专利名称：软骨中间层蛋白2 c1及其区分骨关节炎与类风湿性关节炎及非疾病状态的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及帮助评估骨关节炎(OA)的方法。所述方法特别地用于评 估骨关节炎的不存在或存在。所述方法例如通过分析生物化学标志物来实 现，包括测量样品中人类软骨中间层蛋白2 (CILP-2)在体液中的浓度，以 及将所测定的浓度与骨关节炎的不存在或存在相关联。更具体地，本发明 涉及软骨中间层蛋白2Cl的N-末端部分或其片段。本发明还描述了开发用于 区分骨关节炎与类风湿性关节炎(RA)及非疾病状态的诊断和预测性分析 法。
背景駄
关节炎是一类影响身体关节健康的病症，包括类风湿性关节炎和银屑 病性关节炎，它们是自体免疫疾病；由关节感染引起的脓毒性关节炎；以 及更常见的骨关节炎。不同于自体免疫疾病，骨关节炎主要影响老年人， 并引起关节软骨的退化。
骨关节炎是影响大部分人的最常见的关节炎形式。虽然骨关节炎可能影 响几乎任何关节，它最常见地影响手、膝盖、臀部和脊柱。共同症状包括疼 痛、僵硬、关节活动的丧失、以及受影响关节的形状的改变。它常被称为退 化性关节病或"磨损性"关节炎。虽然它可能突然由外伤导致，它的发作一般 是逐步的；老化导致软骨中的分解，疼痛逐渐变得更为严重，虽然在早期阶段它可以通过休养来减轻。隐隐的、抽动性的夜间疼痛是特征性的，它可能 伴随着肌无力或退化。症状通常在50岁以后出现并慢慢地进展。从关节疼痛 开始，所述状况发展，最后关节变得变形，限制运动。随着软骨分解，留下 暴露的骨骼使步态改变。疾病的晚期显示了具有炎症的成分，其中在软骨中 的过程可能在刺激这种炎症中起作用。所述状况被认为由关节上过度的或不 正常的负荷引起，已知的是，过重、不良姿势、劳作的重复性应力、损伤、 运动损伤或这些因素的组合提高了风险。
骨关节炎还包括组织结构的新的产生，特别明显的是在所谓的骨赘的形 式中，骨赘是通过软骨内骨形成所形成的新的结构。虽然机械因素看起来在 疾病起始和发展中起到作用，但关于具体的事件所知很少，部分是由于缺少 可以鉴定疾病的早期的诊断操作。患者通常在疾病发展的晚期由于疼痛和关 节功能失常来寻求治疗，此时软骨破坏已经明显地发生。
当今，没有单独的病征、症状或测试结果容许确定性地诊断骨关节炎。 相反，诊断基于几种因素的考虑，包括骨关节炎的特征性体征和症状的存
在、实验室测试和X光的结果、美国风湿病学学会(ACR)设定的指标。
放射照相通常可以确认骨关节炎的诊断，然而这种发现是非特异性的。 疾病的主要放射照相特征是关节间隙的丧失和新的骨形成或骨赘的存在。 骨关节炎的关节疼痛和放射照相特征之间的相关性不是非常紧密的，从而 即使具有这种疾病的病理性证据或放射照相证据的关节可能仍然是无症状 的。利用放射照相术来描绘OA中软骨破坏水平的另一个缺点是，特别是对 于膝盖，X射线的精确角度对于正确测量关节间隙是必需的。在损伤发生几 年之后才能使用X射线诊断，而生物标志物如软骨中间层蛋白2 Cl和其片段 可以早得多地用于适当的诊断。
不清楚的是骨关节炎的渐进性组织破坏中的基础性过程是什么，但是存在着由增高的蛋白质分解活性引起的主要组织大分子的分解的明确事件。己
经显示的是，这种渐进性组织破坏中的早期事件是软骨蛋白聚糖(aggrecan， 一种作为软骨的主要结构成分的蛋白多糖)的降解，沿着该分子的五个特异 性位点可以被所谓的软骨蛋白聚糖酶(ADAMTS-4和5)裂解。然而，正常 水平的软骨蛋白聚糖适合于，例如，在一过程中软骨上改变的机械载荷，所 述过程涉及分子在典型位点和被相同的ADAMTS酶的裂解。存在着由特异 性胶原酶和降解主要分子如软骨寡聚基质蛋白质(COMP)的其他酶所实现 的胶原蛋白的片段化。
