专利名称：：一种体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法
技术领域：
：本发明涉及体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法。
背景技术：
：转移因子是从淋巴细胞中提取的一种低分子多肽与核酸复合物，能特异性或非特异性地提高机体免疫功能，传递免疫信息，被誉为细胞免疫激活剂。它无种属特异性，可在种属间传递，动物来源可用于人类。转移因子常规的制备方法是将动物新鲜或冷冻的脾脏及淋巴结在25t:左右去除脂肪及结缔组织，然后用纯化水洗净；将洗净的组织切成小块，加入适量水，用组织捣碎机破碎细胞，制成匀浆，加适量纯化水，混匀，置_201:反复冻融58次，融化温度不得超过37t:;将冻融的匀浆离心(离心温度4t:)，去沉淀，留上清液备用；上清液装透析袋，透析24-48小时，半成品过滤除菌；成品的配置与检验。转移因子是经诱导，由动物免疫防御系统产生的可对抗外源性病原体的防御性肽类活性物质，分子量小、活性强，具有抗细菌、真菌、病毒和原虫作用，甚至对癌细胞也具有杀伤作用，应用十分广泛。转移因子作为具有特异性与非特异性的免疫活性细胞调节因子，广泛应用于治疗任何动物病毒性疾病、真菌感染、细胞免疫减弱或缺陷病以及恶性肿瘤的辅助治疗，并有好的疗效。但制备转移因子的工艺繁琐复杂、回收率低、无特异性。本发明通过体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子特异性强、产出率高。
发明内容本发明的目的是克服现有技术中制备的及转移因子针对疾病没有特异性，治疗效果不稳定等缺点，提供一种体外免疫法生产特异性强、成本低、产出率高、效果更好的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法。本发明的技术解决方案概述如下—种体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，由如下步骤组成(1)无菌采取实验鸡脾脏或抗凝血，用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层；(2)对淋巴细胞单层进行传代培养；(3)当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素和鸡新城疫病毒诱导培养，即获得体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子。剌激鸡脾细胞和鸡血淋巴细胞增殖的植物血凝素剂的质量浓度为20-200mg/L。本发明的优点本发明以较少的鸡脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，在体外培养，然后用植物血凝素和鸡新城疫病毒诱导培养诱导淋巴细胞单层即可体外生产出大量抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的混合体，本发明的方法制备的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子无需进一步的提纯，直接将混合体用于禽类，即可起到抗鸡新城疫病毒及抗菌的作用，同时提高禽类的免疫力。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1—种体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，步骤(1)无菌采取实验鸡脾脏，用脾脏制备淋巴细胞单层，步骤为A、处理鸡脾脏取新鲜鸡脾脏置于无菌玻璃容器中，加入PBS(pH为7.2)溶液浸泡半小时或浸于质量百分浓度为1%的新洁尔灭溶液中，取出以酒精消毒脾脏表面，用解剖剪及镊子去除脾脏脂肪及包膜，用PBS(pH为7.2)液洗涤一次，再将脾脏剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪将脾脏剪成lmm3小块，再用PBS(pH为7.2)液洗涤2_3次，以去除血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞；B、消化及分散组织块将上步清洗过的PBS(pH7.2)液吸掉、将剪碎的组织块移入锥形瓶中，按组织块体积的5倍量加入0.25%胰蛋自酶液(pH为7.67.8)，置37"水浴中消化2040分钟。每隔10分钟摇动一次锥形瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、表面发毛时为止，这时从水浴中取出锥形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用PBS(pH为7.2)液洗涤23次，用0.5%水解乳蛋白-Hanks液洗，用口径稍大的细管吹打数次，用四层纱布滤过；C、细胞计数采用血球计数板进行计数，计数方法与白细胞计数相同；D、细胞悬液的分装和培养按细胞计数结果，将细胞悬液用DMEM营养液调整至60万/毫升细胞悬液。将细胞悬液分装入细胞培养瓶(100ml)和细胞转瓶，分装量为该瓶容量的1/5，盖上盖，做好标识，然后将细胞培养瓶和转瓶分别放在二氧化碳培养箱和转瓶机上培养；E、观察置于37t:培养的细胞，需逐日进行观察。若细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段直至形成淋巴细胞单层。(3)对淋巴细胞单层进行传代培养在作传代细胞培养前，首先将培养瓶置于显微镜下现察，以确定细胞已长成单层，即可进行细胞的传代培养。(4)当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素和鸡新城疫病毒诱导培养当脾淋巴传代细胞长成单层后，更换维持液同时加入植物血凝素(终浓度为100mg/L)和鸡新城疫病毒(终浓度为640血凝单位/ml)诱导培养。(5)诱导培养24小时后，将细胞培养物经超声破碎后取样检测转移因子和的浓度。转移因子浓度的测定对转移因子的定量多以多肽含量定量用Folin-酚法或分光光度法测定多肽含量，以多肽含量lmg为一个转移因子单位。本方法生产的的转移因子为黄色澄明液体，多肽含量0.35g/L，核糖含量0.46g/L。半成品和成品的检验半成品检定半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测。成品检定成品分别作转移因子和的鉴别试验、外观检测、pH值、多肽含量、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒性等项检验。