符位点的数量除以对比窗中位点的总数(即窗的大小)，结果乘以100得到序列同一性百分比。此处所述术语"基本同一性"指一个多核苷酸序列的特征，其中该多核苷酸序列与参照序列在至少20个核苷酸的对比窗，经常是在至少25-50个核苷酸的对比窗中比较，具有至少85%的序列同一性，优选至少90%-95%的序列同一性，更多的是至少99%的序列同一性，序列同一性百分比的计算是通过在对比窗上，比较参照序列和可能包括总共20%或更少的该参照序列的缺失或添加的多核苷酸序列而计算得出的。该参照序列可能是一个大序列的一个子集。除了这些多核苷酸序列关系，本发明重组PIV编码的蛋白和蛋白区域也典型的选择具有保守性关系，即，与选择的参照多肽具有基本的序列同一性或序列相似性。当用于多肽，术语"序列同一性"指肽在相应位置上具有相同氨基酸。术语"序列相似性"指肽在相应位置上具有相同或相似氨基酸。术语"基本同一性"指两个肽序列，当最优排列时(如用程序GAP或BESTFIT)，具有至少80%的序列同一性，优选至少90%的序列同一性，更优选的是至少95%的序列同一性或更高(如99%的序列同一性)。术语"基本相似性"指两个肽序列的序列相似百分比相当。优选的，不一致的残基位点因保守氨基酸替代而差异。保守氨基酸替代是指具有相似侧链的残基可互换。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸、苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸；具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸、甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替代组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬酰胺-谷氨酰胺。此处对氨基酸的简写依据传统用法(Immunology-ASynthesis,第二版，E.S.Golub&D.R.Gren编辑，Si羅erAssociates,Sunderland,MA,1991，在此弓l用作为参考)。这20种常规氨基酸的立体异构体(如D-氨基酸)、非天然氨基酸(如a，a-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也是本发明多肽的合适成分。非常规氨基酸包括4-羟脯氨酸、7-羧基谷氨酸、e-N,N,N-三甲基赖氨酸、e-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、co-N-甲基精氨酸，以及其它相似氨基酸和亚氨基酸(如4-羟脯氨酸)。此外，氨基酸还可以经糖基化和磷酸化等修饰。根据本发明选择候选疫苗病毒时，用已知的方法决定活性、减毒性和免疫原性的标准。最希望用于本发明疫苗的病毒必须有活性，稳定的减毒表型，在免疫宿主体内有复制(即使水平低)，并在受接种者中有效地诱导免疫应答的产生，足以赋予对抗之后野生型病毒感染所导致的严重疾病的保护性。本发明重组PIV不仅是有活性，比先前的候选疫苗更适合地减毒的，而且在体内遗传上更稳定一仍具有剌激保护性免疫应答的能力，同时，因多处修饰的存在可将这种保护扩展，如，诱导抗不同病毒株系或亚型的保护，或一种不同的免疫基础赋予其这种扩展的保护，如分泌型与血清型免疫球蛋白，或细胞免疫，以及其它类似情况。本发明重组PIV可以在多种被熟知并通常认可的体内和体外模型中检测，以确认疫苗使用中的足够减毒、对表型回复的抗性和免疫原性。体外分析中，修饰了的病毒被测试如复制水平、病毒复制的温度敏感性(即tS表型)、小噬菌斑或其它期望的表型。修饰了的病毒进一步在PIV感染的动物模型中测试。在此引用的各种文献中描述了多种动物模型。评价PIV候选疫苗的减毒和免疫原性的PIV模式系统，(包括啮齿类动物和非人灵长类)，在本领域被广泛接受，从中获得的数据与人中PIV感染、减毒和免疫原性非常一致。与以上所述一致，本发明还提供用于疫苗的分离的感染性重组PIV病毒组合物。作为疫苗一个成分的减毒病毒是经分离和(典型的)纯化的形式。分离的是指处于非野生型病毒所处的天然环境的PIV，如处于被感染人的鼻咽处。更常见的，分离的是指包括该减毒病毒为细胞培养或其它人工培养基的一个成分，在其中病毒可繁殖，并在控制的背景下定性。例如，本发明的减毒PIV可在感染的细胞培养物中产生，从细胞培养物中分离获得，并被加入稳定剂。本发明重组PIV可直接用于疫苗制剂中，或根据需要，利用本领域技术人员所熟知的冷冻干燥方法进行冷冻干燥。冻干的病毒典型的保存在约4°C。使用前，冻干的病毒重溶于稳定性溶液中(如盐溶液或包含SPG、Mg+1nHEPES的溶液)，其中也可能存在佐剂，以下将进一步说明。本发明PIV疫苗包含按此处所述方法产生的、具有效致免疫量的PIV作为活性成分。修饰的病毒可与一种生理上可接受的载体和/或佐剂共同引入宿主。本领域已知的载体有水、缓冲的水、0.4%盐、0.3%甘氨酸，透明质酸等。得到的溶液可立即包装使用，或冷冻干燥，冻干的制剂在给药之前与无菌溶液混合，方法如上所述。根据要求，组合物可能包含药学上可接受的辅助物质，使其接近生理状态，如pH调节和缓冲剂、渗涨度调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。可接受的佐剂包括不完全弗氏佐剂、MPLTM(3-0-去乙酰单磷酸脂质A;RIBIImmunoChemResearch,Inc，Hamilton,MT)和IL-2(遗传研究所，剑桥，MA)，以及其它本领域熟知的合适佐剂。用如上所述的PIV组合物经喷雾、滴加、口服、局部或其它途径免疫后，宿主的免疫系统产生特异于PIV病毒蛋白(如F和HN糖蛋白)的抗体作为应答。用如上所述的具有有效致免疫量的PIV接种，宿主至少部分或完全地对PIV的感染免疫，或对轻微或严重PIV感染的有抗性，尤其在下呼吸道中。疫苗接种的宿主可以是任何对PIV或其它近源病毒感染敏感，且对接种株的抗原产生保护性免疫应答的动物。相应的，本发明提供了制作多种用于人和动物的疫苗的方法。包含本发明PIV的疫苗组合物给药对PIV敏感或易受PIV感染攻击的宿主，以增强该宿主的自身免疫力。这种量是"有效免疫原剂量"。使用中，在有效剂量内给药的PIV精确量依赖于宿主健康状态和体重、给药方式、制剂性质等，但一般范围是从每个宿主约103-约107或更多噬菌斑形成单位(pfu)的病毒，常见的是每个宿主约104-约106噬菌斑形成单位(pfu)的病毒。任何情况时，疫苗制剂应提供足量的本发明经修饰的piv，以有效保护宿主对抗严重的或威胁生命的piv感染。根据本发明产生的piv可以和其它piv血清型或株病毒组合，达到抗多种piv血清型或株的保护效果。此外，抗多种piv血清型或株的保护效果也可通过组合多种血清型或株的保护性表位于一个病毒中。典型的，当给药多种病毒时混合同时给药，但也可以分别给药。一种毒株的免疫可以产生抗同种或不同血清型不同株的保护。一些情况下，可能希望将本发明piv疫苗与诱导对其它药物(特别是儿童期病毒)保护性应答的疫苗组合使用。本发明另一些方面中，piv可用作其它病原(如呼吸道合胞病毒RSV或麻疹病毒)保护性抗原的载体，将编码这些保护性抗原的序列引入用来制造感染性piv的piv基因组或反基因组中(参见，如1999年12月10日Murphy等的美国临时专利申请60/170,195，在此引用作为参考)。对所有个体，重组piv疫苗的精确给药量以及给药时间和重复性依赖于宿主健康状态和体重、给药方式、制剂性质等，但剂量范围一般是从每个患者约103-约1(^或更多噬菌斑形成单位(pfu)的病毒，更常用的是每个患者约104-约1()spfu的病毒。任何情况时，疫苗制剂应提供足量的减毒piv，以有效刺激或诱导抗piv的免疫应答，如可通过补体活化、噬菌斑中和和/或酶联免疫分析，及其它方法进行确定。这方面，也需要监视个体是否有上呼吸道疾病出现的迹象和症状。对给药猕猴，该疫苗的减毒病毒在受接种者鼻咽中的复制水平，比野生性病毒低约io倍或更低，比不完全减毒piv低约io倍或更低。