在骨关节炎的过程中，生产的某些片段不再保留在组织中，被释放到 周围体液中，并最终可以到达循环。新的技术基于测量体液中的这些片段， 作为导致组织破坏的活动过程的指标。这种分子标志物技术提供了新的诊 断操作的可能性。与当前使用的方法所可能的相比，这些方法具有潜力检 测组织破坏中更早得多的事件。已经观察到的是，当释放到滑液中的循环 COMP片段的提高水平最终到达血液时，它们可以用作由X射线成像观察到 的、导致关节软骨破坏的过程的预测性指标。虽然骨关节炎和类风湿性关 节炎的疾病中的过程是不同的，看起来在两种情况下血清COMP水平都具有
在评估体液中改变的COMP水平的显著性方面的局限性是，在区分所检 测的大部分COMP是来源于正常的周转还是疾病发展方面是困难的。已经使 用的其他指标包括在II型胶原蛋白(称为CTX-II)的裂解时释放的C-末端肽。
其他的分析直接测量当n型胶原蛋白被胶原酶裂解时形成的原始多肽链内
的新的末端。针对修复阶段的分析利用了当前胶原被加工用于胶原蛋白原纤
维形成时n型胶原蛋白(cp-n)的c-末端前肽的释放。这种前肽看起来不保 持在软骨中。测量软骨蛋白聚糖片段的释放的程序仅有有限的用途，因为 含有带负电的硫酸软骨素的主要片段看起来主要在淋巴结中被清除，而不到达循环(Frazer, Heinegard， Saxne，未发表的数据)。然而，来自患有 早期类风湿性关节炎的患者的滑液中软骨蛋白聚糖片段的测量证明鉴定出 在10年时间内发生更大范围软骨破坏的那些患者(1)。
所有这些标志物的一个明显的缺点是缺乏对给定关节疾病的特异性，以 及在来自正常个体和患有关节疾病的个体的样品之间所测量的水平的重叠。 此外，使用任何这些指标都没有或很少观察到类风湿性关节炎和骨关节炎的 病例之间的区别。仅仅一部分患者显示了被足够地提高的值以清楚地将他们 从正常个体中区分开(2)。
一个问题是，存在着响应于常规和频繁的负荷的组织结构分子的持续性 周转。这足以使组织功能适应新的需求，包括除去疲劳的组织的分子。这种 周转的一个结果是，存在着由这些正常裂解所产生的片段的持续释放。在当 今使用片段作为分子指标的分析中，由正常周转所产生的与由病理过程所产 生的之间存在很少的区别。因而存在着高的背景，其妨碍了检测提高的病理 性分子加工的能力。然而可能的是，II型胶原蛋白(胶原蛋白，富含在关节 软骨中)分解产物的某一些可以在正常事件和病理性事件之间更清楚地区 分，即使该过程可能是由相同的酶所诱导的。这是可能的，因为关节软骨所 显示的正常的胶原蛋白周转比其他基质组成部分所显示的要更慢几个数量 级。
如在此使用的，软骨中间层蛋白前体的蛋白质分别被称为CILP-1和 CILP-2。我们研究的N-末端部分被称为软骨中间层蛋白2C1，其不同于软骨 中间层蛋白2C2。
软骨中间层蛋白(CILP)， 一种大的分泌糖蛋白(3-6)被认为在软骨 支撑中起到作用(7)，也被声称具有三磷酸核苷焦磷酸水解酶[NTPPPH] 活性(8-11) 。 CILP的表达看起来基本上局限于软骨(3,4,9,11,12) 。 CILP蛋白质的数量在老化的人类关节软骨中提高，CILP是在早期骨关节炎中其 表达变得显著地增量调节的少数软骨基质蛋白质之一 (4)。在正常培养 的猪软骨细胞中，转化生长因子P1 (TGF(31)诱导CILP表达，而胰岛素样 生长因子l (IGF-1)抑制CILP表达(10)。原先检测的CILP现在被称为软 骨中间层蛋白1C1 (UniProtKB/Swiss-Prot entry 075339)。
在蛋白质的核苷酸序列中，软骨中间层蛋白2 (CILP-2)被保存在 Genbank序列数据库中(登记号AF542080， 2002年)。蛋白质CILP-2的最先 的研究在2003年出现(13)，此时发现的是它不显示核苷酸焦磷酸酶磷酸二 酯酶(NPP)活性(13)。
