专利名称：：用于增加宿主细胞中重组蛋白表达的重组表达载体元件(reves)的制作方法用于增加宿主细胞中重组蛋白表达的重组表达载体元件(REVES)相关申请的交叉参考本申请要求于2007年3月30日提交的美国临时申请第60/921,141号的优先权。发明背景使用核酸载体分子用于在不同和广泛种类的真核或原核宿主细胞内表达重组蛋白的多种系统是可利用的。使用何种载体/宿主细胞对的决定通常视何种系统提供呈最优选适于其所欲用途的形式的所要重组基因产物的最高产率而定。例如，如果诸如糖基化作用的翻译后修饰对所要重组蛋白的需要(例如，就抗原性、活性、构象等等而言)是关键的，则真核宿主细胞系统将是所期望的，因为原核细胞在特征上缺乏翻译后糖基化活性。还重要的为，载体/宿主细胞对不仅产生呈所希望形式的表达基因产物，而且所希望表达基因产物的分子可易于从产生其的细胞分离。由于涉及开发欲用于人类疗法的重组蛋白的成本逐步升高，仍需不断努力以增加该重组蛋白的表达水平，尤其在使用真核宿主细胞的系统中的表达水平。已表征各种顺式和反式作用调节元件，其具有可改善所要重组基因产物的表达效率和/或总产率的核苷酸序列(DNA或RNA)。这样的调节元件包括但不限于高度有效启动子、转录增强子序歹寸(参见，例如，Dillon和Grosveld的评论，7>e"AGe"".，9:134(1993))、基因座控制区(LCR;参见，例如，Grosveld等人，Ce〃,5/:975(1987))、基质或支架附着区(MAR、SAR;参见，例如，美国专利第7,129,062号；Bode等人，/"f.iev.Q^/.,/6Z4:389-454(1995);Bode等人，CWf.Aev.五wto，"'cG匿Ex戸肌》w,6:115-138(1996));P鬲离子元件(参见，例如，Kellum等人，Ce〃，"941(1991);和内部核糖体进入位点(IRES;参见，例如，McBratney等人的评论，Cw".(9p/".Ce〃说o/.,5:961(1993))。随后发现这样的元件的一些核酸序列拥有可影响表达的特定子序列。尽管对于在可影响重组蛋白在各种类型的宿主细胞内的表达的各种序列及其它因素的了解有进展，但仍需要改善重组蛋白的产率，尤其在当这样的重组蛋白欲用于治疗或其它特殊应用时。发明概述本发明提供了分离的核酸分子(多核苷酸分子)，其包含增加重组蛋白的表达的核苷酸碱基序列。这样的核酸分子在本文中称为重组表达载体元件(rEVE)。与不存在rEVE的表达水平相比，rEVE在表达载体上的存在增加一种或多种重组蛋白的表达水平，所述重组蛋白是由一个或多个驻留在表达载体上的功能基因来编码。无论rEVE位于编码所关注重组蛋白的基因的5'、3'还是5'和3'(例如旁侧)，重组蛋白的表达水平的该rEVE介导的增加均是可能的。无论编码在单独相应基因上还是编码在表达载体上存在的单一多顺反子基因上，表达载体上存在的rEVE可增加一种或多种重组蛋白的表达。REVE可用于使用稳定表达系统和瞬时表达系统来增加重组蛋白的表达水平。在一个实施方案中，本发明提供了分离的rEVE多核苷酸分子，其包含选自下列的核苷酸碱基序列SEQIDNO:l("ARMl")的碱基序列、SEQIDNO:2("ARM2")的碱基序列和前述序列的任一个的增加表达部分，其中当rEVE多核苷酸作为编码所关注重组蛋白的重組基因存在于相同表达载体上时，重组蛋白的表达水平与不存在rEVE的表达水平相比是增加的。本发明的优选rEVE分子包括2329碱基对(bp)的rEVE核酸分子，其具有SEQIDNO:1的核苷酸碱基序列；和2422bp的rEVE核酸分子，其具有SEQIDNO:2的核苷酸碱基序列。SEQIDNO:2的序列的3'末端区含有对于rEVE介导的蛋白表达增加而言是关键的序列。这样的优选的SEQIDNO:2的3'末端区序列包括SEQIDNO:2的碱基462-2422的序列和SEQIDNO:2的碱基1087-2422的序列。包含本文中所述的一个或多个核苷酸碱基序列的分离的rEVE核酸分子可具有多种形式中的任一个，包括但不限于直链核酸分子、质粒、真核病毒分子、原核病毒(噬菌体)分子、人工染色体和重组染色体。在一个优选实施方案中，本发明提供了包含至少一种本文中所述rEVE的表达载体。与在携带缺乏rEVE的相同表达载体的宿主细胞中的表达水平相比，该含rEVE的表达载体在适当宿主细胞中提供了至少一个编码在表达载体上的重组蛋白的增加(提高)的表达水平。适用于本发明的表达载体包括任何核酸载体分子，其可经工程化以在适当(同源)宿主细胞中编码和表达一种或多种重组蛋白。这样的表达载体包括但不限于真核质粒载体、真核病毒载体、原核质粒、噬菌体载体、穿梭载体(例如可在真核和原核细胞中复制的载体)、微型染色体(mini画chromosome)和各种人工染色体。优选i也,表达载体为质粒表达载体，更优选为稳定整合到真核宿主细胞基因组中的质粒表达载体，且甚至更优选为通过非同源重组而稳定整合到宿主细胞基因组中的质粒表达载体。在另一个实施方案中，本发明提供了宿主细胞，其含有包含本文中所述的rEVE和指导至少一种重组蛋白在宿主细胞内表达的重组基因的表达载体。宿主细胞可为真核或原核宿主细胞。适用于本发明的优选真核宿主细胞包括但不限于哺乳动物宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞、真核藻类宿主细胞、原生动物宿主细胞、昆虫宿主细胞和鱼类宿主细胞。更优选地，适用于本发明的宿主细胞为哺乳动物宿主细胞，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人类胚肾(HEK293)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Hela细胞、人类B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞和MDCK细胞。特别优选的为CHO细胞，其可用标准曱氨喋呤处理方案处理以扩增插入宿主细胞中的表达载体上的重组基因的拷贝数量。可在本发明中用作宿主细胞的真菌细胞包括但不限于子嚢菌(Ascomycete)细胞，诸如曲霉属(/^;^g/〃z^)、链孢霉属(AAewravora)，和酵母细胞，尤其为选自下列的属的酵母酵母菌属(Sacc/zaramyce力、毕赤酵母属(尸/c/z,a)、汉森酵母属(Z/aw"w"/a)、裂殖酵母属(Sc/z/zc^(2cc/zar函;vc—、克鲁维酵母属(^7t(yvera考ces)、耶氏酵母属(K^raM^)和念珠菌属(Omt/z^)。可根据本发明用作用于表达重组蛋白的宿主细胞的优选酵母物种包括但不限于酿酒酵母(Sacc/zaromyces、多形汉森酵母(//0"化""/(3/70(ym077/2a)、乳酸克鲁维酵母(^7t(yveraw少c^/"cto)、曱醇酵母(尸/c/z/a/a^or&)、粟酒裂歹直酵母(Sc/n'zos73cc/z"romyces/ow6e)禾口耶罗纟,亚解月旨酵母(KarrovW"/^0(y"ca)。