专利名称：一种艾滋病毒重组抗原及其融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫检测领域，具体地说，本发明涉及一种新的融合蛋白， 含有编码该融合蛋白的核酸序列，以及含有上述核酸序列的质粒载体，转 化有上述质粒载体的宿主细胞转化子，还涉及一种利用该融合蛋白构建的
HIV重组抗原，以及该重组抗原制备的HIV抗体检测试剂盒。
背景技术：
艾滋病的医学全名为"获得性免疫缺陷综合征"(Acquired Immune Deficiency Syndrome-AIDS),由人类免疫缺陷病毒(HIV，又称艾滋病病 毒)引起。HIV是一种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免疫系统中 最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏T4淋巴细胞，从而 破坏人的免疫系统，最终使免疫系统崩溃，使人体因丧失对各种疾病的抵 抗能力而发病并死亡，故科学家称这种病毒为"人类免疫缺陷病毒"。艾滋 病病毒在人体内的潜伏期平均为12年至13年。在发展成艾滋病病人之前 外表看上去正常，他们可以没有任何症状地生活和工作很多年，便能够将 病毒传染给其他人，使艾滋病病毒在人群中得以迅速传播和蔓延。
自1981年全球发现首例艾滋病病人以来，国际社会一直在积极研究以 应对这一重大传染性疾病。2008年7月，联合国艾滋病规划署发表的《2008 年全球艾滋病疫情报告》指出，经过国际社会多年来为防治艾滋病做出的 积极努力，全球艾滋病防治在2007年首次出现了 "明显的重要进展"，艾 滋病病毒新感染人数和死亡人数都有所下降。但是，全球艾滋病疫情蔓延 的趋势还没有得到逆转。据联合国艾滋病规划署统计，目前全球共有3320 万名艾滋病病毒感染者，其中2250万名感染者分布在撒哈拉沙漠以南的众 多非洲国家；亚洲有近500万名感染者；东欧和中亚地区约150万名；拉 美地区约170万名；北美、西欧和中东欧地区约200万名，其中美国约120万名。中国于1985年发现首例艾滋病感染病例。在1985年至2000年底的 15年间，中国累计报告的发病人数和死亡人数分别为880例和496例，。而 截全2007年底，我国现存艾滋病病毒感染者和病人约70万人，其中艾滋 病病人8.5万人。各种数据说明不论是我国还是全球其他各国在艾滋病防治 领域的工作任重而道远。
目前各国在艾滋病防治领域的研究重点主要集中在疫苗、诊断和治疗 这三个方面。多年来，有效的HIV疫苗研制工作仍未成功，治疗HIV的特 效药虽然有了一定的成果但是仍然有待进一步研究，这使得对HIV感染的 及时和准确诊断成为了目前艾滋病预防控制工作中的重中之重，也是控制 艾滋病传播的基础工作和最有效的手段之一。在艾滋病诊断方面，HIV抗 体筛査是目前HIV诊断的通用方法和重要手段。通过对各种血制品和受检 人群的血液或其他体液进行HIV抗体筛查，能有效的检测出艾滋病病毒感 染。具体的抗体筛査方法以检测原理的不同可划分为酶联免疫吸附法、凝 集法和层析法，它们均可对血液、唾液和尿液标本进行常规或快速检测。
随着医学和生物技术的不断发展，目前在HIV的免疫检测中以双抗原 夹心法的应用最为广泛。HIV双抗原夹心法原理是在固相支持物上面包 被第一抗原(即包被抗原)，加入待检标本，以合适的方式引入标记有特殊
标记物的第二抗原(即标记抗原)，假如标本中存在mv抗体，则HIV抗
体跟上述二种抗原，形成"包被抗原-HIV抗体-标记抗原"的三明治结构， 然后通过标记抗原上的标记物将信号放大，得出最终的判定结果。
应用HIV双抗原夹心法的关键之一在于标记抗原的质量，标记抗原的 活性对免疫检测的灵敏度有着决定性的影响。而高活性的标记抗原需要具 备两个条件 一方面，标记抗原中单位抗原上结合的标记物要尽可能多； 另一方面，标记抗原中抗原的免疫学活性要尽可能高。因此，在标记物和 标记方法限定的情况下，制备的标记抗原活性好坏是由抗原特点决定的， 高活性的标记抗原其抗原需要具备的条件是-
1.可溶性好，折叠构象正确。抗原的免疫学活性很大程度依赖于其空 间构象，尤其是对抗原上面的构象型表位。抗原在表达时，如果作为包涵体的形式， 一般来说都是没有正确折叠的。这种溶解性不好的抗原在标记 之后一般活性不佳。
2.抗原表达量大，有利于大量生产。这一点是本领域技术人员公知的。 由于很多抗原在和标记物偶联之后，其形成的标记抗原的活性很低。 通常的解决方法就是在抗原上融合表达一段融合蛋白，形成融合蛋白-抗原 的嵌合抗原的表达形式，使用该方法表达出来的重组抗原在可溶性和表达 量方面均有更好的表现，从而具备优良的标记性能。现有技术中普遍采用 的融合蛋白有TRX (由Novagen公司pET-32a载体所带有的融合蛋白，货 号69015-3) 、 GST (由Phamarcia公司pGEX-4T-l载体所带有的融合蛋白， 货号，27-4580-01) 、 SOD (Chiron公司，US5066591) 、 CKS (Abbott公 司，US5124255)等融合蛋白。这些融合蛋白的运用在一定程度上有利于提 高抗原在表达或标记方面的性能，但是均存在一定程度的不足。例如，CKS 表达量非常大，但是大部分表达在包涵体，对抗原标记有不利；GST、 SOD 与HIV抗原蛋白融合表达结果也大多在包涵体，同样不利于标记；TRX是 目前实际应用中最为常用的一个,但使用中仍存在不足，例如假阳较高。
本发明提供了一种更具优势的全新的融合蛋白(为便于描述，将此融 合蛋白命名为"HT")。将HT融合蛋白和HIV抗原融合表达，在抗原表达 量和可溶性方面均具有明显优势。将HT-HIV融合抗原标记之后作为标记抗 原应用于fflV双抗原夹心法检测HIV抗体，检测的灵敏度、特异性也有了 明显提高。
此外，本发明的融合蛋白HT，还可以应用于HIV项目之外的其它蛋白 的可溶性表达上面。
发明内容
名词定义
本发明中使用的术语除非另有说明，否则具有以下含义 融合蛋白本发明中使用的术语"融合蛋白"是指与目的抗原融合表 达成融合抗原的蛋白。
