专利名称：一种用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽。
技术背景放射性核素标记的多肽类分子探针在肿瘤显像领域有广阔的应用前景1.多肽 分子量小，免疫原性低；2.放射性核素标记方法简单易行；3.多肽合成简单、经济。 目前开发放射性核素标记的多肽类显像剂是医学中的热门领域。Liu等(Liu S, Hsieh WY, Jiang Y et al. Evaluation of a (99m) Tc-labeled cyclic RGD tetramer for noninvasive imaging integrin alpha(v) beta3-positive breast cancer[J]. Bioconjug Chem. 2007 18(2):438-46滩过用放射性核素""Yc标记与整合素 |33特异性结合的RGD多肽， SPECT显像显示小鼠肿瘤部位放射性高浓聚。日本学者Hanaoka等(Hirofumi Hanaoka， Takahiro Mukai， Sayo Habashita et al. Chemical design of a radiolabeled gelatinase inhibitor peptide for the imaging of gelatinase activity in tumors[J]. Nuclear Medicine and Biology, 2007, 34(5):503-510)设计了一条环肽CTTHWGFTLC,这条多 肽可以选择性抑制明胶酶，通过将放射性核素min连接到多肽上可以靶向肿瘤内的 明胶酶，从而达到对肿瘤进行显像的目的。在荷瘤小鼠肿瘤显像研究中，min标记 的CTTHWGFTLC可以特异性的聚集于小鼠肿瘤内并能清晰地显示出肿瘤。胃泌素 /CCK-2受体在90%的甲状腺髓样癌及60%的小细胞肺癌中过表达，在正常组织中 低表达或无表达(Brillouet S, Caselles O, Dierickx L O et al. Preclinical evaluation of new radioligand of cholecystokinin/gastrin receptors in endocrine tumors xenograft nude mice[J]. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 2007, 571 (2): 160-164.)。 Sosabowski JK等(Sosabowski JK, Lee M, Dekker BA et al. Formulation development and manufacturing of a gastrin/CCK-2 receptor targeting peptide as an intermediate drug product for a clinical imaging study [ J] European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2007,31 (2): 102-111)通过将放射性核素min与胃泌素类似物APH070连接，可以 特异性靶向肿瘤中的胃泌素/CCK-2受体，动物实验结果表明min标记的APH070 在小鼠肿瘤内高浓聚。血管活性肠肽(VIP)受体过量表达于多种肿瘤中，因此放射 性核素标记的VIP类似物可以通过与VIP受体特异性结合而靶向肿瘤。Kothari K等99m(Kothari K, Prasad S， Korde A et al. Tc(CO人-VIP analogues: Preparation andimaging agent[J]. Applied Radiation and Isotopes. 2007， 65 (4): 382-386)将放射性核素"、c标记于VIP类似物，动物实验结果显示肿瘤内放射性 高浓聚。Brown (Brown CK, Modzelewski RA, Johnson CS, et al. A novel approach for the identification of unique tumor vasculature binding peptides using an E. coli peptide display library[J]. Annals of Surgical Oncology, 2000， 7(10): 743-749)等通过一种体外 大肠杆菌系统(FliTrx大肠杆菌肽展示文库)发现了RRL三肽序列，通过肿瘤源性 内皮细胞(TDEC)的体外结合试验证实RRL三肽序列可与TDEC特异性结合，因 此RRL三肽序列得到研究者的关注，将其应用于诊断耙点研究。Gregory等(Gregory ER, Michael KK， Ruth A. Ultrasonic Imaging of Tumor Angiogenesis Using Contrast Microbubbles Targeted via the Tumor-Binding Peptide Arginine-Arginine-Leucine[J]. Cancer Research, 2005,65(2): 533-539)将微泡(MB) 与RRL三肽序列连接，观察其对TDEC和人冠状动脉内皮细胞的结合情况，结果显 示肿瘤源性内皮细胞比正常的内皮细胞有更高的MBRRL粘合性(尸<0.01) 。 