自聚体多肽及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：自聚体多肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种自聚体多肽及其形成的多肽凝胶纤维在止血和促进创面愈合方面的应用，属于生物技术多肽及医学材料领域。
背景技术：
：任何外科操作无一例外地涉及到出血与止血。手术搡作或创伤，特别是大的创面出血、渗血，有时很难控制，不但会导致失血量增大，而且还会增加手术难度，甚至危及生命，而良好的止血是手术安全进行的前提和保障。止血药可通过收缩小动脉及毛细血管，或增强血小板功能，或加速、加强血液凝固过程，或抑制血块溶解过程而产生止血作用。止血技术已由过去单纯的器械止血措施发展为现代外科条件下的纷繁复杂的技术体系。目前，外科手术中常用到的止血方法包括以下几各方面1、手术操作性止血措施即在手术过程中采取的止血措施，如结扎、缝合、电凝、填压等方法，这些措施要求手术实施者对局部流血控制的范围、时间、结局等有深刻的理解，处理不当则会诱发感染、继发性出血的等问题。2、介入性止血措施介入性止血治疗是指在内镜、超声、CT或X线监视下将治疗用的导管、注射针、气囊或其他相关器械导入脏器内，并给以局部喷洒或注射止血药物、生物胶、化学胶等进行栓塞治疗，或导入高频电流、激光、微波等理化因素，达到治疗出血灶的目的。其操作简单、创伤小、恢复快。3、理化止血措施如通过电凝、激光、微波、热量达到止血。4、外用止血药多为局部止血用途。机理多为止血剂在伤口处形成一层薄膜，胶粘创面而止血。如纤维蛋白凝胶、微丝纤维胶原止血剂、氧化纤维素和氧化再生纤维素、胶原可吸收性止血剂、化学胶、明胶海绵、凝血酶、施必止、外用中草药制剂等。5、控制性降压应用麻醉学方法降低患者血压，以减少术中及术后出血。目前国内临床常用的止血药约有20多种，根据其凝血机制的不同环节，分为四大类。一是促凝血因子活性药通过影响某些凝血因子，促进或恢复凝血过程而止血。代表药物有血凝酶、去氨加压素、维生素K1、维生素K3、维生素K4、甘氨酸乙二胺等。二是降低毛细血管通透性药能增强毛细血管对损伤的抵抗力，降低毛细血管的通透性，促进受损毛细血管端收缩而止血。代表药物有卡巴克络、卡络磺钠。三是纤维蛋白原与抗纤维蛋白溶解药通过抑制纤维蛋白酶原的激活因子，使纤维蛋白溶酶原不能被激活，从而抑制纤维蛋白的溶解。代表药物有氨基己酸、氨甲苯酸、氨甲环酸、抑肽酶等。四是外用止血药有可吸收创面的止血封固剂、明胶海绵、氧化纤维素、醛基纤维素、小蘖胺、云南白药、止血粉8号、止血消炎贴等。这些止血方法及药物等要求较高的搡作技术，止血时间较长，不同程度的存在不良的反应或者并发症，如一些粉末制剂药物，不能够流到伤口部位发挥其止血功能；某些液态的药物，如氰基丙烯酸盐粘合剂，在干燥的环境下才能发挥药效；一些药物可以引起免疫反应，造成邻近的细胞死亡，对肌体造成额外的压力，延长或阻碍康复；某些药物的保存期短，而且需要特殊的保存方法;许多现用止血剂很难作用于人力不可控制的体内环境。传统人工压迫止血法，止血所需时间及卧床制动时间较长，同时易出现渗血、血肿及迷走神经反射等并发症。此外，如果治疗使用润胀剂，就必须釆用额外的护理，确保伤口处的血液供给，避免其他组织的损伤或死亡。在使用膨胀泡沬时这一点尤为重要。由于保存时间短，许多止血剂必须在使用前就准备好。外科器械，如烧灼器、钳子和夹子，必须由专业人员在可控的情况下使用，上述很多药物成分复杂，或者含有难降解的高分子材料，生物相容性差，具有毒性等。科学家发现部分多肽具有自组装现象，可以形成纳米级纤维的片层结构，如2005年2月17号公布的国际专利WO2005/014615A2，公布该自组装多肽的创面愈合功能；专利CN200710048975.1公布了RADA16-1肽的烧伤治疗作用。在长期的研究过程中，发明人意外的发现了一种适于规模化应用的单一成分多肽自组装化合物，利用其可以形成纳米纤维的性能可提高或改良止血或伤口护理。
