一种新的植物强耐盐基因nhxfs1及其编码蛋白和应用的制作方法

专利名称：一种新的植物强耐盐基因nhxfs1及其编码蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到植物基因工程领域，具体的说是利用DNA家族改组技术获得功 能显著提高的植物Na7H+逆向转运蛋白的基因，本发明还涉及到利用此基因培育 转基因耐盐植物。
背景技术：
土壤盐渍化是影响农作物生产和生态环境的一个重要的非生物胁迫因素。目 前，世界上大约有20%的耕地和接近50%的灌溉用地受到盐渍的严重危害 (Flowler T J ， Yeo A R. Breeding for salinity resistance in crop plants. Where next Aust. J.尸J朋t尸力，'o丄1995, 22:875 884)。我国大约有5亿亩 盐碱地，并且其面积有不断增加的趋势。培育抗盐植物是促进盐碱地开发利用、 改良土壤和生态治理的有效途径。因此，利用现代生物学技术，通过对植物耐盐 生理和分子生物学的深入研究，克隆和改造植物重要的耐盐基因，进而将这些基 因转化到植物中以培育转基因耐盐植物新品种，对于农业生产、环境保护和生态 治理等都具有重要的意义。
高浓度的盐分对植物造成严重的伤害，主要表现在渗透胁迫和离子毒害两方 面(Blumwald E， Aharon G S， Apse M P. Sodium transport in plant cells. A'oc力e历"J'c^/ y Jcte. 2000， 1465: 140 151)。 一方面，土壤中高浓度的盐 分使土壤水势低于植物细胞的水势从而引起植物细胞水分亏缺即渗透胁迫；另一 方面，过量渗入植物细胞的各种盐离子又会对细胞造成离子毒害，主要是Na+毒 害。遭受渗透胁迫和离子毒害的植物细胞的质膜的通透性增加，导致过氧化胁迫、 营养亏缺及一系列生理代谢反应的紊乱等次生伤害作用，从而对植物正常的生长 发育造成严重危害。
自然界中植物为了适应高浓度的盐，形成了一系列的防御机制(BohnertH丄Nelson D E ， Jensen R G. Adaptation to environmental stress. /7朋t Ce7丄1995，7 :1099 11U)，主要包括渗透调节和重建细胞的离子均衡两种策 略。前者指植物细胞利用一些无机离子或者合成一些小分子有机化合物作为渗透 调节剂，以降低细胞水势，抵御渗透胁迫。后者主要指植物细胞通过将细胞质中 过量的Na+转运出细胞或者区隔化到液泡中，实现离子均衡、消除Na+毒害的目的。 植物细胞的一个显著特征就是拥有体积很大的膜隔离的液泡，盐胁迫条件下，植 物细胞保持细胞质低浓度Na+的最直接方式就是将Na+隔离到液泡中。这样既可以 使胞质酶免受离子毒害，又能提高细胞整体的渗透压起到促进细胞吸水的作用， 是自然界中耐盐植物主要的耐盐机制(Flower T J ， Troke P F ， Yeo A R. The mechanisms of salt tolerance in halophytes. j/zw/ Tl/朋t 脚w'。〗.1977 ，28 :89 121.)。
植物Na7H+逆向转运蛋白是一种Na+的逆向转运体，在植物质膜和液泡膜上都 有分布，其中液泡膜Na7H+逆向转运蛋白是负责将Na+区隔化到液泡的主要蛋白。 植物Na7H+转运蛋白最先在大麦质膜上发现，之后在多种植物质膜和液泡膜上普 遍检测到Na+AT转运的活性。自世界上首个植物Na7H+逆向转运蛋白基因力^^n 被克隆后(Gaxiola R A， Rao R， Sherman A， Grisafi P， Alper S， and Fink G R. The力i^j'abjO i51 t力sh's朋proton transporters , AtNhxl and Avpl , can function in cation detoxify cation in yeast . 