可根据本发明用于表达重组蛋白的原核宿主细胞包括但不卩艮于大肠4干菌(E^c/^n'c/zz'acoh')、肠道妙、门氏菌(5^/wowe〃ae/^en'ca)的血清型变体，志贺杆菌种(57z/^〃"《/^"^)、产琥珀酸沃廉菌(『o〃,"e〃"wcc,"oge"es)、普通变形杆菌(尸ra&wsvw/gan力、雷特才各氏变形杆菌(尸ra&M薦m&7/力、迟緩爱德华氏菌(^/wara^e〃a,ara^f)、弗氏衧檬酸^干菌(Oo6ac/er/rew"t^7)、巴氏斥干菌种(尸aWewe〃(2j/ec7'e力、p耆血4干菌种(/Z(2emo;/n7wss/ec/es)、，支单月包菌种(尸化wt/omowcws/ec/e力、^干菌种(5""'〃waj/e"W)、葡萄球菌种(S啤/^/occocwss/g"'e5)和链球菌种(5^eAococcw^ec/e力。可才艮据本发明用作表达重组蛋白的宿主细胞的其它细胞包括原生动物细胞，诸如锥虫类宿主蜥蜴利什曼原虫(丄e/s/2wam'"fare"fo/"e),和线虫类秀丽引4干线虫(C^ewor/w(i"^e/egaw"的细月包。如本文中所述的rEVE多核苷酸、包含一个或多个本文中所述的rEVE的载体和包含这样的包括一个或多个如本文中所述rEVE的载体的宿主细胞可用于与所关注重组蛋白的表达有关的多种方法中。在一个实施方案中，本发明提供了增加所关注重组蛋白在宿主细胞中的表达的方法，所述方法包括以下步骤将重组表达载体插入宿主细胞内，该重组表达载体包含本文中所述的rEVE和编码所关注重组蛋白且指导所关注重组蛋白在宿主细胞中的合成的重組基因；和在促进重组蛋白表达的条件下培养宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了产生甲氨喋呤抗性宿主细胞的方法，所述宿主细胞在不存在曱氨喋呤("MTX")时，即在不存在用于通过甲氨喋呤的存在所提供的重组蛋白的提高表达的选择性压力时，以增加水平稳定(与瞬时对比)表达重组蛋白。该方法包括以下步骤将表达载体插入宿主细胞中，该表达载体包含编码所关注重组蛋白的重组基因、本文中所述的rEVE和编码二氢叶酸还原酶("DHFR")的基因；在甲氨喋呤存在下使宿主细胞生长以选择表达所关注重组蛋白的甲氨喋呤抗性宿主细胞；和分离曱氨喋呤抗性宿主细胞，其中甲氨喋呤抗性宿主细胞以比甲氨喋呤敏感性宿主细胞更高的水平来表达所关注重组蛋白，并且其中当在存在或不存在甲氨喋呤下生长时，曱氨喋呤抗性宿主细胞稳定表达提高水平的所关注重组蛋白。在一个特别优选的实施方案中，用于该方法中的rEVE包含SEQIDNO:2的序列或其增加表达部分，当作为编码所关注重组蛋白的基因存在于相同表达载体上时，其增加重组蛋白在宿主细胞中的表达水平。在另一个实施方案中，本发明提供了在用于扩增重组蛋白表达的DHFR-甲氨喋呤程序中产生对于曱氨喋呤的存在具有增加或改善适应性的宿主细胞群体的方法，所述方法包括以下步骤将表达载体插入宿主细胞中，该表达载体包含编码所关注重组蛋白的基因、本文中所述的rEVE和DHFR基因，其中与携带缺乏rEVE序列的表达载体的宿主细胞群体相比，含有表达载体的宿主细l包群体适应更好，即在曱氨喋呤存在下，具有更高存活性和/或更高生长速率。在另一个实施方案中，本发明提供了增加重组蛋白在使用DHFR-甲氨喋呤程序获得的宿主细胞中的扩增(升高)表达的方法，所述方法包括以下步骤将表达载体插入宿主细胞中，该表达载体包含编码所关注重组蛋白的重组基因、本文中所述的rEVE和DHFR基因；在曱氨喋呤存在下使宿主细胞生长以选择表达所关注重组蛋白的曱氨喋呤抗性宿主细胞；和分离甲氨喋呤抗性宿主细胞，其中分离的曱氨喋呤抗性宿主细胞在甲氨喋呤存在下，以比含有缺乏rEVE的相同表达载体的曱氨喋呤抗性宿主细胞的更高的水平表达重组蛋白。尽管诸如5nM至10pM的更低和更高浓度也可成功用于这样的方法中以选4奪所关注重组蛋白的扩增表达，但甲氨噪呤可方便地以20nM至500nM的范围用于本文中所述的方法中。在另一个实施方案中，本发明提供了减少、显著抑制或基本上沉默重组蛋白从表达载体表达的方法。所述方法使用包含rEVE的一个或多个片段的表达载体，该rEVE提供比使用包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的序列的rEVE所提供的更低水平的特定重组基因产物的表达。这样的片段具有SEQIDNO:2的特定截短变体，其包括SEQIDNO:2的碱基1-1086或SEQIDNO:2的碱基1-461的核芬酸碱基序列。具有由SEQIDNO:2的碱基1-461组成的截短ARM2序列的核酸分子尤其适用于抑制或,基本上沉默重组蛋白从宿主细胞中的载体分子的表达。这样的发现还指示SEQIDNO:2的核普酸石咸基462-2422的序列和SEQIDNO:2的核苷酸石咸基1087-2422的序列对于最大rEVE介导的重组蛋白表达的增加而言是最优选的。其表达可通过一种或多种本文中所述rEVE分子来增加的重组蛋白可为任何蛋白(包括肽、多肽和寡聚蛋白)，其功能基因可被工程化到用于在适当宿主细胞中表达的核酸载体分子中。这样的蛋白包括但不限于可溶性蛋白、膜蛋白、结构蛋白(即，向细胞、组织或器官提供结构或支撑的蛋白)、核糖体蛋白、酶、酶原、抗体分子、细胞表面受体蛋白、转录调节蛋白、翻译调节蛋白、染色质蛋白(例如组蛋白)、激素、细胞周期调节蛋白、G蛋白、神经活性肽、免疫调节蛋白(例如介白素、细胞因子)、血液组分蛋白、离子门(iongate)蛋白、热休克蛋白、二氢叶酸还原酶、抗生素抗性蛋白、其功能片段、其含表位的片段及其组合。含有本文中所述的rEVE的序列或其部分的核酸分子还可作为核酸探针用于通过核酸杂交来鉴定其它核酸分子中rEVE序列的存在，或者作为适用于各种聚合酶链反应(PCR)程序中的引物来源，例如可用于操纵、鉴定、产生或扩增本文中所述rEVE序列。诸如ARM1(SEQIDNO:l)和ARM2(SEQIDNO:2)的那些序列的REVE序列可包含一个或多个基质附着区(MAR)序列。MAR序列可在rEVE序列内以群集形式出现，包括在rEVE序列的5'和/或3'末端区处呈群集形式。如本文中所述的rEVE多核苷酸为MAR序列的适用来源。因此，本发明提供了适用于增加核酸分子中的MAR序列的组合物和方法，所述方法包括将含有一个或多个MAR序列的本文中所述rEVE或本文中所述rEVE的一部分插入核酸分子中。本文中所述的核普酸碱基序列还用以提供其互补序列。本文中所述的DNA分子和核苷酸碱基序列还提供相应RNA分子和碱基序列，其中胸腺嘧啶(T)是被尿嘧啶(U)置换，和与其互补的核酸序列。附图简述图1显示用以表达免疫球蛋白重链和K轻链的质粒表达载体pA205的示意图，这样的免疫球蛋白重链和K轻链在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的稳定转染子中形成活性人类抗-TNF-aIgGl分子("阿达木单抗(adalim腿b)")。