CILP-2具有与CILP-l的50。/。同源性，数据(Lorenzo and Heinegard，未 发表的)表明它被类似地裂解成相应的软骨中间层蛋白2C1和软骨中间层蛋 白2C2 (UniProtKB/Swiss-Protentiy Q8IUL8)。根据蛋白质组方法，两种蛋 白质都在软骨提取物中发现(OnnerfjordandHeinegard，未发表的))。
在近来的工作中，我们显示了在骨关节炎的早期和晚期阶段中， COMP、纤连蛋白以及同时我们表征和命名为CILP、现在称为软骨中间层 蛋白1C1的新蛋白质的产生的增量调节(3， 4， 16)。
本专利申请的发明人令人惊讶地显示了，覆盖人类CILP-2的氨基酸 21-709 (SEQIDNO: 1)的肽是可以作为用于区分骨关节炎与类风湿性关 节炎和非疾病状态的标志物。
研究暗示了CILP (软骨中间层蛋白l Cl)作为患有骨关节炎的患者中的 自身抗原(14， 15)。还没有已知的研究指出软骨中间层蛋白2C1可能在骨 关节炎中被改变。没有发现论文或专利显示或暗示软骨中间层蛋白2 Cl或 其片段可以用于骨关节炎的诊断。Du等人2005年(14)的工作暗示了，患有膝盖骨关节炎的小比例的患 者具有针对CILP (软骨中间层蛋白1C1)的自体抗体。抗体仅在136位骨关 节炎患者中的25位中检测到。类似地，Tsuruha等人2001年(7)检测了仅 8-10.5n/。的抗体针对CILP (软骨中间层蛋白l Cl)的不同区域。还没有研究 报道指出软骨中间层蛋白2 Cl或其片段的抗体，该蛋白质是本发明的主题。
在授予因赛特的美国专利No. 6,124，095和美国专利No. 6，251，389中，公 开了CILP-2和编码CILP-2的多核苷酸。在这些专利中，蛋白质被命名为人类 核苷酸焦磷酸水解酶-2 (NTPPH-2)，但是NTPPH-2序列与CILP-2是相同的。 他们注意到NTPPH-2在类风湿性和骨关节炎性关节嚢中的表达。这个专利 没有描述利用NTPPH-2选择性识别骨关节炎患者的可能性。同一申请人拥有 关于CILP-1 (NTPPH-1)和编码NTPPH-1的多核苷酸的授权的专利(美国专 利No. 5，876，963)。
DE 10328033 (S. Blaess)描述了携带有与骨关节炎和类风湿性关节炎 相关的DNA序列的芯片，例如，用于诊断、监测和药物开发。他们没有提 及软骨中间层蛋白2C1。
WO03/054166 (Incyte)描述了测定个体、优选的骨关节炎患者对关节 间隙狭窄和/或骨赘发生和/或关节疼痛的易感性的方法，包括鉴定个体在编 码蛋白质的多核苷酸中是否具有至少一种多态性，提及的许多蛋白质之一就 是CILP。然而他们没有提及软骨中间层蛋白2C1。
WO02/095415和WO01/38872 (Osteometer Biotech)都描述了用于诊断 骨关节炎或类风湿性关节炎的严重度的分析，包括检测样品中异构化的或光 学转化的蛋白质或蛋白质的片段。在WO02/095415中描述的片段或 WO01/38872中的蛋白质都不是来自软骨中间层蛋白2Cl。
WO 01/20018 (加利福尼亚大学)描述了鉴定关节炎疾病例如骨关节炎的风险的方法，包括与对照样品比较生物样品中改变的线粒体功能的至少一
个指标，例如NTPPH的水平。
骨关节炎的正确诊断当前仅在晚期疾病中是可能的，并且取决于X射线 和临床调査。在类风湿性关节炎的情况下，关节软骨的破坏仅可以通过X射 线在晚期测出。
RA在它的早期可能非常快地恶化，关节的严重破损可能在24个月的短 时间跨度内发生。当现代的、有效的RA治疗，例如阻断TNF-(x活性在早期 开始时，症状可以被缓解，关节破坏的恶化被减慢，可以避免早期的失能。