新生儿和幼儿中，需要多次给药以诱导足够水平的免疫。给药开始于出生后第一个月，儿童期按需要间隔给药，如隔2个月，6个月，1年，2年，以维持对天然(野生型)piv感染的足够抗性。相似的，对重复性或严重piv感染特别敏感的成人可能需要多次免疫以建立和/或维持保护性免疫应答，包括医务工作者、护理工作者、家庭中有儿童的成员、老人、心肺功能损坏的个体。诱导的免疫水平可通过检测中和分泌和血清抗体确定，并需要调整剂量或重复接种以维持合适的保护水平。进一步，不同的疫苗病毒给药不同的受体组。例如，表达细胞因子或其它在t细胞表位中富含的蛋白的工程化piv株可能特别适宜成人，而非幼儿。根据本发明产生的piv疫苗可以组合表达piv其它亚型或株蛋白的病毒，以产生抗多种piv亚型或株的保护。或者，该疫苗病毒可以包含工程化引入一个piv克隆的多种piv亚型或株的保护性表位。本发明的piv疫苗诱导抗因后来感染野生型piv时产生的严重下呼吸道疾病(如肺炎和细气管炎)的免疫应答。尽管这种自然循环的病毒仍有感染性，特别在上呼吸道，其接种导致鼻炎发病几率的降低以及对后来的野生型感染增强的抗性。接种后，出现可检测水平的宿主造成的血清抗体，和可在体外和体内中和同源(同一亚型)野生型病毒的分泌性抗体。许多情况下宿主抗体也能中和不同的非疫苗亚型的野生型病毒。本发明优选的piv候选疫苗显示比在人体内自然循环的野生型病毒显著降低的毒性。该病毒足够减毒使感染症状在大多数免疫个体中不发生。一些情况时，该减毒病毒仍然可能分布到未经免疫的个体中。但由于其毒性基本消除，在免疫和偶然宿主中不会发生严重的下呼吸道感染。确定piv候选疫苗的减毒水平可通过例如量化被免疫宿主呼吸道中的病毒量，并将其与野生型piv或其它被认为是候选疫苗株的减毒piv的相应量比较。例如，在高度敏感的宿主(如猩猩或猕猴)上呼吸道中，本发明的减毒病毒复制与野生型病毒复制水平相比，被很大程度地限制，如降低10-1000倍。为了进一步降低鼻液溢的发展(其与病毒在上呼吸道中的复制相关)，一个理想的候选疫苗病毒应表现在上下呼吸道复制水平都降低的性质。但为了赋予免疫个体保护，本发明的减毒病毒应在人中有足够的感染性和免疫原性。确定PIV在感染宿主鼻咽中水平的方法是本领域所熟知的。本发明疫苗诱导的免疫水平可通过测定中和分泌性和血清型抗体的量来监测。基于检测结果，按需要调整疫苗剂量或重复接种，以维持理想水平的保护。进一步，不同的疫苗病毒可能适宜不同的受体组。例如，表达在T细胞表位中富含的其它蛋白的工程化PIV株可能特别适宜成人，而非幼儿。本发明另外的方面中，PIV被用作呼吸道瞬时基因治疗的载体。根据这一实施方案，重组PIV基因组或反基因组包含能编码目的基因产物的序列。该基因产物受与控制PIV表达相同或不同的启动子控制。通过共表达N、P、L或其它需要的PIV蛋白和重组PIV基因组或反基因组来产生，并编码目的基因产物的序列，将这样的感染性PIV给药患者。给药一般通过气溶胶、喷雾器或其它局部施用，给药接受治疗患者的呼吸道。重组PIV的给药量应足以产生治疗或预防水平的期望的基因产物表达。这种方法中可给药的代表性基因产物优选适合瞬时表达的，如白介素-2、白介素-4、7-干扰素、GM-CSF、G-CSF、红细胞生成素以及其它细胞因子、葡糖脑苷脂酶、苯丙氨酸羟化酶、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、细胞毒素、肿瘤抑制基因、反义RNA和疫苗抗原。以下为说明目的提供了一些实施例，并非是对其的限制。实施例1编码嵌合HPIV3/BPIV3的反基因组cDNA的构建和感染性病毒的咴复以下三个实施例研究确定了有助于BPIV3在灵长类动物中宿主范围限制的蛋白。该方法是将野生型HPIV3病毒的N蛋白替换为BPIV3上的对应部分。这一替换通过利用以上所述的反向遗传系统从cDNA中回收感染性PIV。此研究从BPIV3N开始是因为，与其它HPIV3和BPIV3蛋白相比，该蛋白具有与其HPIV3对应部分的氨基酸序列适度的差异(参见实施例1)。构建了嵌合的重组病毒，其中HPIV3JS株的N0RF被BPIV3Ka或SF株的替代(图1)。这些嵌合病毒具有HPIV3亲本的HN和F糖蛋白，在灵长类动物中可诱导对HPIV3高水平的免疫。两嵌合病毒被成功获得。在细胞培养时都表现高效价，在猕猴中都表现减毒。因此，N蛋白被认为是赋予BPIV3宿主范围表型的模式蛋白。Ka或SF嵌合重组病毒对猕猴的免疫诱导对作为野生型侵入的HPIV3复制的高水平抗性。因此，本发明建立了有用的反向遗传方法，产生组合了BPIV3的宿主范围减毒特性和HPIV3HN和F保护性抗原免疫原性的嵌合人-牛PIV。这种嵌合病毒免疫人，可以纠正从前在人中观察到的BPIV3疫苗具有低于最佳的免疫原性的问题。BPIV3Ka或SF株的完全一致核苷酸序列从毒粒RNA的RT-PCR产物中得以确定。这些序列分别在图6A-6G，7A-7G中。编码BPIV3Ka反基因组RNA的15456个核苷酸全序列的全长cDNA在图6A-6G中表示(参见GenBank入藏号弁AF178654)。BPIV3Ka株的GenBank序列与作为范例的cDNA在核苷酸21、23的两个位点处不同。发表序列与作为范例的cDNA序列在Ka株病毒群体中自然产生的频率相似。本实施例使用的cDNA序列包含开始于核苷酸18的序列，ACTQGIT(SEQIDNO.1)，而相应的发表序列(GenBank入藏号弁AF178654;图6A-6G;SEQIDNO.22)为ACTIGGT(核苷酸21、23两个位点处的不同以下划线表示)。为构建BPIV3Ka和SF株的共有核苷酸序列，对毒粒RNA进行反转录，使用超转录II预扩增系统(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)和200ng的六聚体随机引物。第一条链的产物进行PCR，使用AdvantagecDNAPCR试剂盒(ClontechLaboratories,PaloAlto，CA)。Ka和SF基因组利用与现有副粘病毒中保守RNA区域同源的引物，分别经PCR扩增出3-4个重叠片段。各引物对的构件包括了符合的限制性酶切点(在扩增靶序列中不出现的)。用合适的限制性酶消化PCR产物，凝胶纯化、将产物连接为串联阵列并超声处理，产生了每个扩增子的独立的随机文库。从这个cDNA序列片段库中可获得一个随机文库，方法是将一个亚组(约500bp片段)克隆到M13中。插入的cDNA核苷酸序列用TaqDYE脱氧终止子循环测序试剂盒(ABI，Foster,CA)进行自动DNA测序分析。每个原始的大RT-PCR片段被以足够冗余地装配出一个连续的序列(contig)，每个核苷酸位置都由至少3个M13的克隆进行确定。Ka和SF株的3'和5'末端基因组序列都利用cDNA末端的快速扩增系统(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)转为cDNA，并自动测序。这些序列分别公布于图6A-6G(Ka)，7A-7G(SF)中。对序列的分析显示HPIV3禾BBPIV3之间各蛋白的氨基酸相似比例为N(86%)、P(65%)、M(93%)、F(83%)、HN(77。/。)和L(91%)。因此序列的差异分布于许多基因。两个病毒N基因演算出的差异出现在GenBank弁AF178654(Ka)和GenBank#AF178655(SF)，未包括在内。NORF在BPIV3基因组的位置在其各自的BenBank报告中指出，在此引用作为参考。以下的实施例中，因为其在6个BPIV3和HPIV3蛋白中具有适度的序列差异，Ka或SF病毒的NORF首先被选择用来替换HPIV3的相应基因。研究中，NORF除3'，5'端和N基因非编码序列外的序列被替换，使我们可以将cKa和cSF中观察到的减毒表型赋予N基因编码的蛋白。