尸roc yVaz^Z Jcsd 5"cj' 1999,96 :1480 1485)，水稻、北滨黎、碱蓬等高等植物的液泡膜Na7H+逆向转 运蛋白基因相继得到克隆，分别为flaWil ( Fukuda A , Nakamura A , Tanaka Y. Molecular cloning and expression of the Na+/H+ exchanger gene in Or"s ■satira. ^'oc力i/z 5j'op力ys A ta 1999, 1446 :149 155) 、 Z^WZL (Hamada A， Shono M， Xia T, 0hta M， Hayashi Y， Tanaka A, Hayakawa T. Isolation and characterization of a Na+/H+ antiporter gene from the halophyte JtrfjO/ex ^z eh'/^'.尸J朋tyl/Wec"〗ar^z.oJogy. 2001，46:35 42) 、 (MaXL， Zhang
Q， Shi H Z， Zhu J" K, Zhao Y X， Ma C Zhang H. Molecular cloning and different expression of a vacuolar Na+/H+ antiporter gene in 5"〃aeofe sa/ss under salt stress .倫J柳W /^朋tar"瓜2004， 48(2) :219—225)等。在 液泡膜质子泵提供的能量下，位于液泡膜的Na7H+逆向转运蛋白将Na+区隔化进入液泡中从而降低细胞质中Na+的浓度，使过多的Na+离开代谢位点，减轻其对酶和 膜系统的伤害，还可降低细胞水势，抵抗盐分造成的渗透胁迫。所以，Na7H+逆 向转运蛋白对植物的抗盐性起着重要的作用。
将Na7H+逆向转运蛋白(Na7H+antiporter)基因转化到目标植物中进行过 量表达是培育转基因耐盐植物的有效方式。Apse等对转^M好i7基因的拟南芥植 株进行了分析，过量表达Na7H+逆向转运蛋白的转基因拟南芥植株在200mmo1/ L NaCl中能正常生长发育。免疫印迹表明，在转化植株叶片提纯液泡中含有比 从野生型叶片提纯液泡中更多的j^Wi7产物，液泡上Na7H+逆向转运蛋白活力 显著增强(Apse M P ， Aharon G S , Snedden W A ， Bl丽ard E. Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+antiporter in ylra^'c/opsis . 5We"ce. 1999,285 :1256 1258)。同样，将拟南芥^z^Wi7基因转入西红柿 中，转基因西红柿在200 mmol/L NaCl胁迫下能够正常生长、开花和结实。尽管 叶片中Na+浓度高，但西红柿果实中Na+浓度很低(Zhang H X， Blumward E. Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit . 7fez^re 5i"ec力/7o7c^y . 2001, 19 : 765 768)。这些研究都表明 了 Na7H+逆向转运蛋白基因及其蛋白在植物对于高盐反应中的重要性，被认为 是目前最有希望利用其特性培养转基因耐盐品种的基因。
然而，在实际生产应用上，目前在植物中已克隆的Na7H+逆向转运蛋白基 因仍然存在着活性不高、耐盐性不强的问题，很大程度上限制了该基因的生产应 用和推广。如何利用特定的现代生物学技术，克隆新的强耐盐基因或对该基因进 行分子进化和改造，进而将这些新基因转化到植物中以培育转基因耐盐植物新品 种，对于农业生产、环境保护和生态治理等都具有重要的意义。
