专利名称：：大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
：大豆作为人和动物优质的植物蛋白和油脂来源，具有广泛应用。大豆及豆制品大量应用于食品行业，玉米-豆粕型日粮作为主要的动物饲料广泛应用于畜禽生产。但是大豆球蛋白作为含量丰富、热稳定性强、具有较强免疫原性的大豆抗原蛋白，经常引起过敏反应，在医学领域常表现为婴幼儿腹泻，以及5-6%的儿童和2-4%的成年人对大豆和豆制品表现出临床症状，常表现为腹泻，严重的伴有颤抖、咽喉水肿和急性哮喘等症状；在畜牧行业，大豆抗原蛋白可导致断乳仔猪和妊娠母猪、犊牛、大鼠等幼龄动物的过敏反应，常表现为腹泻、生长性能下降直至死亡。目前已经开发了多种加工工艺来处理大豆、豆粕及豆制品，如多项研究证实豆粕、膨化大豆、发酵豆粕、大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白等大豆制品的抗原活性弱于生大豆。然而大豆球蛋白是热稳定性的抗原蛋白，直接加热并不能彻底破坏其抗原活性。例如，经过加热处理的大豆制品中具有抗原活性的球蛋白残留量仍高达18%,这个量足以引起婴儿的过敏反应。所以，对不同加工工艺处理前后大豆、豆制品、豆粕饲料中大豆球蛋白含量的检测具有重要的理论意义和应用价值。己有的定量检测方法主要以抗血清测定和高效液相色谱分析为主。这些方法从免疫学角度来看仍存在一定的缺陷，前者多抗血清需要重复制备、不同实验室之间不能参比、灵敏度和准确性低；后者则无法体现免疫反应性，并且由于前处理过程繁琐和需要昂贵的专门仪器而难以广泛应用于大豆制品的现场检测。
发明内容本发明的一个目的是提供一种可用于检测大豆球蛋白的单克隆抗体与分泌该抗体的杂交瘤细胞。本发明所提供的分泌大豆球蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNa2791的抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2产生。该单克隆抗体为包含k轻链的鼠IgG2抗体，其亲和常数(Ka)为3.3x108L/mol。抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791已于2008年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCCNo.2791。本发明的另一个目的是提供含有上述单克隆抗体的检测大豆球蛋白的试剂盒。为了更方便现场监控和大量样本筛查，本发明所提供的含有上述单克隆抗体的检测大豆球蛋白的试剂盒中，还含有其它酶联免疫检测试剂，如酶标二抗、大豆球蛋白标准品溶液、显色液、终止液、洗涤液等。将上述大豆球蛋白的单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂，以该免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱和含有该免疫亲和吸附剂和免疫亲和色谱柱的试剂盒均属于本发明的保护范围。其中，所述固相载体可为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶等亲和层析载体。本发明制备的大豆球蛋白单克隆抗体，为大豆球蛋白的基础研究、品种筛选和改造、临床诊断提供了有利的工具，可用于深入研究大豆球蛋白的生物学效应。具体而言可应用于.-(1)饲料行业、食品行业高通量快速检测大豆、豆粕、豆制品、豆粕饲料中大豆球蛋白的含量；(2)将该抗体作为研究大豆抗原性的工具，进行大豆种质资源筛选、品种改造；(3)应用该抗体制备免疫亲和柱，来分离纯化大豆球蛋白；(4)应用该抗体进行动物实验研究；(5)将大豆球蛋白单克隆抗体进行标记(如用FITC进行标记)，用于临床诊断或辅助诊断对大豆食物过敏的患者；(6)应用该抗体进行免疫组化检测大豆球蛋白在器官组织、各种体液的分布；(7)应用该抗体作为大豆球蛋白的拮抗剂，可以进行药理学研究，用于治疗大豆抗原蛋白过敏性疾病。用本发明的大豆球蛋白单克隆抗体检测大豆球蛋白，克服了传统的SDS-PAGE、多抗血清间接性ELISA检测方法存在的不同实验室之间不能参比、灵敏度和准确性低、需要重复免疫制备多抗血清的缺点，其检测准确性接近反相高效液相法(RP-HPLC)，而且成本很低，可满足词料行业、食品行业相关企业单位高通量快速检测大豆、豆粕、豆制品中大豆球蛋白含量的需要，在大豆制品抗原物质定量检测和致过敏性的评估中具有广阔的应用前景。