融合抗原本发明中使用的术语"融合抗原"为融合蛋白与目的抗原的融合表达产物。
重组抗原本发明中使用的术语"重组抗原"为利用基因工程重组技 术，将编码抗原所对应的核酸序列插入到表达载体，形成重组质粒，然后
将重组质粒导入宿主细胞并诱导表达的抗原。
标记抗原本发明中使用的术语"标记抗原"为免疫检测中与标记物 相偶联的抗原。
标记本发明中使用的术语"标记"是指标记抗原跟标记物的偶联。 标记物本发明中使用的术语"标记物"指在免疫检测中可被检测到
的物质，包括但不限于胶体金、辣根过氧化物酶。"标记物"也可指包含该
标记物的"标记复合物"。
胶体本发明中使用的术语"胶体"可为任何合适的胶体，包括但不
限于胶体金、胶体硒、胶体银。
胶体金colloidal gold，也称金溶胶goldsol，本专利可以简称为Au。
发明目的
本发明的目的是为了提供一种表达量大、可溶性好、折叠正确的HIV 基因工程重组抗原，用它改善现有HIV抗体检测试剂盒的灵敏度、特异性。
本发明的另外一个目的是为了提供一种可提高重组蛋白的表达量、可 溶性、折叠正确的融合蛋白，含有编码该融合蛋白的核酸序列，以及含有 上述核酸序列的质粒载体，转化有上述质粒载体的宿主细胞转化子。
发明详述
本发明发现了一种新融合蛋白HT，并提供了该融合蛋白的氨基酸序列， 如SEQIDNO: l所示。本融合蛋白，是根据大肠杆菌K-12株的测序结果 所推导的某个假定基因的产物。值得进一步说明的是，该基因仅是根据测 序得出的核酸序列进行理论上的分析推导而来的，故称其为假定基因。在 本发明之前，还没有资料记载关于该基因或者该基因所编码的蛋白的作用 和及应用。
发明人通过详细分析和实验筛查，发现本发明中涉及到的SEQIDNO: 1的序列的亲水性很好，具有成为融合蛋白的潜力。经过一系列的反复实验分析，得出HT融合蛋白在各方面相较目前技术中采用的融合蛋白有明显的 优势。基于上述分析，将HT蛋白与HIV gpl60蛋白质的510至681位氨基 酸残基的蛋白质片段，例如SEQIDNO: 4所示的HIV蛋白片段融合表达， 根据实验结果显示，HT融合蛋白的应用可以提高HIV蛋白的表达量，并且 使蛋白表达产物分布在上清的比例大大提高。
因此，本发明提供一种重组蛋白质，其特征在于该重组蛋白质含有如 下(A)或者(B)所述的蛋白质(A)具有SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列；(B) 将(A)中的氨基酸序列经过一到几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加而衍 生的蛋白质并且不改变其亲水性。
进一步，本发明提供一种重组蛋白质，其特征在于该重组蛋白质含有 如下(A)或者(B)所述的蛋白质(A)具有SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列； (B)将(A)中的氨基酸序列经过一到几个氨基酸残基的取代，缺失或者添加而 衍生的蛋白质并且不改变其亲水性。
进一步，本发明提供一种重组蛋白质，其特征在于该重组蛋白质含有 如下(A)或者(B)所述的蛋白质(A)具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列； (B)将(A)中的氨基酸序列经过一到几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加而 衍生的蛋白质并且不改变其亲水性。
此外，通过融合表达本发明的HT蛋白和HIV env基因编码的gp41蛋 白(如SEQIDNO: 4所示)，可显著增大整个蛋白的的表达量，提高整个 重组抗原的可溶性；尤其在经过标记之后，将该重组抗原应用于HIV双抗 原夹心法检测，具有灵敏度高、特异性好的突出特点。
因此，本发明提供一种重组蛋白质，该基因工程重组蛋白质里面不仅 包含有SEQ ID NO: 1或2或3所代表的蛋白质序列，还嵌合有含有HIV gpl60蛋白质的510至681位氨基酸残基的蛋白质片段。
进一步，本发明还提供一种重组蛋白质，该基因工程重组蛋白质里面 不仅包含有SEQ ID NO: 1或2或3所代表的蛋白质序列，还嵌合有含有 如SQEIDNO: 4所示的HIVgp41蛋白质片段。
进一步，本发明还提供上述的重组蛋白质制备的HIV抗体检测试剂盒。在另一方面，本发明还提供编码所述重组蛋白的核酸序列的载体和该 载体所转化的宿主细胞。
在另一方面，本发明还提供上述重组蛋白的制备方法，包括
(a) 将编码含有SEQ ID NO: 1或2或3蛋白质片段的核苷酸序列连于 质粒载体，形成重组质粒；
(b) 将步骤(a)中的重组质粒转入宿主细胞，形成转化子细胞；
(c) 在适合的条件下，培养步骤(b)中的转化子细胞，表达该重组蛋白质;
(d) 分离纯化出该重组蛋白质。 技术解决方案
本发明涉及的一个基因工程重组蛋白(即HT)的核酸序列是从大肠杆 菌K-12株的基因组序列中获取的。其获取方法为提取大肠杆菌K-12株 的基因组，以大肠杆菌K-12株的基因组序列为模版，合成两条引物A1和 Bl，其中A1为正向引物，Bl为反向引物，引物两端带有合适的酶切位点， 选择适当的温度和过程PCR出HT的DNA片段。将PCR产物通过琼脂糖 凝胶电泳确定大小和浓度后，经过酶切、连接，将该HT蛋白的基因构建到 一个不带有融合蛋白基因的载体中。HT载体构建好后，通过转化宿主菌， 选取单克隆菌株培养，诱导目的蛋白表达，进行SDS-PAGE电泳、酶切电 泳鉴定阳性菌株。选取合适的宿主蛋白，培养表达并纯化相应的基因工程 重组蛋白HT。
本发明中涉及到的一个重组蛋白，即重组蛋白HT与HIV gp41蛋白融 合的重组抗原的获取方法。以构建好的HT载体为模板，选择合适的酶切位 点，同时扩增SQEIDNO: 4所示的HIVgp41基因片段，并且该片段带有 跟HT载体能够连接到一起的酶切位点，按照通用的分子克隆过程构建载 体。载体构建好后，通过转化，菌株培养，获取相应的质粒。选取合适的 宿主菌株，培养表达并纯化相应的蛋白。