DNA改组(DNA Shuffling)技术是目前蛋白质、酶和单克隆抗体等体外定向 进化的快速高效方法,在提高酶活性、蛋白质产量和改善蛋白质(酶)的性能等方 面具有广泛的应用前景。其原理是将一组紧密相关的核酸序列随机片段化，然后
利用无引物PCR将这些随机片段进行重新组装而得到全长的核酸序列，在这个过 程中引入突变并对不同的突变进行广泛的重组，从而完成对目的核酸序列的迅速 进化，以提高核酸序列或其编码的蛋白的功能(Stemmer W P. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecularevolution, ,roc yVa〃 A:at/5bi 1994, 91:10747-10751) 。 DNA改组可分
为单基因的改组和基因家族的改组，前者仅仅对单个基因进行随即片段化，利用 无引物PCR进行重新组装，而家族改组可对亲缘关系相近或者差距很大的基因家 族进行改组。
DNA改组技术自诞生以来，已成功地对多种基因如工业用酶、抗体及一些重 要的蛋白等进行了定向进化，使酶的活性、底物特异性及抗体的特异性、蛋白功 能、热稳定性等得到了显著的提高(Crameri A， RaillardS， Bermudez E, Stemmer W P. DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution . #atore. 1998， 391:288 )。如Stemmer等应用该技术取得 了一系列研究成果，获得了酶活提高了 32000倍的e-内酰胺酶(Stemmer WP. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling.泡i""re. 1994， 370: 389 391)、荧光强度超过野生型45倍的绿色荧光蛋白(Crameri A， WhitehornE A， Tate E， Stemmer W P. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. 7fet历'"ec力"o丄1996， 14: 315 319)。通 过DNA改组方法,Crameri等成功得到了砷酸盐抗性提高40倍的菌株(Crameri A, Dawes G， Rodriguez E J， Silver S, Stemmer W P. Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling. ;Vat ^/otec/wo/. 1997， 15: 436 438)。但是，应用该技术在改进Na+/H+逆向转运蛋白基因及其蛋白 质的性能方面，国内外均未见报导。

发明内容
本发明目的在于获得一种新的植物强耐盐基因7W 57,此基因能编码具有
离子转运活性的Na7H+逆向转运蛋白。
本发明的另一个目的在于提供上述基因编码的Na7H+逆向转运蛋白NHXFSl，
其离子转运活性比野生型的Na7H+逆向转运蛋白更强。 本发明还提供了含有上述基因的重组载体。 本发明的另一方面，还提供了含有上述重组质粒的宿主细胞。 本发明的另一方面，还提供了重组载体的构建、转基因植物等方法，以应用
上述基因和编码蛋白培育耐盐性更强的转基因植物新品种。Na7H+逆向转运蛋白(NaVH+antiporter)在植物耐盐中起重要作用，其活 性大小影响着植物的耐盐性。本发明通过DNA家族改组技术，对编码Na7H+逆向 转运蛋白的野生型耐盐基因^M好i7、必)Wi7、 ZteA^7进行体外分子进化，以获 得编码离子转运活性更高的Na7H+逆向转运蛋白新基因7Wi^S7。这种新基因所 编码的Na7H+逆向转运蛋白NHXFS1能将更多的Na+从细胞质中区隔化到液泡中， 将得到的新基因转化到目标植物中，能够培育出耐盐能力更强的转基因植物新品 种。
具体来说，通过体外DNA改组技术对野生型的NaVH+逆向转运蛋白基因进行 突变重组，通过功能互补法，在Na7H+逆向转运蛋白基因缺失的酵母突变株中定 向筛选离子转运活性显著增强的Na7H+逆向转运蛋白突变新基因。