图1为SDS-PAGE分析纯化的大豆球蛋白样品。图中条带a:空白对照；条带b:提取的大豆球蛋白粗样品；条带C:纯化的大豆球蛋白样品。图2抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体的效价曲线。图中每一个点代表在ELISA分析中8个重复测定的平均值(n^8)。包被抗原大豆球蛋白的浓度为50.0pg/mL，单抗的起始浓度为1.0mg/mL。(横坐标是指10的n次方，比如说4对应的就是104，即该点代表稀释10000倍)。图3抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体与大豆及其制品的免疫印迹分析。图中条带a:提取的大豆球蛋白粗样品；条带b:纯化的大豆球蛋白样品。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂，如无特别说明，均从商业途径获得。实施例l、抗大豆球蛋白单克隆抗体的制备1、大豆球蛋白的提取和纯化采用分级盐析与凝胶过滤相结合的方法制备。具体步骤如下l丄大豆脱皮后磨浆，过滤后乙醚萃取脱脂，经旋转蒸发除去残留乙醚，制得脱脂大豆粉。1.2.在室温条件下，向脱脂大豆粉中加入0.03M的Tris-HCl(pH8.0，10mM(3-巯基乙醇(购自上海Aladdin,货号1093795))缓冲液(1:20)，溶解，10,000rpm/min离心30min，收集上清液。1.3.以HC1调节pH至6.4，10,000rpm/min(4°C)离心30min，收集沉淀用磷酸盐缓冲液(添加10mmol/LP-巯基乙醇的0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS)，pH8.0)(0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS)8.00gNaCl、0.20gKCl、0.20gKH2PO4、1.15gNa2HP04*12H20，加蒸馏水至1000mL，用lmol/L的NaOH调PH为8.0)。溶解，离心收集上清液，获得大豆球蛋白粗提液。1.4.加入固体(NH4)2S04，使(NH4)2S04饱和度达51。/。，4"C静置过夜后，15,000rpm/min4。C离心30min收集沉淀，沉淀溶解于pH7.6的磷酸盐缓冲液。加入固体(NH4)2S04，使(NH4)2S04饱和度达90。/。，4。C静置过夜后，以15,000rpm/min(4°C)离心30min，沉淀溶于pH7.6的磷酸盐缓冲液中。1.5.琼脂糖凝胶Sepharose6B经真空脱气后装柱(100cmx2.6cm)，充分平衡后上样进行凝胶过滤，用pH7.6的磷酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪280nm检测，分别收集洗脱液组分。将收集到的含有蛋白的洗脱液再经过DEAE-52层析柱(30cmx3.3cm)，收集蛋白洗脱液。将洗脱液于4'C对蒸馏水透析除盐，冷冻干燥。1.6.蛋白纯度鉴定和分子量测定采用SDS-PAGE电泳方法进行，添加SDS的分离凝胶浓度为12%，浓縮胶浓度为5%。以低分子量标准蛋白为标准进行电泳，电泳条件为恒压100V。电泳结束后用考马斯亮兰染色液染色6h以上，脱色观察，结果如图l所示。1.7.利用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白的浓度，测定步骤按操作说明进行。2、杂交瘤细胞系的建立2丄动物免疫将适量纯化的大豆球蛋白溶液加入0.5mL生理盐水中，配成5mg/mL浓度，加入等体积的完全弗氏佐剂(购自Sigma，目录号F5506-10)后制成免疫原乳化剂，免疫6周龄雌性Balb/c小鼠。4周后行第二次免疫，再两周后行第三次免疫，均使用加入等体积的不完全弗氏佐剂(购自Sigma，目录号F5881-10)后制成免疫原乳化剂。在第三次免疫后第10天用间接ELISA法测定小鼠血清中大豆球蛋白抗体效价，效价高者进行下一步细胞融合。2.2.细胞融合无菌取材经过步骤2.1.免疫的Balb/c小鼠脾脏，制成脾细胞悬浮液。分别吸取含lX108个脾细胞和2x1(^个骨髓瘤细胞sp2/0的悬浮液，移至50mL离心管中。