还没有文件记载的骨关节炎的疾病修饰疗法。目前，不能获得治愈， 治疗集中于减轻疼痛。常见的治疗包括使用非甾族抗炎性药物(NSAID's)， 其通常用于缓解疼痛。例如软骨素和氨基葡萄糖的化合物被认为改善软骨 本身，但是良好控制的研究仍然是重要的焦点。
在严重的病例中，关节置换常常成为必需的。在少数病例中，关节可以 被融合。这种操作终止了疼痛，但是导致关节功能的永久丧失。另一种治疗， 尚未用于充分发展的骨关节炎，包括培养的自体软骨细胞的移植。如果状况 持续而没有矫正和/或治疗，关节被破坏，导致使用全假体的较大的置换手 术，或导致失能。
因而，为了引入可以停止早期阶段疾病发展的新的治疗方法，新的、早 期的和正确的诊断是重要的，并且将提供一种突破。为此，本申请的发明人 努力开发一种分析，其可以用作发展中的骨关节炎的指标，以及用于区分骨 关节炎与类风湿性关节炎以及正常的关节。
在早期实验中，发明人可以显示软骨中间层蛋白l Cl虽然在包 早期 和晚期阶段的骨关节炎中增量调节，没有显示在来自患有骨关节炎的患者的滑液中显著提高，在来自患有类风湿性关节炎的患者的体液中没有显著 的不同。在继续开发软骨中间层蛋白2 Cl的分析时，我们令人惊讶地显示 了这种蛋白质作为一种指示物显示了在骨关节炎中意外的和独特地升高的 水平。血清和滑液中的水平高度地升高，并且显示了与来自类风湿性关节 炎和正常个体的样品没有重叠。这是第一次有从组织释放的蛋白质的分析 显示了代表不同关节病类别的样品之间的差异。本发明在此提供了新的诊 断和预测分析，用于在可以建立诊断结论之前或之时骨关节炎性过程的检 测。根据以下的公开内容和附随的权利要求，其他目的和优点将更为显而 易见。
发明内容
本发明提供了用于在样品中区分骨关节炎与类风湿性关节炎及非疾病
状态的方法，包括测量所述样品中软骨中间层蛋白2 Cl蛋白质或其片段的 浓度。
附图简要说明
图1显示的是实施例4中描述的来自患者的血清样品的图。所述样品通过 软骨中间层蛋白2 C1的ELISA技术来分析。
图2显示的是实施例4中描述的来自患者的膝关节滑液样品的图。所述 样品通过软骨中间层蛋白2C1的ELISA技术来分析。
具体实施方式
在此本发明的工作是基于关于软骨中间层蛋白l Cl的早期数据，其被我 们鉴定为在骨关节炎中显示大幅度增加的少数蛋白质之一。使用我们针对从 组织纯化的蛋白质所产生的抗体，我们首次提出抗从组织提纯的蛋白质的抗 体的尝试是有前景的，表明了蛋白质被释放到来自骨关节炎患者的滑液中， 以及在来自骨关节炎患者的样品中发现了最高的水平。
利用EBNA 293成纤维细胞中产生的重组软骨中间层蛋白1 Cl的工作 模糊地显示了这种纯的蛋白质作为ELISA中的包被抗原没有产生滑液样品 的良好抑制水平。在这时候软骨中间层蛋白2在数据库中出现，我们怀疑在 我们的制品中存在着针对这种蛋白质的抗体的污染。因而我们开发了针对 软骨中间层蛋白2C1的特异性抗体，现在已经使用它来幵发滑液和血清中这 种蛋白质的片段的分析。这种分析结果是非常有前景的，来自正常个体以 及患有类风湿性关节炎和骨关节炎的患者的血清样品的分析得到了图l中 描绘的结果。
结果显示了，与类风湿性关节炎和正常个体相比，软骨中间层蛋白2C1 的水平在骨关节炎中高得多，没有重叠。对于从组织释放的任何蛋白质，这 是第一次有分析显示了代表不同关节病类别的样品之间的这种差异。
对于来自患有根据ACR指标临床上确定的类风湿性关节炎的十二位患 者(都有膝关节关节炎)、患有根据临床和放射照相的ACR指标临床上确 定的膝关节骨关节炎的十二位患者的血清和滑液样品，以及来自血液供体的 十二份正常对照血清样品，使用已建立的ELISA操作进行分析。主要的观察 结果是，软骨中间层蛋白2C1或其片段的水平在来自患有骨关节炎的患者的 样品中明显地更高，与正常个体中的水平没有显著的重叠，其随后显示了非 常类似于患有类风湿性关节炎的患者的样品的水平。患有骨关节炎的患者显 示了较宽范围的显著更高水平，表明增高水平的软骨中间层蛋白2 Cl的释放 是这个组的共同特征。结果显示了在影响关节的不同状况之间分子标志物水平方面独特的差异。有趣地，丰富的数据显示了，在类风湿性关节炎和骨关节炎中血清中的
