专利名称：：卵巢癌抗独特型抗体与热休克蛋白融合蛋白的制备及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及卵巢癌抗独特型单链抗体6BllScFv与热休克蛋白(HSP)融合蛋白(6BllScFvHSP)的制备及其在抗卵巢癌免疫反应中的应用。
背景技术：
：卵巢癌是严重威胁妇女健康的疾病，在妇科恶性肿瘤中发病率第二位、死亡率却居首位，是妇科恶性肿瘤的主要死亡原因。由于其发病隐匿、进展迅速，70%80%的卵巢癌患者发现时已为晚期，5年生存率仅为30%左右，传统手术、化疗效果尚不满意；即使暂时控制病情，70%以上的卵巢癌最终仍会进展或复发，进一步治疗更加困难。因此，目前迫切需要更有效的治疗方法来提高卵巢癌患者的生存率，改善生活质量。肿瘤生物治疗是继传统手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗模式，肿瘤疫苗作为肿瘤生物治疗的一种，其能动员机体免疫系统发挥积极抗肿瘤作用，具有特异性、靶向性，成为传统治疗手段的有益补充，已应用于多种恶性肿瘤的临床治疗。随着生物技术的不断进步和对机体免疫反应的深入研究，肿瘤疫苗也经历了极大发展，主要包括细胞疫苗、抗原疫苗、抗独特型疫苗、肽疫苗或表位疫苗。肿瘤细胞疫苗来源于自体或异体肿瘤细胞或肿瘤细胞粗提物，由于其含有个体全部肿瘤抗原，能诱导出一定的抗肿瘤免疫反应，但是，肿瘤细胞疫苗尚存在免疫原性弱、有致瘤性等缺点，疗效和安全性受到质疑；抗原疫苗是从肿瘤细胞中提取的特异性或相关性抗原，成份明确，降低了致瘤性和自身免疫反应，但机体免疫系统对肿瘤抗原发生耐受会导致这类疫苗难以诱导出有效抗肿瘤免疫反应；抗独特型疫苗是模拟肿瘤抗原表位的内影像，与原始的肿瘤抗原不同，能够打破机体固有的免疫耐受状态，激发特异性免疫反应，同时比抗原疫苗制备过程简单，副作用轻微；6BllScFv即模拟卵巢癌相关抗原OC166-9的抗独特型单链抗体，在体内外都有刺激特异性抗卵巢癌免疫反应的能力，但分子量较小，免疫原性较弱，寻找合适的佐剂具有重要意义。热休克蛋白(HSP)是从原核生物到真核生物普遍存在的一种高度保守的蛋白质，具有分子伴侣作用，参与细胞内蛋白和多肽的折叠、装配和转运，按其分子量大小可分为多个家族，包括HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP(相对分子质量为2.0kDa)及泛素。近年研究表明热休克蛋白(HSP)具有免疫剌激作用，作为哺乳动物来源的免疫佐剂，能为免疫细胞提供协同刺激信号，激活DC并促进其分泌细胞因子，增强免疫反应强度；同时在DC表面存在特异性HSP受体(CD91,CD14,CD40,Toll样受体4和Lox-l)，利于DC细胞以受体依赖方式识别结合与HSP融合的外源性抗原，对其进行摄取呈递；此外，作为分子伴侣，HSP在DC细胞内可介导外源性抗原的交叉呈递，运载其进入MHC1类分子通路，激活肿瘤免疫所需的特异性CTL，从而激发有效抗肿瘤免疫反应。由于进化中高度保守，HSP通常被机体视为自身蛋白，作为佐剂不会因为自身复杂的表位结构影响机体对肿瘤抗原表位的免疫应答。因此，HSP作为融合疫苗的佐剂具有显著优势，是构建小分子疫苗的理想载体。在肿瘤领域中应用较多的是HSP70和Gp96两种HSP分子。目前，多种肿瘤组织来源的HSP—多肽复合物、体外结合的HSP/抗原肽复合物、重组HSP—抗原肽疫苗，经证实都能够活化细胞毒性T淋巴细胞(CTL),诱导抗肿瘤免疫应答，并且发挥免疫作用的只是HSP所伴随的抗原肽。因此，我们选用HSP70分别与6BllScFv及6Bll两条T细胞表位肽构建融合疫苗，既保存了6B11的抗原特异性，又引入了HSP的非特异免疫增强活性，预期能够产生较强的抗卵巢癌免疫反应，为进一步研究及应用奠定基础。