缩写"增强子"是指细胞巨细胞病毒(CMV)的中间早期基因增强子；"ADENO启动子"是指腺病毒的主要晚期启动子；"阿达木单抗重链"是指阿达木单抗的IgGl重链的编码区；"SV40PolyA"是指猴病毒40聚腺苷酸化位点；"胃泌素终止子"是指人类胃泌素基因的转录终止信号；"SV40启动子，，为猴病毒40启动子；"DHFR，，是指小鼠二氢叶酸还原酶基因；"TKPolyA，，是指单纯疱渗病毒胸普激酶基因的聚腺苷酸化位点；"阿达木单抗轻链"是指阿达木单抗的k轻链的编码区；"ORI"是指在大肠杆菌中起作用的质粒ColEl原核的复制起源；"P(BLA)"是指P-内酰胺酶基因(氨节青霉素抗性基因)的原核启动子且小箭头指示转录方向；"Apr"("氨千青霉素抗性")是指p-内酰胺酶的编码区。箭头指示转录方向(5'至3')。图2为质粒表达载体pA205Genomic的示意图，其中具有SEQIDNO:1的核苷酸碱基序列的ARM1("A1")核酸插入表达载体pA205(图l)中腺病毒主要晚期启动子和阿达木单抗IgGl重链编码区上游处，且具有SEQIDNO:2的核苷酸碱基序列的ARM2("A2，，)核酸插入阿达木单抗k轻链编码区的下游中。关于其它缩写，参见上文图1的描述。图3为质粒表达载体pA205Al的示意图，其中具有SEQIDNO:1的序列的ARMl("Al")核酸插入表达载体pA205(图l)中adeno启动子和阿达木单抗IgGl重链编码区上游处。关于其它缩写，参见上文图1的描述。图4为质粒表达载体pA205A2的示意图，其中具有SEQIDNO:2的核苦酸碱基序列的ARM2("A2")核酸插入阿达木单抗k轻链编码区的下游中。关于其它缩写，参见上文图1的描述。图5为用以表达免疫球蛋白重链和k轻链的质粒表达载体pCHOEL246GGhum的示意图，这样的免疫球蛋白重链和k轻链在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的稳定转染子中形成活性人类抗-EL-选择蛋白IgGl分子。"抗-EL-选择蛋白重链"是指人类抗-EL-选择蛋白IgGl抗体的重链的编码区；"抗-EL-选择蛋白轻链"是指人类抗-EL-选择蛋白IgGl抗体的k轻链的编码区。关于其它缩写，参见上文图1的描述。图6为质粒表达载体pA-Gen-EL-选择蛋白的示意图，其中具有SEQIDNO:1的核苦酸碱基序列的ARM1("A1")核酸插入表达载体pCHOEL246GGhum(图5)中抗-EL-选择蛋白IgGl重链编码区上游处，且具有SEQIDNO:2的核苷酸碱基序列的ARM2("A2")核酸插入抗-EL-选择蛋白k轻链编码区的下游中。关于其它缩写，参见上文图1的描述。图7为用以在CHO细胞的稳定转染子中表达增强绿色荧光蛋白13(eGFP)的质粒表达载体pA205-eGFP的示意图。eGFP编码区("EGFP，，)插入pA205(图l)中腺病毒主要晚期启动子("ADENO启动子，，)的下游处，轻链编码区、近端启动子和近端增强子和重链编码区已从该pA205缺失。关于其它缩写，参见上文图1的描述。图8为质粒表达载体pA205G-eGFP的示意图，其中具有SEQIDNO:1的核苷酸碱基序列的ARM1("A1")核酸插入表达载体pA205-eGFP(图7)中eGFP编码区("EGFP")的上游处，且具有SEQIDNO:2的核苷酸石咸基序列的ARM2("A2")核酸插入eGFP编码序列的下游中。关于其它缩写，参见上文图1的描述。图9为质粒表达载体pA205A2-Spe-trunc的示意图，除ARM2(SEQIDNO:2)已经截短ARM2变体"A2(bpl-1086)"置换外，该质粒表达载体基本上与图4中所示的表达载体pA205A2相同，该截短ARM2变体由于ARM2核酸被限制性核酸内切酶印e/的消化而具有SEQIDNO:2的碱基1-1086的核苦酸碱基序列。关于其它缩写，参见上文图1的描述。图10为质粒表达载体pA205A2-Swa-trunc的示意图，除ARM2(SEQIDNO:2)已经截短ARM2变体"A2(bpl-461)"置换外，该质粒表达载体基本上与图4中所示的表达载体pA205A2相同，该截短ARM2变体由于ARM2核酸净皮限制性核酸内切酶Swa/的消化而具有SEQIDNO:2的碱基1-461的核苦酸碱基序列。关于其它缩写，参见上文图1的描述。发明详述本发明基于以下发现一种或多种分离的核酸分子(多核苷酸分子)，所述核酸分子包含SEQIDNO:l的核普酸序列aattgaattcgttccctttagtgagggttaattccgcggccgcgtcgacagctctagagggagtgccaggataggctccaaagctaC8C3g3g33tCCCtgtttca3犯a3CC33aaa3a犯33aata肌333t3a3333taa3助gt3gggt3Cag3tCt333t3g3C33ttctc幼t3g3gg犯tct肌犯tgcctg3幼g3ca犯t幼g幼3gtgttc肌c3tcctt3gccatcaggg3犯tgc幼3tc幼犯c33CtCtgag3t3Ct3tCtt3CtCCtgtcat福ggCC幼3ttC咖幼C3Ct肌tg3CElgttC3tgttgg3g3g幼tgtgg3g3幼g3ggagcacttctccactgctggtgggagtgccaacttggacagccactttggaaatcagtatggctactcctcaagaaaatggaaatc3gttt3CC8caag3tcc3gc犯ttcc3ctc3ggC3t8t3ccca幼agaaccgC3ttC3t3c犯gcaat3tctgttc3acg3tgttc3tagcagctctatttgtaacagccagaaactggaagcagcctagttgcacctcaaccaaagaaatggatagagaaaatatggtacatttetgc犯tggagt3ct3ctc3gcgg幼肌gtec犯tgg幼tcttg3幼tttgc幼g3aaatgg3tgg犯ct3g幼g幼3cctttctg3gc肌ggt幼ctc肌tC3咖幼3g3ca肌catg3t3tgt犯tC3Ctc3tatgtggatttt堪3C3C3gtgt3肌gg3tt3Ccagcctac福cc3C3Ctgcc幼3g肌cct犯t3aaca3gg3ggaccct幼ggg3g3C3tacatggtcccctggEig3tgggg幼tgggtcaagatatgctgagcaaagtgggaacatgggaagaggggggaaggagctaggaaattgagaaagggagaaaaggagggatgc卿ggac3taagggagcag幼ac3ttg3ctcaggg3atg3atcg幼gat幼caagcc3tgg3gatatcitaatag3ggg3g3C3ttttgggtat3C3g3g3犯tc3ggc3Cttggg3肌tgtctgg3幼tct3C3幼gtat肌