构建人-牛嵌合全长PIV3基因组，方法是将BPIV3Ka或SF的N编码区作为其HPIV3中对应部分的替代，引入编码完整HPIV3正义反基因组RNA拷贝的rJScDNAp3/7(131)2G(参见Durbin等，1997a，同上；Hoffman等，1997,同上；Skiadopoulos等，1998，同上；1998年5月22日的美国专利申请09/083,793;1997年5月23日的美国临时申请60/047，575(相应于国际申请WO98/53078);1997年9月19日的美国临时申请60/059,385;分别在此引用作为参考)。具有侧翼序列的HPIV3和BPIV3N编码区首先被亚克隆，再进一步修饰以许可只有NORF的交换。利用Kunkel的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492,1985，在此引用作为参考)对具有HPIV3N基因的pUC119JSN和具有BPIV3Ka或SF的质粒(pBSKaN和pBSSFN)诱变，以分别在翻译开始和终止位点引入Ncol和AflII限制性酶识别位点(图1A)。Ncol/Aflll对pUC119JSN-NcoI/Afl11消化后，在pUC119JSN-NcoI/Afl11中引入Ncol/Aflll片段的BPIV3N编码序列以替代HPIV3N编码序歹!j(图1B)。这种具有HPIV3的3'和5'端非编码区和BPIV3ORF的嵌合N基因经定点诱变，恢复原始的HPIV3的非编码序列和BPIV3的编码序列。接着该嵌合N基因利用该人序列中存在的Mlul和EcoRI位点，被引入rJS反基因组5'末端，pLeft，替换相应的HPIV3序列(图2A和2B)。每种情况时都对SFNORF进行平行反应。该嵌合的pLeft与来自pRight(具有侧翼为5核酶和3'末端T7终止子的rJS反基因组3'末端)的XhoI/NgoMI片段组合(图2)。得到定名为pB/HPIV3Nka或pB/HPIV3NSF的嵌合PIV3质粒，其含有其中NORF编码BPIV3Ka或SFN蛋白的全长rJS反基因组。嵌合反基因组HPIV3/BPIV3的cDNA单独与两个前述质粒pTM(PnoC)禾卩pTM(L)、Lipofectace(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)，转染在6孔板上生长接近汇合的HEp-2细胞，并用一种前述的表达噬菌体T7RNA聚合酶(MVA-T7)的修饰的痘苗病毒重组体感染(Durbin等，Virology234:74-83,1997b)。因该反基因组质粒可产生足量的N蛋白，之前研究中支持N的质粒被省去。培养物在32t:保持3.5天，然后收集上清，LLC-MK2细胞中传代，并在LLC-MK2细胞中噬斑纯化3次。转染后回收的具有人PIV3背景基因组或反基因组和BPIV3N蛋白(定名为rHPIV3-NB的嵌合重组体，或更特异的，"cKa"和"cSF"嵌合重组体)的嵌合病毒，通过RT-PCR产物(具有来自三次噬菌斑纯化扩增后分离的毒粒RNA的NORF开始和终止密码子)测序的鉴定，予以确认(图3)。该扩增产物和相应扩增的HPIV3rJS和BPIV3Ka或SF序列也进行Taql消化，以确认cKa和cSF病毒的嵌合特性(图4)。这3个亲本和2个嵌合病毒的Taql消化图是各异的，每个亲本的图包括独特大小的Taql片段，使可以确定rJS、Ka和SF亲本序列对嵌合病毒的贡献。获得的cKa和cSF嵌合重组体各具有设计的期望序列。实施例IIHPIV3/BPIV3嵌合病毒在细胞培养中的复制活的减毒病毒疫苗在组织培养细胞中的有效复制是本发明人-牛嵌合PIV的一个特色，因而可有效地生产重组疫苗材料。rJS亲本、cKa、Ka亲本、cSF和SF亲本在牛细胞系(MDBK)和猿猴细胞系(LLC-MK2)中的多循环复制通过以上所述方法(Tao等，1998，在此引用作为参考)确定，即，病毒以0.01的感染复数感染细胞，在5天的时期内收集样品(平行三次)(图5)。这些嵌合病毒在两种细胞系中和其人或牛亲本病毒同样有效地复制，复制无显著的延迟，或得到的病毒效价无明显的下降。任何一种情况，嵌合病毒复制至10^TCID5o/ml(即，远大于目前用于人临床实验的活的减毒人或牛PIV疫苗每剂10"或10")(Karron等，1996,同上；Karron等，1995a，同上；Karron等，1995b，同上)。实施例IIIHPIV3/BPIV3嵌合病毒在猕猴中减毒和保护效率的评估BPIV3Ka和SF在猕猴上下呼吸道都是减毒的(vanWykeCoelingh等，1988，同上)。这种减毒的表型与人中的减毒相关(Karron等，1995a，同上)，因Ka在充分敏感的血清反应阴性幼儿和儿童的上呼吸道中，复制被高度地限制。在BPIV3感染的接种者中未出现咳嗽、哮吼、细气管炎或肺病，这暗示KaBPIV3病毒在下呼吸道也是减毒的。因此，猕猴被认为是一种广泛认可的合理相关的模型，以评估候选PIV疫苗病毒的减毒和其抗野生型PIV的有效性。rJS、cKa、Ka亲本、cSF和SF亲本以鼻内和气管内给药猕猴，每个位点每剂量105'GTCID5Q。利用前述方法监视其复制，获得上(鼻咽擦拭样品)下(气管灌洗样品)呼吸道样品，测定LLC-MK2细胞中病毒效价(Hall等，1992，同上)。cKa和cSF在上呼吸道显著地减毒(表1)，与rJSHPIV3亲本相比，其平均最大病毒效价分别显示了63倍或32倍的降低。cKa和cSF在下呼吸道也有减毒(表1)，但差异不如cKa的显著。rJS在下呼吸道的低水平复制使难以以统计上显著的方式表明，基于该位点的减毒表型所引起的进一步的复制限制。表1:在猕猴上下呼吸道中相对于HPIV3的受限制的cKa和cSF复制病毒复制平均最高效价平均效价1og,。TCID5。/ml士标准误差1og,。TCID5。/ml土标准误差[邓肯分组]2_[邓肯分组]鼻咽气管鼻咽气管免疫动用病物毒1数rJS4cKa4Ka4cSF4SF4第6天5.3土0.59[a]3.0土0.58[b]2.0土0.27[b]3.3±0.40间2.8±0.48间第7天3.9土0.36[a]2.9士0.42[ab]2.4士0.30[b]3.7士0.57[a]2.6土0.40[ab]第4天1.7土0.45[a]1.5土0.40[a]1.3土0.26[a]1.1土0.25[a]1.6土0.46[a]第6天1.7土0.29[a]1.0士0.19[a]1.3土0.21[a]1.1土0.24[aj1.5土0.40[a]5.3土0.59[a]3.5士0.54[b]2.5土0.30[b]3.8土0.46[b]3.3±0.28问2.5士50.51[a]1.5土0.18[ab]1.6土o.15[ab;]1.4土0.26[b]1.8士0.41[ab]i'以鼻内和气管内接种猴，每个位点lml接种物，剂量为105.0TCID50。2'利用邓肯多差距测验(『0.05)将每列中平均病毒效价分为统计上相似的组(以字母表示)，不同字母的每列平均效价是统计上不同的。尽管嵌合病毒在上呼吸道中比其亲本BPIV3的复制稍好，但cKa和cSF中每一嵌合病毒的复制水平在上下呼吸道中与其牛亲本没有显著差异。rJSHPIV3获得BPIV3Ka或SF之一的N基因，可使人病毒在猕猴中减毒至几乎相当于其BPIV亲本的水平。因HPIV3/BPIV3嵌合重组子在体外的组织培养细胞中可有效复制，这两种牛亲本病毒表现的宿主范围限制性表型是由N0RF转移入HPIV3的。可能，但仍未知和不可预计的，其它BPIV3基因(如M、P、L)替代其rJSHPIV3的相应部分，可以产生与BPIV3N基因替代HPIV3N基因所产生的相似或更大水平的减毒。观察到cKa和cSF在上呼吸道中的复制比其BPIV3亲本略高，这暗示另外的牛基因有助于该BPIV3亲本病毒在该位点的宿主范围减毒表型。未经接种的猴，和先前感染了人或牛PIV3亲本病毒或感染了cKa或cSF嵌合病毒的猴，在每个位点1ml的106QTCID5C)/mlrJS以鼻内和气管内接种后42天，接受病毒攻击。在所述的时间点采集鼻咽和气管样品(表2)。确定各动物在LLC-MK2单层细胞中每个位点的病毒效价，所示效价为平均最高效价(Hall等，1992，同上)。在上下呼吸道中，任何嵌合病毒的先前感染都诱导对rJS攻击病毒复制的高水平抗性。