本发明涉及到一种新的植物强耐盐基因Aft^F67，是编码Na7H+逆向转运蛋 白NHXFS1，能够提高植物抗盐能力，是下列核苷酸序列之一
1) 序列表中的SEQ ID N0:1;
2) 与序列表中SEQ ID N0:1限定的核苷酸序列同源性在70-100%、且编码 相同功能蛋白质的DNA序列；
3) 编码序列表中SEQ ID N0:2所示蛋白质序列的DNA序列。
优选的植物强耐盐基因AKT尸5V，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1，与野生型 Na7H+逆向转运蛋白基因&7\%17之间相比，有4个核苷酸的突变，其中第185 位和1059位为腺嘌呤，1221位和1517位为鸟嘌呤。
上述基因的编码蛋白，为具有离子转运活性的Na7H+逆向转运蛋白NHXFS1， 其特征在于，是下列氨基酸序列之一
1) 序列表中SEQ ID NO:2;
2) 与序列表中SEQ ID N0:2限定的氨基酸序列同源性在70_100%之间的蛋 白质；
3) 在SEQIDN0:2限定的氨基酸序列中增加、减少或替换一个或几个氨基 酸且具有相同活性的蛋白质。
优选的氨基酸序列如SEQ ID N0:2，与水稻野生型Na+/H+逆向转运蛋白0sNHXl之间相比有2个氨基酸的改变，其中第62位为天冬氨酸，506位为甘氨 酸，也包括与SEQ ID N0:2所示氨基酸序列同源性在70-100°/。之间的蛋白质，也 包括在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中增加、减少或替换一个或几个氨基酸的蛋 白质。
本发明的技术方案如下
1、 Na7H+逆向转运蛋白基因的克隆可以采用PCR扩增法、重组法或人工 合成法等多种方法来获得Na+/H+逆向转运蛋白核苷酸全长序列或其片段。比如， 基于Na7fT逆向转运蛋白基因序列设计多核苷酸探针来从cDNA文库或基因组文 库中筛选目的基因，也可以用PCR扩增方法直接从cDNA或基因组中扩增出有关 序列。
2、 Na7H+逆向转运蛋白基因的DNA改组用于DNA改组的底物可以是生 物体不同个体、株系或种类的Na7H+逆向转运蛋白基因，也可以是通过易错PCR、 定点突变等常规方法制取的不同突变形式的Na+/H+逆向转运蛋白基因。
对Na7H+逆向转运蛋白基因进行DNA改组的主要步骤为首先用DNase I 或限制酶对Na7H+逆向转运蛋白基因进行随机片段化，回收其中的小片段即重 叠片段。然后在不加引物的情况下，用DNA聚合酶进行Primerless PCR使小片 段互为引物和模板进行扩增，从而使不同的突变得到广泛的重组。最后经Primer PCR扩增得到含有重组Na7H+逆向转运蛋白基因片段的重组基因库。
含有重组Na7H+逆向转运蛋白基因片段的重组基因库可以转入到一种细胞 或生物体内如细菌、酵母或植物细胞进行筛选。例如，可以将本发明得到的重组 基因库连接到任何酵母表达载体如pYPGE15中，利用本领域公知的方法如乙酸锂 技术、电转法等转化酵母Na7H+逆向转运蛋白突变体如W303Aenal-4Anhxl中， 构建表达重组基因库。将酵母转化子涂布在含高NaCl浓度的APG选择性平板中 以高盐为选择压力进行高通量筛选，得到盐耐受性显著提高的突变株。
从筛选到的盐耐受性显著提高的酵母突变株中提取质粒，通过测序来获取改 组后的耐高盐Na7H+逆向转运蛋白基因的核苷酸序列，运用常规的生物软件如 DNA Star、 Clustalx和TMpred等对耐高盐Na+/H+逆向转运蛋白基因和野生型 Na7H+逆向转运蛋白基因进行核苷酸序列比对、氨基酸序列比对以及亲水性疏水 性分析等生物信息学分析。结果表明，Na7H+逆向转运蛋白NHXFS1比未改组Na7H+逆向转运蛋白具有更强的离子转运活性，可以将更多Na+的从胞质中区隔 化到液泡中，使导入该基因的宿主细胞具有更好的耐盐性。
