专利名称：粉防己碱有机酸盐及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及柠檬酸粉防己碱(Tetrandrine citmte)和制备，以及含有它们的药 物组合在制备治疗肿瘤性疾病药物中的应用。
背景技术：
据世界卫生组织报告2007年全世界大约2500万人患有各种各样的癌症， 790万人死于这些癌症(约占所有死亡人数的13%)。预计全世界癌症死亡将 继续增加，2030年估计将有1200万人死于癌症。2006年，癌症在中国夺去了 近180万人的生命，比2005年的数字多出了约30万。癌症已成为人类健康的 第一杀手。然而，令人遗憾的是，目前常用的药物并不能有效控制和治疗这些 癌症，因此研究新的更好的药物来预防和治疗这些癌症有着十分重要的意义。
粉防己碱，又名汉防己甲素(Tetrandrine，简称Tet)，是存在于中草药粉 防己的根块中的双苄基异喹啉生物碱，具有消炎、镇痛、降压、抗矽肺、抗肿 瘤等多种药理作用[Xie QM，et al. Acta Pharmacol Sin. 2002， 23:1107-13; Choi HS， et al. J Ethnopharmacol. 2000， 69:173-9; Pang L, et al. Biochem Pharmacol. 1997;53:773-82]。在抗肿瘤研究领域，粉防己碱已被证实具有逆转P-糖蛋白 (P-glycoprotein，P-gp)介导的肿瘤多药耐药(multidrugresistance, MDR)作用[Wen-Lin Xu et al. Leuk Res， 2006， 30:407-13; Zhu X， et al. Anticancer Res. 2005; 25:1953-62; Liu ZL, et al. J Pharm Pharmacol. 2003;55:1531-7 ]。也有文献报道， 粉防己碱能直接诱导体外培养的多种人肿瘤细胞死亡[Ng LT, et al. Am J Chin Med. 2006;34:125-35; Meng LH， et al. Cancer Res. 2004;64:9086-92; Kuo PL et al. Life Sci. 2003; 73:243-52]。但这些文献报道结果显示，尽管粉防己碱能逆转体 外培养肿瘤细胞多药耐药，以及诱导一些肿瘤细胞死亡，但它在体内逆转肿瘤 细胞耐药作用和抗肿瘤效果并不理想。
已知， 一些化合物的水溶性是决定其生物利用度和药效的关键因素之一。 生物碱在植物体内常与有机酸(柠檬酸，果酸，草酸，琥珀酸，醋酸，丙酸等) 结合成盐而存在，而目前大多数研究中所用的粉防己碱是不溶于水的游离生物 碱，这种粉防己碱的疏水性无疑会影响其体内抗肿瘤效果。因此，有必要研制 具有高水溶性的新型粉防己碱盐类，以提高其生物利用度和药效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有以下结构通式的粉防己碱有机酸盐类:
"CH3 3HCO,w
(1)。
本发明的另一个目的在于提供上述粉防己碱有机酸盐的制备方法，通过以 下步骤实现-
(1) 室温下，将粉防己碱加入一水柠檬酸(或者无水柠檬酸)溶液中进 行成盐反应，粉防己碱和柠檬酸的优选比例为2 10: 1 (重量比)，但不限于 此比例，得粉防己碱柠檬酸盐溶液；
(2) 将上述粉防己碱柠檬酸盐溶液干燥，得白色柠檬酸粉防己碱盐结晶。 本发明的再一个目的是提供上述柠檬酸粉防己碱盐在制备治疗肿瘤性疾
病药物中的应用。例如但不限于制备治疗造血系统恶性肿瘤白血病、多发性骨 髓瘤、淋巴瘤和实体肿瘤肝癌、胆管细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、骨肉瘤等药物 中的应用。