加不完全培养液，使细胞液总体积为30mL。充分混匀后，于1000xg离心7min，弃上清液。轻弹管底，松散沉淀细胞。将离心管底部浸入37。C温水中，均匀转动，将1mL50%PEG溶液沿离心管壁加样转动的离心管，加样时间60秒左右。立即将细胞悬浮液全部吸入吸管，静置30秒后，再将其吹入离心管内。在5min内加入25mL不完全培养液以稀释PEG，使PEG失去促融作用。于800xg离心7min，弃上清液。加入10mLHAT培养液，悬浮并混匀沉淀细胞。将细胞悬浮液加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，每个孔0.1mL。然后将培养板置于37'C和5%C02的培养箱内培养。将融合后的细胞悬浮于HAT培养液中，置于37"C和5%<:02的培养箱内培养。每2-3天更换培养液一次。在融合后7天内用HAT培养液；第7-14天改用HT培养液；第14天以后则用普通的完全培养液。2.3.间接免疫酶联吸附实验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞在细胞融合后第7天，每次换液收集杂交瘤细胞培养液，然后采用间接ELISA方法对每个细胞培养孔的培养液进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。具体操作如下(1)包被用包被缓冲液((0.85mol/L、pH9.6的碳酸缓冲液)准确称取1.59gNa2C03和2.93gNaHC03，将其混溶于1000mL蒸馏水中)将纯化大豆球蛋白溶液稀释至最佳工作浓度(2.5|ig/mL)，每孔加样100)LiL，置湿盒于37"C温育1小时。(2)封闭弃去酶标板孔内的液体。每个孔加入封闭液(用包被缓冲液配制，加入1%明胶)150pL，置湿盒中37i:温育1小时后，用洗涤缓冲液(含0.05%Tween-20的0.01mol/LPBS(pH7.4);0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)的配方为8.00gNaCl，0.20gKCl，0.20gKH2PO4，1.15gNa2HP04*12H20;加蒸馏水至1000mL)洗涤3次，每次90s(简称洗涤，下同)，然后拍干。(3)加待测样品用抗体稀释液(含0.01。/。Tween-20、0.1%明胶的0.01mol/LPBS(pH7.4))将杂交瘤细胞培养上清液以适当起始浓度倍比稀释后加入酶标板，每个孔100^L,每个浓度梯度设3个重复，同时设空白对照、阴性对照和阳性对照。37'C温育lh后，洗涤，拍干。(4)加酶标二抗(抗抗体)用抗体稀释液将酶标二抗(羊抗鼠IgG/HRP)稀释到工作浓度(1:5000)，加入酶标板，每个孔100pL，置于37'C温育lh后，洗涤，拍干。(5)加底物溶液向各酶标孔加新鲜配制的OPD底物使用液(OPD底物使用液将40mgOPD溶于100mL底物缓冲液，再加30pL30%H202。底物缓冲液((pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液)将25.7mL的0.2mol/L磷酸氢二钠(28.4g/L)和24.3mL的0.1mol/L柠檬酸(19.2g/L)溶于50mL蒸馏水)100|iL，37。C温育15-30min。(6)终止反应每个孔加终止缓冲液((2mol/LH2S04):将21.7mL浓硫酸(98%)溶于156.6mL蒸馏水中)50mL，终止底物显色反应。(7)判定结果用酶标仪于492nm波长下测定各个孔内溶液的吸光值(OD492)，若待测孔00492大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即认为是阳性值，从而得出可能的阳性杂交瘤细胞克隆。2.4.阳性杂交瘤细胞的单克隆化采用有限稀释法对筛选的阳性细胞株进行克隆，具体步骤如下于克隆前一天制备饲养细胞(Balb/c小鼠的腹腔单核巨噬细胞)。将待克隆的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后，转至24孔细胞培养板中，并进行细胞计数。根据计数结果，对细胞悬浮液做适当稀释。取250个活细胞悬浮于4.6mL(终体积)培养液中(此时平均每0.1mL溶液中含5个细胞)，接种96孔培养板，每个孔0.1mL，共36个孔。