发明内容本发明的目的之一是提供一类新型的多肽，该类多肽具有在离子环境下可以自组装成为纳米级纤维片层，以达到快速止血的目的。本发明另一目的是提供上述合成多肽在止血药物及伤口护理方面的应用。本
发明内容如下一种合成多肽，其氨基酸序列满足如下通式(I):Ac-Xo-(X厂X2-X3誦X4)n國NH2(I)其中，Ac为乙酰化N末端；Xo为L-氨基酸，氨基酸类型为:Ala、Val或Gly;Xt、X2、X3和X4全为L型氨基酸或D型氨基酸，其中，X,为带正电荷氨基酸Arg、Lys或His，X3为带负电荷氨基酸Asp或Glu,乂2和乂4为不带电荷氨基酸Ala、Val或Gly;X「X2-X3-X4为重复序列，n为氨基酸的排列在序列中的重复次数，n=2~4。结合计算机自由能模拟和^-片层的多肽分子设计替换数据，发明人发现了要达到止血的目的，自组装成为纳米级纤维屏障的多肽序列具有如下特点如图1所示，氨基酸之间排列由亲水-疏水氨基酸重复序列组成，排列模式为_+-+-+-+，多肽分子之间通过亲水端和疏水端的交互作用，形成"-片层，堆叠在一起，重复序列按2-5次，可以形成稳定的自组装结构，亲水和疏水氨基酸之间为不带电荷的氨基酸间隔，满足此结构序列的多肽溶液在体内湿润的离子环境中可以形成孔径为50-200nm网状结构(纳米纤维屏障)，从而达到止血的目的。本发明合成多肽可采用固相多肽合成方式合成和生产，包括但不限于Fmoc-SPPS方式，BOC-SPPS方式，片段縮合连接方式。釆用Fmoc-保护或BOC-保护的的固相多肽合成技术(Solidphagepeptidesynthesis,SPPS)合成上述通式的多肽，树脂釆用Fmoc-Rink-MBHA-resin,用20。/。的六氢吡P定/二甲基甲酰胺溶液脱除FMOC保护基后，采用多肽合成仪或者手工多肽合成方式，由N端向C端分步偶联发明通式所述的所有序列多肽，依次连接氨基酸Fmoc-氨基酸，催化剂(HBTU，HOBT)对树脂摩尔比采用1.5-4倍，Kaise测试每步连接是否完全，进行监测，直至序列完成，在最后一个氨基酸Fmoc-脱除保护后，加入乙酸酐/DCM的溶液进行乙酰化封闭，成为多肽树脂，用标准TFA切割混合物95%三氟乙酸(TFA):0.4%苯甲硫醚(thioanisole):0.4%1，2-二巯基乙醇(EDT):0.2%水切割2-3小时，切割液过滤，导入冰乙醚中沉析出来，离心3-4次，成为粗品多肽，利用制备级液相色谱，纯化后冻干成为98%以上纯度级别的多肽粉末。称取多肽粉末，用双蒸水或去离子水配成质量体积比为0.5%-10%多肽溶液，用于止血或伤口护理，也可以直接用多肽粉末用于止血或伤口护理。多肽粉末或多肽水溶液在遇到血液或在粒子环境下，自己很快组装成为凝胶纤维(纤维屏障)，外观形成透明凝胶，如同致密纱布一样，发挥止血功和伤口护理功能。本发明的多肽其有益的效果是具有自组装形成纳米级纤维屏障的特点，可以在体外或体内粒子环境下，形成多肽组成的凝胶状纤维屏障，用于止血或者伤口护理。本发明的多肽也可以和其他药物及药物组合物，辅料，赋形剂等组合成为不同的药物形式，用于止血及伤口护理的广泛用途，其本身属于多肽物质，很容易被降解，止血机理与以往药物不同，应用前景广阔。说明书附图图l为本发明合成多肽形成纤维凝胶的示意图；图2自组装多肽合成MS图谱；图3自组装多肽纯化HPLC图谱；图4多肽P/。溶液自组装形成凝胶AFM图片；图5纳米纤维形成原理图。具体实施例方式7可以形成自组装的多肽通式可替换氨基酸如下表:通式Ac-X0-(X1-X2-X3-X4)n-NH:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以下通过实施例对发明做更进一步阐述，实施例是对本发明的更进一步的解释，并不限于该实施例，其他未列出的符合氨基酸替换规则的序列化合物，制备和应用也属于本发明的保护范围。