本发明涉及的重组抗原即HT与艾滋病毒gp41蛋白融合表达的应用仅 为该基因工程重组蛋白HT作为融合蛋白在免疫抗原方面的一个具体应用， 但不仅仅局限于艾滋病蛋白，还可以与其他蛋白融合应用，并应用于除免疫检测以外的其他方面。 具有的有益效果
根据以上本发明的描述，本发明的重组蛋白作为融合蛋白与其他目的 蛋白融合表达后，能增强目的蛋白亲水性，有利于目的蛋白表达在上清部 分，从而使目的抗原的空间构象折叠的更加接近天然抗原。根据以上特点，
采用此重组蛋白HT作为融合蛋白与目的蛋白融合表达出来的重组抗原具 有很高活性，尤其是用在免疫检测中的酶标记或者胶体标记的标记抗原时， 灵敏度、特异性等均显著优于目前常用的其他方式所表达的抗原。
本发明的目的、特征及优点将结合实施例，参照附图作进一步详细阐 述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 0989)中所述的条件，或者试剂盒生产厂家推荐的方法。
图1: P2-HT载体的构建过程
图2: P2-HT-fflV表达质粒的构建过程
具体实施方式
实施例l构建带有HT融合蛋白的载体
本发明参考专利FPCH04160045P构建了表达质粒P2，也就是本发明所 使用的克隆载体，在实施本发明的过程中P2并不是必须表达载体，其上游 的增强子在本发明中也不起实质作用，构建此载体只是为了克隆方便，其 它许多表达载体如pET-24a ( + )(美国Novagen公司，货号69749-3)均 可用于实施本发明。
用Oligo软件计算机辅助设计该SEQIDNO: l区段的引物，引物序列 为上游引物Al 5，誦GGC AGA TCT CAC CAC CAC CAC CAC CAC GAA GCG GAA CAG CAA GG -3， ， 5'端带有BglII酶切位点和三个保护碱基，以及6个His的标签，下游引物Bl 5，- GGC GAA TTC TTA GGA TCC ATT AAACCAGCTGTCCGATT-3，， 5'端带有BamHI、 EcoRI酶切位点，两 个酶切位点之间加入一个终止密码子，最末端带有三个保护碱基。同原理， 用Oligo软件计算机辅助设计分别设计SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3区 段的引物，其中SEQ ID NO: 2的两条弓l物分别为A2 5，-GGC AGATCT CAC CAC CAC CAC CAC CAC GAC AAA AAA CGC隱3， ， B2 5，- GGC GAA TTC TTA GGA TCC CTT TGT GCT TCA GTT -3，； SEQ ID NO: 3的两条引 物分另'J为A3 5，- GGC AGA TCT CAC CAC CAC CAC CAC CAC AAG AAA GCT CGT C -3, ， B3 5，- GGC GAA TTC TTA GGA TCC CTT TGT GCT TCA GTT -3，。
在装有5ml LB培养基的试管内，接种大肠杆菌ER2566菌株(美国New England Biolabs公司)，37。C摇床培养至OD= 1 ，收集菌液，12000rpm离 心，去掉上清，菌体用基因组提取试剂盒(本发明所使用的分子生物学提 取和回收试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司)提取其全基因组。
以上面提取的ER2566基因组作为模板，用上面设计的三对引物分别 PCR扩增HT基因。PCR条件为94°C， 5分钟xl个循环，(94°C， 30秒 钟，55°C， 40秒钟，72°C， 40秒钟)x30个循环，72°C， 10分钟xl个循环。 为了方便描述，得到的SEQIDNO: 1， 2和3三段PCR产物分别对应命名 为HT1， HT2禾QHT3。将上述PCR产物回收之后，分别用BglII和EcoRI 酶(本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自大连宝生物工程有限公司) 同时酶切，之后回收各自的酶切产物，分别连接到用Bamffl和EcoRI酶切 之后的P2载体上，经过转化，PCR鉴定重组子，得到阳性转化子，提质粒， 就得到了改造好的载体P2-HT1， P2-HT2， P2-HT3。该步骤可参见图1。
实施例2构建含有HIV融合抗原基因的表达质粒
PCR扩增HIV的env基因gp41中SEQ ID NO: 4区段所对应的DNA 片段，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有EcoRI位点且EcoRI位 点之前带有终止密码TAA。 PCR的片段经过回收和酶切之后，分别连接到 经过Bamffl和EcoRI酶切之后的P2-HT1， P2-HT2， P2-HT3载体，经过转化，PCR鉴定重组子，得到的阳性克隆P2-HT1-HIV， P2-HT2-HIV， P2-HT3-HIV。该步骤可参见图2。
实施例3含有HIV融合抗原的表达和纯化
将P2-HT1-HIV， P2-HT2-HIV， P2-HT3-HIV质粒分别转化大肠杆菌 ER2566,涂布于含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程技术服务有 限公司，以下简称生工，货号KB0286)的LB平板上，37。C过夜培养，挑 取单克隆，用含同一浓度卡那霉素的500ml LB培养基37'C振荡培养至 OD600 1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG (生工，货号IB0168)进行诱 导，诱导条件为37°C， 200rpm， 4小时。4°C 5000rpm离心20分钟收集 菌体，每升菌液的菌体用10ml裂解缓冲液(50mMTirs-HCl， pH8.0， lmM EDTA， 100mM NaCl)重悬，超声破碎，4°C 12000rpm离心20分钟，经 SDS-PAGE电泳鉴定后，三种表达产物均有90%以上的目的蛋白分布在裂 解上清液中。