caccaggt肌c幼tct犯gc幼c8gaggagaggctaccttaaatgtcctaccctgatagtgagattgatgactaacttatatgccatgttatagccttcatccagcagctggtgg33gteg33gcag織ccc3t肌ct幼tc3Cgg幼ctg肌ctgg肌ccc3g3ttc，g肌ggatg3gtga3gggC3cag3ggtCC3g3CC3ggCtggtg幼3CCC3C幼咖C3gttg咖tg犯t3tCggtg幼CtCttgCtCCCC3g3Ctg加gCtgg肌t3ccagcatgggactgatccagactccaggaacatgagttcctgtgaggaaacctcggaaatctaagggacctcctgtagaagttcagt3cttatccct3gca1;aggtgtgg3ctg8gggagcccattccatat2ig2igg3at3ctctctggEigcc犯cac3catgggggtgggc3taggccctttccc朋agcatac幼tagactcggatgawccct3tggaaggcctcatc3tccagggggagcag3犯ggat3tgtgatagacagggtttcagttgggagccgggtagtgggaggggagaattggtggaagaaggaaaccgggattgtcatgtaaatc3atgctgtttctaattC33at肌g肌3gttg幼aa幼幼g3幼actg自cttattgcaccatgta3tgttetg幼atggc3tttgctgtt犯g3tg3gc3gtct3tctgct犯tctccct3gctggcttgtg肌cttgttet3tggac3肌gctggtctc幼3ttC3幼g3t3tttgcgt3tgtctgtctcctg2igtgttg3g3gtec肌gt3tgtacc3cc幼tccctttg3tt3tac3att3C3tttga幼acagtttg，ttt幼tt3ta3ct3tgc肌tc肌ttcaa犯t3由a3ttt肌atctc3tatttgtcttt2iggtgg肌atctgtt3atateicatcatgatt3t3t3tttt幼tttatt由tgttttct3gg3c幼3at3t3ct3aaatg肌atct肌ggctct肌acat3c肌幼ctgtatgcat3g3t織tcacg3tcat3t幼tttcc3tg3C3tgct3ttcggg幼t由atg3tctacctgc3gtaatgatt3atttgga幼tgctg幼t3c幼ctgcttctcttttg3犯由ca幼ttcctt3catttgt肌tct3ttt肌tttt咖ggttgt3cccc3g3幼gt3gtg3attctt叫或SEQIDNO:2的核芬酸序列肌g肌t3tgctc肌tgta2it3ccc2itggc3ggc3ttc助tgtttgtctgtcttc由ttg肌g3ta幼cag3tgt3t3tc3t由c犯肌atattt幼tgtga3gttgtccatgtgttcaggatct3t3tactttc肌3犯tctttttcc3t3ttcttttctta3tcctcctg肌gtgt3g3cc3tt3tactggaa幼ccgtC3ctattgtBC3ggat3ggagcctttgactctgagaggatcccat3cattgattgtettttcaaat自ttttggctgcttttctccatgtgatatttggcaatctggagaggcatttgctcctggaaatttatcaatgttgacaatgttgtttacatgttttaagt幼ctattttgctacc幼ggaaactgcttceictccctttcac3tataa肌ctc3t肌a3tattg幼aggctccaat幼gttt肌atcattctgtattgctcatggagatttaaatttcagtgctaattttttattagcactttaatttagaaggcaccaggtttctacaagatttaaaattattggagc3tttc3333tttt3t33gctttcc3gt33ggttgtggct3tg3ttctttgcttgta33gtaa3gtgca3ttta33gttaatttaa3t83ttt3actgCtgC3g3CattttaggElg3attgtttgtatttC333Ctg3aattC3gggt3g3C33tt3g33t38tttt3C333g3gg犯3t3tttttctaataataaattagtaactctaacttatattaaaatttaagtcctcattgctttcaatattttaacaaccctattgtattatttttcttataaat3tttg33ttt3t33tg3tC33ag33tttCtttg3t3C33gtgtCtaa3tgatt3CC3tC333Ctgttggt3gg3gCttgttat3tatgtgttttaccttatgttttttgatacttcatttgttactgtactgtgatcgagttaattccctactgaaactaaaaatgctatcacatagttttagcatcatctgttggggaaatggctattttaactactctgagatgagaaattcaacaecattcactaacaatatagggaaactagtgttggtagattgttgagtgcttatacatatatcttgtcccatggttaactataagttggtgtctgttgctgccacccagtatggaaacacattatgttttttctttttttttttttatagccatgagaaagaccaaaattctatacttgaaaaaccgtttatattgaatgtgtattcctttcacgtccaccttagattca3CtCCt33gtC肌ttt3tggt3aagC3t3g3tC3tCtgCttg3C33C3gtttgg3tg3tgatCttgga3犯肌tgCCtt3tt3t3tg3t3caatggaattaatgatatgagctgaataaatatatcaatattcaaatgacatactaatatttatgtctaagagaatgtgttcaaagtagatga肌gtgCCttC3Cttg3333ttCBtctg3gtta333C3g3t3gttgCttCggttttagtt3tttC3g3ggt3ttC3agttg3C83Ct3eigaatagccgtcacagatacatatcaattatggacccaaattctattgaatgtcagctacatattcttatagaaaataggaacctagatgaggccgtgttcttggaatgaattttcaacacattgtatgagggttttattgtggttttggttgttgttttactttcctttttttccatagacaaatttgtccc3tgt3ccc3C3aggtg3cc3gtggtg3CB3gcctactcc3gg3gtcctggtgaat33agattat3caagatagtag3gactC3tC犯3aC33t3ag333肌g3g肌t3C3tagggCag幼3tttCtC3ttttCtC8gCt3tggtatCCt3tttC3CtCttgt3Ct3ttCt3Ctc3ct3ga3gtc3gtg3ct3ccat3actc3gtggctgtgccct3gatc3幼gga33cattatttc3aggcatgaatgtc3gccac3cCttC3t3gtgggtt3Ctttt33tttgttt3gt33g33t3g3C3CCCtaCtttggtt3gg33eiC3ta33Ctt3C幼gaCattC3ttggtttttCtttactaaattaaatcattaagaaaatcgtaattatcagagtttaaatggcatgaaacatagaaatactcatttgctgccctgatttattttcCC幼ga3t3ttttC3atgtCttCtttgga3gCtCCttggt3a3tgCactttCtttC3CtC3ttt3tg3ggtCtgtgC3C3tC3C3gtC3at犯3ggCCtgCagt3ttga3tC3gCC3t3C3g3C3ta3ttCat33C柳ttCt3tttCtCatg3BtCa3at3ttgtt3ttgCtgt3C3t3333t3atgaatcaaagtataggtctaga，所述核酸分子可被工程化到表达载体分子中，以增加一种或多种重组蛋白从存在于表达载体分子上的一个或多个基因的表达。包含SEQIDNO:1或SEQIDN0:2的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子在本文中是指重组表达载体元件(rEVE)。本发明的rEVE还包括4旦不限于包含SEQIDNO:l("ARMl")或SEQIDNO:2("ARM2")中所示的序列的增加表达部分的多核苷酸分子。来自ARM2SEQIDNO:2的3'末端区的序列，诸如具有SEQIDNO:2的碱基462-2422和SEQIDNO:2的碱基1087-2422的序列的那些序列，尤其适用于提供所关注重组蛋白的增加表达。本文中所述的rEVE可与当前可用以增加重组蛋白在宿主细胞中的产生的其它控制序列、调节子和程序组合使用。为更清楚描述本发明，定义以下术语如本文中所使用和理解，术语"抗体"或"抗体分子"广泛是指包含4个多肽链，即2个重(H)链和2个轻(L)链的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物，其保留Ig分子的基本表位结合特征。这样的突变体、变体或衍生物抗体在本领域中为已知的且包括下文所讨论的非限制性实施方案。在全长抗体中，各重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个域，即CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个域(CL)。VH和VL区域可另外再分成具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR),其被更保守的区域(称为框架区(FR))间隔开。各VH和VL包含3个CDR和4个FR,其按以下顺序从氨基末端排列至羧基末端FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可为任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY),类另'J(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或子类。术语"抗体"和"抗体分子"还涵盖保留特异结合于抗原的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来执行。这样的抗体实施方案还可为双特异(bispecific)、双重特异性(dualspecific)或多重特异性；其与两种或两种以上不同抗原特异性结合。涵盖于术语"抗体"内的结合片段的实例包括Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1域组成的单价(l个结合位点)片段；F(ab')2片段，即包含2个通过在铰链区处的二硫键连接的Fab片段的二价(2个结合位点)片段；由VH和CH1域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH域组成的Fv片段；单域抗体(dAb)(Ward等人，A^w"，3W:544-546(1989);Winter等人，PCTpublicationWO90/05144Al，其以引用的方式并入本文)，其包含单一可变域；双可变域(DVD)抗体(参见，例如PCT公开第WO2007/024715号)；和分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个域，即VL和VH是由分离基因编码，但可使用重组方法，通过合成连接子来连接其，该合成连接子能使其成为单一蛋白链，其中VL和VH区域配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv),参见，例如，Bird等人Sc/e薦，423-426(1988);Huston等人，尸rac.淑/./4cWU&4，5879-5883(1988))。这样的单链17抗体是由术语"抗体"和"抗体分子'，所涵盖。双功能抗体还由术语"抗体"和"抗体分子"所涵盖。双功能抗体为二价、双特异性抗体，其中VH和VL域在单一多肽链上表达，但其使用太短以致于不能允许在相同链上2个域之间的配对的连接子，进而迫使域与另一链的互补域配对且产生2个抗原结合位点(参见，例如，Holliger爭乂，尸rac.A^//.Jed园，卯6444-6448(1993);Poljak等人，5"，2:1121-1123(1994))。术语"抗体"和"抗体分子"还涵盖双可变域免疫球蛋白分子，诸如DVD-IGTM(AbbottLaboratories)双可变域免疫球蛋白分子(参见例如，PCT公开第WO2007/024715号)。如本文中所使用，"载体，，是指能够充当用于外来多核苷酸在宿主细胞中遗传转移、表达或复制的载体的任何遗传因子。例如，载体可为人工染色体或质粒，且可能能够稳定整合到宿主细胞基因组中，或其可以独立遗传因子(例如离合染色小体(episome)、质粒)形式存在。载体可以单一多核香酸或以两种或两种以上分离的多核苷酸形式存在。当存在在宿主细胞中时，载体可为单一拷贝载体或多拷贝载体。适用于本发明的优选载体为表达载体分子，其中一个或多个功能基因可以适当定向插入载体分子中且接近驻留在表达载体分子中的表达控制元件，以便当载体分子驻留在适当(同源)宿主细胞中时，指导一种或多种蛋白的表达。