Weller 等将微泡(MB)连接的RRL三肽以静脉弹丸方式注射于荷瘤小鼠(Clone C及PC3 肿瘤)，进行时控超声显像，结果显示在荷瘤小鼠注射MB,后肿瘤区域有明显的 回声信号，注射MBc。n^后肿瘤区域显示出背景回声信号。Wdler等还用荧光标记 RRL三肽，尾静脉注射到荷PC3和Clone C肿瘤的裸鼠中，五小时左右处死小鼠， 取其心、肺、肾、肝、脾、肠、肿瘤，冷冻切片通过荧光定位观察，结果显示无论 在PC3或Clone C肿瘤，都有明显的荧光信号；而对照肽在任何一种肿瘤内均无聚 集，除了肾，在其它器官如心、肝、肺、脾或消化道没有荧光信号。Henry等(Henry DO, Chen SC， Wong MK. Targeted molecular imaging of prostate cancer using tumor endothelium homing Arg-Arg-Leu peptides[J]. Journal of Clinical Oncology, 2006, 24(18S):14582)利用Alexa 680, 800两种近红外染料与含RRL肽结 合，嵌合物通过静脉注射于荷PC3前列腺癌小鼠中，进行肿瘤荧光显像。结果显示 整体动物除肿瘤外，未显示出其它部位的显像。肿瘤组织冰冻切片后免疫组化分析 显示RRL与VIII因子共同定位于肿瘤血管。目前国内外尚无关于用放射性核素标记RRL多肽的相关研究报道。 发明内容本发明的目的是一种用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽。 本发明所提供的用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽，是放射性同位素标记 的由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽。所述多肽中的两个Cys之间形成二硫键。所述放射性同位素为1311或mI;所述放射性同位素标记于所述多肽的Tyr上。 本发明还提供上述用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽的制备方法。 上述用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽的制备方法，是合成由序列表中序 列1所示的氨基酸序列组成的多肽，并使其两个Cys之间形成二硫键，将得到的多 肽按氯氨-T法标记131I得到用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽。本发明的用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽可以与肿瘤新生血管特异性结 合，从而特异的定位于肿瘤中，这对肿瘤的早期诊断提供了帮助。放射性同位素标 记多肽相对于其他显像剂具有如下优点l分子量小，在体内无免疫原性；2合成 过程简单、成本低；3靶向肿瘤血管，具有广谱性，可以诊断大多数肿瘤。
图1为本发明的多肽结构式及其HPLC结果图；图中A为本发明多肽化合物的 结构式；B为本发明的多肽的HPLC结果图，其纯度高达99.56%。 图2为本发明的多肽质谱分析结果3为本发明的1311标记化合物Sephadex G-25纯化后各管放射性活度分布图，图中可见共有2个放射性峰。图4为本发明的I标记化合物280nm吸光度图5为本发明的标记化合物在人血清中在37。C下放化纯曲线图6为荷瘤裸鼠的SPECT显像情况，图中A为对照显像，图中B为标记RRL多肽的肿瘤显像。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均属于常规方法。实施例1、本发明用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽的制备及其效果验证1、用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽的设计与合成设计用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽，其序列如下所述 Tyr-Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cys (序列表中序列l);该序列中含有可与 肿瘤源性内皮细胞结合的RRL三肽序列，因此将其命名为RRL多肽。其中 Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cys片断通过二硫键形成环形结构，可以增加多肽 的稳定性，Tyr的引入可以使该多肽进行131I标记。由Apex 396多肽合成仪采用固相法(浦迎秋，闫琰,黄艳.固相合成血管紧张素II及其反相高效液相色谱纯化与分析[J].中南药学,2007,5(4):308-311.)合成的具有上述 序列的多肽，合成过程中通过氧化反应使该多肽的两个Cys之间形成二硫键结构， 以维持多肽的稳定。将该多肽进行质谱分析检测证实，结果如图2所示，结果表明， 该多肽的结构示意图如图1中A所示，图1中A的结构式左端连接的H是最左端氨 基酸的一个H原子，右端的氨基是酰胺化的结果。2、 皿多肽的1311标记通过氯氨-T法(俞惠新，谭成,陈波，等.碘标APRPGY多肽与肿瘤新生血管亲和 性的实验研究。核技术，2006， 29 (4) : 291-294)对步骤1制备的RRL多肽进行 1311标记。