将4mL培养液加入到余下的l.OmL细胞溶液中(此时平均每0.1mL溶液中含1个细胞)，将此细胞液接种至其次的36孔，每个孔O.lmL。向剩余的1.4mL细胞悬浮液中补加培养液1.4mL(此时平均每0.1mL溶液中含0.5个细胞)。混匀后，将其接种于剩余的24孔，每个孔0.1mL。将培养板置于37'C和5n/。C02培养箱中培养。适时进行换液和检测。有多孔阳性时，应尽可能取单克隆孔进行再次克隆，直至所有细胞孔的培养液均为阳性。最后获得稳定分泌抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2，该细胞株已于2008年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCCNo.2791。3、体外培养法制备单抗将己经建立的抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791进行扩大培养，所用的培养基为DMEM培养基添加20。/。的胎牛血清，置于37°(3和5%(:02孵箱中培养，待细胞浓度大于10S/ml时停止换液，持续孵育至细胞全部死亡。收集培养上清液，1500-2000xg，离心10分钟，上清液含有高水平的单克隆抗体，-20°C保存备用。4、体内诱生腹水法制备单抗抗体的大量制备采用体内诱生法。将液体石蜡(0.5mL/只)注入健康的Balb/c雌性小鼠腹腔内，1-2周后备用。将扩大培养的抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791吹落，于1000xg离心5min后收集细胞，弃上清。用不完全培养液将细胞悬浮，混匀，将细胞浓度调整至10S个/mL。向已进行石蜡处理的小鼠腹腔内注射lmL/只的上述杂交瘤细胞。7-9天后收集腹水，于3000xg离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，置于-7(TC冻存。5、单抗的纯化5丄预处理(二氧化硅吸附法)取步骤3获得的上清液或步骤4获得的小鼠腹水，用等体积的巴比妥缓冲液稀释。加二氧化硅粉末，室温下不时摇动30min。于2000xg离心20min，即得澄清的液体。5.2.辛酸-硫酸铵沉淀法纯化IgG向一份经过步骤5丄预处理过的液体中加入2倍体积的0.06mol/L乙酸缓冲液(pH5.0)。用0.1mol/LHCl调pH值至4.8。于室温下搅拌，并在30min内逐滴加入辛酸(每lmL稀释前的经过步骤5丄预处理过的液体加33pL辛酸)。在4°C静置2h后，于15000xg离心30min。弃沉淀，上清液经砂芯漏斗过滤。向溶液中加入经过步骤1预处理过的液体的1/10体积的0.1mol/LPBS，用1mol/LNaOH调pH值至7.4。置于4i:冰浴中，在30min内加入0.277g/mL的(NH4)2S04，使其饱和度达45%。静置lh以上后，于10000Xg离心30min。弃上清，将沉淀溶于PBS(含137mmol/LNaCl、2.6腿ol/LKC1和0.2mmol/LEDTA，pH7.4)中。在4"C于PBS中透析过夜。于10000xg离心30min后，除去不溶性沉渣，澄清液即为初级纯的抗体。5.3.亲和层析纯化IgG抗体的进一步纯化采用HiTrapProteinGHP亲和层析柱进行。具体操作如下用10倍柱体积(约10mL)的结合缓冲液(20mmol/L磷酸盐，pH7.0)平衡层析柱。用直径为0.45pm的过滤器过滤样品除去不溶物，然后与结合缓冲液按l:l(V/V)混合。再用注射器进样，随后以10倍柱体积(约10mL)结合缓冲液清洗，以除去未结合杂蛋白。最后用2-5倍柱体积的洗脱缓冲液(0.1mol/L甘氨酸-盐酸，pH2.7)洗脱样品。收集洗脱液(收集试管事先加有lmol/LpH9.0的Tris-HCl中和液，其用量为100pL/mL收集液)。于5mmol/LPBS中充分透析，然后浓縮备用。6、单抗的特性鉴定6.1.抗体的类型及亚型取抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791培养液，于2000xg离心8min，以去除细胞及其碎片。用免疫纯单抗分型试剂盒I(ImmunoPureMonoclonalAntibodyIsotypingKitI)测定抗体的类型、亚型和轻链的亚型。