实施例X0为Val，Xl为Arg，X2为Val,X3为Asp，X4为Val，序列重复2次(11=2)时，序列如下Ac画Val-Arg画Val画Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2自组装多肽合成称取Fmoc-Rink-MBHA-resin树脂10g(替代度d=0.87),用20%的六氢吡^^/二甲基甲酰胺溶液200ml脱除FMOC保护基后，釆用多肽合成仪或者手工多肽合成方式，由N端向C端分步偶联发明通式所述的序列多肽，连接氨基酸，Fmoc-氨基酸，催化剂(HBTU，HOBT)对树脂摩尔比釆用2倍量，用DIEA做催化，在DMF中活化5分钟，加入多肽反应器进行氨基酸偶联，Kaise测试每步连接是否完全，进行监测，不断重复以上步骤，直至序列合成完成，在最后一个氨基酸Fmoc-脱除保护后，加入乙酸酐/DCM的溶液进行乙酰化封闭30分钟，成为多肽树脂，用标准TFA切割混合物100ml95。/。三氟乙酸(TFA):0.4%苯甲硫醚(thioanisole):0.4%1，2-二巯基乙醇(EDT):0.2%水切割2.5小时，切割液过滤，滤液倒入冰乙醚中沉析出来，离心3-4次，成为粗品多肽，利用制备级液相色谱，纯化条件为A相0.1%TFA+H2O,B相0.1。/oTFA+乙腈，用C18制备柱4Ox250mm,采用B相10-60%线型洗脱，收集主峰后，浓缩后冻干成为98%以上纯度级别的多肽粉末4.2g。(质谱检测1097.52，理论值MS为1097.5)图2为自组装多肽合成MS图谱；图3为自组装多肽纯化HPLC图谱；图4多肽1。/。溶液自组装形成凝胶AFM图片；图5纳米纤维形成原理图。可以看出，合成得到的多肽为Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2。显然，通过上述相同程序可以合成以下序列多肽XO为Val，XI为Arg,X2为Val，X3为Asp,X4为Val，序列重复2次(n=2)时，序列如下Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2XO为Val,XI为Arg，X2为Val,X3为Asp，X4为Val，序列重复3次(n=3)时，序列如下Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val誦Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2XO为Val,XI为Arg,X2为Val，X3为Asp,X4为Val，序列重复4次(n=4)时，序列如下Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2XO为Ala,XI为Lys,X2为Ala,X3为Glu,X4为Ala,序列重复3次(n=3)时，序列如下Ac-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-NH2本行业的技术人员也可以很容易合成新的符合本发明的序列，符合替换列表的氨基酸替换产生的所有序列，都在本发明保护范围。