本发明所述的柠檬酸粉防己碱盐不仅能选择性诱导造血系统恶性肿瘤如 白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤等肿瘤细胞死亡(见实施例5-10)，而且也能 诱导多种人实体肿瘤如肝癌、胆管细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、骨肉瘤等肿瘤细 胞的死亡(见实施例11-15)。更有意义的是，动物实验证实口服柠檬酸粉防己 碱盐能显著抑制动物体内人异种移植瘤生长，对其中的一些肿瘤，例如白血病 显示出完全清除，达到根治肿瘤效果，体内抗肿瘤效果明显高于不溶于水的粉 防己碱游离碱(见实施例16)。值得一提的是，动物实验结果显示，本发明所 述的柠檬酸粉防己碱在抗肿瘤有效剂量下对实验动物无明显毒性反应(见实施 例16)。
本发明所述含有通式(I)柠檬酸粉防己碱的药物，该药物包括一种如上 所述的柠檬酸粉防己碱，和任选的药学上可以接受的赋型剂。
本发明的柠檬酸粉防己碱可以以口服的形式给药，例如但不限于普通片剂 和肠溶片、胶囊、药丸、粉剂、粒剂、酊剂、溶液、悬浮液和糖浆剂。它们也 可以以肠胃外的形式给药，例如但不限于药学领域的普通人熟知的静脉内、腹膜腔内、皮下和肌肉等形式。
目前常用的粉防己碱是一种未成盐的游离生物碱，不溶于水，而事实上， 大多数生物碱在植物体内常与有机酸(柠檬酸，果酸，草酸，琥珀酸，醋酸， 丙酸等)结合成盐而发挥作用。因此，本发明的发明人应用可食用的强有机酸
柠檬酸设计和制备水溶性(Water-solubility)更好的粉防己碱有机酸盐，通过体外 和动物体内抗肿瘤活性筛选，以期获得抗肿瘤活性更高、毒性更低的新型粉防 己碱盐，供进一步开发成新的药物。本发明人惊奇的发现，柠檬酸粉防己碱不 仅具有很好的水溶性，而且在动物体内对多种肿瘤性疾病具有很好的治疗作 用。
本发明所要解决的技术问题之一是提供药理上可接受的、治疗效果好的新
型粉防己碱有机酸盐柠檬酸粉防己碱及其制备方法。选用商品化的粉防己碱 游离碱作为原料，在室温条件下，应用可食用的强有机酸(柠檬酸)按一定比 例进行成盐反应，获得水溶性好的新型有机酸粉防己碱盐拧檬酸粉防己碱盐
(Tetrandrine citrate)。
同时，本发明还提供含有上述柠檬酸粉防己碱盐的治疗肿瘤性疾病药物组 合，例如但不限于治疗白血病药物组合、治疗多发性骨髓瘤药物组合、治疗淋 巴瘤药物组合、治疗肝癌药物组合、治疗胆管细胞癌药物组合、治疗胰腺癌药 物组合、治疗乳腺癌药物组合、治疗骨肉瘤药物组合等等。
按上述方法和步骤制备的柠檬酸粉防己碱盐的特点是应用可食用的强有 机酸柠檬酸制备粉防己碱有机酸盐，获得的柠檬酸粉防己碱盐其水溶性大于 200mg/ml (见实施例3)，而且用上述柠檬酸粉防己碱盐配制的溶液的pH值在 4.5左右(见实施例4)。
使用本发明的柠檬酸粉防己碱的剂量方案由本领域的普通技术人员根据 各种因素来选择所述因素包括但不限于年龄、体重、性别和接受者的体格状 况、需要治疗的疾病的严重程度、给药的途径、接受者的代谢水平和排泄功能、 采用的剂量形式、采用的具体化合物。
本发明的药物组合可以进一步包含另外一种或多种抗癌药物，例如市场上 供应的现有抗癌药物。
抗癌药物通常在联合使用时更为有效。此外，最好以大多数药物的最大耐 受剂量，两次给药之间的时间间隔最小进行给药。
本发明的柠檬酸粉防己碱优选在给药之前与一种或多种药学上可以接受 的赋型剂一起配制。赋型剂是惰性物质，例如但不限于载体、稀释液、调味剂、甜味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、粘合剂、药品崩解剂和胶囊材料。
本发明的另一个具体实施方案是药物制剂，该制剂包括本发明的柠檬酸粉 防己碱和一种或多种药学上可以接受的赋型剂，该赋型剂可以与该制剂中的其 它成分相容且对其接受者无害。本发明的药物制剂通过将治疗有效量的本发明 的柠檬酸粉防己碱与一种或多种药学上可以接受的赋型剂组合来制备。在制备 本发明的组合物过程中，所述活性成分可以与稀释剂混合、或被封闭在载体内， 该载体可以是胶囊、小袋、包装纸或其它容器。该载体可以用作稀释剂，可以 是用作运载体的固体、半固体或液体材料；或是药片、药丸、粉剂、锭剂、悬 浮液、乳剂、溶液、糖浆、软和硬的凝胶胶囊、栓剂、无菌的注射溶液和无菌 的包装粉剂。