根据分型试剂盒分析，抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791产生的单抗属于含A轻链的IgG2。6.2.抗体的含量收集抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791的培养液，然后采用夹心ELISA法测定培养液中的抗体浓度，以纯化兔抗鼠IgG包被酶标板，洗涤后加入适宜浓度的兔抗鼠IgG-HRP识别抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体。以小鼠IgG的不同浓度为横坐标，以对应的OD492值为纵坐标，绘制标准曲线。根据检测各株杂交瘤细胞培养液的OD492值，计算出抗体的准确浓度。6.3.抗体的效价用步骤1的大豆球蛋白(50.(Hig/mL)包被酶标板。将纯化的单抗(单抗的起始浓度为1.0mg/mL)进行倍比稀释后，用间接ELISA方法测定抗体的效价，以未进行融合的SP2/0细胞的培养上清液为阴性对照。图2是抗体的效价曲线图，与OD柳值为l.O相对应的抗体效价为2.7x1(^(图中每一个点代表在ELISA分析中8个重复测定的平均值)。6.4.单抗稳定性的检测复苏杂交瘤细胞，收集不同传代次数的细胞上清，并用间接ELISA方法检测其效价。结果表明抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791不同代次能够稳定产生单克隆抗体(以实施例1，步骤6.3所述的方法进行检测，该细胞株第1代至第8代的抗体效价均高于lx104)。6.5.抗体亲和力的测定(非竞争性ELISA)抗体的亲和常数采用非竞争性ELISA法，操作程序除了加入系列稀释的已知浓度的抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791培养液外，其他同步骤2.3。以待测样品的不同浓度为横坐标，以其相应的OD492值为纵坐标，绘制三条测定曲线。以各曲线上部趋于平坦的OD492值为100%，计算00492值为50%时抗体的浓度[Ab]t，这样每份待测样品可得[Ab]t、[Ab]'t、[Ab]"t三个值，然后根据徐志凯(徐志凯主编，1991，实用单克隆抗体技术。西安陕西科学技术出版社。pp7-145)描述的方法计算，抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体的亲和常数(《。)为3.3xl()8L/mo1。6.6.单抗的反应特异性(1)抗体与类似物交叉反应用竞争性ELISA测定大豆球蛋白与其结构或功能类似物之间的交叉反应。将抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体作适当浓度稀释后，以等体积分别与系列倍比稀释的大豆球蛋白、P-伴聚球蛋白、胰蛋白酶抑制因子和凝集素混匀后，室温反应15min。然后加至已包被处理的酶标板中。其余步骤同2.3.。其中，用于ELISA分析的包被抗原(大豆球蛋白)浓度为50.0|ig/mL，大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体浓度为50ng/mL。根据00492值绘制标准曲线，确定IC5。(ng/mL)(ICso为抑制抗原抗体结合的50%时各竞争物浓度，表l中每个iq。代表12个重复测定的平均值)。按照如下公式计算各类似物的交叉反应率(即大豆球蛋白的IC5()与各竞争物IC5Q之比。交叉反应率CR(。/。)=(大豆球蛋白的IC50)/(某竞争物的ICso)xl00X。如表1所示。表l中第二列上一行的数值为ICso，以平均值±标准差表示，单位是ng/mL;下一行的数值是交叉反应率，单位是％。表l.抗体与大豆球蛋白及其结构类似物或相关物质的交叉反应<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(2)用WesternBlot免疫印迹实验检测单抗与大豆球蛋白结合反应将大豆粗提蛋白和纯化的大豆球蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉在4°C封闭过夜，加入抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体。