表达载体可包括但不限于真核质粒载体、真核病毒载体、原核质粒、噬菌体载体、穿梭栽体(例如可在真核和原核细胞中复制的载体)、微型染色体和各种人工染色体(例如，细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC))。优选地，用于本发明中的表达载体为质粒，更优选为稳定整合到宿主细胞基因组中的质粒表达载体，且甚至更优选为通过非同源重组稳定整合到宿主细胞基因组中的质粒表达载体。"穿梭载体"(或双功能载体)是指可在生物体的超过一个物种中复制的任何载体。例如，可在大肠杆菌(^sc/^〃'c/z/aco")(Eco")和酿酒酵母(Sacc/zaramj/cescewv7'w'ae)(5".cerev/57'"e)中复制的穿梭载体可通过将来自大肠杆菌质粒的序列与来自酵母2ILl质粒的序列连接来建构。表达系统包含表达载体和将表达编码在表达载体上的重组蛋白的适当(同源)宿主细胞。表达系统可为稳定表达系统或瞬时表达系统。在稳定表达系统中，表达载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或连续复18制且如实地传代至两个子代细胞中，以便宿主细胞能够当在适当条件下培养时，继续表达重组蛋白。在瞬时表达系统中，表达栽体分子不保留在两个子细胞中且最后丢失，或在生长细胞培养物中减少，使得重组蛋白从培养物的表达将最后停止或太低以致不适用于大多数生产目的。下文用于实例中的表达载体为穿梭载体类型，当插入(例如通过转型)至大肠杆菌细胞中时，其可复制成相对较高的拷贝数量，且其还可插入(例如通过转染)至且稳定维持在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，以获得所关注的其编码基因产物的稳定表达(Kaufman等人，Mo/ec.Ce〃.AW.，5:1750-1759(1980))或其可瞬时维持在HEK293细胞中(Durocher等人，A^c/ezc」c,A/^y.，30:E9)。因此，本文中所述的rEVE多核苷酸分子可用以增加所关注重组蛋白在稳定和瞬时表达系统中的表达。可用于本发明中的示例性真核载体包括但不限于病毒和非病毒载体。病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)；腺病毒载体，包括其具有复制能力的、复制缺陷和无活力形式；腺病毒相关性病毒(AAV)载体；猴病毒40(SV-40)载体；牛乳头状瘤病毒载体；埃-巴二氏病毒载体(Epstein-Barrvirusvector);疱渗病毒载体、牛痘病毒载体；莫洛尼鼠白血病病毒载体(Moloneymurineleukemiavirusvector);p合维鼠肉瘤病毒载体(Harveymurinesarcomavirusvector)、鼠类乳lU中瘤病毒载体和劳氏肉瘤病毒载体(Roussarcomavirusvectors)。才干讶犬病毒载体为熟知的且适于在昆虫细胞中表达。适合于在真核或原核细胞中表达的多种载体在本领域中是熟知的且许多为市售的。商业来源包括但不限于Stratagene(LaJolla,California)、Invitrogen(Carlsbad，California)、Promega(Madison,Wisconsin)和Sigma-Aldrich(St.Louis,Missouri)。许多载体序列可经由GenBank得到，且涉及载体的额外信息可经由RikenBioSourceCenter在互联网络上得到。载体分子通常包含至少一个复制起源且还可包含用于"标记"或"选择性标记，，的基因，当将载体插入宿主细胞中时，其可通过标记基因来鉴定或选择。这样的适用标记可(不限于)赋予对抗生素的抗性；提供给予选择性生长优点的功能，其优于缺乏这样的功能的细胞；或提供易鉴定拥有载体(例如染色遗传(colorigenic)系统)的细胞的方式。这样的标记在本领域中是熟知的，且用于载体分子中的适当选择性标记的选择将视使用何种宿主细胞和含有载体的宿主细胞的何种性质为需要的而定。术语"功能基因构建体"、"功能基因"和"基因"是指含有一种或多种蛋白的编码序列的多核苷酸，该编码序列可操作地连接于启动子序列及其它可能的转录调节序列以指导编码序列向信使RNA(mRNA)中的适当转录，且其还包含多种翻译调节序列的任何序列，该序列对指导mRNA向所欲宿主细胞中的所要蛋白中的适当翻译而言可为必需或所要的。在mRNA中通常需要翻译起始密码子(例如ATG)和核糖体结合位点，以使翻译在原核和真核细胞中发生。视宿主细胞而定还可使用的其它翻译调节序列包括但不限于RNA剪接位点和聚腺普酸化位点。本文中使用术语"重组体"来描述被改变或操纵的核酸、从天然存在的环境分离的核酸、被转染或被操纵以含有外生核酸的宿主细胞、或经由分离的DNA操纵和宿主细胞的转型而非天然地表达的蛋白。"重组体"为特别涵盖已使用遗传工程技术活体外建构的DNA分子的术语，使用术语"重组"作为形容词来描述分子、构建体、载体、细胞、蛋白、多肽或多核苷酸是特别排除天然存在的这样的分子、构建体、载体、细胞、蛋白、多肽或多核苷酸。特别为本发明的目的，"重组蛋白，，为由一种在表达蛋白之前已通过并入至少一个非天然存在的遗传因子所操纵的宿主细胞表达的蛋白。一种蛋白，其编码序列已由人工并入宿主细胞(例如通过包括该蛋白的编码序列的表达载体转染)使的能够表达该蛋白，一旦由该宿主细胞表达，即为"重组蛋白"。"宿主细胞"是指可插入载体分子的任何细胞，即任何真核或原核细胞。才艮据本发明，优选宿主细胞为真核或原核细胞，包括但不限于动物细力包(例如哺乳动物、鸟和鱼类宿主细力包)、植物细胞(包括真核藻类细胞)，真菌细胞、细菌细月包和原生动物细胞。适用于本发明的宿主细胞可为任何遗传构建体，但优选为单倍体或二倍体细胞。适用于本发明的优选哺乳动物宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人类胚肾(HEK293)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Hela细胞、人类B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞和MDCK细胞。优选昆虫细胞为Sf9。可在本发明中用作宿主细胞的真菌细胞包括但不限于子嚢菌细胞，诸如曲霉属、链孢霉属，和酵母细胞，尤其以下各属的酵母酵母菌属、毕赤酵母属、汉森酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属和念珠菌属。可用作表达重组蛋白的宿主细胞的特别优选酵母真菌物种为酿酒酵母、多形汉森酵母、乳酸克鲁维酵母、曱醇酵母、粟酒裂殖酵母和耶罗维亚解脂酵母。可在本发明中用作宿主细胞的优选原核细胞包括但不限于大肠杆菌、肠道沙门氏菌的血清型变体、志贺杆菌种、产琥珀酸沃廉菌、普通变形杆菌、雷特格氏变形杆菌、迟緩爱德华氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、巴氏杆菌种、嗜血杆菌种、假单胞菌种、杆菌种、葡萄球菌种和链球菌种。