为进一步证明本发明中的融合蛋白具有表达量大，上清分布比例大的 优势，故将上述fflV的env基因gp41中SEQ ID NO: 4区段所对应的片断 分别与其他载体P2 (不加任何融合蛋白)、P2-TRX、 P2-GST、 P2-S0D、 P2-CKS进行融合表达，并将其结果作对比实验，来进行关于HT融合蛋白 优越性说明。即将P2-HT1-HIV， P2-HT2-fflV, P2-HT3-HIV、 P2-HIV、 P2誦TRX-HIV、 P2-GST-HIV、 P2-SOD-HIV、 P2-CKS-fflV (这几个克隆的 制备过程，和P2-HT1-HIV类似，本领域的技术人员应该熟知，在此不再赘 述)在同一条件下的诱导表达结果作比较。对比实验步骤:各取P2-HT1-HIV， P2-HT2-fflV ， P2國HT3-fflV 、 P2画HIV 、 P2-TRX-fflV 、 P2-GST-HIV 、 P2-SOD-fflV、 P2-CKS-HIV质粒0.2 ul转化大肠杆菌ER2566感受态细胞， 涂布于含100ug/ml卡那霉素的LB平板上，37匸过夜培养。各挑取 P2画HT1-HIV ， P2-HT2-HIV ， P2-HT3隱HIV 、 P2-HIV 、 P2-TRX-HIV 、 P2-GST-HIV、 P2-SOD-HIV、 P2-CKS-fflV的单克隆10个，分别用含同一 浓度卡那霉素的500ml LB培养基37t:振荡培养至OD600二1.0，用终浓度 为0.5mM的IPTG (生工，货号IB0168)进行诱导，诱导条件为37°C，200rpm， 4小时。4°C 5000rpm离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用10ml裂解缓冲液(50mMTirs-HCl， pH8.0， lmMEDTA， 100mMNaCl)重悬，超声破碎，4'C 12000rpm离心20分钟，收集上清和沉淀部分，分别取相同初始菌体积的蛋白成分，上SDS-PAGE电泳，通过Dolphin-lD软件分析凝胶，得出各自表达量(目的蛋白占总蛋白的百分比)和溶解性(上清目的蛋白占总目的蛋白的百分比)的平均值，结果如下
表1 Dolphin-ID分析凝胶对P2-HT1-HIV、 P2-HT2-HIV、 P2-HT3-HIV、 P2-HIV、 P2-TRX-HIV、
P2-GST-HIV、 P2-S0D-H1V、 P2-CKS-HIV表达结果的分析比对表达体系表达量溶解性
P2-HT1-HIV20.4卯.5
P2-HT2-HIV21.8卯.7
P2-HT3-HIV22.191.2
P2- HIV5.65.1
P2-TRX- HIV13,969.5
P2-GST- HIV15.84.6
P2-SOD-HIV14.133.8
P2-CKS-HIV18.72.5
从上述结果可以看到，P2-HTl-fflV， P2-HT2-HIV， P2-HT3-HIV的表达量和溶解性要好于其它几种抗原。
收集P2-HTl-HIVAg上清，加入0.5倍上清体积的饱和硫酸铵溶液，4°C12000rpm离心20分钟，收集沉淀，用10ml平衡缓冲液(10mMNa2HPO4，1.8mMKH2P04， 140mMNaCl， 2.7mMKCl， 5mM咪唑(美国Sigma隱Aldrich公司，货号15513) ， pH8.0)溶解，用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司，货号30210)之后，加入蛋白样，用10倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白，再用5倍体积洗脱缓冲液(50mMNaH2P04， 300mM NaCl， 500mM咪唑，pH8.0)，洗脱目的蛋白，测定蛋白浓度，-20^保存备用。P2-HT1-HIV质粒表达纯化之后的融合抗原在下文简写为P2-HTl-HIVAg。其它表达在上清中的目的蛋白，纯化方式类似。
P2-HIV、 P2-GST-HIV、 P2-CKS-HIV、 P2-S0D-HIV包涵体的纯化方式经SDS-PAGE电泳鉴定后，部分目的蛋白分布在裂解液沉淀。每升菌液的菌体用10ml裂解缓冲液(50mM Tirs-HCl，pH8.0， lmMEDTA， 100mMNaCl)重悬，超声破碎，4°C 12000rpm离心20分钟收集包涵体，用含2% TritonX-100 (生工货号T0694)的溶液I (20mMTirs-HCl， pH8.5， 5mMEDTA，lOOmMNaCl)重悬，4°C 12000rpm离心20分钟收集包涵体，用溶液I配制的8M尿素溶解后对100倍体积的PB缓冲液(pH7.0， 20mM)透析，换液3次，4°C 12000rpm离心20分钟去除沉淀后制成粗抗原，用10ml平衡缓冲液(10mMNa2HPO4， 1.8mMKH2P04， 140mM NaCl， 2.7mM KC1， 25mM咪唑(美国Sigma画Aldrich公司，货号15513) ， pH8.0)溶解。用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司，货号30210)之后，加入蛋白样，用IO倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白，再用5倍体积洗脱缓冲液(20mMNa2HPO4， 300mMNaCl， 250mM咪唑，pH8.0)，洗脱目的蛋白。
纯化之后的目的蛋白分别命名为P2-HTl-fflVAg、 P2-HT2-HIVAg、P2-HT3-HIVAg 、 P2画HIVAg 、 P2-TRX-HIVAg 、 P2-GST画HIVAg 、P2-S0D画HIVAg、 P2画CKS画HIVAg。
实施例4融合抗原和HRP的偶联