与未接种的对照猴相比，先前感染cKa的猴在上呼吸道表现出野生型rJS复制的300倍抑制，在下呼吸道中降低IOOO倍。先前感染cSF的猴在上呼吸道表现出野生型rJS复制的2000倍抑制，在下呼吸道降低1000倍。预先接种了cKa或cSF猴中rJS攻击病毒复制的降低水平，与预先接种了牛或人PIV亲本的猴中降低水平相当。因此，HPIV3/BPIV3嵌合病毒中任何一个的感染都在猴上下呼吸道中提供高水平的保护，二者都是有前景的候选疫苗。依据前述方法(Coelingh等，J.Infect.Dis.157:655-662,1988)对第0和28天采集的血清进行HAI分析，以HPIV3(JS株)和BPIV3(Ka株)为抗原。尽管相对于rJS，cKa-N和cSF-N在猕猴上下呼吸道中是高度减毒的，二者中任何一种嵌合病毒可诱导比其相应BPIV3亲本强2.5-5倍的对HPIV3的凝血抑制(HAI)抗体。这可能因为嵌合病毒中存在HPIV3HN蛋白。嵌合病毒诱导的HPIV3特异的HAI反应与rJS免疫诱导的反应在统计上难以区分。此处出现的其它未预料的结果是，HPIV3攻击猴后，预先免疫了cKa-N或cSF-N的猴中HAI抗体水平显著高于免疫了rJS、Ka或SF的动物中的水平。实施例IV具有异源融合和血凝素-神经氨酸酶糖蛋白的嵌合HPIV3/BPIV3候选疫苗的构建和特性在前一实施例中，BPIV3在灵长类呼吸道中复制的宿主范围限制是通过产生和定性N的读码框(ORF)被BPIV3中相应部分替代重组PIV3(rHPIV3)来鉴定的。产生的嵌合病毒rHPIV3-NB，也称为cKa或cSF，在体外有效复制，但在猕猴上呼吸道复制受限制，表明猕猴中N蛋白是BPIV3宿主范围限制的独立决定簇(Bailly等，J.Virol.24:3188-3195，2000)。在本实施例中，产生和定性两个交互嵌合的HPIV3/BPIV3，以确定牛副流感病毒类型3(BPIV3)的融合(F)糖蛋白基因和血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白基因对非人灵长类呼吸道中限制复制的贡献。获得了一个异源BPIV3F和HN蛋白基因代替其自身基因的嵌合HPIV3，和具有一个HPIV3F和HN基因代替其自身糖蛋白基因的BPIV3"骨架"与之交互的嵌合重组体，以评估这种糖蛋白替代对HPIV3和BPIV3在猕猴上下呼吸道复制的效果。因此，一个嵌合病毒中，HPIV3F和HN基因被BPIV3的相应部分代替，产生命名为rHPIV3-FsHNB的嵌合重组体。与之交互的嵌合重组体PIV3(rBPIV3-FHHNH)是重组BPIV3(rBPIV3)F和HN基因被HPIV3的相应部分代替而构建的。后者中，HPIV3F和HNORF对BPIV3骨架的导入组合了HPIV3的抗原决定簇和BPIV3骨架，并因此比亲本BPIV3提供了改善的候选疫苗。F和HN基因按要求成对地与同源F和HN基因交换，使副流感病毒保持其全部的功能活性(Deng等，Virology209:457-469,1995;Tanabayashi，J.Virol.70:6112-6118,1996;分别在此引用作为参考)。上述嵌合病毒易于获得，在猿猴LLK-MK2细胞中表现与其亲本病毒相当的复制动力学，这暗示，异源糖蛋白与PIV3自身蛋白是相容的。BPIV3与HPIV3相比的细胞病理学差异与其各自的F和HN基因相伴随。具有BPIV3F和HN基因的HPIV3在猕猴中复制的减毒与其BPIV3亲本相似，表明BPIV3糖蛋白基因是在猕猴中宿主范围限制的主要决定簇。具有HPIV3F和HN基因的BPIV3(rBPIV3-FHHNH)在猕猴中复制的减毒界于HPIV3和BPIV3之间。这些结果表明F和HN基因在BPIV3的全部减毒中起到重要作用。此外也表明F和HN基因外的BPIV3基因也参与在灵长类的减毒表型。后一发现与前一实施例中的一个结果一致，即BPIV3的核蛋白序列是其在灵长类减毒的决定因素。尽管其在猕猴呼吸道中限制的复制，rBPIV3-FHHNH赋予了对野生型HPIV3攻击的一定程度的保护，这与野生型HPIV3前期感染所赋予的保护难以区分。这些和相关结果中可以明显看出，rBPIV3-FHHNH是一种有用的候选疫苗。病毒和细胞Hep-2和猿猴LLC-MK2单层培养细胞生长在添加了5%的胎牛血清(SummitBiotechologies,Ft.Collins,CO)、50ug/l硫酸庆大霉素和4mM谷氨酰胺(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)的MEM培养基中(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)。野生型BPIV3的Kansas株/15626/84(克隆5-2-4，批号BPI3-1)(BPIV3Ka)，HPIV3JS野生型，其重组型(rHPIV3)和以BPIV3Ka的NORF替换了HPIV3NORF的rHPIV3病毒(rHPIV3-NB)，分别在以上做了说明(也参见Clements等，1991，同上；Karron等，1995a，同上；Bailly等，2000，同上；Durbin等，1997,同上)。根据上述方法，PIV在LLC-MK2细胞(ATCCCCL-7)中32。C增殖(Hall等，1992，同上)。表达噬菌体T7RNA聚合酶的经修饰的痘苗株Ankara(MVA)重组病毒由Wyatt等做了说明(1995，同上)。构建编码重组BPIV3/HPIV3病毒的反基因组cDNAa)构建cDNA以恢复rBPIV3根据以上所述，构建了编码BPIV3Ka全部15456个核苷酸的反基因组RNA的cDNA。利用超转录II预扩增系统(LifeTechnologies,Ga池ersburg,MD)和聚合酶链式反应(PCR)用高保真PCR试剂盒(ClontechLaboratories,PaloAlto，CA)扩增，从病毒RNA反转录(RT)中获得的4个亚克隆装配该cDNA。利用以下天然产生的内部限制性识别位点将RT-PCR产物克隆在修饰的质粒pUC19中(NewEgnlandBiolabs，Biolabs,Beverly,MA):SmaI(BPIV3Ka序列位点ntl86)、PstI(nt2896)、MluI(nt6192)、SacII(ntl0452)、和BspLUll(ntl5412)。反基因组cDNA的多亚克隆利用PerkinElmerABI310测序仪和dRhodamine终止循环测序(PerkinElmer应用生物系统，Warrington,UK)测序，只有与BPIV3Ka共有序列符合的可用于装配全长序列。BPIV3Ka的3'和5'末端被克隆，全长cDNA的装配发生在前述的p(Right)载体中(Durbin等，1997，同上)，该载体经修饰具有可被限制性酶XhoI、Smal、MluI、SacII、EcoRI、HindIII、RsrII识别的新的多连接区。全长cDNA克隆pBPIV3(184)从3'到5'具有以下元件T7启动子，2个非病毒的胱氨酸残基，BPIV3Ka完全的反基因组序列，S肝炎病毒核酶和一个T7聚合酶转录终止子(Bailly等,2000a，同上；和Durbin等,1997a，同上)。b)rHPIV3-FRHNn和rBPIV3-FwHNH的构建在BPIV3反基因组cDNA和前述的HPIV3反基因组cDNAP3/7(131)2G(Durbin等,1997a,同上)中引入独特的限制性酶识别位点，以促进BPIV3和HPIV3间F和HN基因的交换。利用Clontech的转化子定点诱变方法(ClontechLaboratories,PaloAlto，CA)，在rBPIV4811位和rHPIV3JS序列(Genbank接入号弁Z11575)4835处M基因的下游非编码区引入SgrAI限制性位点。限制性酶识别位点的给定核苷酸编号表示了酶切后的核苷酸，而非限制性酶识别位点的第一个核苷酸。该序列的改变是rBPIV3中从TCCAACATTGCA(SEQIDNO.2)至ljTCCACCGGTGCA(SEOIDNO.3)、rHPIV3中从CGGACGTATCTA(SEQIDNO.4)到CGCACCGGTGTA(SEOIDNO.5)(识别位点下划线)。