室温反应lh，洗涤三次。随后加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，室温反应lh，洗涤三次。最后加入NBT/BCIP底物显色。洗涤均用TBST，每次10min。结果如图3所示，结果表明抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体与大豆球蛋白具有较强的特异性反应，条带a:提取的大豆球蛋白粗样品；条带b:纯化的大豆球蛋白样品。ELISA和WesternBlot的结果都证明抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体能和大豆球蛋白发生强烈的结合反应，因此可以应用于的免疫学检测和蛋白定量，以及其他的相关应用研究。实施例2:大豆球蛋白的双抗夹心ELISA检测方法以抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体对大豆球蛋白进行检测可以包括如下试剂1)抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体按实施例1步骤5进行纯化；2)抗大豆球蛋白的多克隆抗体。该多抗的制备、纯化方法如下a.多抗的制备取实施例1制备的大豆球蛋白用生理盐水配成5mg/mL，与等量弗氏佐剂混合，利用旋涡混合器使其乳化完全。选取健康雌性新西兰大白兔，首次免疫为足内侧上皮，注射完全佐剂乳化抗原，选两个位点，每点0.5mL;首免后14天加强免疫，背部随机选取4点，消毒后皮下注射不完全佐剂乳化抗原，0.5mL/点；以后每隔10d加强免疫一次，连续三次加强免疫。最后一次加强免疫后10d，在耳上选择清晰的静脉血管，注射肾上腺素0.1mL/只，过0.5h后，再往静脉直接注射提纯的抗原。待效价达到要求后，对兔子进行前腔静脉采血，分离血清，-20°(3保存备用。b.多抗的纯化同实施例1的步骤5。3)羊抗鼠IgG/HRP酶标二抗；4)大豆球蛋白标准品(可按照实施例l步骤l的方法进行制备纯化)；5)包被缓冲液(组成同实施例1步骤2.3.(1));6)1%牛血清白蛋白封闭液(组成同实施例1步骤2.3.(2));7)洗涤缓冲液(组成同实施例1步骤2.3.(2));8)OPD底物液(组成同实施例1步骤2.3.(5));9)终止液(组成同实施例1步骤2.3.(6))。所建立的大豆球蛋白双抗夹心ELISA定量检测法的实验过程包括以抗大豆球蛋白的多克隆抗体包被ELISA酶标板，顺序加入待检样品、抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体、羊抗鼠IgG/HRP酶标二抗、OPD底物液、终止液，然后用酶标仪检测各个孔内溶液的吸光值(OD492)。可以以大豆球蛋白为标准品，倍比稀释加样，根据吸光值读数建立标准曲线。样品孔吸光值比对标准曲线得出精确大豆球蛋白含量。具体的方法及操作如下(1)大豆样品的处理如果待检测的样品为大豆或者颗粒饲料，需预先按照如下方法制备大豆脱皮后磨浆，过滤后乙醚萃取脱脂，经旋转蒸发除去残留乙醚，制得脱脂样品，再溶于0.03mol/LTris墨HCl(含0.01mol/L的(5-巯基乙醇，pH8.0)中。如果待检测的样品为粉状豆粕或者饲料，可直接将待测大豆样品溶于0.03mol/LTris-HCl(含0.01mol/L的(3-巯基乙醇，pH8.0)中，并磁力搅拌2h，使大豆蛋白以游离的形式释放出来，以便于用免疫学方法定量检测其中大豆球蛋白的实际(2)包被多抗纯化后的抗大豆球蛋白的多克隆抗体用0.05mol/LNaHCO3pH9.6配成2ug/ml，包被于96孔酶标板中，4"C过夜(200wL/孔)包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体。(3)封闭弃去酶标板孔内的液体。洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用1%牛血清白蛋白封闭液进行封闭，每个孔加入封闭液150)LiL。置湿盒中于37匸温育lh后，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次90s(简称洗涤，下同)，然后拍干。(4)加待测样品用包被缓冲液将大豆球蛋白标准品稀释成O、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0(ig/mL八个工作浓度。