多肽合成实验材料及缩写表示Fmoc-SPPS:利用FMOC-保护性氨基酸组装合成的固相多肽合成(Solidphagepeptidesynthesis,SPPS)方法BOC-SPPS:利用BOC-保护性氨基酸组装合成的固相多肽合成(Solidphagepeptidesynthesis,SPPS)方法Fmoc-:9-芴甲氧羰基BOC-:叔丁氧羰基Fmoc-Rink-MBHA-resin:氨基肽合成树脂，购自西安创景生物科技公司DCM:二氯甲烷DMF:二甲基甲酰胺TFA:三氟乙酸Thioanisole:苯甲硫醚EDT:1，2-二巯基乙醇HBTU:O-(Benzotriazol-1-yl)画N，N，N，，N，-tetramethyluroniumhexafluorophosphateHOBT:l-羟基苯骈三唑DIEA:N，N-二异丙基二乙胺Fmoc-氨基酸(纯度98.5%以上，购自成都凯泰公司)如下Fmoc-Ala-OH(Fmoc-丙氨酸)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Fmoc-精氨酸)Fmoc-Asp(OtBu)-OH(Fmoc-天冬氨酸)Fmoc-Glu(OtBu)-OH(Fmoc-谷氨酸)Fmoc-Gly-OH(Fmoc-甘氨酸)Fmoc-His(Trt)-OH(Fmoc-组氨酸)Fmoc-Lys(Boc)-OH(Fmoc-赖氨酸)Fmoc-Val-OH(Fmoc-缬氨酸)止血实验称取多肽粉末200mg(序列为Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2),或用去离子水配成质量体积(wt/V)比为1%-3%多肽溶液，用于止血或伤口护理实验。多肽粉末大鼠尾部切断止血实验实验釆用大鼠，体重270士30g，购自西安交大实验动物中心。用大鼠戊巴比妥钠50mg/kgip麻醉，仰卧固定，将大鼠尾部用消毒液消毒，在尾部尖端5cm处用锋利的刀片将尾部切断，立即把残留的尾部断面下边垫一预先称重的纱布，并将定量的上述合成多肽冻干粉末迅速洒在尾部断面上，同时记录出血时间(完全止住血时间)，用称重法称量纱布的重量，计算失血量。实验方法详见参考文献KathyL.Ryan,etal.EfficacyofFDA-approvedhemostaticdrugstoimprovesurvivalandreducebleedinginratmodelsofuncontrolledhemorrhage.Resuscitation2006，70:133-M4(FDA批准的大鼠止血药物恢复存活模型)；StephenW.Rothwelletal.Additionofapropylgallate-basedprocoagulanttoafibrinbandageimproveshemostaticperformanceinaseinearterialbleedingmodel.ThromvosisResearch2003,108:335-340(静脉止血模型)。表l多肽粉末对大鼠尾部切断出血的止血作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表1可见，多肽止血粉末与普通纱布和止血明胶对照组相比，产生的止血作用起效快、止血效果确切，能显著减少尾部失血量，明显縮短出血时间。临床上可用于微小血管出血的止血，以及某些外伤性出血的止血和伤口护理。多肽1%水凝胶对兔耳皮肤切口止血实验实验动物选大白兔，体重2.7土0.3kg,购自西安交大实验动物中心。用戊巴比妥钠45mg/kgip麻醉，仰卧固定，气管插管，将兔右耳剃毛，用碘酒消毒，用手术刀在兔耳切一条1.5CM的切口，使其出血。立即将配置好的1%的多肽水凝胶涂敷在切口上，并以预先称重的纱布覆盖，记录止血时间和完全止住血液的时间，用称重法称量兔耳切口出血的失血量。表2多肽1%水凝胶对兔耳皮肤切口的止血作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结果表明(见表2)，多肽1%水凝胶与对照组普通纱布，云南白药等相比，止血作用起效更快、止血效果确切，能显著减少兔耳皮肤切口出血的失血量，明显缩短出血时间。临床上可用于皮肤表面创伤出血的止血，尤其是各种皮肤外伤出血的快速止血。止血多肽对兔股静脉血管出血的止血实验实验选用大白兔，体重2.7士0.3kg,购自西安交大实验动物中心。