BsiWI限制性位点被引入了rBPIV3序列的nt8595禾口rHPIV3JS序列nt8601处的HN基因的下游非编码区。该序列的改变是rBPIV3中从GATATAAAGA(SEQIDNO.6)到GACGTACGGA(SEOIDNO.7)并得到pBPIV(107)、rHPIV3中从GACAAAAGGG(SEQIDNO.8)至UGACGTACGGGfSEOIDNO.9)并得到pHPIV(106)。F和HN基因在pBPIV和pHPIV间的交换是通过各用SgrAI和BsiWI消化，片段经凝胶纯化，将合适的片段装配出全长的cDNA。具有BPIV3F和HN基因的HPIV3骨架，定名为pHPIV(215)，编码病毒序列的15480个核苷酸，其中nt4835-8619来自BPIV3，被用于获得rHPIV3-FBHNB(^8A-8C)。具有HPIV3F和HN基因的BPIV3骨架，定名为pBPIV(215)，编码病毒序列的15438个核苷酸，其中nt4811-8577来自HPIV3，被用于获得rBPIV3-FiiHNH(图8A-8C)。用于从cDNA中回收病毒的BPIV3支持质粒编码BPIV3KaN、P、L基因的支持质粒在修饰的pUC19中装配，接着克隆于前述的pTM-l载体中(Durbin等，1997a，同上)。为了将单个基因放在紧挨该pTM载体T7启动子的下游，利用定点诱变在N、P、L读码框(ORF)起始密码子处引入了一个Ncol位点。该Ncol位点和各ORF下游天然存在的限制性位点(NSpel，PHincII，LBspLU1ll)被用于对pTM的克隆。克隆后，pTM(N)的NcoI位点突变回原始序列，以恢复第二个密码子中的正确氨基酸排列。pTM(P)和pTM(L)中ORF编码的氨基酸序列没有因NcoI位点的引入而改变。转染HEp-2细胞(6孔板的每个孔约1.5乂106个细胞)生长到90%汇合，用BPIV3支持质粒pTM(N)和pTM(P)各0.2ptg，O.lpgpTM(L)，禾n5/Ltg全长的反基因组cDNA、12]tdLipofectACE(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)共同转染。各转染混合物也含有1.5X10"筮菌斑形成单位(PFU)的MVA-T7，如前所述(Durbin等,1997a，同上)。培养物在32。C培养12小时，替换为包含10%胎牛血清的MEM培养基(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)。32。C又培养了三天后，收集上清，铺于25cn^烧瓶中的LLC-MK2单层细胞，32。C培养5天。上清中的病毒在扩增和定性前进行3次噬菌斑纯化。回收的嵌合重组体的分子特性牛或人PIV3骨架中存在的异源F和HN基因通过从感染细胞或上清中分离病毒RNA的RT-PCR在噬菌斑纯化重组病毒中得以确认,其进行是使用识别rHPIV3和rBPIV3上保守序列的引物对。产生大小相似的片段(rBPIV3中nt4206-9035，rHPIV3中nt4224-9041，rBPIV3-FHHNH中nt4206-9017，rHPIV3-FBHNB中nt4224-9059)，进行EcoRI的消化，并1%的琼脂糖电泳分析(图9)。每个病毒中侧翼为引入的SgrAI和BsiWI限制性位点的核苷酸序列，通过测序其相应的RT-PCR产物来确认。HPIV3/BPIV3嵌合病毒在细胞培养中的复制确定LLC-MK2细胞中BPIV3Ka、rBPIV3-FHHNH、rHPIV3-FBHNB、rHPIV3-NB禾PrHPIV3的多循环生长动力学，以0.01的感染复数(MOI)分三份感染细胞，6天内每24小时收集细胞，方法同上所述(Tao等，1998，同上)。样品瞬时冷冻，在32。C在96孔板的LLC-MK2单层细胞中做一次效价分析，方法同上所述(Durbin等，Virology261:319-330,1999b,在此引用作为参考)。灵长类模型研究血凝抑制(HAI)分析(vanWykeCoelingh等，1988，同上)确定的PIV3血清反应阴性猕猴以鼻内和气管内接种BPIV3Ka、rBPIV3-FHHNH、rHPIV3-FBHNB、rHPIV3-NB或rHPIV3，每毫升105组织培养物感染剂量5Q(TCID5()),每组动物为2-4只。从第1-11天和第13天每天采集鼻咽擦拭样品。在第2、4、6、8、IO天采集气管灌洗样品。单个样品瞬时冷冻，在-7(TC保存，直到可用于测定效价。样品效价在24和96孔板的LLC-MK2单层细胞中测定(Durbin等，1999b，同上)。在0和28天采集的猴血清用HPIV3JS和BPIV3Ka进行HAI分析，方法同上所述(vanWykeCoelingh等，1988，同上)。接种后28天，HPIV3JS以每个位点1(^TCID5o鼻内和气管内攻击猕猴。攻击后第3、4、5、6、7、8天采集鼻咽擦拭样品。在第4、6、8天采集气管灌洗样品。用上述方法以单一分析检测样品效价。攻击后28天采集血清。rBPIV3禾卩BPIV3/HPIV3嵌合病毒0HPIV3-FbHNb禾卩rBPIV3-FHHNH)从cDNA的恢复构建一个定名为pBPIV(184)的编码BPIV3Ka共有序列的完整BPIV3反基因组cDNA。通过分别在M和HN基因下游非编码区引入唯一的SgrAI和BsiWI位点，对该BPIV3反基因组cDNA进一步修饰(图8C)。同样的限制性位点也引入了前述完整HPIV3反基因组cDNA(p3/7(131)2G)的M和HN基因下游非编码区(Durbin等，1997a，同上)。HPIV3和BPIV3的F和HN糖蛋白基因因SgrAI-BsiWI限制性片段的互换而交换。由于HPIV3和BPIV3顺式作用元件的高度保守性，预计全基因的直接交换是可以容许的。具有BPIV3的F和HN基因的HPIV3反基因组cDNA定名为pHPIV(215)，具有HPIV3的F和HN基因的BPIV3反基因组cDNA定名为pBPIV(215)。反基因组cDNApBPIV(184)、pHPIV(215)、pBPIV(215)和p3/7(131)2G分别与三种BPIV3支持质粒pTM(N)、pTM(P)、pTM(L)转染HEp-2细胞。细胞同时也转染了表达T7RNA聚合酶的重组MVA。为了确定回收病毒是否真是预期的rBPIV3、rHPIV3-FBHNB、rBPIV3-FHHNH和HPIV3病毒，使用识别HPIV3JS和BPIV3Ka—致序列的引物对，RT-PCR分析来自各克隆病毒的细胞内RNA或上清RNA。该引物对扩增出4.8kbDNA片段，相应于M基因、F和HN基因的下游末端和L基因的上游末端(rBPIV3中nt4206-9035，rHPIV3中nt4224-9041，rBPIV3-FHHNH中nt4206-卯17，rHPIV3-FBHNB中nt4224-9059)。每个PCR产物的产生都依赖反转录酶的加入，表明其均来自病毒RNA，而不含有cDNA(未发表资料)。PCR产物用EcoRI消化，可预测这四种病毒中任一都有不同的独特的限制性酶切图产生(图9)。观察到每种情况的预期表现，确认了骨架和插入的F和HN基因。此外对PCR产物的核苷酸测序确认了导入的限制性位点和侧翼序列的存在。在LLC-MK2细胞中，由rBPIV3-FHHNH引起的致细胞病变效应(CPE)难以与HPIV3JS(致密的圆形细胞和小合胞体)引起的CPE相区别，但可与BPIV3(大的多室合胞体)相区分，而rHPIV3-FBHNB引起的CPE与BPIV3引起的相同。这说明嵌合PIV的致细胞病变性是与亲本源F和HN基因相伴随的。BPIV3/HPIV3嵌合病毒在细胞培养中有效复制以0.01MOI感染单层LLC-MK2细胞，比较rHPIV3-FBHNB和rBPIV3-FHHNH与其亲本病毒的生长动力学，并监测感染性病毒的产生。这两种嵌合病毒复制的动力学和程度与其HPIV3或BPIV3亲本相当(图10)。暗示，BPIV3和HPIV3的糖蛋白与异源PIV3的内在蛋白相容。