对于口服给药，所述活性成分可以与口服的、非毒性的药学上可以接受的 载体组合，该载体例如但不限于乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、碳酸钠、甘露 醇、山里糖醇、碳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、甲基纤维素等；任选地还可以与崩 解剂、结合剂、润滑剂组合，该崩解剂例如但不限于玉米、淀粉、甲基纤维 素、琼脂润土、黄原胶、褐藻酸等；结合剂例如但不限于凝胶、天然食糖、卩-乳糖、玉米甜料、天然和合成橡胶、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素、聚乙二醇、 石蜡等；润滑剂例如但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钠、硬脂酸、油酸钠、苯甲 酸钠、乙酸钠等。
在粉剂形式中，所述载体可以是与细碎的活性成分混合的细碎的固体。该 活性成分可以以合适的比例与具有结合属性的载体混合，并压成希望的形状和 大小，从而形成片剂。所述粉剂和片剂优选含有1%到99%重量的活性成分， 该活性成分是本发明的柠檬酸粉防己碱。合适的固体载体是羧甲基纤维素镁、 低熔点的蜂腊和可可油。
无菌的液体制剂包括悬浮液、乳状液和糖浆。所述活性成分能够溶解或悬 浮在药学上可接受的载体中，例如无菌水、无菌有机溶剂、或无菌水和无菌有 机溶剂的混合物。
上述制剂可以以单位剂型存在，该单位剂型是含有单位剂量的物理分散单 元，适于向人体和其它哺乳动物体给药。单位剂型可以是胶囊或片剂，或是很 多胶囊或片剂。"单位剂量"是本发明的活性化合物的预定量，经过计算使其与 一种或多种赋型剂组合能产生理想的治疗效果。根据所涉及的具体治疗，活性 成分的单位剂量的量可以在约0.1到约1000毫克或更多之间进行变化或调整。
本发明所述的柠檬酸粉防己碱盐与目前常用的粉防己碱游离碱相比，具有
6以下一些优点和特性(1)具有很好的水溶性和接近人体血液生理状态pH值， 有利于提高其生物利用度和药效(实施例3-4); (2)制备工艺简单易行，成功 率高，成本低，适合规模化生产(实施例l-2); (3)采用可食用的有机酸柠檬
酸制备粉防己碱盐，具有比无机酸盐酸制备的盐酸粉防己碱盐更高的安全性； (4)具有更广和更强的抗肿瘤活性，已证实敏感的肿瘤有但不限于白血病、
多发性骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、胆管细胞癌、胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌等(实
施例5-16); (5)毒付作用更低，体外细胞培养体系和动物实验证实，柠檬酸
粉防己碱在有效抗肿瘤剂量下对正常人细胞生长和实验动物没有明显毒副作
用(实施例16)。
本发明所用的制备柠檬酸粉防己碱盐的方法，成功率高，简单易行，成本
低，适合规模化生产(实施例1-2)。
具体实施例方式
本发明结合下列实施例，将更加具体地解释本发明。但应理解，下列实施 例旨在说明本发明而不对本发明的范围构成任何限制。 实施例1 一水柠檬酸粉防己碱盐制备
在室温下，称取10克粉防己碱，放入玻璃烧杯中，然后加入100毫升2.5% 的一水柠檬酸(C6H507.H20)溶液，搅拌，待粉防己碱完全溶解，溶液完全透 明，然后将柠檬酸粉防己碱盐溶液进行干燥，得白色柠檬酸粉防己碱盐粉末。
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(I)
实验结果显示应用这一方法制备的一水柠檬酸粉防己碱盐不仅成功率高 (100%);而且，所需试剂少，只需柠檬酸和水，操作步骤少而简单，普通实 验室即可操作，成功率100%。
实施例2无水柠檬酸粉防己碱盐制备
在室温下，称取IO克粉防己碱，放入玻璃烧杯中，然后加入IOO毫升2.5% 的无水柠檬酸(C6H507)溶液，搅拌，待粉防己碱完全溶解，溶液完全透明，然后将柠檬酸粉防己碱盐溶液进行干燥，得白色粉防己碱柠檬酸盐粉末< 反应式
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实验结果显示应用这一方法制备的无水柠檬酸粉防己碱盐不仅成功率 高(100%);而且，所需试剂少，只需柠檬酸和水，操作步骤少而简单，普通 实验室即可操作。