NaVH+逆向转运蛋白基因yV^^57作为目的基因，可以构建在任何植物表达 的Ti-质粒双元载体中比如pBISNl上，其中有LB和RB的T-DNA 25bp重复序列， 甘露氨酸合成酶启动子(Pmas)， polyA nos终止子，还有在真核生物中作为选 择标记使用的新霉素磷酸转移酶II(nptII)，用于选择的抗生素是卡那霉素。植 物表达载体中的启动子可以是任何一种组成型启动子、组织特异性启动子或环境 诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，Ubiqutin启动子。载体中 的增强子既可以是转录增强子，也可以是翻译增强子。为了便于对转基因植物细 胞或植物进行鉴定及筛选，载体中还应有植物可选择性标记(GUS基因、荧光素 酶基因等)或具有抗生素等抗性的标记物(如卡那霉素、除草剂等)。
通过本领域公知的研究方法如冻融法、电击法等将上述重组载体导入农杆菌 中，进行农杆菌转化。可通过微注射、基因枪、农杆菌介导或花粉管通道方法等 常规生物技术方法将新的强耐盐Na+/H+逆向转运蛋白基因A^ZFS/转入植物 中，培育出抗盐品质优良及生物学性状得到改善的植物新的品种。被转化的植物 宿主既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物，如拟南芥、烟草、番茄、油菜、 水稻、小麦、玉米、大豆、蔬菜、树木、花卉、牧草和草坪草等。本发明的基因 对于培育抗盐植物品种，提高农作物产量、改善生态环境等具有重要的意义。
本发明的转基因重组载体可作为商业用途的品种、品系或作为基因资源在生 产上直接使用或进行农业生物育种和转基因植物以提高作物的抗盐性。


图1为改组获得的NHXFS1基因与未改组AtNHXl、 0sNHXl、 DmNHXl基因在酵 母双突变菌株W303-IB A enal-4 A nhxl中功能互补实验比较，即以下细胞在 pH5. 5、含有0、 100mM、 200mM、 250mM、 300mM和350mM NaCl的APG平板上生长 情况
其中I为含有PYPGE15质粒的野生型W303-1B， II为含有PYPGE15质粒的 W303-IB Aenal-4: :HIS3 Anhxl: :TRP1， III为含有pYPGE15质粒的W303-1B △ enal—2: :HIS3， IV为含有AtNHXl-pYPGE15重组质粒的W303-1B Aenal-4: :HIS3Anhxl::TRPl， V为含有0sNHXl-pYPGE15重组质粒的W303-IB Aenal-4: :HIS3 Anhxl::TRPl， VI为含有DmNHXl-pYPGE15重组质粒的W303-1B Aenal-4: :HIS3 Anhxl::TRPl， VII ， VI为含有NHXFS1-pYPGE15重组质粒的W303-1B △ enal-4::HIS3 Anhxl::TRPl。
具体实施例方式
实施例1.拟南芥，水稻，菊花Na7H+逆向转运蛋白基因的克隆
用TRizol试剂从拟南芥，水稻和菊花植物幼叶中抽提总RNA，以总RNA为 模版进行反转录，合成cDNA第一链。以合成的cDNA为模版，参照AtNHXl、0sNHXl、 DmNHXl的cDNA序列，设计以下引物(5'端分别包含Smal和SalI酶切位点)
AtR (5' -GCGTCGACTCAAGCCTTACTAAGATCAGGAGG-3，)
AtF (5' -TCCCCCGGGATGTTGGA TTCTCTAGTG-3，)
0sR (5， -ACGCGTCGACTCATCTTCCTCCATGGC-3 ，)
0sF (5， -TCCCCCGGGATGGGGATGGAGGTGGCG-3 ，)
DmR (5' -GCGTCGACTTAGTTTCTTTCTTCATCTTC-3，)
DmF (5， -TCCCCCGGGATGGTGTTCGATTC-3，)