这是一个重要的性质，可能有效地制备疫苗病毒。BPIV3/HPIV3嵌合病毒的F和HN基因是猕猴呼吸道中BPIV3Ka复制宿主范围限制的决定簇估计rHPIV3-FBHN"nrBPIV3-FHHNH在猕猴上下呼吸道中复制的能力。特别的显示了BPIV3的F和HN基因引入HPIV3对其在猕猴中复制的影响，如上关于BPIV3N蛋白的描述(也参见Bailly等，2000，同上)。此外，也确定了HPIV3的F和HN基因引入BPIV3对其在猕猴中减毒的影响。如BPIV3中首要的减毒突变是除F和HN以外的基因，则可以预计，HPIV3-BPIV3糖蛋白的互换对BPIV3在猕猴中的复制没有太多的影响。每种病毒以每个位点1()STCID5()鼻内和气管内给药猕猴。嵌合病毒的复制水平与其rHPIV3和BPIV3亲本病毒和rHPIV3-NB相比(表3)。因为rHPIV3亲本病毒在下呼吸道中的复制由低到中等，组间有意义的比较应在上呼吸道中进行。rHPIV3-FBHNB复制水平与其BPIV3亲本病毒相似，但远低于其HPIV3亲本(表3;图11，A组)。这表明BPIV3糖蛋白基因含有BPIV3在猕猴中宿主范围限制表型的一个或多个决定簇。rHPIV3-FBHNs和rHPIV3-NB复制程度和方式非常相似，显示这两种牛遗传元件中的任一，即N基因对F和HN基因对HPIV3减毒有相似的程度。表3BPIV3F和HN糖蛋白基因对其在猕猴呼吸道中限制性复制的贡献动物平均峰值病毒效价3在第28天7针对HPIV3在第28天1针对免疫用病毒1(log10TCID50/ml±S.E.)[邓肯分组]4的血清HAI抗体的效价(平均倒数BPIV3的血清HAI抗体的效价(平均倒数数2NP擦拭5气管灌洗6log2±S.E.)1og2土S.E.)rHPIV364.7土0.54[A]2.4土0.37[A]9.5土0.72[A]6.8土1.03[B]rBPIV3-FHHNH43.1土0.58[BJ1.6士0.05[A]6.8土0.63[BC]3.8土0.63[C]rHPIV3-NB63.0士0.60[B;i1.4士0.19[A]8.2土0.48[AB]6.5土0.62[B]rHPIV3-FBHNB42.9土0.28[BJ2.0土0.24[A]4.5士0.29[DJ9.5土0.65[AJBPIV3Ka62.6土0.26[BJ1.6士0.10[A〗5.5士0.62[CD]9.2土0.60[AJL以鼻内和气管内接种猴，每个位点lml接种物，每剂量105GTCID50。2'6个动物的组包含分别来自前期猕猴实验的4个动物(Bailly等，2000，同上)。3'不考虑采样日，组内各动物最大病毒效价的平均值。SE^标准误差。《在32。C的LLC-MK2细胞中测定病毒效价。病毒效价的可检测极限是10TCID5o/ml。利用邓肯多差距测验(『0.05)比较平均病毒效价。每列中不同字母的平均效价是统计上不同的。有两个字母的效价与有其中任一字母的效价无显著差异。5'鼻咽擦拭样品采自第l-ll天和第13天。6'气管灌洗样品采自感染后第2、4、6、8和10天。7'0天的效价小于2.0。第28天是野生型HPIV3攻击的时间。**rHPIV3组中两只动物感染了rHPIV3(其针对糖蛋白交换有两个限制性酶识别位点)rBPIV3-FHHNH嵌合病毒的复制显著低于rHPIV3(表3)，并在邓肯多差距测验中和BPIV3分为一组。但图11B中关于其复制方式的检测发现，rBPIV3-FHHNH的复制水平介于其亲本HPIV3和BPIV3之间。Friedman的级另'J一致性检测(Sprent，P.，"AGeneralizationofTheSignTest"AppliedNonparametricStatisticalMethod,pp.123-126，ChapmanandHall，London,1989，在此引用作为参考)支持对rBPIV3-FHHNH的复制水平介于其亲本HPIV3和BPIV3之间的解释，即表明HPIV3、rBPIV3-FHHNH和BPIV3的平均效价在感染后3-8天内是显著不同的(d.f.2,8;p<0.05)。观察到HPIV3F和HN基因的引入导致BPIV3在猕猴中复制水平的增加，这表明(i)F和HN包含一个或多个宿主范围限制的决定簇(ii)F和HN基因外的一个或多个BPIV3遗传元件，如N蛋白，使病毒在猕猴中减毒。这确定了宿主范围限制的遗传基础可能包括多个基因。具有HPIV3糖蛋白基因的嵌合BPIV3诱导HPIV3的血清HAI抗体和对野生型HPIV3攻击的高水平抗性rBPIV3-FHHNH的重要特点使其成为抗HPIV3的候选活减毒的病毒疫苗，包括BPIV3的减毒基因和HPIV3的抗原特异性，即是主要保护性抗原的F和HN糖蛋白。因此，记录了其免疫原性和抗HPIV3攻击的保护性效果。BPIV3Ka、rHPIV3-FBHNB、rBPIV3-FHHNH、rHPIV3-NB或rHPIV3感染以免疫猕猴。28天后用HPIV3JS野生性病毒攻击。采集初次感染前0天和攻击前的血清。BPIV3和rHPIV3-FBHNB诱导与HPIV3比与BPIV3更有效反应的HAI抗体，而HPIV3和rBPIV3-FHHNH与之相反。因此各病毒糖蛋白基因的来源决定HAI抗体主要针对HPIV3还是BPIV3。攻击HPIV3病毒的复制在预先免疫的猕猴的上下呼吸道中显著降低(表4)。尽管抗HPIV3的保护性效果在不同病毒中没有显著差异，一般具有HPIV3F和HN的病毒在上呼吸道中比具有HPIV3F和HN的病毒保护性更强。这与具有HPIV3F和HN的病毒诱导高水平的HPIV3-特异性HAI抗体相符合。表4BPIV3/HPIV3嵌合重组病毒在猕猴中的免疫诱导对野生型HPIV3攻击的抗性<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>L各选已前接种的猴和未免疫的对照在免疫28天后，用106TCID5()HPIV3JS攻击，每个位点lml接种物。2'6个动物的组包含分别来自前期猕猴实验的4个动物(Bamy等，2000，同上)。3不考虑采样日，组内各动物最大病毒效价的平均值。4'在32。C的LLC-MK2细胞中测定病毒效价。病毒效价的可检测极限是10TCIDWml。利用邓肯多差距测验(c^0.05)比较平均病毒效价。每列中不同字母的平均效价是统计上不同的。有两个字母的效价与有其中任一字母的效价无显著差异。攻击日的未经免疫动物不包括在邓肯分析中。5'鼻咽擦拭样品采自攻击后第3-8天。6.气管灌洗样品采自攻击后第4、6、8天。**rHPIV3组中两只动物感染了rHPIV3基于前述实施例，本发明提供BPIV基因输入毒性HPIV骨架和相反情况，以获得新的人-牛嵌合PIV候选疫苗。在本实施例中显示的模式嵌合重组子，rHPIV3-FsHNB和rBPIV3-FHHNH对应物，在体外复制，其相应的亲本病毒也一样。也确定了BPIV3和HPIV3的F和HN交换是相容的，因为更大差异的HPIV3的F和HN蛋白在HPIV3骨架中是高度有功能的(Tao等，J.Virol.72:2955-2961.1998)，该嵌合病毒在体外复制能力的未减弱说明了这一点。rBPIV3-FHHNH在猕猴上呼吸道的复制水平介于其HPIV3和BPIV3之间，表明BPIV3的F和HN基因对BPIV3在灵长类动物的全面减毒有独立的作用。因此，BPIV3的全面减毒是两个或多个遗传元件的总和，其中之一是F和HN基因，而其它显示为N。尽管BPIV3本身被估计是HPIV3的疫苗病毒(Karron等，Pediatr.Infect.Dis.J.15:650-654,1996;Karron等.J.Infect.Dis.171:1107-1114,1995)，但其与HPIV3只有25%的相关(Coelingh等，J.Infect.Dis.l57:655-662,1988)。因此，如果根据本发明修饰为表达保护性的HPIV3F和HN的抗原，可提高BPIV3对抗HPIV3的免疫原性。rBPIV3-FHHNH是这种病毒的代表，并且在本实施例中，rBPIV3-FHHNH对猕猴的免疫诱导对HPIV3的抗体高于BPIV3免疫所诱导的。