可为根据本发明用于表达重组蛋白的适用宿主细胞的其它细胞包括原生动物细胞，诸如锥虫类宿主蜥蜴利什曼原虫，和线虫锥虫秀丽引杆游^的细胞。各种表达载体可适用于上述细胞中。存在将载体分子插入细胞中的多种方式和方案，包括但不限于转型，转染，细胞或原生质粒融合，使用化学处理(例如原生质粒的聚乙二醇处理、钓处理、转染剂，诸如可购自Invitrogen(Carlsbad，California)的LIPOFECTIN⑧和LIPOFECTAMINE⑧转染试剂)，使用各种类型的脂质粒，使用机械装置(例如，用核酸涂布的微珠)，使用电荷(例如电穿孔)，及其组合。确定用以将本文中所述的特定载体分子插入所要宿主细胞中的特定方案和/或方式是在本领域技术人员的技术水平内。从一个载体或其它核酸分子"转移核酸序列信息"至另一个中的方法在本发明中非限制性的，且包括本领域中已知的多种遗传工程化或重组核酸技术的任一个。特别优选的转移技术包括但不限于限制；肖化和连接技术、聚合酶链反应(PCR)方案(利用特定或随机序列引物)、同源重组技术(利用具有同源性的多核苷酸区)和非同源重组(例如随机插入)技术。含有特测序列的核酸分子还可(例如)使用自动核酸合成器来合成，且将所得核酸产物随后通过上述方法中的任一个并入另一核酸分子中。使用遗传工程化技术必然需要在如通过本领域技术人员由所要细胞和特定细胞状态的要求而确定的多种特定条件下，使重组宿主细胞(例如转染子、转型体)生长。例如，宿主细胞可拥有(如通过其遗传排列所决定)某些管养需求或对物理(例如温度)和/或化学(例如抗生素)条件的特定抗性或敏感性。另外，特定培养条件可为调节所要基因的表21达(例如使用可诱导启动子)或引发特定细胞状态(例如酵母细胞配合或孢子形成)所必需。这样的变化条件和满足这样的条件的要求为本领域技术人员所理解和了解。在使用标准二氢叶酸还原酶(DHFR)-甲氨喋呤(MTX)扩增程序扩增(提高)重组蛋白在宿主细胞中的表达的情况下，术语"稳定性"和"稳定表达"是指当在不存在甲氨喋呤下生长时，即，不存在通过用于扩增程序的曱氨喋呤的存在所提供的用于提高表达的选择压力时，细胞培养物继续以扩增(提高)水平来表达重组蛋白的能力。因此，一旦分离，稳定转染子宿主细胞即可在存在或缺少甲氨喋呤下表达所关注重组蛋白。在使用标准二氢叶酸还原酶(DHFR)-甲氨喋呤(MTX)扩增程序扩增重组蛋白在宿主细胞中的表达的情况下，对曱氨喋呤存在的"增强适应性"或"改善适应性"是指与在甲氨喋呤存在下携带缺乏rEVE的表达载体的宿主细胞培养物的存活性和/或生长速率相比，在甲氨喋呤存在下携带包含本文中所述的rEVE的表达载体的宿主细胞培养物存活性更高和/或生长速率更高。宿主细胞群体的"存活性"是指宿主细胞群体在选择性压力(例如甲氨喋呤)存在下生长和繁殖的能力。"序列同源性"为该领域中的本领域技术人员所熟悉的概念。为测定2个氨基酸序列或2个核酸的同源性百分比，将序列比对以达最优选比较目的(例如，间隙可引入第一氨基酸的序列或核酸序列中以用于与第二比较氨基酸或核酸序列的最优比对)。随后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核普酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苦酸占据时，则分子在该位置处为同源的(即，如本文中所使用，氨基酸或核酸"同源性"相当于氨基酸或核酸"同一性")。核酸序列同源性可以2个序列之间的一致性程度来判定。同源性可使用本领域中已知的计算机程序，诸如GCG程序包中提供的GAP软件来测定。参见，Needleman和Wunsch,丄iUo/.5/o/.,4S:443-453(1970)。当"包含，，一个或多个指定要素或步骤时，本文中所述的组合物或方法是开放式的，其意谓指定要素或步骤为必要的，但在组合物或方法的范畴内，还可添加其它要素或步骤。还应了解，为避免冗长，当"包含"一个或多个指定要素或步骤时，所述任何组合物或方法还22描述"基本上由相同指定要素或步骤组成"的相应的更限制性组合物或方法，其意谓组合物或方法包括指定的必需要素或步骤且还可包括不会本质上影响组合物或方法的基本和新颖特征的额外要素或步骤。还应了解，当"包含"一个或多个指定要素或步骤或"基本上由一个或多个指定要素或步骤组成"时，本文中所述的任何组合物或方法还描述"由指定要素或步骤组成"以排除任何其它未指定要素或步骤的相应的更限制性和封端(close-ended)组合物或方法。在本文中所揭示的任何组合物或方法中,任何指定必需要素或步骤的已知或所揭示等价物可取代该元素或步骤。还应了解，"选自…"的要素或步骤是指紧接着的名单中的要素或步骤的一个或多个，包括所列要素或步骤的任何两个或两个以上的组合。，于、，一、、乂，、、、、口、'、、、、口、、、、与通过本领域技术人员所理解和使用的相同。本领域技术人员还应了解，如本文中所述的核酸序列(核苷酸碱基序歹'J)才是供DNA、RNA及其互补序列。本发明的重组表达载体元件(rEVE)首先从位于存在于转染的DUXB11CHO细胞系的细胞中的表达载体的整合位点的任一侧旁侧的基因组DNA区分离，该细胞是从存在于表达载体上的基因表达格外高水平的抗IL-12抗体分子。DUXB11CHO基因组DNA的这样的旁侧区的克隆和测序揭示SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的序列。SEQIDNO:1的2329碱基序列在本文中还称为"ARM1"，且SEQIDNO:2的2422碱基序列称为"ARM2"。旁侧ARMlDNA序列经显示位于整合表达载体的重链基因的转录方向的上游，且旁侧ARM2DNA序列经显示位于±4"八t，J"J0"'/Jr丄厶2A*世DTI丄厶_SL二人丄A-T",'A/右m一r>二Air^J-人^er5-^i^辟人r^w.vw^et^w、j，vj^y、口jw、jr///r(/乡、夕ctr人^r^—i"j—-p勿J。将含ARM1和含ARM2的DNA分子单独且以组合形式插入表达载体中，以测定其存在是否会影响各种重组蛋白于含有表达载体的宿主细胞中的表达水平。与不存在这样的序列下获得的制备水平相比，含ARM1和含ARM2的DNA提供重组蛋白在宿主细胞中的增加表达水平(参见下文实施例)。因此，含ARM1和含ARM2的核酸分子为重组表达载体元件的实例(rEVE)。通常，用ARM1多核苷酸获得的增加制备水平比用ARM2多核苷酸或用ARM1和ARM2多核苦酸的组合获得的那些稍微更低。在其中ARM1和ARM2的任一个或两个已用于建构用于制备本发明所关注重组蛋白的表达载体的所有情况下，使用ARM1和/或ARM2表达增强子元件的蛋白表达水平更大。直接观察到，超过不具有ARM增强子的对照表达系统的大于2倍、大于3倍、大于4倍、大于5倍、大于6倍、大于9倍、大于10倍、大于13倍、大于16倍和大于18倍的重组蛋白产物的增加的比较表达水平。