专利名称：：表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法及其用途的制作方法表面^^厲离子的磁性二氣4I^^!备方法及其用途駄领域本发明属于材^l域，^tMU用于M^IF菌中分离六ll^^l白的材料。生!^SI^^是在^8i^fi^K^R&Jb^1^,以细龐、细菌、核酸和蛋白JWi物体为Jgffl^的H^^离^,^*1^^￡^&#^卜M^用下i^ffii^H^,对目旨iwj^fim、富集、分awi化，早期的工作i^i中于^K4^ietiWil^t上，^ss过在i^E体中g^，性^m邻附，^m聚丙iftKK、鹧:z^gZ^^l^l^中'这flW纖大小分布均匀M^tl^匀纖，舰了不同生纖鹏的可重现性和可皿。生iW分离^l^准分离^9比有一定^,首5fc^离nga常非常简单，只涉及几个鹏步骤.所有,鄉m^在单^t離織中发生，不窬要昂贵wi[相色谱系厲、离(浙、过^s微其它设备。分离过程可以在含有悬浮圏傳物M^粗,品iA^行，,對青况下(例如细胞内蛋白质的提取)甚至可以整^lfla分离步骤，从而缩短ftt分离时间。磁分离技术对细胞、蛋白质和核^it^通常是非雜和的。与离鹏心和亲和色谱相比，磁分离技术具WS低的剪切力，^W地麟被分离细胞的活力和生物肝的生物活性》目前，生繊分离技术正賊为生##翔究的~^重醉段。鄉胞生物学领域中，職*面被的不同蛋白质，表面结辦#体的^^舰来分离富##^类梨的细胞。在蛋白^f^i内，職蛋白质表面雖或iim鲺翻的差异，利用金属l^離'麟，说蛋白;itt行分离、宫集和纯化，在肝生物糊究中，经職及繊的分离^l化，基于麟的核^l肪法具有高效舰和易于自靴鰣点，正在逐步靴微的赫卿法,nay^于核酸,取、纯化、序列测定w增等过程中。,髙w^m^wmM^散自珠法、单，、^^、大^稳定铁氣化^Wt、天^8^t、磁性转化法。传统皿淀富集，*^^可^1^,用a^^离细iii8RS液中的蛋白质，几乎不霱要^5fe^，与其lfc^相比，4辦^tt^^l^'要从^Jt、培养J^m、血糖、駄中分离蛋白质，用^fr、分析，,*^为固《体》1^豕腚的髓在于^M结絲力学和简单的分离'15^^,在蛋白鹏化中，为了得到髙销合容酺鹏大孔如Jl^3,5,,并用^1|^的酶，生棘鄉的j^蛋白(I讲)可WmW^iJB^M:,键合l^的,不会因L^^而改变a1^#^^#是20H^鄉的一^^ft告基因fitilM瞧餘，其主要jta&^用飾鹏^s祀蛋白iim因的3端或5^H^某种織^ii^，MJlJifi,^3feSBa^蛋誠，鋭fi^ll白质可KUiifilfe飾^^爐在固:ISII赝上&^ffia^^而Jlff纯化，目前常用的蛋白纯tt^ffiiGST,His^fef^。最常用6tl^l^5mS酸*即His磁,^^由610"1i^MlSKm暨于蛋白的^^s糊,His職与其它^^相比有很多明显微:d^繊离子如镍、f6W^度繊ffl4和亲和力:鹏誠离子的结合不S3^剂很索、胍的糊:娜和多样fl^餅(10025ftiraol/Lol/L咪哇，低pH,Ktool/Lol/LEOTA)。目前己有各种商品化介质(Ni-WA—Agarose,Ni—IM-Agarose)提供，另夕卜，抗His織的单滅多抗也被应用于His融合蛋白,化。金厲^#1^色潘(Irnnol/LobilizedMetalionAffinityChrooatography,I舰C)最早是由Porath于l975年提出的.Porath认为，某些蛋白质与S^厲离子之间的亲和力可以作^31代色^m7Jt中蛋白质分离与纯化WMi,力。具有錢特性的蛋白质^^m氛ii^半fifeftp^^w片段，可以与其产生一辨异tt^和力的金属离子主要是过鹏^JR离子ZrAOAOf、Hg"、Co》、W等。Porath以劇織为基质，环諷氣丙烷为^！1，亚MS二乙酸(IDA)为ES合成了一系列分别S^Cif、Sf、Ni&、fc，新色谱TO，并用该系歹WW4对血淸蛋白分别进行了分离纯化，例如，专利号为20071004,、发明名称为《一种褒面圏定金厲离子的磁性自及其带洛:^i应用》专利中，采用(2,3—环氧丙氧基)丙基三乙l^^和亚自二乙酸(IDA)对其进行表面化学,，进而固定金属离子衝获得该固定金厲离子的sitt,作为微吸附剂。在常见的络合剂中舰脏配位，与金厲离子之间的作用力比较弱，银容易引起彌离子KM问题，關，N'-三傻甲基)乙烯:iM孤JiSSS&，与^H离子,用力娜由于其仅^Ni^蛋白jr作用，所以和蛋白质的作用力x^弱，