rBPIV3-FHHNH在上下呼吸道中赋予抗HPIV3攻击病毒复制的保护，其与先前rHPIV3感染赋予的保护在统计上难以区分。同样的，rHPIV3-Ne(因BPIV3N减毒但具有HPIV3保护性抗原)也诱导对HPIV3攻击的高水平抗性。尽管在猕猴中复制水平相似，rHPIV3-NB比rBPIV3-FHHNH诱导对HPIV3更高水平的抗体。尽管其与HPIV3相比是显著减毒的，rBPIV3-FHHNH在猕猴中比BPIV3复制水平高。因为BPIV3复制水平在人中低(Karron等，J,Infect.2i^m:1107-1114,1995)，这种增加预期在受接种者中有良好耐受。另外，此处公布了其它可使本发明人-牛嵌合病毒减毒的方法，以确保疫苗病毒复制限制于适当水平，如在人幼儿中，预防受接种者出现严重的呼吸道疾病。本发明其它方面中，rBPIV3-FHHNH在灵长类动物复制的少量增加提供了用rBPIV3-FHHNH作为异源病毒抗原如其它PIV(如HPIV1和HPIV2)的糖蛋白、RSVF和G糖蛋白、麻疹HA糖蛋白，其可以作为添加或替代基因或基因组区段，引入减毒的HPIV3候选疫苗)载体的可能。此处公布的各种其它实施方案中，rBPIV3-FwHNH在猴中比BPIV3少量增加的复制，可以通过外源病毒保护性抗原(如RSV糖蛋白，其添加赋予了一种选定水平的减毒)而抵消。这里发表的数据进一步定义了BPIV3在灵长类动物中的宿主范围限制基础，也确定了rBPIV3-FHHNH是潜在的抗的HPIV3的候选疫苗和异源病毒抗原的载体。微生物保藏信息遵循布达佩斯条约，以下材料保藏于美国典型培养物保藏中心(10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209)，并命名如下保藏号(ATCC97990)CATCC97989)(ATCC97991)质粒p3/7(131)p3/7(131)2Gp218(131)存放日期1997年4月18日1997年4月18日1997年4月18日尽管为清楚理解目的通过实施例对上述发明进行了详细描述，但是本领域技术人员应当清楚，通过所述公开可以作出一定的改变和变化，并且在所附权利要求的范围内无需进一步实验即可实施，而所述说明的给出只是说明性的而非限制性的。序列表<110>美国政府健康及人类服务部(TheGovernmentOfTheUnitedStatesOfAmericaasr印resentedbyTheDepartmentOfHealthAndIlumanServices)<120>减毒的人-牛嵌合副流感病毒(PIV)疫苗(AttenuatedHuman-BovineChimericParainfluenzaVirus(PIV)Vaccines)<130>SPI082276-01〈150〉PCT/USOO/17066<151>2000-06-15<150〉60/143,134<151>1999-07-09<160>31<170>Patentlnversion3.1<210〉1<211〉7<212>腿<213>人工序列〈220〉<223〉BPIV3Ka序列多态性位点的侧翼序列<400>1actggtt7<210>2<2U〉12<212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223>用于向rBPIV3Ka引入SgrAl位点的位置的侧翼序列<400>2tccaacattgca12<210>3<211〉12<212〉DNA<213>人工序列〈220>〈223〉用于向rBPIV3引入SgrAl位点的位置的侧翼序列<400〉3tccaccggtgca12<210>4<211〉12<212〉DNA<213>人工序列<220><223>用于向rHPIV3JS引入SgrAl位点的位置的侧翼序列〈400〉4tccaccggtgta12<210>5<211>12<212>DNA〈213〉人工序列<220><223>用于向rHPIV3引入SgrAl位点的位置的侧翼序列<400〉5cgcaccggtgta12<210>6<211>10<212>DNA〈213>人工序列〈220><223>用于向rBPIV3Ka引入BsiWl位点的位置的侧翼序列<400>6gatataaaga10<210>7〈211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223〉用于向rBPIV3引入BsiWl位点的位置的侧翼序列<400>7gacgtaxgga10<210>8<211〉10<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>用于向rHPIV3JS引入BsiWl位点的位置的侧翼序列<400>8g3C3aasggg10〈210〉9〈211>10<212>DNA<213>人工序列<220〉〈223〉用于向rHPIV3引入BsiWl位点的位置的侧翼序列〈400〉9gacgtaxggg10<210>10<211>11<212>DNA〈213>人工序列<220〉<223〉N基因起始密码子的侧翼序列<400>10caaaaatgttg11<210〉11<211〉12<212>DNA<213>人工序列<220><223〉N基因终止密码子的侧翼序列〈400〉11gcaactaatcga12〈210>12〈211〉12<212>DNA〈213>人工序列<220><223〉引入到N基因起始密码子上的限制性位点的侧翼序列<400>12taacca.tggtga12〈210>13<211>12<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223〉引入到N基因终止密码子上的限制性位点的侧翼序列〈400〉13gcacttaagcac12<210〉14<211〉12<212〉DNA<213>人工序列<220〉〈223〉用以恢复N基因起始密码子前后序列的突变的侧翼序列<400>14caaaaatgttga12<210>15<211>12<212〉DNA<213〉人工序列〈220><223>用以恢复N基因终止密码子前后序列的突变的侧翼序列<400>15gcaactagtcga12<210>16<211〉40<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉rJS中N基因起始密码子的侧翼序列〈400>16ggaactctataatttcaaaaatgttgagcctatttgatac40<210>17〈211〉40<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>cKa和cSF中N基因起始密码子的侧翼序列〈400〉17ggaactctataatttcaaaaatgttgagtctattcgacac40〈210〉18〈211〉40<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223〉Ka和SF中N基因起始密码子的侧翼序列<400>18gaaatcctaagactgtaatcatgttgagtctattcgacac40<210〉19〈211〉40<212>DNA〈213〉人工序列<220><223>rJS中N基因终止密码子的侧翼序列<400>19ttaacgcatttggaagcaactaatcgaatcaacattttaa40<210>20<211>40<212>腿〈213〉人工序列<220><223>cKa和cSF中N基因终止密码子的侧翼序列<400〉20tcagtgcattcggaagcaactagtcgaatcaacattttaa40<210>21〈211〉40<212>DNA〈213〉人工序列<220><223>Ka和SF中N基因终止密码子的侧翼序列<400>21tcagtgcattcggaagcaactagtcacaaagagatgacca40<210>22<211>15456〈212〉DNA<213>牛副流感病毒3(Ka株)〈400〉223cca^ca^gagaagagactggtttggg^犯cttaggat60taaagawtttaccgaaaggt犯gggga犯gaaatcctaagactgtaatcatgttgagtc120tattcgacacattcagtgcgcgtaggcaggagaacataacgaaatcagctggtggggctg180ttattcccggactgtgtctatatttgctcttggaccatcaataacagatg240acaatgataaaMgacattggctcttctctttttgtCtCELttctttagac300agcatgcgcatttttagtttctctgttatcaatggcttatgccaacccag360ggtagtaatgatatgttatctacatgat已g420ag已aaga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修饰。