COMP水平显示了提高的水平。因而COMP和软骨中间层蛋白2 Cl之间的比例用于区分患有类风湿性关节炎的个体与正常个体，特别是看起来显示了亚正常水平的软骨中间层蛋白2C1或其片段的患者的亚群。
结果显示了一种新的分子标志物，其具有潜力用于骨关节炎状况的诊断。软骨中间层蛋白2C1的水平明显地高于正常的个体和患有类风湿性关节炎的患者中的水平。正常个体和患有骨关节炎的个体的水平之间的差异表明，软骨中间层蛋白2C1的分析还充当了存在疾病活动的指示物。患者样品中数值的宽阔范围表明，所述水平与过程的强度相关。可以通过本发明的方法分析的样品包括滑液、血液、血浆、血清和尿液。
本发明还涉及包含抗体和用于指导分析的说明书的测试试剂盒,所述抗体对包含氨基酸序列(SEQIDNO: 1)的肽和/或其片段有免疫反应性的。
实施例l
抗原和抗血清的制备
人类CILP-2 (GeneBank登记号NO.Q8IUL8)的氨基酸21-709 (SEQIDNO: 1)内的合成肽被用作免疫原。在氨基末端添加另外的半胱氨酸残基以容许与不同底物的选择性偶联。肽序列(SEQ1)在它的N-末端通过添加的半胱氨酸结合到钥孔戚血蓝素(KLH)之后被用作免疫原，用于根据标准方案产生多克隆抗体。人类软骨中间层蛋白2Cl的氨基酸21-709的范围内的任何片段可以用作免疫原。
商售的资源(InnovagenAB， Lund， Sweden)被用于肽的合成、与载体的结合、用于免疫的抗原的制备，包括对兔子的注射和抗血清的产生。
实施例2
来自粗抗血清的抗肽抗体的纯化
产生的抗血清在具有固定化的软骨中间层蛋白2C1肽(InnovagenAB，Limd， Sweden)的柱子上亲和纯化。柱子(1.5ml凝胶)用磷酸盐缓冲盐水(PBS， O.IM磷酸盐缓冲液，150mMNaCl， pH7.5)平衡，添加5 ml的血清，在室温下反复颠倒地孵育l小时，然后不混合地进一步孵育l小时。柱子用15ml、然后用10ml含有l MNaCl的PBS洗涤。柱子使用1.5 ml的100 mM甘氨酸pH 2.7进行洗脱步骤。采集十个馏分，立即用50 ^d的l M Tris pH9.5中和。具有最高吸光度的馏分被集中，相对于含有0.05M叠氮化钠的PBS进行透析。在透析之后，测量体积，通过280nm处的OD测定IgG的浓度。亲和纯化的抗体以200 (!l等分量在-2(TC冷冻保存，在所有的分析中使用。
实施例3
对于软骨中间层蛋白2 Cl的竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)
开发了特异性竞争性ELISA来测量体液中人类软骨中间层2C1。
1. 肽的生物素化如厂家(P正RCE)所描述的，利用肽的末端半胱氨酸用EZ-Link⑧Maleimide PE02-生物素将肽生物素化。
2. 抗体的预处理亲和纯化的肽抗体在含有5% n，n-二甲基甲酰胺(Sigma-Aldrich)的磷酸盐缓冲盐水(PBS) pH 7.4中1:50稀释。在室温下
孵育l小时之后，抗体用在10mM磷酸盐(NaH2P04) pH 7.5中的4% Triton稀释到1:2000。
3. 标准物和样品的预处理在含有0.5 %牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich)的O.l M氯化钠、0.05 M磷酸钠pH 7.5中的1% (w/v)十二烷基苯磺酸钠(SDBS， Sigma-Aldrich)中的标准物(l到125ng/ml)和在没有BSA的1。/。 (w/v) SDBS溶液中合适稀释度的滑液或血清，在室温下孵育过夜。