实施例3柠檬酸粉防己碱盐水溶性测定
在室温下称取O.l克柠檬酸粉防己碱，放入10ml试管内，然后慢慢加入去 离子水或蒸馏水，边加边摇匀，直至加入的柠檬酸粉防己碱盐充分溶解，溶液 呈现完全透明为止。然后，测定完全溶解柠檬酸粉防己碱盐所需的水，计算柠 檬酸粉防己碱盐在水溶性中的溶解度。
实验结果显示柠檬酸粉防己碱盐在水中的溶解度大于200mg/ml。
实施例4柠檬酸粉防己碱盐水溶性pH值测定
在室温下称取O.l克柠檬酸粉防己碱盐，放入10ml试管内，然后慢慢加入 去离子水或蒸馏水，边加边摇匀，直至加入的柠檬酸粉防己碱盐充分溶解，溶 液呈现完全透明为止。然后，用精密pH试纸测定溶液pH值。
实验结果显示柠檬酸粉防己碱盐水溶液的pH值为4.5左右。与盐酸小 檗胺盐水溶液pH值(2.0)相比，柠檬酸粉防己碱盐水溶液pH值更接近正常 人血液生理pH值(7.3-7.4)。
实施例5:柠檬酸粉防己碱盐抗人慢性髓系白血病细胞K562活性测定
(1)实验材料
白血病细胞株人K562白血病细胞系购自中国科学院上海细胞库。 主要试剂柠檬酸粉防己碱为我们自己合成。 主要仪器细胞培养箱，酶标仪取生长良好的白血病细胞8000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液 为含10%胎牛血清的1640细胞培养液。加入不同浓度的柠檬酸粉防己碱，混 匀后，置二氧化碳(5%C02)细胞培养箱37'C培养48小时。然后用MTT法 测定活细胞浓度。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100。％， 并计算出药物作用后细胞活力(％)和48小时白血病细胞半数生长抑制浓度 (48小时IC50值)。
(3) 实验结果
实验结果证明柠檬酸粉防己碱能诱导人白血病细胞系K562细胞死亡和抑 制白血病细胞生长，其48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50)分 别约为1.5吗/ml。
实施例6:柠檬酸粉防己碱盐抗人急性髓系白血病细胞NB4活性测定
(1) 实验材料
白血病细胞株人NB4白血病细胞系购自中国科学院上海细胞库。 主要试剂柠檬酸粉防己碱为我们自己合成。 主要仪器细胞培养箱，酶标仪
(2) 实验方法
取生长良好的白血病细胞8000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液 为含10%胎牛血清的1640细胞培养液。加入不同浓度的柠檬酸粉防己碱，混 匀后，置二氧化碳(5%C02)细胞培养箱37。C培养48小时。然后用MTT法 测定活细胞浓度。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100%， 并计算出药物作用后细胞活力(％)和48小时白血病细胞半数生长抑制浓度 (48小时IC50值)。
(3) 实验结果
实验结果证明柠檬酸粉防己碱能诱导人急性髓系白血病细胞系NB4细胞 死亡和抑制白血病细胞生长，其48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时 IC50)分别约为23g/ml。
实施例7柠檬酸粉防己碱盐抗耐药人慢性髓系白血病细胞K562/ADR活 性测定
(1)实验材料
9白血病细胞株多药耐药人K562/ADR白血病细胞系由浙江大学肿瘤研究
所提供。
主要试剂柠檬酸小檗胺为我们自己合成。 主要仪器细胞培养箱，酶标仪
(2) 实验方法
取生长良好的白血病细胞8000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液 为含10%胎牛血清的1640细胞培养液。加入不同浓度的药物，混匀后，置二 氧化碳(5%C02)细胞培养箱37"培养48小时。然后用MTT法测定活细胞 浓度。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100%，并计算出药 物作用后细胞活力(％ )和48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50 值)。