发明内容本发明所要,fl^问邇在于MLfciilt性高分f^,备方法的缺点摁供一鄉it^i、工2BT行、^HW便、贿ffl)IHiit臓面3^yil离^m二氧化硅鹏制备滩。本发明ff5解决的技术问麗在于^一种表面M^鹏离子KHi性:^化硅,的新用途。解决±^问,^1的^;5^该镧备:!&^#驟如下将"h^a&H甲ffiSWi铵与甲^SyRit妙1:1220ftjAi鹏口繊内，用#器以1000转/^JW均匀，将PeClHftO与FeCk6fW，ft比为"3溶解于二^K中，R^W^为13(H4S0g/L的水m在23nL/ninIi气微下将此溶液以45ri7h滴加泰JJ^i^中，800转/^^1#46小时，再3taAJI*为25%跳+7^^甲織化铵与^1^为2S^K的戯妙1:O.卜O丄以800转/W^g^2小时，在混，中，有四氧ltHl^^Pt形成。将十^^H甲基溴化铵与正JW乙鼸,量比为1:11.5的iB^ZJI缓働fl入，以800转/##1鹏，群pH至8，以23mL/h滴加正職乙麟毕后l小时，停止氮气做，鄉转/^，常温常压下老化5无a^中加入乙醇，十^X三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1:22.5,以2000转/辦萬心40分钟，去掉JiM液，沉淀鹏乙醇中回流12小时，回流乙醇用S^b^三￥基謝七铵与，的|1比为1:20~幼计》,M^温，离心分离，去掉JlM亮黄色溶液。纖色沉淀用乙酵、水、丙敝替洗涤，放入真^m箱内601C残1224小时，制备,ftz:氣化硅,a2、磁性:r^化硅,的环氣皿繊性ilaili^^甲苯^l量比为1:IOHIOO加AH口纖，用,^mm率为60Hz的超声处理10，，在23mL/minffe气旨下，再JRA与该混雜麵量比为1:25的3-缩水甘油^RX丙基三甲氧^^800转/^ffi拌，11(TC回流12小吋，用外*#11淀物分离，依細二甲基甲繊、彌、脉乙醇、*^3次，MA真空^H^I内e0lC预1224小时，制备戯面键辨7鰱的磁性二氧ttilii^3、磁性:m^^^^将b^^K与^jmSSfl^eog/l的ifem;!K^^llft比为i:15,潘台溶解inA两口自内，用IS8^il以iooo转/^MSS^，使棘沐至&再JtaA与该泡^y^比为i:wo,性:JRifc^i^80o转/^ma^，并;Wfe至8(rc反应24小时。反m^毕，用外^m铁:f^分离，用0.51101/1乙8^:淀10^后，弃去乙酸，用二ifc^涤沉淀3次，4^ft^^feAII空T^内601C伟1224小时，帝條成L"^冬银靴的磁tt^條眺将澳诚与鹏微为60g/L的纖;!l^MM量比为h15幼m^W加入两口自内，^^#以1000$|/^|^^均匀，调节沐至9,再JtaA与m^iElli:比为1:100200的L-^冬IP^fc的iift:ifl化e^,24小时。碰完毕，用外IP^^臓敝离,用0*Snol/Lft化钠水,洗涤沉淀610次，再用二次水610次，放入真空干燥箱内60C1224小时,W^H^t的磁性:^t化链麟，4、金属离子的齡繊基化的磁性二氣化硅微球与赚为0,2mol/L的Coa',按貭量比为1:100150加入,内，4S溫下用動^IS以咖转/辦攙摔72小时，用夕h!P^I鄉淀敝离，用二fc!lC洗繊6m次，在真空^^箱内601Cfli1224小时,翻烙戯面齢KHS性:^ttffi麟，在本发明mW4Kfc^^工艺步骤l中，十5^^三甲S^化铵与甲苯的iJt^Jt量比为l:1218,FeCl2，与FeCU'6ty)的^S比为1:3溶解于二次水中，配^^雌为140150g/Lfi^C輒飾到战混賴中，再MA质t^jS为2涨tUK,"t^^H甲基溴化铵与质fllfoS为25%旨》^1量比为i:(USM).2。在混賴中，将+^^S三甲S^化铵与正縫酸乙W^IUt比为1:L21,5的正繊乙Htto入，在产物中加入乙醇,十A^三甲繊化饺与乙醇的ttSSI量比为l:2.12.4,沉淀物用譜臓12小时，回流乙醇用量^+六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量fc匕为l:2Q24计，制备,性Z1载化硅微哮。在iStt二諷維麟的环煞靴工艺步骤2中，織性Z^化^^球与甲苯按ftM量fc匕为i:10201080加ah口繊内濯合。在磁性二諷化挂m^Sto:艺歩骤3中，将L-天冬氨酸与^浓度为60g/L的fte^a水溶液按ttii质量比为i:1618^^fttaA两口l^,再;taX与^i^Wfc&Kft比为h120i幼的表面键辆縫的ftfc^toiw，镧备成Li#iWfcifcmto^球.将渙ZJl与4m&ft^6(^/L的Nam水ii^tt^lUtfcb为l:1520#溶觯加入两口鵷内，再加入与^i^glftti^Jfti:比为]U120180的L-天冬教靴fl^^fWfc^^,在^S离TMi^工艺频4中，Jffi^Hs的tttt::m化硅IW与浓度为0,2啦1/L的CoCl,',^tt^M量比为l:1幼15Q加，杯内，絲发明miittriw^m:艺步骤i中，+7^1三甲1化铵与甲苯的最*比为h15，FeClHWf与Pea6ft0的jil比为1:3溶解于二^C中,RtM^A^为i40g/L的水瀋齔勵n到±^漏，中，再inAiu^K为m駄，十:^HH甲絲化铵与Jga^为25ift!KJRmil量比为l:0*17,鄉賴中；将+7^^甲S^fc铵与I0i^ZaSftm8Wt比为1;1.25的正繊乙II^KlQA;ft^中加入乙醇，十六,三甲S^t铵与乙醇的J^t量比为1:2,25;沉淀物用乙鹏流12小时，+7^三甲翻^^与乙醇的§||*比为h22.5,鹏成磁性二氣化硅微球，在磁性二氧化硅鹏的环,化工艺歩骤2中，^it^w^m^与甲^a^iis比为i:服o加ah口繊内混合，在磁性:z^fcaW^4fcXX^骤3中，将L-天冬氣酸与#,为60g/L的Ma水溶,最ttMl:比为i:18混^^P加入两口,内，再加入与该混合溶液最顿量比为h150的表面键合环條的離I^條鹏，审恪成L-天錄靴^tt:imtta^将溴i酸与鹏總为60g/L的Na^Mia^质i比为l;1S潘絲解MA两口鹏内，再加入与该棍合^MmS比为1:150的L-天冬氯酸化6!8性二氧化娃,。