由于HSP在不同物种之间有很高同源性，小鼠HSP70在氨基酸水平与人HSP70同源性达到95X，为了保证融合疫苗小鼠体内实验研究的顺利进行，疫苗构建及体内外研究我们都选取小鼠HSP70与单链抗体或表位肽进行融合，用于临床之前，需要进行人源化改造，用人HSP70替换鼠HSP70，从而消除异源蛋白带来的免疫不良反应，促进融合疫苗疗效的发挥。本发明用卵巢上皮癌可溶性抗原0C166-9免疫BALB/c小鼠制备抗卵巢癌单克隆抗体C0C166-9，再用C0C166-9免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术制备出一株可以模拟卵巢癌抗原0C166-9的Ab2e型抗独特型抗体6Bll(具体参见本申请人在先的专利申请CN1356341，该申请已授权)。经基因工程改造，获得6BllScFv单链抗体(参见中国专利ZL01130756.0)，同时对6B11鉴定获得了两条模拟卵巢癌抗原的T细胞表位肽(申请号中国专利申请号2006100832997.7)，这些抗独特型抗体与原始肿瘤抗原不同，有助于打破肿瘤机体的免疫耐受状况，可用于调节抗卵巢癌细胞免疫反应和进行临床治疗。
发明内容本发明将6BllScFv与小鼠热休克蛋白70(mHSP70)进行基因水平的融合，在原核表达系统中表达融合蛋白，鉴定其体内外抗卵巢癌活性，为进一步应用于临床治疗提供基础。本发明还提供了制备上述融合疫苗的具体方法。优点如下1、本发明选用mHSP70作为佐剂与6BllScFv构建融合疫苗，既保完整保存了6B11的抗原特异性，又引入了HSP的非特异免疫增强活性，预期能够产生较强的抗卵巢癌免疫反应。2、本发明的单链抗体及T细胞表位肽均来源于抗独特型抗体6B11，为一种模拟抗原，与真实的肿瘤抗原不同，可打破肿瘤机体固有免疫耐受状态，促进融合疫苗发挥抗肿瘤作用。3、本发明选用HSP70作为融合疫苗载体，可通过多个途径增强免疫反应，同时作为进化上高度保守的蛋白，HSP70参加构建融合疫苗本身副反应少，使疫苗应用于临床更加安全有效。图1为6BllScFvmHSP70融合基因表达载体图谱图2为融合蛋白诱导表达图3为不同诱导时间蛋白的表达图4为不同浓度IPTG诱导的蛋白表达图5为0.6mMIPTG，4h诱导的蛋白表达图6为稀释复性纯化过程图7为柱上复性过程图8为纯化蛋白_一柱上复性，稀释复性图9为Westernblotting测定融合蛋白HSP70部分活性图10为Westernblotting测定融合蛋白6BllScFv部分活性图11为直接ELISA测定融合蛋白6BllScFv部分活性图12为间接ELISA测定融合蛋白HSP70部分活性图13为竞争抑制ELISA—融合蛋白与OC166-9竞争结合COC166-9的能力测定图14为直接法ELISA检测6BllScFv-mHSP70模拟卵巢癌抗原OC166-9的活性的比较图15为竞争抑制ELISA检测6BllScFv-mHSP70竞争抑制卵巢癌抗原OC166-9结合卵巢癌单克隆抗体COC166-9的活性的比较图16为间接法ELISA检测6BllScFv-mHSP70与小鼠抗-HSP70抗体结合的活性的比较图17为CCK-8法淋巴细胞增殖实验图18为不同蛋白诱导的PBMC对H0C1A的杀伤作用比较图19为6BllScFv-mHSP70在相同效靶比时对不同细胞系杀伤作用的比较图20为6BllScFv-mHSP70在同一细胞系时对不同效耙比杀伤作用的比较具体实施例方式实施例1卵巢癌抗独特型抗体6B11的制备具体的制备过程参见本申请人的在先申请CN1356341，其技术路线包括以下两个主要步骤1.以卵巢上皮癌可溶性抗原0C166-9免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术制备抗卵巢癌单克隆抗体C0C166-9。