(3) 实验结果
实验结果证明柠檬酸粉防己碱同样能诱导耐药的人白血病细胞系 K562/ADR细胞死亡和抑制白血病细胞生长，其48小时白血病细胞半数生长 抑制浓度(48小时IC50)分别约为2.5ng/ml。
实施例8柠檬酸粉防己碱盐抗人淋系白血病细胞Jurkat活性测定
(1) 实验材料
人白血病细胞株:人淋系白血病细胞系Jurkat购自中国科学院上海细胞库。
主要试剂柠檬酸粉防己碱为我们自己合成。 主要仪器细胞培养箱，酶标仪
(2) 实验方法
取生长良好的白血病细胞8000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液 为含10%胎牛血清的1640细胞培养液。加入不同浓度的药物，混匀后，置二 氧化碳(5%C02)细胞培养箱37'C培养48小时。然后用MTT法测定活细胞 浓度。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100。％，并计算出药 物作用后细胞活力(。％ )和48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50 值)。
(3) 实验结果
实验结果证明拧檬酸粉防己碱能诱导人淋系白血病细胞系Jurkat细胞死亡 和抑制白血病细胞生长，其48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50) 分别约为L53路/ml。实施例9柠檬酸粉防己碱盐抗人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226活性测定
(1) 实验材料
人多发性骨髓瘤细胞株人多发性骨髓瘤细胞株系RPMI8226由浙江大学 血液病研究所提供。
主要试剂柠檬酸粉防己碱为我们自己合成。
主要仪器细胞培养箱，酶标仪
(2) 实验方法
取生长良好的人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞8000个，接种到96 孔细胞培养板孔内。培养液为含10%胎牛血清的1640细胞培养液。加入不同 浓度的药物，混匀后，置二氧化碳(5%C02)细胞培养箱37'C培养48小时。 然后用MTT法测定活细胞浓度。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活 力设为100%，并计算出药物作用后细胞活力(％)和48小时白血病细胞半数 生长抑制浓度(48小时IC50值)。
(3) 实验结果
实验结果证明拧檬酸粉防己碱能诱导人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226 细胞死亡，其48小时半数生长抑制浓度(48小时IC50)为1.26|ig/ml，表明柠檬 酸粉防己碱具有抗人多发性骨髓瘤活性。
实施例10柠檬酸粉防己碱盐抗人淋巴瘤瘤细胞DOHH2活性测定
(1) 实验材料
人淋巴瘤细胞株人淋巴瘤细胞株由浙江大学医学院附属第二医院血液科 吴东博士提供。
主要试剂柠檬酸粉防己碱为我们自己合成。 主要仪器细胞培养箱，酶标仪
(2) 实验方法
取生长良好的白血病细胞8000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液
为含10%胎牛血清的1640细胞培养液。加入不同浓度的药物，混匀后，置二 氧化碳(5%C02)细胞培养箱37。C培养48小时。然后用MTT法测定活细胞 浓度。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100%，并计算出药 物作用后细胞活力(％ )和48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50 值)。
ii实验结果证明柠檬酸粉防己碱能诱导人淋巴瘤细胞死亡，其48小时半数
生长抑制浓度(48小时IC50)约为0.50pg/ml，表明柠檬酸粉防己碱具有抗人淋 巴瘤细胞活性。