4. 分析96孑U敫量滴定板(Nunc-Immunoplates， Maxisorp， Nunc IntermedLtd， Copenhagen, Denmark)在PBS pH 7.4中用50 j^l链霉抗生物素蛋白
(ImmunoPure Streptavidin， PIERCE)在湿润的房间中在室温下包被过夜。在用0.15M氯化钠和0.05。/。 (w/v) Tween20清洗平板之后，聚苯乙烯表面的结合位点用80 pl在PBS pH 7.4中的2 mg/ml牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)在室温下封闭l小时。然后添加1:10000稀释的生物素化的肽，在室温下孵育l小时。
三十微升的预处理的标准物(l到125ng/ml)和滑液或血清的样品(通过普通的穿剌获得)与30 pl稀释的抗体混合。在室温下预孵化l小时之后，将50 ^混合物添加到微量滴定平板的包被的孔中，在室温下进一步孵育l小时。平板如上述地清洗，通过添加在含2mg/mlBSA的0.1M氯化钠、0.05 M磷酸钠、0.05 % Tween 20、 pH 7.5中的与碱性磷酸酶偶联的兔抗猪IgG的50 pl稀释物来检测结合。在室温下孵育l小时之后，平板如上述地清洗，添加50 pi的底物(在含有0.5MMgCl2的l M二乙醇胺pH9.8中的l mg/mlp-硝基苯基磷酸盐)。
通过微量培养板读取器(Expert96， AsysHitech， Austria)测量在405 nm处每种样品和标准物的吸光度， 一式两份。Mikrowin 200软件程序(AsysHitech， Austria)被用于绘制标准曲线和计算分析的样品中CILP-2的实施例4研究设计
对于来自患有根据ACR指标临床上确定的膝关节类风湿性关节炎的12位患者、患有根据ACR指标临床上确定的膝关节骨关节炎的12位患者的血清和滑液样品，以及来自血液供体的12份正常对照血清样品，使用已建立的ELISA操作进行分析，结果在图l中显示。
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18Arg Asp Aa Thr Pro Thr Glu Glu Pro Met Ala Thr Ala Leu Gly Leu 15 10 15
Glu Arg Arg Ser Val Tyr Thr Gly Gin Pro Ser Pro Ala Leu Glu Asp 20 25 30
T卬Glu Glu Ala Ser Glu Tip Thr Ser Tip Phe Asn Val Asp His Pro 35 40 45
Gly Gly Asp Gly Asp Phe Glu Ser Leu Ala Ala lie Arg Phe Tyr Tyr 50 55 60 '
Gly Pro Ala Arg Val Cys Pro Arg Pro Leu Ala Leu Glu Ala Arg Thr 65 70 75 80
Thr Asp Tip Ala Leu Pro Ser Ala Val Gly Glu Arg Val His Leu Asn 85 90 95
Pro Thr Arg Gly Phe Tip Cys Leu Asn Arg Glu Gta Pro Arg Gly Arg 100 105 110Arg Cys Ser Asn Tyr His Val Arg Phe Arg Cys Pro Leu Glu Ala Ser 115 120 125
Trp Gly Ala Trp Gly Pro Trp Gly Pro Cys Ser Gly Ser Cys Gly Pro 130 135 140