融合抗原和HRP的偶联采用Nal04氧化法。称取10mg辣根过氧化物酶(HRP，美国SIGMA公司，货号P8375)溶解于lml超纯水中，再缓慢滴加lml超纯水新鲜配制的5mg/mlNa104 (生工，货号ST1244)溶液，室温下避光轻柔搅拌40分钟后加入20%乙二醇(生工，货号E0582)溶液0.05ml，室温下避光搅拌40分钟。然后立即加入事先对100mM， pH9.51碳酸盐缓冲液透析2小时，2.5mg/ml的纯化好的P2-HTl-HIVAg抗原lml， 4'C避光对100mM， pH 9.51碳酸盐缓冲液透析过夜。次日，向混合物中滴加0.1ml新鲜配制的4mg/mlNaBH4 (生工，货号ST1268)溶液，混匀，4t:静置2小时。将上述溶液装入透析袋中，对PBS缓冲液(150mM， pH7.4)透析，4"C过夜。加入酶保护剂及终浓度50%的甘油混匀后-20°(:避光保存备用。P2-HTl-HIVAg融合抗原标记HRP之后的标记抗原在以下的文字中称为P2-HTl-HIVAg-HRP，其它抗原制备标记抗原的名称和制备方法均以此类推。
实施例5含有HRP的HIV重组抗原用于双抗原夹心法ELISA检测HIV抗体
将P2-HIVAg抗原以一定比例用碳酸盐缓冲液(50mM， pH9.51)稀释，100ul/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司辐照酶标板)，4'C包被24小时，次日用PBST (10mMPB， 150mMNaCl， 0.05% Tween画20， pH7.4)洗涤液洗板二次，拍干，120ul/孔加入含30%新生牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)，8%蔗糖，5%。酪蛋白(美国Sigma-Aldrich公司，货号C-8645) , 1%。卩-巯基乙醇(生工，货号M0482) , 150mMNaCl的pH7.4，lOmMPB封闭液，37"C封闭2小时，甩掉孔内液体，拍干，置室温20-25"C、湿度55%-65%、有通风设备的房间内风干。封装于加有干燥剂的铝膜袋中，包被完毕。
在包被酶标板中先加入100ul待测样品、阴性参照样品(正常人阴性血清)、阳性参照样品(fflV-l型抗体阳性血清)对照，37-C温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干。再100ul/孔加入含有20。/。新生牛血清，以一定比例稀释的P2-HTl-HIVAg-HRP缀合物的pH7.4的20mM PB缓冲液，37'C温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干。(P2-HT2-fflVAg-HRP，P2-HT3-HIVAg-HRP的实验方法同P2-HTl-HIVAg-HRP)
每孔加入含0.5%。过氧化氢尿素(生工，货号UB1753) 、 4.76%。三水合乙酸钠、0.9。/。。冰醋酸的显色剂A及含0.3296。TMB (生工，货号TB0514)、5mM拧檬酸、0.5mM EDTA-2Na、 5%甲醇、2%。二甲基甲酰胺的显色剂B各50ul， 37t:避光显色IO分钟。每孔加50ul，含2M硫酸的终止液终止反应，酶标仪450nm波长(参考波长630nm)空白孔校零后读取OD值。
截值(Cutoff Value (COV))计算COV二阴性对照平均OD值x2.0(阴性对照OD值低于0.075按0.075计算，高于0.075按实际OD值计算)，待测样品OD值^COV为阳性，待测样品OD值〈COV为阴性。
本发明的融合蛋白HT (包括HT1， HT2， HT3)连接HIV目的蛋白之后表达的重组抗原，标记HRP之后用于双抗原夹心法ELISA检测HIV抗体，灵敏度、特异性、准确性等指标均优于P2、 P2-TRX、 P2-GST、 P2-S0D、P2-CKS等表达载体表达的HIV抗原标记HRP之后的缀合物。(1)灵敏度
我们用同样的方法选择最佳的标记条件，将P2-HTl-fflVAg，P2-HT2-fflVAg ， P2-HT3-HIVAg 、 P2画HIVAg 、 P2-TRX-HIVAg 、P2-GST-HIVAg、 P2-SOD-HIVAg、 P2-CKS-fflVAg分别标记上HRP，并用同样的方法选择各自的最佳使用比例，再用二步夹心法在同一环境统一的试剂的条件在对100份的系列稀释比例的HIV-1型抗体阳性血清进行检测，得到了表2的结果，结果表明本发明融合蛋白连接HIV基因并标记后和P2、P2画TRX、 P2-GST、 P2-SOD、 P2-CKS等表达载体连接HIV抗原并标记后对各稀释度血清反应的灵敏度差异均具有统计意义(PO.05)。由此可见，本发明融合蛋白连接HIV型抗原并标记后的灵敏度有较大的提高。
表2本发明融合蛋白HT连接HIV抗原表达的融合抗原制备的HRP缀合物在用于双抗原夹心法ELISA检测HIV抗体时的灵敏度比较
100份血中检测出的份数
血清稀释度(倍)
i2550100200
P2-HTl-HlVAg-HRP1001001009895
P2-HT2-HIVAg-HRP100100999896
P2-HT3-HIVAg-HRP1001001009894
P2-HIVAg-HRP10096827054
P2-TRX-HIVAg-HRP100100979491
P2-GST-HIVAg-HRP100100%9184
P2-SOD-HIVAg-HRP10099917365
P2-CKS-HIVAg-HRP10098886962
(2)特异性
用 P2-fflVAg 包被 96 孔板，用P2画HT1-HIVAg-HRP ，P2-HT2-HIVAg画HRP ，P2陽HT3-HIVAg-HRP、 P2-HIVAg-HRP 、