2.以C0C166-9免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术制备模拟卵巢癌抗原0C166-9的抗独特型抗体。实施例2抗独特型单链抗体6BllScFv的制备.具体的制备过程参见本申请人的在先申请CN1356341，其技术路线包括以下主要步骤16B11卵巢癌抗独特型单链可变区基因的克隆及序列分析2卵巢癌抗独特型单链抗体6BllScFv在大肠杆菌中的高效表达3以包涵体形式表达的6BllScFv的复性、纯化和活性研究实施例36BllScFvmHSP70融合基因构建，蛋白表达及活性测定技术路线如下重组6BllScFvmHSP70融合基因的构建用限制性内切酶Spel和EcoRl消化pET30a(+)-6BllScFvmGM质粒，回收纯化线型PET30a(+)-6BllScFv质粒；PCR法以pET30-mHSP70为模板，克隆出小鼠HSP70全长cDNA(1929bp)，根据Genebank上基因序列(NM_010478)设计上下游引物，以粘末端连入pET30a(+)-6BllScFv质粒，构建成融合基因pET30a(+)6BllScFvmHSP70。为得到相同粘末端，在上下游引物5'端分别加入Spel和EcoRl酶切位点，下游引物5'端尚加入终止密码子TTACTA，引物序列为上游引物5，-GCGACTAGTATGGCCAAGAACACGG-3'下游引物5'-GCGGAATTCTTACTAATCCACCTCCTCGA-3'PCR条件为:95。C变性2min，95°C，20s，56°C，20s,72。C，30s，30个循环，72。C延伸3min。产物测序正确后，SPel和EcoRl双酶切，凝胶纯化回收，以T4连接酶与pET30a(+)-6BllScFv连接构成目的基因，转化入大肠杆菌DH5a,筛选阳性克隆，酶切鉴定后测序。二融合蛋白的表达，复性及纯化1融合蛋白的诱导表达测序正确的融合基因转化入大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达并对诱导剂浓度(设0，0.2,0.4,0.6,0.8，l.Oand1.2mM)及诱导时间(设lh,2h，3h,4h,5h，6h)进行优化，表达菌在37度生长至0D600达0.8时，加入IPTG，诱导一定时间，收获菌体，SDS-PAGE分析蛋白表达情况，通过凝胶灰度扫描分析确定目标蛋白最大表达量的诱导时间和IPTG浓度，以此为条件，在1LLB液体培养基中接种表达菌，诱导目的蛋白的大量表达。6000g离心15min收获细菌沉淀，用电子天平称取沉淀质量。2包含体分离及裂解细菌沉淀经PBS洗涤，重悬于超声裂解液中(50mMTris-HC1pH8.0,100mMNaCl,5mMEDTApH8.0)，lg湿菌加20ml超声裂解液，加入lmg/ml溶菌酶，冰上孵育30min，-80度及37度反复冻融46次，超声裂解细菌，释放包含体，4度，12000rpm离心15min，弃上清，收集包含体沉淀并称重(共5.4g)，沉淀经2M尿素洗涤液(lOOmMTris-HCl，2Murea，50mMNaCl，O.5mMEDTA,5mMDTT，0.02%TritonX-100)充分洗涤三次，TE(IOmMTris-HC1,lmMEDTA,pH8.O)洗涤一次，洗涤后的包含体溶解于6M盐酸胍裂解液(每lg包涵体加入20ml裂解液)(50mMTris-HC1，6M盐酸胍，100mMNaCl,5mMDTT，0.lmMPMSF)中，65度水浴2小时至包含体彻底溶解，12000rpm离心15min，上清用8M尿素裂解液(50mMTris-HCl，8Murea，100mMNaCl,lmMEDTA,5MmB-巯基乙醇)透析34次，离心取上清继续下步实验。