在金厲离子的,工，骤4中，^M性zm化硅,与浓度为0.2nl/L的CoClWW)最佳拔廣量比为1:120加入烧杯内。，制备的表面,金属离子的磁性二氣化硅微,，杆菌中分离六聚组氮酸标签蛋白中的用途。本发明采用了溶M^S^备了以四氧ftS^W^为核，以正繊乙酯作1为壳《:^化敏微球,以此,^^环氣,偶SIM3-缩氷甘油1W基丙SH甲^Si^、l—天冬氣酸w^溴乙^i^后形成的配体为络合剂，截m属钴离子，翻恪自面l^^属离子ttM性:^il^,。本发明自了Li#S酸和澳乙,l^tW性:^化娃旨，可以为金厲离子li^个配位点，不仅保与蛋白质貭。翻,较強,合力^i使钴离子M，而且与蛋白赝上B^氣m^^Wii^^铖的结^Mt,从而使表ffil^l离子,性:^化^im^聚组氣l1^蛋白有根swii^tt和易于实现目标蛋白的分离wi化，本发明与现有e^膝m相比，具有设^#、,简单、誠^fc^^a細本发明脚條表面螯合金属离子的^ttrm化硅微球可用于分离六皿氨^s蛋白*-图i^y^施例i^#表面^^1离子的《^4{^^的￥別,屈线-图2是,例lti^^M^^Jg离子的Stti^Wfc^^的娜电子繊镜照片e图3是实施例i铜搭的，^jj离子fltiattz^tti^w^g描电子显微镜照片。图4是^M例imw細i^JS离子的afe^4k^^xps光电予麟图。图5是实MMim的表面^^a离^rt性i化硅,xps光电子s^N元素的化学位移谱图。图6是例i银洛的表面^^Ji离子的磁性:im化硅1SWt!全自动x—射线衍射團谱a图7是以实例i制备的表面螯^r属离子的磁性z^WM自测得的电泳照片。图s是实例i的磁性^^m化^^io^ffi螯合^ii离子的磁ttzm化硅,分离蛋白的电泳照片。图9是不同釁亵M^金腐离子的自:zWtft1^,化分fifS白的电i^片。图10Sffl环,丙m3-缩水甘油l^丙SH甲^sa^分别修饰^IM性二氧化硅微球纯化分析蛋白的电泳照片。图11六聚组鳜m^蛋白标准曲线a具体实施例方式.7结合附图和^1^^本发明进一##细说明，鮮发明不限于这Hi施例。麯例i本^i^出了麵^kl离子^ifcm^imi搖雄，其工继驟如下1.制^Htt:i^條,取7.娜2g十^6H甲^fc铵与100.0g甲苯MX到四口繊内，基三甲M^铵与甲^JH:比为i:15，用^l以woo转/^W^;将0.329gPea卿与0,987gFeCh働港解于9,4397g二次水中配制^St为140g/L的;!K^,FeCla，与FeClj柳ltt比为1:3,在23ttL/斑inft气微下将ii^K以4M/h滴JnaJtJ^i糊中，800转/^^#46小时；再toAHjB^为2mL,+7^三甲^铵与*^为25^K的蹄比为l-0,17，柳转/^IWta^2小时，左混糊中有四载4tHl5felft3W^成;以23A/h^Wra入碰酸乙酯9.79mU"h^^甲^a化铵与B^乙酷按质量比为h1.25,卿转/^#反应，用lSi:调节沐至8,以2W7h滴加正翻乙iiWn完毕后i小时，停止掇气做咖转/^tti拌，aa常sr老化5天;ffiJ^W0XZ^限银十^^H甲^^條与ZJf的繊比为U.25，以2000转/賴离心40鎌战液，Mlt被164g乙醇中回流12小时，回流乙酵用量按十六^三甲^Mfc铵与i酵的质量比为l:22.5计；分离ffitS物，#*掉上験黄^^,黑felK淀用乙酵、水、丙,交替繊，^A真空T^内60"12~24小时，制备鹏性^m化硅麟。2.,二氧化14',的环《1基化取鹏二辍化挂鹏o,lg、甲苯i05g加AH口繊，磁性:;mifctt徼球与甲苯的貭量比为h1050，用,^W^W6QHz下超声处理10，,在23raL/MnN汽W下，再加入3—^甘油ll^丙SH甲f^^42g,3—,甘油,基丙基三甲ft^^与该混^W量比为l:25,800转/##}^#,1!01C回流12小时，用夕OT^将沉淀物分离，依細二甲基甲職、丙酮、无水乙醇、水洗涤3次，^AA空^f^if内60"锡！224小时，翻潘戯面键執*4二氣化娃微球。3.磁性:i^爐微^^fc取L^e^(il2^66g、！^S^拳的lfa^水繊47.88&L"^4ftK与^^H^60g/L的Ifa8OQb7ld^Uia:比为l:18^fSliaA^口皿内，用wm以i咖转/^w^駒，aa^wtewifl^沐至8:再她表面键^fHHI^fcm化a^(X戰表面镳合环縫KHttt^fWWim球与^1^比为1:150,800转/:JHWK并加艇8CTC鹏24小时te宪毕，用^Wli^^K^分离，用0.&1/1乙^&^淀10，，用二feK洗沉淀3次，鹏涤emateA^空fla^内6oic德i224小时，ii^成Li4M^ft的磁te4t化硅，；将漠乙酸2.T7g、W^CiK^Wg/L的Ntfft，液50.02g混^g柳AM口繊内，溴乙酸与^^6C^/L的織水^W雌比为1:18,^1以l卿转/^MIW购，iffW糊对比例使沐至9;再加入L-天雒^MHtti:ifW^1^纖g,Li^j^的離:rm化硅,与该^8F^iKfi比为l:150,^24小时SJ^完毕，用夕Wi^^繊物分离，用0.501/1氣化鹏^^繊沉淀610次，再用二姊繊610次，41^:^\^空::[:^内60t预1224小时，审J^l^k的離二氧化硅微，4.