P2-TRX-fflVAg-HRP 、P2-GST-fflVAg-HRP 、P2-SOD-HIVAg-HRP 、P2-CKS-fflVAg-HRP缀合物作为酶标记物分别组成试剂盒，用二步夹心法在相同条件下分别分别检测了 3000份临床阴性血清，P2-HTl-HIVAg-HRP，P2-HT2-HIVAg-HRP ， P2-HT3-fflVAg-HRP假阳性率为 0.033% ，P2-HIVAg-HRP 、 P2-CKS-fflVAg-HRP 假阳性率为 0.066% ，P2-GST-fflVAg-HRP 、 P2-SOD-fflVAg-HRP的假阳性率为0.1% 、P2-TRX-HIVAg-HRP假阳性率为0.133%。
(3) 重复性
对阴、阳性待测样品各240份，采用不同时不同批次不同操作者进行多次检测，考查 P2-HTl-HIVAg-HRP ， P2-HT2-HIVAg-HRP ，P2-HT3-HIVAg-HRP分别用于组成试剂盒后判定结果的重复性，结果显示本发明P2-HTl-fflVAg-HRP， P2-HT2-fflVAg-HRP， P2-HT3-HIVAg-HRP
用于组成的试剂盒对阴、阳性判定结果的重复性均为100%。这表明本融合蛋白用于基因克隆及HRP标记的再现性好，重复性高。
(4) 稳定性
将本发明的融合蛋白连接抗原后表达的蛋白P2-HTl-HIVAg，P2-HT2-fflVAg，P2-HT3-HIVAg以及标记HRP的抗原P2-HTl-HIVAg-HRP，P2-HT2-HIVAg-HRP， P2-HT3-HIVAg-HRP分别37。C考核144小时，取出后与同时4T:存放的抗原和抗原酶在同一条件下检测相同的阴、阳性质控血清，抗原包被后间接法检测，抗原酶稀释成工作液后二步夹心法检测，其结果见表3和表4。实验表明，本发明融合蛋白用来表达的抗原和表达抗原标记后的稳定性好。
表3 P2-HTl-HIVAg， P2-HT2-HIVAg, P2-HT3-HIVAg抗原稳定性实验结果
抗原名称 试剂保存状态
线性
CV值
阳性对照阴性对照
均值
均值
阴、阳性质控血清
P2-HTl-HIVAg
P2-HT2-HIVAg
P2-HT3-HIVAg
4'C存放
37'C考核144小时
4'C存放
37'C考核144小时
4'C存放
37'C考核144小时
99.卯％
8%
2.220
0.029
99.卯％7%2.1910.027
99.85%7%2.3450.025
99.85%8%2.3360.021
99.80o/o6%2.0140.032
99.80%7%1.9980.035
两条件下标本测得
OD值无明显差异
两条件下标本测得OD值无明显差异
两条件下标本测得OD值无明显差异
表4 P2-HTl-HIVAg-HRP， P2-HT2-HIVAg-HRP, P2-HT3-HIVAg-HRP抗原酶稳定性实验结果
缀合物名称 试剂保存状态 线性 cv值 阳認J照阴篇2照阴、阳性质控血清4'C存放
P2-HTl陽,Ag-H
Rpg 37。C考核144小
时
4'C存放
P2-HT2-HIVAg隱H
37'C考核144小时
4'C存放
P2-HT3-HIVAg-H
37'C考核144小时
99.卯％ 7% 2.472
99.90% 6% 2.388
99.85% 8% 2.523
99.80% 7% 2.538
99.卯％ 7% 2.114
99.85% 8% 2.089
说明书第15/23页
0.031
两条件下标本测得OD值无明显差异
0.029
两条件下标本测得OD值无明显差异
0.028
两条件下标本测得OD值无明显差异
0.035
在用P2-HIVAg包被的同一反应板上对同一份已知阳性标本，多次平行做人于等于IO孔重复间接法检测，得到各孔的检测OD值，计算其CV值均低于15% ;在同 一 反应板上对同 一 份已知阳性标本，用P2-HTl-HIVAg-HRP、 P2-HT2-fflVAg-HRP、 P2-HT3-HIVAg-HRP稀释的酶当作酶工作液多次平行做大于等于IO孔重复二步夹心法检测，得到各孔的检测OD值，计算其CV值均低于10Q/。，说明本试剂盒精密性较好。
实施例6含有胶体金的的HIV重组抗原的制备
取100ml超纯水于500ml圆底烧瓶中，放到加热搅拌器上加热至沸腾，加入lmll。/。氯金酸(美国Sigma-Aldrich公司)的水溶液，沸腾后加入lml1%的柠檬酸钠(美国Sigma-Aldrich公司)，继续加热10分钟后放置自然冷却。取10ml P2-HTl-HIVAg抗原装入透析袋中，对10mM PBS PH 7.4缓冲液透析8小时，其间每1小时换一次缓冲液。取10ml胶体金，用0.2MK2C03溶液调节胶体金的pH至6 7，加入200ugP2-HTl-HIVAg抗原，继续搅拌5~10分钟。在上述混合液中加入0.5ml 2%BSA溶液，继续搅拌5分钟。将上述混合液装入合适的离心管中。5000rpm离心IO分钟，吸出上清，将沉淀收集至一合适容器；对上清再用10000rpm离心15分钟，重复第一次离心的操作；对上清再用12000rpm离心30分钟，弃掉上清，将三次离心的沉淀收集到同一离心管中，用胶体金稀释液定容至lml。将上述沉淀于-4°C冰箱中保存。金标记好的P2-HTl-HIVAg抗原命名为P2-HTl-HIVAg-AU，其它抗原制备标记抗原的名称和制备方法均以此类推。采用如下方式确定最佳使用效价将P2-HTl-HIVAg-AU用胶体金稀释液稀释x个稀释度，每个稀释度不少于lml，即稀释好的HIV金标工作液，浸泡合适大小的固相载体(如玻璃纤维、聚酯膜、无纺布等)，用己知检定合格的HIV包被抗原包被硝酸纤维素膜(Milipore公司)，用夹心法做胶体金免疫试验，从x个条件中选择灵敏度最高，特异性最好的条件，即P2-HTl-HIVAg-AU的最佳比例。本领域技术人员应领会，x为相对有限的数目，并且大于等于试验次数。
实施例7本发明融合蛋白连接HIV抗原后标记胶体金的缀合物用于双抗原夹心法金标检测HIV抗体
本发明融合蛋白连接HIV抗原后标记胶体金的缀合物用于双抗原夹心法金标检测HIV抗体，其灵敏度、特异性、准确性等指标均优于P2、P2-TRX、P2-GST、 P2-SOD、 P2-CKS等表达载体连接fflV抗原后标记缀合物的对应性能。
(1)灵敏度