3重组蛋白复性及纯化Bradford法或Gene-Quant测定包含体裂解液上清的蛋白浓度(约20mg/ml),分别通过稀释复性及柱上复性两种方法对重组蛋白进行复性及纯化(1)稀释复性将包含体裂解液快速稀释入新鲜配制的复性液中(50mMTris-HCl，5mMEDTA，O.5ML-Arg，50raMNaCl，pH8.0，GSH0.2mM,GSSGlmM)使蛋白终浓度为100-150iig/ml。为了提高复性效率，我们进行了续贯稀释(sequentialdilution)的复性方法，即每加入一定量的包涵体裂解液后，室温放置一小时，连续进行三次稀释复性，稀释过程迅速，水平摇晃容器，此后复性液在100C敞口静置4872小时，离心测上清蛋白浓度62.7ug/ml。稀释复性蛋白液经Ni-NTA柱(Qiagen)进行亲和层析纯化，在上柱前用20mMTris-HC1,pH8.0,0.5M尿素透析除去复性液中可能影响Ni2+-NTA柱亲和力的小分子如L-Arg和EDTA，纯化步骤按照6*His_taggedprotein纯化说明书进行(Qiagen,GeneCompanyLimited,China)(2)柱上复性层析柱采用AmershamPharmaciaBiotech公司10ml柱床，填入5mlNi-NTA填料，5倍体积的bufferE(50mMTris-HC1，8M尿素，300mMNaCl，5mM巯基乙醇，20mM咪唑,pH8.0)平衡柱床。lml包含体裂解液(20mg/ml)上样，然后用5倍体积的bufferE洗柱，去除非特异结合杂蛋白及其他杂质。复性过程是用一系列含不同浓度尿素的复性液进行阶梯式流洗。具体过程为依次用含有8M/7M/6M/5M/4M/3.5M/3M/2.5M/2M/1M/0.5M尿素，50mMTris-HC1pH8.0,300mMNaCl，及20mM咪唑的复性液流洗柱床，其中尿素浓度为5M到2M的复性液中加入lmMGSSG和0.2mMGSH组成的氧化还原体系。每种液体10倍体积流洗柱床，速度O.5ml/min。最后，用洗脱液(50mMTris-HClpH8.0，300mMNaCl，250mM咪唑，0.5M尿素)将复性蛋白从柱上洗脱下来。通过流洗液及洗脱液在280nm处的吸收峰来监测并收集蛋白液，收集液体进行SDS-PAGE分析。整个层析复性过程在PharmaciaBiotechGradiFracSystem上进行。全部蛋白洗脱液(体积6ml)用50mMTris-HClpH8.0，200rnMNaCl,0.25M尿素透析除去咪唑，测浓度(0.4mg/ml)。通过下面公式分别计算稀释复性及柱上复性蛋白复性率蛋白复性得率(％)-复性后样品量(未纯化时)/复性前样品量X100X三重组蛋白鉴定及测活1ELISA方法测定重组蛋白活性(1)直接ELISA检测融合蛋白6BllScFv部分活性lOOu110ug/ml的复性蛋白倍比稀释包板，6B11完整抗体作阳性对照，10%羊血清作阴性对照包板，4oC过夜。次日PBS-T洗三次，每次5min，向各孔分别加入100ul10%羊血清，37oC.封闭1小时；PBS-T洗三次，每次5min，再向各孔加入100p1辣根过氧化物酶标记的COC166-9(本室制备，浓度50ug/ml)，其中空白对照孔用PBS代替酶标COC166-9，37°C孵育1小时，PBS-T洗三次，每次5min，然后分别加入100ix1显色底物OPDs室温避光5min，加50u12MH2S04终止反应，酶标仪上读取490nm光密度值(Bio-RadModel550，Hercules,CA)。(2)间接ELISA测融合蛋甴HSP70部分活性包板同前，抗mHSP70单克隆抗体(l:2500稀释)作一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG1(396羊血清1:2000稀释)作二抗，常规ELISA,酶标仪读取490nm光密度值。