金属离子的，^Sifc9W4:i^化lii^0.2g与爐为0.2rool/L的CbCL'TO的水,2紐toA,内，^t的^fc^ifc^W与浓度为0.anol/L的CoClf6恥的质量比为l:120;室細磁力38^以咖转/^#1#72小时后，用夕f^^^淀齢离，用二絲,沉淀610次，^Ut淀在真空fliffi内60'CT#12~24小时,制备赚面螯合金厲离子的磁性:^化硅微球a上述第峰的表面螯合金属离子的磁性:^化链^可用于在:杆菌中分离六聚组氨酸織蛋白。实施例2在^^litt^^4fc^球工艺歩骤l中，取7.繊g十^^H甲H^化铵与87.47g甲苯加入到四口,内，十^^三甲基溴化铵与甲苯的Si:比为1:12,用器以1000转/##|#^匀；将0.3(BgFea'4lfc0与0,916gPeCk投W溶解于9.4397g二fefc中配制^Jg为I30g/L的水液液，M:k4W)与FeClWHdO质量比为1:3，在23raL/mir^气做下以45ttL/h将jfc^i滴加到战M^中，腳转/^##^46小时；再加A^ftt^t为25%氣水1.l&ii，十六^H甲l^fc铵与IIBlEffi^29J^Kfiya:比为1,0,1，800转/^^UW2小时，在11#*中，有EMMtHf^lWm膝以23ni/hMttnABM乙酯6.miL,十7^^H甲S^化铵与正,ZimM比为1:1，800转/^#&^用氟水鄉沐至8，正繊ZJgSI加完毕后l小时，停it^气餅800转/^8拌，鄉常压下靴5天;！E^中JnA譜14幼g,十A^H甲^^化铵与乙酵的质驚比为1s2，以漏转/辨离心40辦,銷JJlgt,MS被145.8g乙酵中醜12小时，鹏Z:瞎用量按"h^^H甲^^化铵与乙賻的J!SJt比为1:如计离'0^离繊，去摊Jd^Eftfem黑色iEttffl乙酵、水、Pfll^替麟将繊的TO^AUCTi箱内6(TC賴1224小时，翁潘^tttrlMfc^L在離二諷to^^I环^fcl艺滩2中，取磁性zm腿鹏O.1g、甲苯ioogtoAH口鹏，磁性:zlWfc^^甲糊l8m比为i:woo,用fi^繊麵率为馳的超声舰10她在2M7ndnN汽微下，再加入3,水甘油^I丙基三甲^J^4.Og,3邀糊imS两基三甲l^^与该棍維^S量比为1:25,该工艺步骤中的其它^S与实施例1相同。衝衞m^面键^F教基a^ttzm條鰣。在Wiz:親舰'^^fcl艺娜3中，取L-天錄酸166g、#總为60g/L的N禱水,孰9gL-天絲酸与鹏雌为60g/L的Nam7j^液的质量比为b15^加入两口^内，用^#器以1000转/^11#,,i!M调节两者的相，,液pH至8;再加Aa面镶合ifmSWIi性1化硅微球0.425紐，表面键辨縫的鹏化硅^该濯铺*比为1:则，柳转/##,并iU^8(TC,24小时；M^完毕，用夕f"SP^I^fe^离，用0.5mol/L乙^g^l淀10辦，用二脉洗沉淀3次，将繊的沉tt&A真空千麟内6CTCf燥1224小时，制备成L-天冬鲺敝的磁ttl^a化硅,；将溴乙酸2.77g、体积浓度为60g/L的駄瓜水溶液41,55g混铺解加入两口繊内，溴乙酸与#度为60g/L的Nam水溶液的质量比为h15,用lg^器以1000转/^ftWN^]，WWW者IW比例使沐保持至9:再加入L-天冬^ttSOIi二氣舰,0眉2g，天^M化的離m化硅麟与繊^I^S比为1:微。紅艺歩骤中的其它歩骤与鄉例i相亂制t^^t,性:ift化纖球。在金属离子的螯合工艺歩4中，^!^MHi性二氧化自球0.2g与浓度为OH/L的Cba柳20g駄,内'^fc的磁性1化娃麟与浓度为0.2ffiol/L的Cba柳的质量fcKl1:100。虹怨聽中的其它步鹏^jl相同.制备自面,的,z:fwtemsu麯例3在制絲1^^^:^l中，取7.2892g+^|^甲^81化铵与145.784g甲苯加入到四口繊内，十^SH甲i^fc铵与甲^W质量比为1:20,用*器以1000转/^均匀；将0.354gFeCL4IW与1.06"FeCls'溶解于9.4397g二Jfe^中配M^fot为I60g/L的水自，FeClr4ftD与FeCl3，质量比为1:3，在2M/Bin&气做下将jlfc^以4^5mL/h滴加到UiM^I中，800转/^W^SW小时；再加AMKft^2Si^K2.28taL,十A^S三甲MHfc^与^a^为2em^的雌比为1:0.2,卿转/#*|#^2小时,在混合物中，有四氣tt3铁纳米顆粒形成；以23nL/h缓慢加入正硅酸乙酯U,76o^i"^mH甲SM化铵与i0^乙^MS比为1:1.5，800转/^m拌腿，用氨水肺pH至8，以23iC/h滴加正繊乙S^毕后l小时，停止氮气做800转/^tWW,^^常压下靴5天^t!中JtaA乙醇18.223g,十^^三甲基溴化铵与乙醉的质量比为1:2.5,以2000转/，离心40，,去掉±^液，繊被1S123g禱中回流12小时，回流乙酵用鹏+^^H甲基渙化铵与乙醇的膽比为1:25计；冷却MS温，离A汾离，去掉上层亮黄色溶液,屨色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤，将^fe涤的伤3fe^A真空^BI箱内60C1224小时，审洛^itt二氣化硅鰣。