我们用同样的方法选择最佳的标记条件，将P2-HTl-fflVAg，P2-HT2-fflVAg ， P2-HT3-fflVAg 、 P2-fflVAg 、 P2-TRX-HIVAg 、P2-GST-HIVAg、 P2-SOD-HIVAg、 P2-CKS-HIVAg分别标记，并用同样的方法选择各自的最佳使用浓度，制成胶体金试纸条在同样的条件下对100份的系列稀释比例的HIV-1型抗体阳性血清进行检测，得到了表5的结果，结果表明本发明融合蛋白连接HIV抗原并标记胶体金后和P2、 P2-TRX、P2-GST、 P2-SOD、 P2-CKS等表达载体连接HIV抗原并标记胶体金后对各稀释度血清反应的灵敏度差异均具有统计意义(PO.05)。由此可见，本发明融合蛋白连接HIV抗原并标记后的灵敏度有较大的提高。
表5本发明融合蛋白HT连接HIV基因表达的融合抗原制备的胶体金缀合物在用于胶体金检测HIV阳性血清的H1V抗体时的灵敏度比较
IOO份血中检测出的份数缀合物血清稀释度(倍) 125 50 100200
P2-HTl-HIVAg-AU 100 98 97 94 89
18P2-HT2-HIVAg-AU10098979490
P2-HT3國HIVAg-AU10098%9489
P2-HIVAg-AU10094796650
P2-TRX-HIVAg-AU10098949086
P2-GST-HIVAg-AU10098938678
P2-SOD-HTVAg-AU10097887062
P2-CKS國HIVAg-AU10096856557
(2) 特异性
本发明的融合蛋白HT连接HIV抗原后，使HIV抗原可溶性明显增加，利于纯化，且更利于胶体金的标记，与其他融合蛋白比特异性明显改善。我们用P2-HTl画HIVAg-AU， P2-HT2画HIVAg漏AU， P2-HT3-fflVAg-AU、P2國HIVAg画AU、 P2-TRX國HIVAg-AU、 P2-GST-fflVAg画AU 、P2-SOD-fflVAg-AU、 P2-CKS-fflVAg-AU用相同的包被硝酸纤维素膜组装成胶体金试纸条，用双抗原胶体金夹心法在同条件下分别分别检测了 2000份临床阴性血清，P2-HTl-HIVAg-AU ， P2-HT2-fflVAg-AU ，P2-HT3-fflVAg-AU假阳性率均为0.35%， P2-fflVAg-AU假阳性率为0.9%、P2-SOD-HIVAg-AU假阳性率为0.75%、 P2-TRX-HIVAg-AU假阳性率为0.8%、 P2-GST-HIVAg-AU假阳性率为0.6%、 P2-CKS-HIVAg-AU假阳性率为0.85%。
(3) 重复性
对阴、阳性待测样品各200份，采用不同时不同批次不同操作者进行多次检观!l ， 考査 P2画HTl-HIVAg-AU ， P2-HT2-HIVAg-AU ，P2-HT3-fflVAg-AU组装成的试纸条后判定结果的重复性，结果显示本发明P2隱HTl-HIVAg-AU， P2-HT2-fflVAg-AU， P2-HT3-HIVAg-AU组装成的试纸条对阴、阳性判定结果的重复性为100%。这表明本融合蛋白用于基因克隆及胶体金标记的再现性好，重复性高。
(4) 稳定性
将本发明的融合蛋白连接抗原后表达的蛋白P2-HTl-HIVAg，P2-HT2-HIVAg， P2-HT3-HIVAg以及胶体金标记的P2-HTl-HIVAg-AU，P2-HT2-fflVAg-AU， P2-HT3-HIVAg-AU分别37。C考核7天，取出后与同时4'C存放的抗原和抗原金标复合物在同一条件下检测相同的阴、阳性质控血清，抗原用同样方法标记，与抗原金标复合物分别稀释成工作液后制成胶体金成品条检测，其结果见表6和表7。实验表明，本发明融合蛋白用来
表达的抗原和表达抗原标记后的稳定性好。
表6P2-HTl-HIVAg， P2-HT2-HIVAg, P2-HT3-HIVAg抗原稳定性实验结果
、#刘但衣HIV稳定HIV稳定HIV稳定阳,杜衬昭抗原名称 "2 性阳性质性阳性质性阳性质W^^'、、、阴、阳性质控血清
控l 控2 控3
4'C存放+++ +++ -两条件下标本检测
P2-HTl墨HIVAg37°C考核 7天+++ +++ -的显色程度无明显 差异
4'C存放+++ +++ -两条件下标本检测
P2-HT2-HIVAg37'C考核 7天+++ +++ -的显色程度无明显 差异
4'C存放+++ +++ -两条件下标本检测
P2-HT3-HIVAg37'C考核 7天+++ +++ -的显色程度无明显 差异
注表6中信号强度+代表弱阳，++代表中阳，+++代表强阳。
表7P2-HTl-HIVAg-AU， P2-HT2-HIVAg-AU， P2-HT3-HIVAg-AU抗原金标复合物稳定性实验结果
抗原名称试剂保存 状态HIV稳定HIV稳定HIV稳定u日i^w昭 性阳性质性阳性质性阳性质，2'、" 控l 控2 控3 ^￡阴、阳性质控血清
4'C存放+++ +++ -两条件下标本检测
P2-HTl-HIVAg-AU 37'C考核 7天+++ +++ -的显色程度无明显 差异
4'C存放+++ +++ -两条件下标本检测
P2-HT2-HIVAg-AU 37'C考核 7天+++ +++ -的显色程度无明显 差异
4'C存放+++ +++ -两条件下标本检测
P2-HT3-HIVAg-AU 37'C考核 7天+++ +++ -的显色程度无明显 差异
注表7中信号强度+代表弱阳，++代表中阳,
(5)精密性
+代表强阳(
20在用P2-HTl-fflVAg-AU， P2-HT2-fflVAg-AU， P2-HT3-fflVAg-AU稀
释成工作液后制成胶体金成品条检测同一份已知阳性标本，多次平行做10次重复检测，得到各检测条的结果均为阳性，且各检测条的显色程度也无显著差异，说明本试剂条精密性较好。序歹U表
<110>深圳市菲鹏生物股份有限公司
<120> —种艾滋病毒重组抗原及其融合蛋A
<160>4
<210> 1
<211> 149
<212> PRT
<213>大肠杆菌(E.coli)<400 1