(3)竞争抑制ELISA测定融合蛋白模拟0C166-9竞争结合C0C166-9的能力卵巢癌患者腹水提取物100ul包板(浓度20ug/ml,含2ugOClQ6-9)4oC过夜，倍比稀释的复性蛋白(20ug/m起)分别和酶标COC166-9U.5ug/ml)在EP管中室温孵育30min进行反应，100u1各管反应产物加入ELISA反应孔，37oC孵育2h，对照孔只加入显色底物而不加入管内反应产物(未抑制孔)，常规ELISA，酶标仪读取490咖光密度值(A490)。抑制率(%)=[A490(未抑制孔)—A490(检测孔)/A490(未抑制孔)]X100%2Westernblotting鉴定融合蛋白复性蛋白经8%SDS-PAGE电泳后，IOOV，1小时湿转至PVDF膜(Millipore)。5%脱脂奶室温封闭1小时，加入l:2500稀释的抗mHSP70单克隆抗体，或者1:50稀释的COC166-9,摇床，4度孵育过夜，次日TBS-T洗三次，每次15min，加入l:2000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgGl，摇床，室温孵育l小时，TBS-T充分洗涤后化学发光显影(SantaCruzBiotechnology)。四融合疫苗体外抗卵巢癌免疫活性的测定16BllScFv-mHSP70融合蛋白的活性比较(1)直接法ELISA检测6BllScFv-mHSP70模拟卵巢癌抗原OC166-9的活性的比较6BllScFv-mHSP70融合蛋白、6BllScFv自2pmol/ml倍比稀释，包被酶标板，6B11完整抗体作阳性对照，10。/。羊血清作阴性对照4。C过夜。次日加含10%羊血清的PBS100nl/孔，37。C封闭lh。力卩3。/。羊血清稀释的HRP-COC166-9(浓度50ug/ml)100nl/孔，其中空白对照孔用PBS代替HRP-COC166-9，37。C孵育lh。每次加样前PBS-T洗3次，显色，测吸光度值A490。结果见附图14。(2)竞争抑制ELISA检测6BllScFv-mHSP70竞争抑制卵巢癌抗原OC166-9结合卵巢癌单克隆抗体COC166-9的活性的比较含OC166-9的卵巢癌患者腹水提取物100ul包板(浓度lug/ml)，4T过夜。次曰加含10。/。羊血清的PBS100nl/孔，37。C封闭lh。一系列EP管中加入倍比稀释的6BllScFv曙mHSP70融合蛋白、6BllScFv(2umol/ml起)禾HHRP-COC166-9(50ug/ml)，室温孵育30分钟。向反应孔中分别加入100[il各管反应产物，37°C孵育lh。阳性对照只加HRP-COC166-9(未抑制孔)。阴性对照只加显色底物液。除最后一步外，每次加样前PBS-T洗3次，显色，测A490nm值。计算抑制率抑制率(％)二[A490(未抑制孑L)—A490(检测孔)/A490(未抑制孔)]xl00%。结果见附图15。(3)间接法ELISA检测6B11ScFv-mHSP70与小鼠抗-HSP70抗体结合的活性的比较6BllScFv-mHSP70融合蛋白、mHSP70包板(2nmol/ml)。次日加10(HU3%羊血清稀释的抗一HSP70单克隆抗体(1:2500稀释)，空白对照孔用PBS代替抗一HSP70，37。C孵育lh。加100[ilHRP-羊抗鼠IgG(3%羊血清l:2000稀释)，370C孵育lh，每次加样前PBS-T洗3次，显色，测A490nm值。结果见附图16。2外周血单个核细胞(PBMC)的分离采集HLA-A2阳性的女性健康志愿者的PBMC，用PBS按1:l比例稀释混匀，1000rpm/min离心10min，弃上清以去除血小板；铺制淋巴细胞分离液，2000-2500rpm/min离心20min。