16.权利要求15的嵌合PIV，其中至少一种其它减毒突变被导致氨基酸点突变的密码子中多重核苷酸改变而稳定化。17.权利要求15的嵌合PIV，其中所述基因组或反基因组包含至少一个直至全部减毒突变，其导致了以下氨基酸取代在L蛋白中相应于JS的Tyr942、Leu992或Thrl558的位点处，在N蛋白中相应于JS的残基Val96或Ser389的位点处，在C蛋白中相应于JS的Ile96的位点处，在M蛋白中相应于JS的Pro199的位点处，在F蛋白中相应于JS的残基Ile420或Ala450的位点处，在FIN蛋白中相应于JS的残基Val384的位点处；嵌合病毒3，前导序列在相应于JScp45的23、24、28或45位核苷酸的位点处的核苷酸取代；和/或N基因起始序列在相应于JScp45的62位核苷酸位置处的突变。18.权利要求15的嵌合PIV，其中所述额外的突变是在PIVN、P、C、D、V、M、F、HN和/或L基因中的一种或多种和/或3'前导区、5'非转录尾区、RNA编辑位点、包壳信号和/或基因间区中的点突变。19.权利要求1的嵌合PIV，其中所述嵌合基因组或反基因组的一种或多种基因通过以下突变整体或部分删除或基因的表达降低或消除RNA编辑位点中的突变，移码突变，改变起始密码子指定的氨基酸的突变，或在所述基因的可读框(ORF)中引入一种或多种终止密码子。20.权利要求19的嵌合PIV，其中在所述嵌合基因组或反基因组中引入修饰，包括C、D和/或VORF中一种或多种的部分或完全删除，或者减少或消除所述C、D和/或VORF中一种或多种的表达的一种或多种核苷酸改变。21.权利要求18-20任一项的嵌合PIV，其中所述嵌合基因组或反基因组被进一步修饰，以编码能引发哺乳动物宿主的保护性免疫应答的细胞因子、辅助T淋巴细胞表位、限制性位点标记或微生物病原的蛋白。22.权利要求5的嵌合PIV，其中所述嵌合基因组或反基因组进一步包含编码一种或多种异源病原的一种或多种抗原决定簇的一种或多种异源基因或基因组区段。23.权利要求22的嵌合PIV，其中背景基因组或反基因组是部分或完整的HPIV3基因组或反基因组，并且编码抗原决定簇的异源基因或基因组区段是一种或多种异源HPIV。24.权利要求22的嵌合PIV，其中所述嵌合基因组或反基因组包含导致减毒的BPIV的一种或多种基因或基因组区段。25.权利要求2的嵌合PIV，其中编码一种或多种HN和/或F糖蛋白或其抗原结构域、片段或表位的一种或多种HPIV1或HPIV2基因或基因组区段，被加入或合并到所述部分或完整的HPIV3载体基因组或反基因组中。26.权利要求25的嵌合PIV，其中编码HN和F糖蛋白的两种HPIV1基因均取代了嵌合基因组或反基因组中的对应HPIV3HN和F基因，并且编码HPIV2的一种或多种抗原决定簇的一种或多种基因或基因区段被加入到嵌合基因组或反基因组中。27.权利要求26的嵌合PIV，其中包含HPIV2HN或F基因的可读框(ORF)的转录单位被添加到嵌合基因组或反基因组中。28.权利要求2的嵌合PIV，其中背景基因组或反基因组是BPIV基因组或反基因组，并且其中所述一种或多种基因或基因区段编码一种或多种HPIV1、HPIV2或HPIV3HN和F糖蛋白或者其抗原结构域、片段或表位。29.权利要求22的嵌合PIV，其中所述异源病原选自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒A亚型和B亚型、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒1型和2型、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、EB病毒、线状病毒、布尼亚病毒、黄病毒、甲病毒和流感病毒。30.权利要求29的嵌合PIV,其中所述一种或多种异源抗原决定簇选自麻疹病毒的HA和F蛋白、呼吸道合胞病毒A亚型或B亚型的F、G、SH和M2蛋白、腮腺炎病毒的HN和F蛋白、人乳头瘤病毒L1蛋白、人免疫缺陷病毒1型和2型的gpl60蛋白、单纯疱疹病毒和巨细胞病毒的gB、gC、gD、gE、gG、gH、gl、gj、gK、gL和gM蛋白、狂犬病病毒G蛋白、EB病毒gp350蛋白、线状病毒G蛋白、布尼亚病毒G蛋白、黄病毒E和NS1蛋白和甲病毒E蛋白，以及其抗原结构域、片段和表位。31.权利要求30的嵌合PIV，其中所述异源病原是麻疹病毒，而所述异源抗原决定簇选自麻疹病毒HA和F蛋白以及其抗原结构域、片段和表位。32.权利要求31的嵌合PIV,其中包含麻疹病毒HA基因的可读框(ORF)的转录单位被添加到包含HPIV3背景基因组或反基因组的嵌合基因组或反基因组中。33.权利要求22的嵌合PIV，其包含来自呼吸道合胞病毒(RSV)的基因或基因组区段。34.权利要求33的嵌合PIV，其中所述来自RSV的基因或基因组区段编码RSVF和/或G糖蛋白或其免疫原性结构域或表位。35.前述权利要求任一项的嵌合PIV，其是亚病毒颗粒。36.—种用于引发抗PIV的免疫应答的免疫原性组合物，其在生理上可接受的载体中包含免疫充分量的任何前述权利要求的嵌合PIV。37.权利要求36的免疫原性组合物，配制成10、1(^PFU的剂量。38.权利要求36或37的免疫原性组合物，配制用于通过喷雾、滴剂或气雾剂向上呼吸道给药。39.权利要求36-38任一项的免疫原性组合物，其中所述嵌合PIV引发对抗至少两种选自HPIV1、HPIV2和HPIV3的病毒的免疫应答。40.权利要求39的免疫原性组合物，其中所述嵌合PIV引发对抗HPIV3和选自HPIV1和HPIV2的另一病毒的免疫应答。41.一种分离的多核苷酸分子，包括编码权利要求l-35任一项的嵌合PIV的基因组或反基因组的多核苷酸。42.从一种或多种编码所述PIV的分离的多核苷酸分子制备感染性减毒的嵌合PIV颗粒的方法，包括在细胞或无细胞裂解物中表达表达载体，所述表达载体包含权利要求41的分离的多核苷酸和PIVN、P和L蛋白。43.权利要求42的方法，其中所述嵌合PIV基因组或反基因组和N、P和L蛋白由两种或多种不同的表达载体表达。44.一种表达载体，包含可操作连接的转录启动子、权利要求41的多核苷酸序列和转录终止子。全文摘要本发明提供了减毒的感染性人-牛嵌合副流感病毒(PIV)，包含主要核壳(N)蛋白、核壳磷蛋白(P)、大的聚合酶蛋白(L)和组合了不同PIV的一种或多种异源基因或基因组区段以形成人-牛嵌合PIV基因组或反基因组的人PIV(HPIV)或牛PIV(BPIV)的部分或完整PIV背景基因组或反基因组，至少一种所述异源基因或基因区段编码PIVP蛋白。本发明还提供了编码所述病毒基因组或反基因组的分离多核苷酸，通过表达所述多核苷酸而制备病毒的方法，以及包含免疫充分量的嵌合PIV的免疫原性组合物。文档编号C07K14/115GK101392239SQ20081009852公开日2009年3月25日申请日期2000年6月15日优先权日1999年7月9日发明者亚历山大·C·施密特,安娜·P·德宾,布赖恩·R·墨菲,彼得·L·柯林斯,简·E·贝利,马里奥·H·斯基亚道普洛斯申请人:美国政府健康及人类服务部