通过？0^扩增获得拟南芥1^7『逆向转运蛋白基因JMffl7、水稻^+/^+逆 向转运蛋白基因&#"17和菊花^7『逆向转运蛋白基因ZWWJ/,分别将其连接 到pGM-T载体中，转入大肠杆菌DH5a，克隆得到^zW^J7、 6te7\^t7、 ZtoWJ7的序 列，并通过测序来确定。
实施例2. ^yWZ7、 flaWJ厶ZfeV^i7基因的DNA改组
1) 起始材料的制备 以pGM-T-AtNHXl、 pGM-T-0sNHXl、 pGM-T-DmNHXl 为模版，用PfuDNA聚合酶对三个基因进行PCR扩增，纯化后作为DNA改组的起 始材料。
2) DNase I随机酶切 紫外吸收法测定纯化后的DNA浓度，取含量为9ug 的AtNHXl、 0sNHXl、 DmNHXl混合，使三个基因物质的量比值为1: 1: 1。取40ul 混合后的AtNHXl、0sNHXl、 DmNHXl加入到50W酶切反应体系中(10函Tris-HCl， pH7. 5， 50mM MnCl2)， 15。C下反应10min。加入 DNase I 0. 15U，混匀，15°C，lminl6s,9(TC, lOmin.产物通过2. 5%琼脂糖凝胶电泳，切下含100-200bp的片 段的凝胶并回收。
3) 无引物PCR 取1Pg回收的小片段，加入到50W反应体系中(10XTaq buffer, dNTP各0. 2mM，6U/W Taq聚合酶)。PCR程序为反应条件94。C预 变性3min， 94。C变性30s， 45°C退火lmin， 72。C延伸lmin，共50cycles， 最后72。C延伸5min。
4) 有引物PCR 取无引物PCR的产物作为模板，分别用AtR和AtF、 OsR和OsF、 DmR和DmF三对引物对重组的基因全长序列进行PCR扩增。PCR反应 体系为(10XTaq缓冲液，dNTP各0. 2mM，每种引物各30MM， 0. 6UTaq聚合酶)， PCR反应程序为94。C预变性3min， 94。C变性lmin， 58°C退火30s， 72。C延 伸1. 5min，共30cycles，最后72°C延伸5rain。
通过DNA改组，以AtF和AtR、 DmF和DmR为引物的两组没有扩增出条带， 而以OsR和OsF为引物获得了含有重组Na7H+逆向转运蛋白基因片段的重组基 因库。
实施例3.表达改组文库的构建及耐高盐^7『逆向转运蛋白基因M/iF57的筛 选
用Sal I和Sma I对实施例2得到的重组产物进行酶切，纯化后连接到同 样酶切的酵母表达载体pYPGE15中，用乙酸锂方法将构建的表达改组文库导入 酵母突变株W303-lBAena1-4: :HIS3 Anhxl: :TRP1中，涂布到不含尿嘧啶的APG 选择培养基上，3CTC，培养2d，筛选到含有1^+/『逆向转运蛋白基因的酵母株， 通过增加NaCl浓度对所筛选到的酵母株进一步进行筛选，最终在200mM NaCl浓 度的选择培养基上得到了一个正常生长的酵母突变子，该突变子含有新的植物强 耐盐基因NHXFS1。
实施例4. 耐高盐基因yV^JAW的序列分析
用酵母质粒提取试剂盒提取耐高盐的酵母突变子中的质粒进行DNA测序。用 DNA Star、 Clustalx和TMpred等软件对耐高盐Na+/H+逆向转运蛋白基因和野 生型Na7H+逆向转运蛋白基因进行核苷酸序列比对、氨基酸序列比对以及亲水性疏水性分析。
结果显示，NHXFS1基因与野生型Na7H+逆向转运蛋白基因6feV〃J7之间有4 个核苷酸的突变，其中第185位鸟嘌呤转换为腺嘌呤，1059位胸腺嘧啶颠换为 腺嘌呤，1221位胸腺嘧啶颠换为鸟嘌呤，1517位腺嘌呤转换为鸟嘌呤。NHXFS1 编码蛋白与水稻野生型Na7PT逆向转运蛋白之间有2个氨基酸的改变，第62位 由甘氨酸变为天冬氨酸，第506位由天冬氨酸变为甘氨酸，如序列表SEQ ID NO: 1 和SEQ ID N0:2。
实施例5. 重组载体和宿主细胞的构建 .