具体标记方法如下50吗多肽溶解于81^1的PB中(0.5M，PH7.4),然 后加入10 pl的 I Na (74 MBq),最后加入9 pl(10iig/inL)氯氨-T (Chloramine-T， 简称CH-T)，震荡反应lmin。将反应得到的含有标记化合物的反应液过Sephadex G-25柱(lx20cm)纯化，用0.1 mol/L PBS(PH7.4)洗脱，然后收集滤出液(洗脱液) 20管(0.5mL/min, 2min/管)。各管通过放射性活度计检测放射性活度及ND-1000分 光光度计(Nanodrop Technologies, Inc.)检测吸光度(波长280nm) 。 Sephadex G-25 纯化后各管洗脱液放射性活度分布如图3所示；各管洗脱液280nm吸光度情况如图 4所示。图3中的第一个峰与图4中的峰相重合，由此证明此峰为1311标记的多肽峰， 收集该峰产物即得到用于肿瘤显像的1311标记RRL多肽。通过薄层层析方法检测其 标记率和放化纯。标记率大约为60%，放化纯为96.5%。上述利用氯氨-T法标记多 肽的原理是氯氨一T (Chloraraine--T)是一种温和的氧化剂，在水溶液中产生次氯 酸，可使碘阴离子氧化成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪氨酸苯环上羟基位的一 个或两个氢，使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。3、 用于肿瘤显像的1311标记RRL多肽的体外稳定性检测；将步骤2得到的用于肿瘤显像的1311标记RRL多肽放置于人血清中，37t:下 放置24h，分别于l,2,4，8，24h，用薄层层析方法检测其放化纯。结果如图5所示， 结果表明，步骤2得到的用于肿瘤显像的mI标记RRL多肽在人血清中在37T:下其 1， 2， 4， 8， 24小时放化纯分别为:96.1， 95.7， 95,5， 94.8， 90.3。结果表明，本 发明的用于肿瘤显像的1311标记RRL多肽在体外稳定性很好。4、 体外动物实验1)荷瘤模型建立5xl06PC3细胞(购自中国协和医科大学细胞中心，前列 腺癌细胞)通过皮下接种于每只BALB/c裸鼠(购自美国Charles公司)。具体方法 为对每只裸鼠右前腋下皮下接种肿瘤细胞5xl0epC3细胞，饲养于屏障环境中，大 约21天接种部位生成直径约lcm的肿块，肿瘤模型成功的被建立。2)待荷瘤小鼠肿瘤直径达lcm左右，分别对3只荷瘤小鼠通过尾静脉每只注射 250ul含200uCi步骤2得到的用于肿瘤显像的1311标记RRL多肽的注射液，注射液 由步骤步骤2得到的用于肿瘤显像的洗脱液用生理盐水稀释而成。24小时后，进行 SPECT显像。以mi标记GGG多肽为对照，对照组处理同RRL多肽组。结果表明静脉注射了步骤2得到的用于肿瘤显像的1311标记RRL多肽的小鼠 SPECT显像可清楚地显示肿瘤部位；而对照组肿瘤不显影。部分注射了步骤2得到 的用于肿瘤显像的1311标记RRL多肽的小鼠SPECT显像结果如图6所示。序列表〈160〉1<210〉1 <211>10 〈212〉PRT <213〉人工序列〈220〉<223><400>1Tyr Cys Gly Gly Arg Arg Leu Gly Gly Cys 1 5 10
权利要求
1、一种用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽，是放射性同位素标记的由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽。
2、 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽中的两个Cys之间形成二硫键。
3、 根据权利要求2所述的多肽，其特征在于所述放射性同位素为1311或1231; 所述放射性同位素标记于所述多肽的Tyr上。
4、 根据权利要求3所述的多肽，其特征在于所述放射性同位素为1311;所述 mi标记于所述多肽的Tyr上。
5、 权利要求4所述用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽的制备方法，是合成 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽，并使其两个Cys之间形成二硫键， 将得到的多肽按氯氨-T法标记1311得到用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽。
全文摘要
本发明公开了一种用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽。该多肽，是放射性同位素标记的由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽。所述多肽中的两个Cys之间形成二硫键。本发明的用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽可以与肿瘤新生血管特异性结合，从而特异的定位于肿瘤中，这对肿瘤的早期诊断提供了帮助。放射性同位素标记多肽相对于其他显像剂具有如下优点1.分子量小，在体内无免疫原性；2.合成过程简单、成本低；3.靶向肿瘤血管，具有广谱性，可以诊断大多数肿瘤。
文档编号C07K1/00GK101597323SQ20081011476
公开日2009年12月9日 申请日期2008年6月5日 优先权日2008年6月5日
发明者于明明, 张春丽, 王荣福, 平 闫 申请人:北京大学第一医院