实施例ll柠檬酸粉防己碱盐抗人肝癌细胞HepG2活性测定
(1) 实验材料
人肝癌细胞株HepG2:人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院上海细胞库。 主要试剂柠檬酸小檗胺为我们自己合成。 主要仪器细胞培养箱，酶标仪
(2) 实验方法
取生长良好的人肝癌细胞系HepG2细胞4000个，接种到96孔细胞培养 板孔内。培养液为含10%胎牛血清的1640细胞培养液。置二氧化碳(5XC02) 细胞培养箱37"C培养24小时后，加入不同浓度的药物，混匀后，继续置二氧 化碳(5%C02)细胞培养箱37'C培养48小时。然后用MTT法测定活细胞浓 度，并计算出药物作用后细胞活力(％)。在本实验中对照组(不加药物处理) 细胞活力设为100%。
(3) 实验结果
实验结果证明柠檬酸粉防己碱盐能明显诱导肝癌细胞系HepG2细胞死亡， 并抑制其生长，其48小时半数生长抑制浓度(48小时IC50)为8.0ng/ml，表明 柠檬酸小檗胺具有抗人肝癌细胞活性。
实施例12:柠檬酸粉防己碱盐抗人胆管癌细胞株FRH0201活性测定
(1) 实验材料
人胆管癌细胞株FRH0201:由浙江大学医学院附属第二医院外科提供。
主要试剂柠檬酸粉防己碱为我们自己合成。 主要仪器细胞培养箱，酶标仪
(2) 实验方法
取生长良好的人胆管癌细胞株FRH0201细胞5000个，接种到96孔细胞 培养板孔内。培养液为含10%胎牛血清的1640细胞培养液。置二氧化碳(5 %C02)细胞培养箱37t:培养24小时后，加入不同浓度的药物，混匀后，继 续置二氧化碳(5%C02)细胞培养箱37。C培养48小时。然后用MTT法测定 活细胞浓度，并计算出药物作用后细胞活力(％)。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100%。 (3)实验结果
实验结果证明柠檬酸粉防己碱能明显诱导人胆管癌细胞株FRH0201细胞 死亡，并抑制其生长，其48小时半数生长抑制浓度(48小时IC50)约为4.0pg/ml，
表明柠檬酸粉防己碱具有抗人胆管癌细胞活性。
实施例13拧檬酸粉防己碱盐抗人乳腺癌细胞MCF7活性测定
(1) 实验材料
人乳腺癌细胞株MCF7:人乳腺癌细胞株MCF7购自中国科学院上海细胞库。
主要试剂柠檬酸粉防己碱为我们自己合成。 主要仪器细胞培养箱，酶标仪
(2) 实验方法
取生长良好的人乳腺癌细胞系MCF-7细胞5000个，接种到96孔细胞培 养板孔内。培养液为含10%胎牛血清的1640细胞培养液。置二氧化碳(5% C02)细胞培养箱37'C培养24小时后，加入不同浓度的药物，混匀后，继续 置二氧化碳(5%C02)细胞培养箱37"C培养48小时。然后用MTT法测定活 细胞浓度，并计算出药物作用后细胞活力(％)。在本实验中对照组(不加药 物处理)细胞活力设为100%。
(3) 实验结果
实验结果证明拧檬酸粉防己碱能明显诱导人乳腺癌细胞系MCF-7细胞死 亡，并抑制其生长，其48小时半数生长抑制浓度(48小时IC50)约为6.96|ig/ml， 表明柠檬酸粉防己碱具有抗人乳腺癌细胞系MCF-7活性。
实施例14柠檬酸粉防己碱盐抗人骨肉瘤细胞MG63活性测定
(1) 实验材料
人骨肉瘤细胞株MG63:人骨肉瘤细胞株MG63由浙江大学骨科研究所提供。
主要试剂柠檬酸粉防己碱为我们自己合成。 主要仪器细胞培养箱，酶标仪
(2) 实验方法
取生长良好的人骨肉瘤细胞系MG63细胞5000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液为含10%胎牛血清的1640细胞培养液。置二氧化碳(5XC02) 细胞培养箱37"C培养24小时后，加入不同浓度的药物，混匀后，继续置二氧 化碳(5%C02)细胞培养箱37。C培养48小时。然后用MTT法测定活细胞浓 度，并计算出药物作用后细胞活力(％)。在本实验中对照组(不加药物处理) 细胞活力设为100%。 (3)实验结果
实验结果证明柠檬酸粉防己碱能明显诱导人骨肉瘤细胞系MG63细胞死 亡，并抑制其生长，其48小时半数生长抑制浓度(48小时IC50)约为5.03pg/ml， 表明柠檬酸粉防己碱具有抗人骨肉瘤细胞系MG63活性。