在磁性::^fc^^wmi艺步骤2中，取磁性1tt^麟(Ug、甲苯noginAH口織，磁性:;^化^l^与甲苯的质量比为i:noo,用超声清洗机在频率为60te下超W4S10辦；在2M7niinN汽微下，再MA3-缩水佑由,基丙基三甲1^4.4g,3-缩水糊imS丙SH甲^i^与该混合溶,量比为1:25,紅艺歩驟中的其它歩骤与实施例1相同》制备職面键合环,的磁性二氧化硅微球。^i性:zm4fciii^llita:艺步骤3中，取L-天冬氨酸2.66g、糊浓度为60g/L的!Wft水溶液53.2g，L"^冬氛酸与^feS为叨症的^m水溶^^量比为i:20混^g解她两口繊内，用wm以iooo转/:iHW^駒，舰调节两者的相皿ft^液pH至8;再加A^面键^f親基的磁性二氧化硅微球转/^,并加縫80"腿24小时iSJS^毕，用夕1^#^淀分离，用0.5mol/L乙^MI10辨，用二JfcWS^縱3次，将織的Wfe^AS空^^f内6(rc，1224小时，f^成l-^4ta6tti的i3^m化^t豕将澳乙酸2.77g、柳g/L的Nam^Fi[胡.4g混^WtaA两口娜内,漠乙酸与M^为60g/L的N^2f^8^Ml:比为1:20,用^NI以1000转/i^ws^,'mM者m比,沐至9;再jQAl-天^a^waiezm化挂麟仏29lg,L"^4^^flffiti:^4lai^^与该漏^SiEJ5ti比为1:卿,该工，骤中em它步ll^实施例l相同。^^^k的,:^/Wii^,^gJi离预齡工怨4中，fl^Sfti的離;z^fcW^o,2g^S为0.2roi/L的coa，30g:taAi^内，3Wfc的磁性:i^化tt^与浓度为0*2tol/L的CoClrW的质i比为1:150。紅艺歩驟中W^它步,魏例1相同，制备i^面^"金属离子的iitt:^Wfc桂,，为了确定本发明^fltl工^驟，发明A^fiT:feSt的^^W究试验，各种^if况如下i、不同偶s^树表面i^i离子的,:^4tai^MfcAmaa^蛋白性能的影响在本发明^SI例i的^ttrlWfc^^的环fWb工艺步骤2中，将等摩尔的3~缩水甘油《^丙基三甲辆^^和环飆親丙旨偶联剂分别加入等量的磁性:2^bft,，并在甲苯里,，分势賜，m^F^的,il^^,后续工艺步骤与实例i宪全相同，得至PW表面齡金属离子fl^t性rm化確微球，1^#到两种表顧螯合金属离子的磁性二執化桂微球纯化分析蛋白的电泳照片见图io。在衝10中，泳道1为蛋白織的电泳m,腿2为l^ll液然鄉^i^蛋白的电泳照片，泳道3为|^3~€水"^11^肉基三甲氧基为偶联剂^#表面螯合扁离子的継:i^t^^^t化蛋白后^l^残留蛋白的电泳照片，泳道4为3,水甘油lP^丙基三甲^ffi^为偶^RJ,表面,金属离子,性二氧化硅微球处理含六聚组flB际签蛋白，ftM,洗脱液中蛋白的电泳照片.腿7为I^M环親氣丙嫁为偶KM^^面螯合^S离子的磁性rft化硅微球纯,白后^自留蛋白的电泳照片，泳邀8为环载氯丙烷为偶联剂fftl表面螯合金属离子的磁性二氣化娃徼球iba含六聚组氨酸标签蛋白凝,后微^繊中蛋白的电icM^,由國10看出，WJfM[^^ii^l^l备S^M齢^iS离子fiHifc^Wfcii^^目^ll白5^^离，用3"^JcH16^PISH甲wsi^i偶i^RWi^的表面M^ii离子的iitt二諷nyii^能^^M^,分离六聚组^白》2、錢酸乙,表面m^M离子fitSffifc^爐HW6餘離^J^螢白性能的彩响鹏不MBi^za^用形jaatttzm^t，而是将四氧te,^feJti[繊合3"#^丙絵甲1^,^K它工fSNi被例i完全相,,^#^由3-^水tiiAiP^丙^s甲^ia^为ffi^w^M^i离子^^1^JIWMi表面m^i离子的^S^W^析蛋白的电泳m见图w,在图io中，泳道5为mg^M^Mn^^ffi^^ii离子,ffiSWB化蛋白后！W^留蛋白的电M片，歉敏6为本实验,下ff^^1^合金属离子的^t性^M:a^ma氟^^蛋白iyiwRB微^fe^液中蛋白的电泳照片s職,5Wdte照片可瞎出，直驗四氣itE铁纳米mi:键合3-缩水甘油i^S丙基三甲^^il^潘的表面^^ll离子的磁性微球皿有效分离六聚组氣酸蛋白，为了验证本发明,益效果，发明ASW本发明^liMl泰1#*^属离子的離zm化^^,舰vsm,nm仪、xps光电子ffita、全自动x—射线衍射仪、纖电子显微镜、離电镜、就分析仪、朦预tottw其断了表征；利稱,*^^了表面^^离子的,1化硅^分离六标签蛋白性能'各种mit况如下观察物品表面螯合金属离子的磁性二氧^^,实验仪器；振^品《^型号为ratt^O0:高^t^电子显m^号为JEM-30Kh光电子Hm型号为PHI-5400型；全自动X-繊衍射鹏号为D/fe^3c;环境扫描电子邋微HS号为Quanta200;元素分析仪原收分计型号为TAS9秘(G)。