用戊巴比妥钠45mg/kgip麻醉，仰卧固定，气管插管，将兔右侧腹股沟剃毛，用碘酒消毒，剪开皮肤，分离皮下组织，暴露股静脉，将静脉完全剪断，使其流血，立即把定量的壳聚糖多孔微球撒在创面上，并以预先称重的纱布覆盖，下方放置一50g砝码的天平，记录止血时间，用称重法称量兔股静脉血管出血的失血量。实验方法详见参考文献同上。表3止血多肽对兔股静脉血管出血的止血实验止血材料失血量(g)止血时间(秒)普通纱布35.21±4.01620±50壳聚糖纱布32.35±5.10550±432%多肽凝胶6.35±3.3625±3实验结果表明(见表3)，2%自组装多肽凝胶与对照组(普通纱布和壳聚糖纱布)相比产生的止血作用起效快、止血效果确切，能显著减少对兔股静脉血管出血失血量，明显缩短出血时间。临床上可用于静脉血管出血的止血。止血多肽对兔股动脉血管流血的止血13实验选用大白兔，体重2.7±03kg,购自西安交大实验动物中心。用戊巴比妥钠45mg/kgip麻醉，仰卧固定，气管插管，将兔右侧腹股沟剃毛，用碘酒消毒，剪开皮肤，分离皮下组织，分离一段动脉，长度约3.4cm,两端分别用动脉夹夹住，用眼科虹膜剪细心在股动脉上剪一个2x3mm的椭圆形孔，取出双侧动脉夹，使其流血。立即配好的3%多肽凝胶涂敷在创面上，并以预先称重的纱布覆盖，且放置一个100g砝码，记录止血时间，用称重法称量兔股动脉血管出血的失血量。表4止血多肽对兔股动脉血管流血的止血作用止血材料失血量(g)出血时间(min)普通纱布55.45±7.7633.12士8.56含壳聚糖纱布46.64±7.4328,26±5.233%多肽凝胶4.21±2.240.50±0.25实验结果表明(见表4),3%多肽凝胶与对照组相比产生的止血作用起效快、止血效果确切，能显著减少兔股动脉血管流血的失血量，明显縮短出血时间。临床上可用于大血管出血的止血，尤其是战伤、各种紧急外伤引起的大出血的快速止血。1权利要求1、一种合成多肽，其氨基酸序列满足如下通式(I)Ac-X0-(X1-X2-X3-X4)n-NH2(I)其中，Ac为乙酰化N末端；X0为L-氨基酸，氨基酸类型为Ala、Val或Gly；X1、X2、X3和X4全为L型氨基酸或D型氨基酸，其中，X1为带正电荷氨基酸Arg、Lys或His，X3为带负电荷氨基酸Asp或Glu，X2和X4为不带电荷氨基酸Ala、Val或Gly；X1-X2-X3-X4为重复序列，n为氨基酸的排列在序列中的重复次数，n＝2～4。2、根据权利要求l所述合成多肽，其特征在于X。为Ala或Val。3、根据权利要求1所述合成多肽，其特征在于X,，X2，X3,X4为L型氨基酸。4、根据权利要求1至3任意之一所述合成多肽，其特征在于X,为Arg或Lys。5、根据权利要求1至3任意之一所述合成多肽，其特征在于n为2或3。6、根据权利要求1至3任意之一所述合成多肽，其特征在于Xo与X4为相同氨基酸。7、权利要求1所述合成多肽在止血及伤口护理方面的应用。全文摘要本发明公开了一种合成多肽，其氨基酸序列满足如下通式Ac-X₀-(X₁-X₂-X₃-X₄)_n-NH₂，其中，Ac为乙酰化N末端；X₀为L-氨基酸，氨基酸类型为Ala、Val或Gly；X₁、X₂、X₃和X₄全为L型氨基酸或D型氨基酸，X₁为带正电荷氨基酸Arg、Lys或His，X₃为带负电荷氨基酸Asp或Glu，X₂和X₄为不带电荷氨基酸Ala、Val或Gly；X₁-X₂-X₃-X₄为重复序列，n为氨基酸的排列在序列中的重复次数，n＝2～4。本发明的多肽具有自组装形成纳米级纤维屏障的特点，可以在体外或体内粒子环境下，形成多肽组成的凝胶状纤维屏障，用于止血或者伤口护理。文档编号C07K1/04GK101514225SQ200810231709公开日2009年8月26日申请日期2008年10月13日优先权日2008年10月13日发明者王亚宏申请人:西安蓝晶生物科技有限公司