Glu Ala Glu Gin Gin Gly Lys Asn Glu Glu Gin Lys Gin His Asp Lys15 10 15
Trp Val Ala Glu Arg Asn Arg Glu lie Gin Gin Glu Lys Gin Arg Arg20 25 30
Ala Asn Ala Gin Ala Ala Ala Asn Lys Arg Ala Ala Thr Ala Ala Ala35 40 45
Asn Lys Lys Ala Arg Gin Asp Lys Leu Asp Ala Glu Ala Ser Ala Asp50 55 60
Lys Lys Arg Asp Gin Ser Tyr Glu Asp Glu Leu Arg Ser Leu Glu lie
65 70 75 80
Gin Lys Gin Lys Leu Ala Leu Ala Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys Arg85 90 95Glu Asn Glu Phe lie Asp Gin Glu Leu Lys His Lys Ala Ala Gin Thr100 105 110
Asp Val Val Gin Ser Glu Ala Asp Ala Asn Arg Asn Met Thr Glu Gly115 120 125
Gly Arg Asp Leu Met Lys Ser Val Gly Lys Ala Glu Glu Asn Lys Ser130 135 140
Asp Ser Trp Phe Asn
145
<210>2<211>45<212> PRT
<213>大肠杆菌(E.coli)<400> 2
Asp Lys Lys Arg Asp Gin Ser Tyr Glu Asp Glu Leu Arg Ser Leu Glu15 10 15
lie Gin Lys Gin Lys Leu Ala Leu Ala Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys20 25 30
Arg Glu Asn Glu Phe lie Asp Gin Glu Leu Lys His Lys35 40 45
<210> 3
23<formula>formula see original document page 24</formula>o卜l- 991-
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96 06 98
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08 9卜 0Z 99
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09 99 g
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9寸 o寸 9￡
权利要求
1. 一种重组蛋白质，其特征在于该重组蛋白质含有如下(A)或者(B)所述的蛋白质(A)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(B)将(A)中的氨基酸序列经过一到几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加而衍生的蛋白质并且不改变其亲水性。
2. —种重组蛋白质，其特征在于该重组蛋白质含有如下(A)或者(B)所 述的蛋白质(A)具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列；(B)将(A)中的氨 基酸序列经过一到几个氨基酸残基的取代，缺失或者添加而衍生的蛋白质 并且不改变其亲水性。
3. —种重组蛋白质，其特征在于该重组蛋白质含有如下(A)或者(B)所 述的蛋白质(A)具有SEQ ID NO: l所示的氨基酸序列；(B)将(A)中的氨 基酸序列经过一到几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加而衍生的蛋白质 并且不改变其亲水性。
4. 根据权利要求1-3所述的重组蛋白质，其特征在于该重组蛋白质还 含有HIV gpl60蛋白质的510至681位氨基酸残基的蛋白质片段。
5. 根据权利要求4所述的重组蛋白质，其特征在于该重组蛋白质还含 有如SQEIDNO: 4所示的fflVgp41蛋白质片段。
6. —种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有能够编码权利要求1-3 所述的重组蛋白质的核苷酸序列。
7. —种采用权利要求6所述质粒载体转化的宿主细胞。
8. —种生产权利要求l-3所述的重组蛋白质的方法，包括(a) 将编码具有权利要求1-3的核苷酸序列连于质粒载体，形成重组质粒；(b) 将步骤(a)中的重组质粒转入宿主细胞，形成转化子细胞；(c) 在适合的条件下，培养步骤(b)中的转化子细胞，表达该重组蛋白质;(d) 分离纯化出该重组蛋白质。
9. 含有权利要求4、 5所述的重组蛋白质的HIV抗体检测试剂盒。
全文摘要
本发明属免疫检测领域。本发明为提供一种新的HIV重组抗原，以及该重组抗原制备的HIV检测试剂盒。经分析大肠杆菌K-12的基因，找到一种氨基酸序列，合成该区段所对应的引物，PCR扩增出该基因序列，克隆到表达载体作为融合蛋白，跟HIV的gp41等目的蛋白嵌合表达成重组抗原，可以提高目的蛋白可溶性，有利于目的蛋白表达在上清，使目的蛋白空间构象接近天然抗原，用作免疫检测中的标记抗原时，可使试剂盒的灵敏度、特异性等均显著优于其它载体所表达的抗原制备的HIV检测试剂盒。
文档编号C07K19/00GK101475642SQ200810217510
公开日2009年7月8日 申请日期2008年11月7日 优先权日2008年11月7日
发明者何志强, 婧 孙, 孙兴宝, 李泓彦 申请人:深圳市菲鹏生物股份有限公司