用Sal I和Sma I对实施例3中得到的重组质粒pGM-T-NHXFS1进行酶切， 回收之后连接到经同样酶切的酵母表达载体pYPGE15中，用乙酸锂方法将构建的 NHXFSl-pYPGE15重组质粒导入到酵母双突变株W303-1B Aenal-4: :HIS3 △ nhxl::TRPl中，在不含尿嘧啶的APG选择性培养基中进行筛选，得到阳性转化 子。
实施例6. 酵母功能互补比较实验
野生型酵母W303-1B是一种具有耐盐性的酵母，其突变株W303-1B △ enal-4::HIS3 Anhxl::TRPl耐盐性很低，将含有NHXFS1基因的重组载体导入 该酵母突变株，可进行功能互补比较实验。
用Sal I和Sma I对重组质粒pGM-T-AtNHXl、 pGM-T-OsNHXl、 pGM_T-DmNHXl 进行酶切，回收之后连接到经同样酶切的酵母表达载体pYPGE15中，用乙酸锂方 法将构建的重组质粒导入到酵母双突变株W303-1B Aenal-4::HIS3 △ nhxl::TRPl中，同时将空的酵母表达载体pYPGE15分别导入到野生型酵母 W303-1B、酵母突变株W303-1B Aenal-2: :HIS3和W303-1B Aenal-4: :HIS3 △ nhxl::TRPl中，在不含尿嘧啶的APG选择性培养基中进行筛选。将筛选到的阳 性转化子和筛选到的耐高盐酵母菌株分别接种到APG液体培养基中培养，将0D6。。 都调整到1. 0，分别进行10倍、100倍和1000倍稀释，各取点种到pH5. 5 不同盐浓度(OmM、 100 mM、 200 mM、 250 mM、 300 mM、 350 mM NaCl)的APG 平板上，30°C，培养2d到一周，观察生长情况。结果如图l所示，缺失Na+AT逆向转运蛋白基因的酵母突变株W303-1B △ enal-4::HIS3 Anhxl::TRPl (II)比野生型的酵母菌株W303-1B (III)对盐敏 感的多，表达A髓X1、 OsNHXl、 DmNHXl的酵母突变株W303-1B Aenal-4: :HIS3 Anhxl::TRPl (IV、 V、 VI)能够部分互补酵母的耐盐性，而NHXFS1基因能够 赋予酵母突变株更强的耐盐性(vn、 VI)，这表明此改组获得的船7『逆向转运
蛋白丽XFS1比未改组AtNHXl、 OsNHXl、 DmNHXl Na+/H+逆向转运蛋白具有更强 的离子转运活性，可以将更多Na+的从胞质中区隔化到液泡中。序列表
<110>华东师范大学
〈120〉 一种新的植物强耐盐基因NHXFS1及其编码蛋白和应用 〈130〉 none 〈160〉 2
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211> 1608
〈212> DNA 〈213>人工序列
〈400〉 1
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cagcaagttg taatatggtg ggctgggctg atgagaggag ctgtgtcgat tgctcttgct 1200
tacaataagt ttacaagatc gggccatact cagctgcacg gcaatgcaat satgatcacc 1260
agcaccatca ctgtcgttct ttttagcact atggtatttg ggatgatgac aaagccattg 1320
atcaggctgc tgctaccggc ctcaggccat cctgtcacct ctgagccttc atcaccaaag 1380
tccctgcatt ctcctctcct gacaagcatg caaggttctg acctcgagag tacaaccaac 1440
attgtgaggc cttccagcct ccggatgctc ctcaccaagc cgacccacac tgtccactac 1500
tactggcgca agttcggcga cgcgctgatg cgaccgatgt ttggcgggcg cgggttcgtg 1560
cccttctccc ctggatcacc aaccgagcag agccatggag gaagatga 1608
〈210〉 2 〈211〉 536 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400〉 2
Met Gly Met Glu Val Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Leu Tyr Thr Thr 15 10 15
Ser Asp Tyr Ala Ser Val Val Ser lie Asn Leu Phe Val Ala Leu Leu
Cys Ala Cys lie Val Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp Val 35 40 45
Asn Glu Ser lie Thr Ala Leu lie lie Gly Leu Cys Thr Asp Val Val 50 55 60
lie Leu Leu Met Thr Lys Gly Lys Ser Ser His Leu Phe Val Phe Ser 65 70 75 80Glu Asp Leu Phe Phe lie Tyr Leu Leu Pro Pro lie lie Phe Asn Ala 85 90 95
Gly Phe Gin Val Lys Lys Lys Gin Phe Phe Arg Asn Phe Met Thr lie 100 105 110
Thr Leu Phe Gly Ala Val Gly Thr Met lie Ser Phe Phe Thr lie Ser 115 120 125
lie Ala Ala lie Ala lie Phe Ser Arg Met Asn lie Gly Thr Asp 130 135 140
Val Gly Asp Phe Leu Ala lie Gly Ala lie Phe Ser Ala Thr Asp Ser 145 150 155 160
Val Cys Thr Leu Gin Val Leu Asn Gin Asp Glu Thr Pro Phe Leu Tyr 165 170 175
Ser Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser lie Val 180 185 190