1、观察fe^电镜、扫描电子显i^OT^f表面iWM性:^化硅m^f观察，观澜结果见图2、图3,由阁2、图3可见，謝电繊柳繊电子显^ffi察表面,繊性:ifWW^3^MaW,銪构織，2、鹏按VSMWIP^仪、xps光电子tim、全自动X—lt^f射仪、^*分析仪、嚴预totem,蹄分H9^t^^w^Ji离子的鹏:imama湖试。3、观騸结果用VSK^^l^S^^面^^Ji离^Hi^:^R化Sl^mB图L由图i可见，表面驗顿离子ewirm^^w舰，^kia，繊为14967ei^/g,用XPS光电子l^t澜试的光电子,國见國4，由图4可见，Co，齢在表面iP^Ji离子,ttll諷化娃,上。各元素的賴腿l,表i表||#^离子《性:^1化《^鹏光电子鲻元素顿积(ets~eV/s)浓度Si2p284070,33921.36Cls3,0,29627.26Ols128827o，ni祸,19Nts33400.477LTOPe2fj21娜2.957I，Co2p220833.,1,57由表1可见，0^^饰Si、C、0、N、Fe、O)等元素，表明表面S^属离子的Mtt:zlj^kai^含有翻恪该^^成分。表面螯^JI离子Wfi^mftMt球xps光电子麟N元素的4t^fi:移谱图见图5。由图5可见，N元素蜂在399.ev,说明N元素以,形式存在。用全自动x—瘌幾衍射仪澜定褒颧f^S离子的fifc氧化^l^的X—射线衍射图^^图6。由國6可见，X—l!l^衍射图谱20在18.2°、30.613°、35,6恥°、43.420°、53.949^57,214嘩处出现了F感fi^lffi强衍,，在22.70T敏出现了SiftW^lE强衍射蜂，i^m射信号与立方晶系FeA的《m)、(220)、(311〉、(柳)、(422)、(511)等点阵面0鹏，65"3107]相一致，在2170(f附近出现了s说无定型i^iE衍,。用元素分析iS[MW试，得到的磁性::^化硅微^^面M^fel离子的目二氧化硅微球的，^lU測试结果赚2表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由表2可见,^wm^Ji离子fitHa4:im^l^l^l^iai^i比，c、H、N的^MMM高，说明,二氧化硅,已被相应的有,分M^,分别配制100iiL胸赚(鹏MJ为40、80、120、160的Co1l子^Wa用原TWfc^ytS^tfi^析，瀾得Co，^S与吸，S^准曲线，并*1#准曲线得翁该M^JS离子fitHS性rm4fc^i^f^c^离:^a见表3a表3原子吸ifefaitt^ffiii^a离子的離二靴a^附CQ，矜量<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>图7是以实例i翻搭的表W^属离子Wli性:iW^E自得的龟,片6在图7中，鄉1为蛋白^^畅照片，腿2为餘^M氣K^M白的裂自电泳照片，嫩邀3为表面螯M属离子的fi^W纯化蛋白后^^^留蛋白的电泳MJt,,4为表面,金羼离子的lltt,Aia^^m^fe签蛋白,鹏'^^E^中蛋白的柳照片。由图7可见，表面t^属离子的lttt二親化硅微球能够^mife^择性分离六聚组t^^蛋白e磁性zm化硅和表面M金属离子的,:^化硅微球分离蛋白的电泳照片见,8，在图8中，鹏l为蛋白縫的电泳照片；泳道2为斩聚组鲺1^S白S^的电多皿；M3为磁性二諷化^^k3itA^[m^S白自,^液中蛋白的电泳照片*.泳道4、s为表a^^金属离子的磁ft^化^^^^iii^匿白裂Amgimwi中蛋白的^瓶片；,e为^^1^1化蛋白后1^霣蛋白的输照片；泳逮7、8为褒面螯^U离^^tr^^ia^t化蛋白^i^l菌蛋白的电iJI片，由图8可见，a^2ii^第6idiw对比可知，^1中^^|^白^:^化^^i^，但自i^的第3,中未见明显的蛋白i^,说明^a氨ftg白和1ifcffi^i^^l"1"M,性的TO,可以:4W^,从自上絲，耐賴ffi^細离子WWirm^(^而言，六l^Ci^S白的结合l^tt的，只有i!MJfefffiftW湘被糊蛋白与表面^^il离邻礅性zJWfc^fc^间麟和作用，不鬨用置的表面^^厲离子的,:ifWWim^纯化分析蛋白的电泳M^见图9，在圉分中，,i为蛋白,的电Wh自2为^A皿lil^1六l^^^g白^II^SW^中蛋白的电泳照片；泳道4为4呢表面薑合金属离子的磁性:^R化硅徵球ifcatA聚^ll酸,蛋白l5W^,^ife液中蛋白的^照片，由图9可见，WPSOT^^厲离子Witt^lWtffit^用量增加，纯化得到fi^聚组^^蛋白量1feit加，用2呢、4崦表顧,金厲离子的磁性二氧化桂徼鹏化蛋白，解機白的量分别为22.26ug、必.52iig。4、用表衝t^H离子的aft:^4^,AUdl杆菌中分离六^MM^合蛋白ACttWfmW^ifBL21腿3)-藏lla,sW^麟，接入M)iL含(W,AMP'的LB^f^E中，3012^,,将过夜雉tWft子職5mL种子液:柳iLLB#1^扩:#，3510,180转/辨,23小时,至光密度为0.40.6;加入异丙*"*4)"81代判,^^6賜tig/mL,湖转/辨，301C离心3小时,收菌体。