外周血PBMC单独位于一层，呈白色膜状；吸取PBMC，移入另一离心管，PBS洗涤2次，1000rpm/min离心5min,不全RPMI1640培养液洗涤一次，台盼蓝染色并计数(活细胞占95%),用完全RPMI1640调整细胞浓度为5xlO"ml。分离过程中，温度控制在18-28'C。3淋巴细胞增殖实验(CCK-8法)按照CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)说明，将用培养基分别倍比稀释6BllScFv-mHSP70融合蛋白、6BllScFv、mHSP70(从1.6至U0.1umol/ml)50ul至于96孔板中，力口PBMC2xl()6/ml50ul。阴性对照只力口lxl()6/mlPBMC100ul，空白对照只加100ul培养液。每个样品有5个复孔。在37'C，5MC02培养箱中共同孵育4h。每孔加入10ulCCK-8溶液，继续培养4h。测定A450值。结果见附图17，经融合蛋白刺激PBMC后的增殖作用最高，与其他对照组相比有统计学差异(P<0.05)。4流式细胞仪分析细胞表型调整PBMC4xl()6/ml，实验组每2mlPBMC加入IL-4、GM-CSF各1000u/ml，再分别加入6B11ScFv-mHSP70融合蛋白0.1umol/ml、6B11ScFv0.8umol/ml、mHSP700.2umoI/ml培养3天，培养第四天再次加入IL-4、GM-CSF各1000u/ml和6BllScFv-mHSP70融合蛋白0.1umol/ml、6BllScFv0.8umol/ml、mHSP700.2umol/ml继续培养3天，最后加入IL-21000u/ml培养3天后做流式分析。培养对照组只加细胞因子。未培养对照组PBMC4xl06/ml，取lml做流式。以上各组各设2个平行管。以上各组PBMC经刺激培养后悬浮为1x106/ml，取1OOul分别加入标记好的小鼠抗人单克隆抗体CD3-PerCP5ul、CD4-FITC5ul、CD8-APC3ul;取标记好的小鼠抗人单克隆抗体IgG-FITC、IgG-APC作为对照；分别吹打混匀，置暗处标记，4'C15分钟；PBS洗2次，第一次，用800ul含5。/。FBS和0.02Q/。叠氮钠的PBS洗。第二次，用800ulPBS洗，以洗去多余的二抗；离心后细胞重悬于200ulPBS中，吹打混匀，置于FCM专用分析管中，用美国BectonDickinson流式细胞仪分析。结果见表l。表l不同蛋白刺激PBMC前后正常人T细胞表型分析<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*为各蛋白组及培养对照组与未培养对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05)PBMC经融合蛋白及细胞因子共同刺激后，CD3+、CD4+、CD8+T细胞比培养对照组及未培养对照组均明显增加，CD4+ZCD8+比值明显增加。融合蛋白刺激PBMC后，CD8+、CD3+和CD4+T细胞的增加比6BllScFv及mHSP70刺激组均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。5LDH释放实验复苏冻存的肿瘤细胞卵巢癌H0C1A细胞(HLA-A2+，OC166-9+)、卵巢癌SKOV3细胞(HLA-A2—，OC166-9+)、肝癌HLE细胞(HLA-A2+，OC166-9一)。HOCIA用完全MCDB培养液传代培养，SKOV3及HLE用完全RPMI1640培养液传代培养，收获对数生长期细胞并调整细胞浓度为2xl06/！111。刺激后的PBMC作为效应细胞，培养刺激过程同流式分析。