Leu Phe Asn Ala Leu Gin Asn Phe Asp Leu Val His lie Asp Ala Ala 195 200 205
Val Val Leu Lys Phe Leu Gly Asn Phe Phe Tyr Leu Phe Leu Ser Ser 210 215 220
Thr Phe Leu Gly Val Phe Ala Gly Leu Leu Ser Ala Tyr lie lie Lys 225 230 235 240
Lys Leu Tyr lie Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu Met 245 250 255
Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu Leu Leu Asp Leu 260 265 270
Ser Gly lie Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly lie Val Met Ser His Tyr 275 280 285
Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr Thr Lys His Ala 290 295 300
Phe Ala Thr Leu Ser Phe lie Ala Glu Thr Phe Leu Phe Leu Tyr Val 305 310 315 320Gly Met Asp Ala Leu Asp lie Glu Lys Trp Glu Phe Ala Ser Asp Arg 325 330 335
Pro Gly Lys Ser lie Gly lie Ser Ser lie Leu Leu Gly Leu Val Leu 340 345 350
lie Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu 355 360 365
Thr Lys Lys Ala Pro Asn Glu Lys lie Thr Trp Arg Gin Gin Val Val 370 375 380
lie Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser lie Ala Leu Ala 385 390 395 400
Tyr Asn Lys Phe Thr Arg Ser Gly His Thr Gin Leu His Gly Asn Ala 405 410 415
lie Met lie Thr Ser Thr lie Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Met Val 420 425 430
Phe Gly Met Met Thr Lys Pro Leu lie Arg Leu Leu Leu Pro Ala Ser 435 440 445
Gly His Pro Val Thr Ser Glu Pro Ser Ser Pro Lys Ser Leu His Ser 450 455 柳
Pro Leu Leu Thr Ser Met Gin Gly Ser Asp Leu Glu Ser Thr Thr Asn 465 470 475 480
lie Val Arg Pro Ser Ser Leu Arg Met Leu Leu Thr Lys Pro Thr His 485 490 495
Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Gly Asp Ala Leu Met Arg Pro 500 505 510
Met Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe Ser Pro Gly Ser Pro Thr 515 520 525
Glu Gin Ser His Gly Gly Arg Glx 530 53权利要求
1、一种新的植物强耐盐基因NHXFS1，其特征在于，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)与序列表中SEQ ID NO1限定的核苷酸序列同源性在70-100％、且编码相同功能蛋白质的DNA序列；3)编码序列表中SEQID NO2所示蛋白质序列的DNA序列。
2、 一种新的植物强耐盐基因y^tF57的编码蛋白，为具有离子转运活性的Na7H+ 逆向转运蛋白NHXFS1，其特征在于，是下列氨基酸序列之一1) 序列表中SEQ ID N0:2;2) 与序列表中SEQ ID N0:2限定的氨基酸序列同源性在70-100%之间的蛋 白质；3) 在SEQ ID NO:2限定的氨基酸序列中增加、减少或替换一个或几个氨基 酸且具有相同活性的蛋白质。
3、 含有权利要求l所述基因的重组载体。
4、 含有权利要求l所述基因的宿主细胞。
5、 权利要求1所述一种新的植物强耐盐基因NHXFS1在培育抗盐植物方面的应 用，其特征在于，所述植物强耐盐基因NHXFS1通过微注射、基因枪、农杆菌介 导或花粉管通道的方法转入植物中，培育出耐盐性及生物学性状得到改善的植物 新品种。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域，提供了通过DNA改组技术获得的新的植物强耐盐基因NHXS1。其核苷酸序列为SEQ ID NO1或者是与SEQ ID NO1核苷酸序列同源性在70～100％之间的DNA序列，或编码SEQ ID NO2蛋白质序列的DNA序列。此基因编码的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白NHXS1比野生型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白AtNHX1具有更强的离子转运活性的。本发明还提供了重组载体的构建、转基因植物等方法以应用上述基因和蛋白质，可培育耐盐性更强或其他生物学性状得到改善的转基因植物新品种。
文档编号C07K14/415GK101413004SQ20081020331
公开日2009年4月22日 申请日期2008年11月25日 优先权日2008年11月25日
发明者涛 夏, 辉 张, 凯 徐 申请人:华东师范大学