按细胞《#^与^|^糊比10:1,用1^飾(100,1几NaftPQ,、10咖1/LTris、10鹏1/L棍合，调pH至8.0)皿菌体，加入溶菌酶至终浓度为l呵/mL,冰浴下超]*|,离心去,胞碎片，》^±淸液《取表面m^s离TOitttzm化硅麟i呢,用iii缓械^ii两遍,磁性分离，去撺上清液,加入姑聚组氮酸織蛋白的1M^200PU^0M赚300uL室温摇^H育1小时，磁粉离，U:^ffl于电泳分析见國7的M3,图8的腿7、腿8,在沉淀物中加入li^M沖液lfiL(50iiiiol/LWTO，300鹏1/L鄉100ia(50,1/LNaHWo鄉鹏1/L!faCl,250鹏1/L味唑，沐saMaaj^5燃处清，该mh赚含有^nsiram白，断电泳分析见图7Wlldi4、图8ft^道4和,5、图96^道3和,4。用Bradford糊錢白繊取5iaWAiffitffl6M白祥品按m^SKl成條嫌(fflg/ttd)为0、0.I、0,4、0*7、1.1、1.4^ft^ftJtaA200wLBradford成树，反应S，'用fi^t于59Sml8^值，六KMiOt蛋白^KK中螢白^4与吸ita的关系，4,标准曲线见图1K表4六jfiMio^白!i^i液中蛋白^ft与ie^度的^吸光值平均00.3270.3160.3215o,iO.娜0.350.35250.40.4360,4480.4420.70.5180.557O.S375i.i0.6710.659O.鄉1.40.7450.7460,7顿取^衮面,Wiite::mt^^，斜成3舰^JIM氣麟白，各取^!Lh清液，分别观機六聚组鄉蛋白缝见表5a表5MJJI液4^^(mutl白^M名称吸舰離Hg組纯化的量yg/呢0,鹏5a3570.U鹏11.l淑0.34850.0868718,鹏33由表5可见，^ffl本发明实施例i制备的i卿表面,的iitfcimfts,用于从大肠杆菌中分离六離贫酸的量为li,1365iig。20权利要求1、一种表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法，其特征在于该制备方法步骤如下(1)制备磁性二氧化硅微球将十六烷基三甲基溴化铵与甲苯按质量比为1∶12～20加入到四口烧瓶内，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，将FeCl2·4H2O与FeCl3·6H2O按质量比为1∶3溶解于二次水中，配制成浓度为130～150g/L的水溶液，在2～3mL/minN2气保护下将此溶液以4～5mL/h滴加到上述混合物中，800转/分钟持续搅拌4～6小时，再加入质量浓度为25％氨水，十六烷基三甲基溴化铵与质量浓度为25％氨水的质量比为1∶0.1～0.2，以800转/分钟持续搅拌2小时，在混合物中，有四氧化三铁纳米颗粒形成；将十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯按质量比为1∶1～1.5的正硅酸乙酯缓慢加入，以800转/分钟搅拌反应，调节pH至8，以2～3mL/h滴加正硅酸乙酯完毕后1小时，停止氮气保护，800转/分钟搅拌，常温常压下老化5天，在产物中加入乙醇，十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶2～2.5，以2000转/分钟离心40分钟，去掉上层液，沉淀物在乙醇中回流12小时，回流乙醇用量按十六烷基三甲基溴化铵与乙醇的质量比为1∶20～25计；冷却至室温，离心分离，去掉上层亮黄色溶液；黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗涤，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成磁性二氧化硅微球；(2)磁性二氧化硅微球的环氧基化将磁性二氧化硅微球与甲苯按质量比为1∶1000～1100加入三口烧瓶，用超声清洗机频率为60Hz的超声处理10分钟，在2～3mL/minN2气保护下，再加入与该混合溶液质量比为1∶25的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷800转/分钟搅拌，110℃回流12小时，用外部磁铁将沉淀物分离，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水洗涤3次，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球；(3)磁性二氧化硅微球羧基化将L-天冬氨酸与体积浓度为60g/L的Na2CO3水溶液按质量比为1∶15～20混合溶解加入两口烧瓶内，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，通过调节两者的相对量使溶液pH至8；再加入与该混合溶液质量比为1∶100～200的表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球，800转/分钟搅拌，并加热至80℃反应24小时；反应完毕，用外部磁铁将沉淀分离，用0.5mol/L乙酸浸泡沉淀10分钟后，弃去乙酸，用二次水洗涤沉淀3次，将洗涤的沉淀放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球；将溴乙酸与体积浓度为60/L的Na2CO3水