Gly Arg Arg Leu Arg Arg Arg His Cys Pro Ser Pro Ala Gly Asp Ala 145 150 155 160
Cys Pro Gly. Arg Pro Leu Glu Ala Gin Lys Cys Val Arg Pro Arg Cys 165 170 175
Pro Gly Cys Ser Leu Asp Thr Cys Glu Cys Pro Asp His lie Leu Leu
180 185 190
Gly Ser Val Val Thr Pro Ser Gly Gin Pro Leu Leu Gly Ala Arg Val 195 200 205
Ser Leu Arg Asp Gin Pro Gly Thr Val Ala Thr Ser Asp Ala His Gly 210 215 220 20Thr Phe Arg Val Pro Gly Val Cys Ala Asp Ser Arg Ala Asn lie Arg 225 230 235 240
Ala Gin Met Asp Gly Phe Ser Ala Gly Glu Ala Gin Ala Gin Ala Asn 245 250 255
Gly Ser He Ser Val Val Thr lie lie Leu Asp Lys Leu Glu Lys Pro 260 265 270
Tyr Leu Val Lys His Pro Glu Ser Arg Val Arg Glu Ala Gly Gin Asn 275 280 285
Val Thr Phe Cys Cys Lys Ala Ser Gly Thr Pro Met Pro Lys Lys Tyr 290 295 300
Ser Tip Phe His Asn Gly Thr Leu Leu Asp Arg Arg Ala His Gly Tyr 305 310 315 320
Gly Ala His Leu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Pro Asp Gin Ala Gly lie325 330 335
Tyr His Cys Lys Ala Trp Asn Glu Ala Gly Ala Val Arg Ser Gly Thr340 345 350
Ala Arg Leu Thr Val Leu Ala Pro Gly Gin Pro Ala Cys Asp Pro Arg355 360 365
Pro Arg Glu Tyr Leu lie Lys Leu Pro Glu Asp Cys Gly Gin Pro Gly370 375 380
Ser Gly Pro Ala Tyr Leu Asp Val Gly Leu Cys Pro Asp Thr Arg Cys385 390 395 400
Pro Ser Leu Ala Gly Ser Ser Pro Arg Cys Gly Asp Ala Ser Ser Arg405 410 415
Cys Cys Sei. Val Arg Arg Leu Glu Arg Arg Glu lie His Cys Pro Gly420 425 430
22Tyr Val Leu Pro Val Lys Val Val Ala Glu Cys Gly Cys Gin Lys Cys435 440 445
Leu Pro Pro Arg Gly Leu Val Arg Gly Arg Val Val Aia Aia Asp Ser450 455 460
Gly Glu Pro Leu Arg Phe Ala Arg lie Leu Leu Gly Gin Glu Pro lie465 470 475 480