实施例2:—种体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，步骤(1)无菌采取抗凝血，用外周血制备淋巴细胞单层，步骤为无菌静脉采取动物全血25毫升，加0.8%肝素溶液0.3ml抗凝，静置45分钟，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤23次，离心速度8001200转/分，然后用含30%犊牛血清水解乳蛋白40毫升进行白细胞培养，均匀混合后分装于容量100毫升培养方瓶或转瓶中，塞紧瓶塞，置37t:恒温箱中或转瓶机中培养，经23天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层。(3)对淋巴细胞单层进行传代培养；在作传代细胞培养前，首先将培养瓶置于显微镜下观察，以确定细胞已长成单层，即可进行细胞的传代培养。(4)当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为200mg/L)和鸡新城疫病毒(终浓度为1280血凝单位/ml)诱导培养。当淋巴细胞传代长成单层后，更换维持液同时加入植物血凝素和鸡新城疫病毒诱导培养。(5)经培养23天，离心细胞培养液，收集上清，上清液在4t:下磁力搅拌透析，超滤除菌，即制成特异型转移因子。转移因子浓度的测定、抑菌实验的方法、半成品和成品的检验项目均同实施例1。本方法生产的的转移因子为黄色澄明液体，多肽含量0.45g/L，核糖含量0.36g/L。实施例3—种体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，步骤(1)取新鲜鸡脾脏置于无菌玻璃容器中，加入PBS(pH为7.2)溶液浸泡半小时或浸于质量百分浓度为1%的新洁尔灭溶液中，取出以酒精消毒脾脏表面，用解剖剪及镊子去除脾脏脂肪及包膜，用PBS(pH为7.2)液洗涤一次，再将脾脏剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪将脾脏剪成lmm3小块，再用PBS(pH为7.2)液洗涤2-3次；(2)将上步清洗过的PBS(pH7.2)液吸掉、将剪碎的组织块移入锥形瓶中，按组织块体积的5倍量加入0.25%胰蛋白酶液(pH为7.67.8)，置37。C水浴中消化2040分钟。每隔10分钟摇动一次锥形瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、表面发毛时为止，这时从水浴中取出锥形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用PBS(pH为7.2)液洗涤23次，用0.5%水解乳蛋白-Hanks液洗，用口径稍大的细管吹打数次，用四层纱布滤过；(3)将细胞悬液用DMEM营养液调整至60万/毫升细胞悬液，然后分装入细胞培养瓶和细胞转瓶，分别放在二氧化碳培养箱和转瓶机上培养；(4)经23天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层，可进行细胞的传代培养。当长成单层后，更换维持液同时用植物血凝素(终浓度为50mg/L)和鸡新城疫病毒(终浓度为1280血凝单位/ml)诱导培养。5(5)经培养12天，离心细胞培养液，收集上清，上清液透析，超滤除菌，上清液即为特异型转移因子。应用实例200只3周龄肉鸡(经过健康检查无菌)分为A、B、C、D、E共5组，B、C、D、E组经过人工感染0.3ml鸡新城疫病毒强毒攻毒后作实验。A组为健康组，不感染病毒，不给药；B组阴性对照组，感染病毒，不给药；C组为本发明药物低剂量组，按禽1.Oml/只鸡/天肌肉注射；D组为本发明药物高剂量组，按禽2.Oml/只鸡/天注射；E组为黄芪多糖组(天津生机集团股份生物有限公司)，按禽0.5g/只鸡/天注射。结果表明，采用本发明药物治疗鸡新城疫病毒病有着明显的疗效。本发明特异性转移因子实验结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>阴性对照组低剂量治疗组高剂量治疗组"黄芪多糖"组0100.0(40/40)80.0(32/40)0(0/40)20.0(8/40)50.0(20/40)10.0(4/40)60.0(24/40)15.0(6/40)40.0(16/40)100.0(40/40)10.0(4/40)70.0(28/40)90.0(36/40)65.0(26/40)本次试验结果表明，该药物低、高剂量治疗组与对照组差异非常显著(P<0.01)，说明本发明药物对病毒引起的鸡新城疫病毒病具有显著的治疗作用。且与"黄芪多糖"组疗效相当(P>0.01)。上述参照实施例对抗鸡新城疫病毒转移因子的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。权利要求一种体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，其特征是由如下步骤组成(1)无菌采取鸡脾脏或鸡血，用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层；(2)对淋巴细胞单层进行传代培养；(3)当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素和鸡新城疫病毒诱导培养，即获得体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子。2.根据权利要求书1中体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，其特征是剌激鸡脾细胞和鸡血淋巴细胞增殖的植物血凝素剂的质量浓度为20-200mg/L。全文摘要本发明涉及一种体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法。本发明鸡脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，在体外培养淋巴细胞，然后用植物血凝素和鸡新城疫病毒诱导培养，体外生产出大量抗鸡新城疫病毒特异性转移因子。本发明的方法体外制备的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子用于治疗鸡新城疫病，同时提高禽类的免疫力。文档编号C07K1/00GK101759764SQ200810152418公开日2010年6月30日申请日期2008年10月21日优先权日2008年10月21日发明者王连民,田杏芳申请人:天津生机集团股份有限公司