溶液按质量比为1∶15～20混合溶解加入两口烧瓶内，用搅拌器以1000转/分钟搅拌均匀，调节pH至9，再加入与该混合溶液质量比为1∶100～200的L-天冬氨酸化的磁性二氧化硅微球，室温搅拌24小时；反应完毕，用外部磁铁将沉淀物分离，用0.5mol/L氯化钠水溶液洗涤沉淀6～10次，再用二次水洗涤6～10次，放入真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备得羧基化的磁性二氧化硅微球；(4)金属离子的螯合将羧基化的磁性二氧化硅微球与浓度为0.2mol/L的CoCl2·6H2O按质量比为1∶100～150加入烧杯内，在室温下用磁力搅拌器以100转/分钟搅拌72小时，用外部磁铁将沉淀物分离，用二次水洗沉淀6～10次，在真空干燥箱内60℃干燥12～24小时，制备成表面鏊合的磁性二氧化硅微球。2、娜权鹏求i臓觫M^JS离子的磁tem^W^雄，其特征在于-在审鹏性:z^化amip:艺步骤(i)中，十^S三甲基漠化铵与甲苯的质量比其中为l:1218,FeCl,4ftO与FeClv6HyO的质量比为h3溶解于二次水中，其中ffi^^jft为140150g/L的水溶瓶滴加到J^混，中，再lBA质SlfeS为25%iUk,十^l三甲基澳化铵与Jft^S度为25%^的自比其中为l:(X150.2:在混娜中，将十^^三甲麟化铵与正硅酸乙ffi^織比其中为1:L2L5的IE^酸乙lS^1ftto入，^^中加入乙醉,十A^i三甲基漠化铵与乙酵的质量比其中为1:2.12.4，沉淀物用乙醇回流12小时，回流乙醇用量按十六Mlt三甲S^化铵与乙醇的质量比为1:2024计，港格j^S性Zm化硅微球；在磁性二氣化娃辦的环氣靴工艺步骤(2)中，鹏性二氣化硅微球与甲苯按质量比其中为l:102010K)加入三口烧瓶内混合；在Wfez:m化硅l^eitiifta:，骤《3)中，将L^5，酸与i^i浓度为eog/L的NewCa維^Hfi比其中为1:1618泡^^解加入两口繊内，再JtaA与该混合溶舰量比其中为l:120180fi^臓合环縫^l性二觏化硅鹏，律條成l-天冬lo^k的磁性二氣^^徼球将溴乙酸与^mfeS为eog/l的^Htt^中为l:1520潘^g觯iOAM口自内，再ftlX与^i^ftJil比其中为l:120180的L-天^IOfi^的磁性:m化硅麟4^离子&^工艺步驟(4)中，fimaitt^iitem4fc^i^与繊为0,2mol/L的CoCl^貼其中^8Wl比为1:120150ftLAJgtf内，3、娜权承展求i^W^^^M离子^Hi:^^Wm摊，^e在于在maM^m^ifiwa:艺歩i1(i)中，tA^s三甲基iWfc铵与甲苯的MfiW^中为"15,FeCMBW与FeCl3mO的m比为l:3溶iff二脉中，KI"J^iM^为i40g/L的^m濾;taSU^濯^i中，再加AJti^度为28^K,"H^H甲i^|化铵与JM^为2ffl6Syc膽战中为1:0.17,在M^J中；将十^6三甲^gl化铵与iE^Z^中SEllS比为1:L25的正硅酸z^BfWra入豕tf^中:taAZA"b^!H甲^fc铵与z^的雌比其中为i:2.25;沉淀物用乙醉回流12小时，十7^H甲Sgl化铵与Z^的鹏比其中为l:22.5，制备自性:^化硅il^;在磁性二氧雌鹏的环^mX艺步骒(2)中，^ifciR化挂m^甲苯质量比其中为h1050加A^口皿内泡合在磁性^LWSI!^mi艺歩衝3冲,将1"^冬氨酸与#^为60g/L的Na孤水溶液^^Jtft比为l:18濕^#解加入两口娜内，再加入与i^i合溶#1比为1:150tt^面键^WaWt:rft化M^,制备成L-天冬^m6Wtzm化硅,将溴乙酸与fl^浓度为60g/L的N^Ca水溶液其中按貭量比为l:18混，解;taA两口,内，再加入与该濯^#*||量比其中为1:150的L-天^1UK化的磁性:^化硅,；fefe属离子的^"工艺步骤(4)中，将羧m的fi^二氧4t^微球与,为0.2mol/L的CoCk,其中按质量比为1:120加AJK杯内n4、表面,金属离子的磁性z:mi^微球在;^杆菌中分离六IKa氨酸旨蛋白中的用途。全文摘要一种表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球制备方法，由制备磁性二氧化硅微球、磁性二氧化硅微球的环氧基化、磁性二氧化硅微球羧基化、金属离子的螯合工艺步骤组成。本发明与现有的制备方法相比，具有设计合理、操作简单、金属螯合量大等优点。采用本发明制备的表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球中含有钴离子，具有与修饰微球间较强的结合力不易使钴离子泄漏，而且与蛋白质上的组氨酸具有较高选择性和合适的结合强度，使表面螯合金属离子的磁性二氧化硅微球对六聚组氨酸标签蛋白有很高的选择性和易于实现目标蛋白的分离和纯化。采用本发明所制备表面鳌合金属离子的磁性二氧化硅微球可用于分离六聚组氨酸标签蛋白。文档编号C07K1/13GK101323454SQ20081015047公开日2008年12月17日申请日期2008年7月28日优先权日2008年7月28日发明者冯国栋,崔亚丽,柳杨,磊杨,胡道道申请人:陕西师范大学