实施例15柠檬酸粉防己碱盐抗人胰腺癌PANC-1细胞活性测定
(1) 实验材料
人胰腺癌PANC-1细胞株由浙江大学医学院附属第二医院外科提供。 主要试剂柠檬酸粉防己碱为我们自己合成。 主要仪器细胞培养箱，酶标仪
(2) 实验方法
取生长良好的人胰腺癌PANC-1细胞5000个，接种到96孔细胞培养板孔 内。培养液为含10%胎牛血清的1640细胞培养液。置二氧化碳(5%C02)细 胞培养箱37'C培养24小时后，加入不同浓度的药物，混匀后，继续置二氧化 碳(5%C02)细胞培养箱37'C培养48小时。然后用MTT法测定活细胞浓度， 并计算出药物作用后细胞活力(％)。在本实验中对照组(不加药物处理)细 胞活力设为100%。
(3) 实验结果
实验结果证明柠檬酸粉防己碱能明显诱导人胰腺癌PANC-1细胞死亡，并 抑制其生长，其48小时半数生长抑制浓度(48小时IC50)约为8.2ng/ml，表明
柠檬酸粉防己碱具有抗人胰腺癌PANC-1细胞活性。
实施例16拧檬酸粉防己碱和粉防己碱人白血病K562/ADR裸鼠体内异
种移植瘤生长和动物毒性影响比较
(1)实验材料实验动物裸鼠购于中国科学院上海动物中心
试剂柠檬酸粉防己碱为自己合成，粉防己碱购上海融禾医药科技有限公司。
仪器细胞培养箱
(2) 实验方法
取7周龄裸鼠，在其背部皮下接种人白血病细胞K562 5xlO々每只鼠。24 小时后，随机分3组。用药组柠檬酸粉防己碱和粉防己碱组采用口服给药途
径，按每公斤体重100mg剂量进行，每天3次(灌渭)。对照组用生理盐水 代替，连用10天。共观察30天，期间测量裸鼠瘤重、体重以及活动与饮食等 情况。实验结束时，处死小鼠，取肿瘤组织，测实际重量。
(3) 实验结果
实验结果证明拧檬酸小檗胺对人白血病裸鼠体内异种移植瘤生长具有明 显抑制作用，在45天实验周期中，6只接种肿瘤细胞裸鼠经柠檬酸小檗胺治疗， 无1只长瘤，无瘤率达100% (6/6)，而粉防己碱组，6只裸鼠中有2只出现肿 瘤生长，无瘤率66.67% (4/6)。对照组6只裸鼠均出现明显肿瘤生长，成瘤率 100% (7/7)。柠檬酸粉防己碱组裸鼠平均体重为20.64克，粉防己碱组裸鼠平 均体重为16.87克，对照组为15.0克。这些实验结果表明，柠檬酸粉防己碱在 动物体内抗肿瘤活性明显好于粉防己碱，而且未见明显毒性反应。
1权利要求
1. 一种粉防己碱有机酸盐，其特征在于具有以下结构通式
2.根据权利要求l所述的粉防己碱有机酸盐的制备方法，其特征在于通 过以下步骤实现(1) 室温下，将粉防己碱加入一水柠檬酸或无水柠檬酸溶液中进行成盐 反应，粉防己碱和柠檬酸的重量比为2 10: 1，得粉防己碱柠檬酸盐溶液；(2) 将上述粉防己碱柠檬酸盐溶液干燥，得白色柠檬酸粉防己碱盐结晶，反应式
3. 根据权利要求1所述的粉防己碱有机酸盐在制备治疗肿瘤性疾病药物 中的应用。
4. 根据权利要求3所述的粉防己碱有机酸盐的应用，其特征在于所制 备的药物还含有制剂允许的药物赋形剂或载体。
5. 根据权利要求3所述的粉防己碱有机酸盐的应用，其特征在于所述 药物的制剂形式包括液体制剂、颗粒剂、片剂或胶丸。
6. 根据权利要求5所述的粉防己碱有机酸盐的应用，其特征在于所述 药物的给药方式包括口服给药或注射给药。严
全文摘要
本发明提供一种粉防己碱有机酸盐类，通过将粉防己碱加入柠檬酸溶液中进行成盐反应，将得到的粉防己碱柠檬酸盐溶液干燥，得白色柠檬酸粉防己碱盐结晶。本发明经药理实验证实具有更广和更强的抗肿瘤活性，体外细胞培养体系和动物实验证实，在有效抗肿瘤剂量下对正常人细胞生长和实验动物没有明显毒副作用，安全性好；具有很好的水溶性和接近人体血液生理状态pH值，有利于提高其生物利用度和药效，可在制备治疗肿瘤性疾病药物中的应用。本发明制备方法工艺简单易行，成功率高，成本低，适合规模化生产。本发明粉防己碱有机酸盐类结构通式如上所示。
文档编号C07D491/00GK101423519SQ20081016269
公开日2009年5月6日 申请日期2008年11月28日 优先权日2008年11月28日
发明者莹 古, 干小仙, 张旭照, 徐荣臻 申请人:浙江大学