按酶标板纵顺序将每一种浓度的标准品加入到酶标板孔中，然后加入每个待测样品(每个样品设10个浓度梯度，每个浓度设3个重复)。每个孔100nL，每个浓度梯度或者样品至少设3个重复，同时设空白对照、阴性对照和阳性对照。置湿盒中于37'C烘箱孵育lh后，弃去孔内的液体，洗涤，拍干。(5)加一抗(单抗)用抗体稀释液将抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2CGMCCNo.2791所产生的单克隆抗体稀释至最佳工作浓度(2.5|ig/mL)，用移液枪准确移至酶标板，每个孔100pL，置湿盒中于37'C温育lh。弃去孔内液体，洗涤，拍干。(6)加酶标二抗用抗体稀释液将酶标二抗(羊抗鼠IgG/HRP)稀释到工作浓度(1:5000)，加入酶标板，每个孔100pL，置于37。C温育lh后，弃去孔内的液体，洗涤，拍干。(7)加底物溶液向各酶标孔加新鲜配制OPD底物使用液100pL，37'C温育15—30min。(8)终止反应每个孔加终止液50pL，终止底物显色反应。(9)判定结果用酶标仪于492nm波长下测定孔内溶液的吸光值(OD492)，以标准品不同稀释度所对应的吸光值(OD492)做图，得出拟合曲线方程。然后把待测样品孔的吸光值(OD492)带入方程，可准确得出大豆球蛋白的浓度。经检测，本研究开发出的大豆球蛋白的双抗夹心ELISA检测方法检测范围为0.02昭/ml10iig/ml;灵敏度为0.01^ig/ml;变异系数为板内变异系数为1.8%，板间变异系数为3.3%，批内变异系数为4.0%，批间变异系数为7.2%;样品不同梯度的线性评估为R2《972。权利要求1、大豆球蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNo.2791的抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2所产生。2、保藏号为CGMCCNo.2791的抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2。3、含有权利要求1所述的大豆球蛋白的单克隆抗体的试剂盒。4、根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。5、将权利要求1所述的大豆球蛋白的单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂。6、以权利要求5所述的免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱。7、含有权利要求5所述的免疫亲和吸附剂或权利要求6所述的免疫亲和色谱柱的试剂盒。8、权利要求1所述的大豆球蛋白的单克隆抗体或权利要求3或4的试剂盒在如下1)或2)的应用1)在检测大豆球蛋白中的应用；2)在分离纯化大豆球蛋白中的应用。9、权利要求5所述的免疫亲和吸附剂、权利要求6所述的免疫亲和色谱柱或权利要求7所述的试剂盒在分离纯化大豆球蛋白中的应用。10、大豆球蛋白的拮抗剂，它的活性成分是权利要求l所述的大豆球蛋白的单克隆抗体。全文摘要本发明公开了一种大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明所提供的大豆球蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNo.2791的抗大豆球蛋白单克隆抗体细胞株4B2产生。用本发明的大豆球蛋白单克隆抗体检测大豆球蛋白，克服了传统的SDS-PAGE、多抗血清间接性ELISA检测方法存在的不同实验室之间不能参比、灵敏度和准确性低、需要重复免疫制备多抗血清的缺点，其检测准确性接近反相高效液相法(RP-HPLC)，而且成本很低，可满足饲料行业、食品行业相关企业单位高通量快速检测大豆、豆粕、豆制品中大豆球蛋白含量的需要，在大豆制品抗原物质定量检测和致过敏性的评估中具有广阔的应用前景。文档编号C07K16/16GK101445558SQ20081024100公开日2009年6月3日申请日期2008年12月24日优先权日2008年12月24日发明者于贵平,尹靖东,李德发,王军军,王凤来,贺平丽,曦马申请人:中国农业大学