Gly Phe Thr Ala Tyi' Gin Gly Asp Phe Thr lie Glu Val Pro Pro Ser485 4卯 495
Thr Gin Arg Leu Val Val Thr Phe Val Asp Pro Ser Gly Glu Phe Met500 505 510
Asp Ala Val Arg Val Leu Pro Phe Asp Pro Arg Gly Ala Gly Val Tyr515 520 525His Glu Val Lys Ala Met Arg Lys Lys Ala Pro Val lie Leu His Thr530 535 540
Ser Gin Ser Asn Thr lie Pro Leu Gly Glu Leu Glu Asp Glu Ala Pro545 550 555 560
Leu Gly Glu Leu Val Leu Pro Ser Gly Ala Phe Arg Arg Ala Asp Gly565 570 575
Lys Pro Tyr Sei' Gly Pro Val Glu Ala Arg Val Thr Phe Val Asp Pro580 585 590
\rg Asp Leu Thr Ser Ala Ala Ser Ala Pro Ser Asp Leu Arg Phe Val595 600 605
、sp Ser Asp Gly Glu Leu Ala Pro Leu Arg Thr Tyr Gly Met Phe Ser610 615 620
24Val Asp Leu Arg Aia Pro Gly Sei' Ala Glu Gin Leu Gin Val Gly Pro625 630 635 640
Val Ala Val Arg Val Ala Ala Ser Gin lie His Met Pro Gly His Val645 650 655
Glu Ala Leu Lys Leu Trp Ser Leu Asn Pro Glu Thr Gly Leu Trp Glu660 665 670
Glu Ghi Ser Gly Phe Arg Arg Glu Gly Sei. Sei. Gly Pro Arg Val Arg675 680 685
Arg
权利要求
1、一种用于在样品中区分骨关节炎与类风湿性关节炎及非疾病状态的方法，所述方法包括测量样品中软骨中间层蛋白2C1(SEQ ID NO1)或其片段的浓度。
2、 根据权利要求l所述的方法，其中，所述样品选自由滑液、血液、 血浆、血清和尿液组成的组。
3、 一种用于区分骨关节炎与类风湿性关节炎及非疾病状态的肽，所述 肽包括SEQIDNO: l或其片段。
4、 一种包括氨基酸序列(SEQIDNO: 1)的肽或其片段的具有免疫 反应性的抗体。
5、 一种测量肽(SEQIDNO: 1)或其片段的化验方法，所述化验方 法包括利用权利要求4的抗体对肽或其片段的样品进行分析。
6、 一种包含抗体和用于指导化验方法使用说明的试剂盒，所述抗体对 包含氨基酸序列(SEQIDNO: 1)的肽或其片段具有免疫反应性。
全文摘要
本发明涉及在样品中区分骨关节炎与类风湿性关节炎及非疾病状态的方法，包括测量样品中人类软骨中间层蛋白2(CILP-2)在体液中的浓度，更具体地，测量样品中CILP-2的N-末端部分(2C1)或其片段的浓度。本发明还涉及对所述蛋白或其片段具有免疫反应性的抗体，以及包含这样的抗体以及用于指导分析的说明书的试剂盒。
文档编号C07K16/18GK101680902SQ200880010173
公开日2010年3月24日 申请日期2008年3月27日 优先权日2007年3月27日
发明者托雷·萨克斯纳, 皮拉尔·洛伦佐, 迪克·海涅高 申请人:安娜玛医药有限公司