按照LDH试剂盒(Promaga公司)说明，设实验孔、效应细胞自然释放孔、靶细胞自然释放孔、靶细胞最大释放孔、体积校正对照孔、培养液背景对照孔。于96孔U形培养板中，效应细胞与靶细胞的比例设为100:1、50:1、25:1、12.5:1。在37。C、5。/。C02培养箱中共同孵育4h;收获前45min，向靶细胞最大释放孔及体积校正对照孔加10ul裂解液/100ul培养液，在37'C、5y。C02培养箱中继续培养至4h。1000rpm离心4min;每孔分别吸取50ul上清至96孔酶标板，加入50ul重悬底物混合液/孔，避光，室温30min;测A490值。每组设4个复孔。计算杀伤率杀伤率(％)=(实验细胞释放一效应细胞自然释放一靶细胞自然释放)X100。/。/(靶细胞最大释放一耙细胞自然释放)。结果见表2，附图18—20。表2不同蛋白剌激正常人外周血单个核细胞对肿瘤的杀伤作用杀伤率％靶细胞蛋白效紀比<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*为在相同效靶比时，各蛋白疫苗组对同一靶细胞的杀伤作用与PBMC组比较差异有统计学意义**为在相同效靶比时，各蛋白疫苗组对H0C1A的杀伤作用与对SK0V3及HLE比较异有统计学意义在相同的效靶比下，6BllScFv-mHSP70融合蛋白刺激诱导的PBMC对H0C1A的杀伤高于未经任何蛋白刺激的PBMC组，而且杀伤率的高低随效靶比的增加而升高，差异有显著性(尸<0.05)。说明6BllScFv-mHSP70融合蛋白刺激诱导PBMC对耙细胞可以产生特异性的杀伤作用。且在实验范围内与效靶比成正比，即效应细胞越多，杀伤作用越大。6B11ScFv-mHSP70融合蛋白刺激诱导的PBMC对HOC1A细胞系的杀伤较6BllScFv、mHSP70组明显增高；在效耙比为100:1、50:1、25:1时，6BllScFv-mHSP70融合蛋白组对HOClA的杀伤较6BllScFv、mHSP70组高，杀伤率均有显著性差异(P<0.05)，证明融合蛋白具有刺激PBMC产生特异性的杀伤作用。所以，由融合蛋白诱导PBMC产生的杀伤效果强于6BllScFv组和mHSP70组。权利要求1.一种卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与热休克蛋白(HSP)构建的融合蛋白(6B11ScFvHSP)。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中热休克蛋白为鼠热休克蛋白。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中热休克蛋白为鼠热休克蛋白70.4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中热休克蛋白蛋白为人休克蛋白。5.如权利要求1所述的6BllScFvHSP融合蛋白在卵巢癌免疫治疗中的应用。全文摘要本发明涉及卵巢癌抗独特型抗体与热休克蛋白融合蛋白的制备及应用。本发明进行了卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与热休克蛋白(HSP)融合蛋白(6B11ScFvHSP)的构建、制备及其体外抗卵巢癌活性的研究，该融合疫苗同时具备了6B11ScFv特异性抗卵巢癌活性及HSP非特异性免疫刺激作用，能够有效刺激体内外抗卵巢癌免疫反应，在卵巢癌治疗中具有良好的应用前景。文档编号C07K19/00GK101381414SQ200810132978公开日2009年3月11日申请日期2008年7月4日优先权日2008年7月4日发明者付天云,刘春雨,雪叶,恒崔,果张,成夜霞,昌晓红,程洪艳申请人:北京大学人民医院