(参见下文实施例)。此外，使用具有ARM1或ARM2或ARM1和ARM2两者的表达载体获得的高表达水平在转染的宿主细胞中随时间稳定地维持。ARM1和ARM2序列拥有相对富集基质/支架附着区的序列的区域(MAR/SAR;参见例如，Michalowski等人，5,oc/zew^^y,3S:12795-12804(1999);Tikhonov等人，77ze尸/"WCe〃，/2:2490曙264(2000)美国专利第7,129,062号；Bode等人,Wev.Q^o/.，/6Z4:389-454(1995);Bode等人,O//.We乂Ei^oTyo/Zc5"jc/^us^z'ow，<5:115-138(1996))。在ARM1的状况下，MAR序列基序尤其集中在序列的3'末端区中，而在ARM2的状况下，MAR基序的群集出现在序列的5'和3'末端区中，较少MAR基序位于序列的中间区中。缺失分析表明ARM2核酸的大致1260碱基对3'末端区含有对ARM2增加的蛋白表达活性而言关键的序列(参见下文实施例6)。本发明的rEVE分子包括那些核酸分子，其包含ARM1和ARM2序列的增加表达部分或片段。ARM1和ARM2序列的这样的增加表达部分为那些当作为编码所关注重组蛋白的基因存在于相同表达载体上时，与不存在ARM1或ARM2序列的这样的部分或片段时获得的表达水平相比，其增加重组蛋白在含有表达载体的宿主细胞中的表达水平。本文中所述的rEVE可单独使用或与任何其它调节元件或表达增加系统组合使用，以用于增加所要重组蛋白在宿主细胞中的制备水平。这样的其它序列和系统可包括但不限于使用调节启动子以控制或最优选化编码所关注重组蛋白的基因的转录，使用指导重组蛋白从宿主细胞分泌的信号序列和使用基因扩增方法，诸如二氬叶酸还原酶(DHFR)-甲氨喋呤(MTX)扩增方案或谷氨酰胺合成酶方案。在DHFR-MTX扩增程序中，就对增加浓度的甲氨喋呤的抗性而言来选择携带包含用于DHFR的基因的表达载体的宿主细胞(参见例如，Kaufman,R丄，/"GeneticEngineering:Principlesandmethods(编者丄K.Setlow),第9巻，第155页(PlenumPublishing,NewYork,1987))。通常，当对甲氨喋呤的抗性水平增加时，存在重组基因的拷贝数量的伴随扩增连同从该扩增基因的重组蛋白表达水平的相应扩增(升高)。SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的核酸序列是从得自DUXB11CHO细胞系的DNA分子来鉴定。多种方法的任一个可用以制备包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2的核普酸序列或这样的序列的任一个的部分的核酸分子。这样的方法包括但不限于将一个或多个包含这样的序列的rEVEDNA分子克隆出DUXB11CHO细胞的基因组DNA,产生包含这样的序列的多核苷酸的固相核酸合成方案，重组核酸技术，聚合酶链反应(PCR)方案，自动核酸合成器，及其组合。本文中所述的rEVE多核普酸分子还可从用户设计(customdesigned)的核酸分子的商品供货商购买。制备或合成rEVE的方法非限制性的，且本领域技术人员可决定何种方法或方法的组合最适于制备本文中所述的特定rEVE。本文中所述的rEVE可插入表达载体中以增加多种蛋白(包括肽、多肽和寡聚蛋白)的任一个从宿主细胞中的表达载体的表达。倘若核苷酸编码序列为已知的或可在核酸(DNA或RNA)分子上得到，则所关注的蛋白的编码序列或整个功能基因可使用本领域中可用的多种方法中的任一个来插入表达载体中。编码序列可操作地连接于启动子，该启动子将在需要其表达的宿主细胞类型中起作用。额外转录和翻译序列还可被工程化到载体中，以用于所要蛋白在宿主细胞中的适当表达。广大种类的蛋白(包括肽、多肽、寡聚蛋白)的任一个从适当宿主细胞中的表达载体的表达可通过一种或多种本文中所述的rEVE来增加，所述rEVE包括但不限于可溶性蛋白、膜蛋白、结构蛋白(即向细胞、组织或器官提供结构或支撑的蛋白)、核糖体蛋白、酶、酶原、各种抗体分子(包括但不限于TNF-a的抗体，诸如阿达木单抗；选择蛋白的抗体；免疫调节蛋白的抗体，诸如IL-13的抗体；双可变域免疫球蛋白分子，诸如DVD-IGTM双可变域免疫球蛋白分子；细胞表面受体的抗体)、细胞表面受体蛋白、转录调节蛋白、翻译调节蛋白、染色质蛋白、激素、细胞周期调节蛋白、G蛋白、神经活性肽、免疫调节蛋白(例如介白素、细胞因子、淋巴因子)、血液组分蛋白、离子门蛋白、热休克蛋25白、二氢叶酸还原酶、抗生素抗性蛋白、任一前述蛋白的功能片段、任一前述蛋白的含表位片段及其组合。所关注重组蛋白可通过转录和翻译编码重组蛋白且存在于本文中所述的表达载体分子上的基因来制备。包括本文中所述的那些的表达载体上的基因的该转录和翻译可使用无细胞的转录/翻译系统或使用适l达载体分子上的基因产生所关注重组蛋白所必需的i当细胞转录和翻译机构。基质附着区(MAR)(还称为支架附着区(SAR))最初是鉴定为染色体DNA的片段，其结合以制备似乎形成真核生物核中的支架或基质的核蛋白。据信MAR驻留在染色质环中，这样的染色质环连接于核基质且界定或限定染色质的个别结构单元。MAR已与一些增强子序列有关且/或与可在染色质中发生的许多过程有关联，这样的过程包括转录、转基因表达、转基因重排、重组、复制和转染的稳定化(参见例如，Michalowski等人，S,oc/zem&^y,3S:12795-12804(1999);Zhong等人，A^/.爿cm/.96f2/力11970-11975(1999);Tikhonov等人，77ze尸/朋fCe〃，"249-264(2000);Zhou等人，Ge"。277:139-144(2001);Sumer等人，Ge"匿toe置/z，":1737-1743(2003);美国专利第7,129,062号；Bode等人，MAev.C,/.，/6Z4:389-454(1995);Bode等人,O".五w^r""c￡"x/ms\s7'o/，6:115-138(1996))。ARMl(SEQIDNO:l)和ARM2(SEQIDNO:2)拥有多种MAR元件，其似乎主要以群集形式位于3'和/或5'末端区中。ARM1在3'末端区中含有一群MAR元件。在ARM2的状况下，可发现MAR元件贯穿该rEVE序列的长度，MAR基序的群集位于5'和3'末端区中。显然，携带ARM1和ARM2序列的载体及其它核酸分子为MAR元件和MAR元件的群集的适宜来源。因此，ARM1、ARM2及其含MAR的部分可用以使用本领域中可用于重组核酸序列信息或另外将核酸序列信息转移至核酸分子中的各种方法的任一个，来增加MAR元件在所关注核酸分子中的数量。包含本文中所述的rEVE的序列或其部分的核酸分子还可用于本领域中已知的多种程序中，以在其它核酸分子中操纵、鉴定、制备或扩增rEVE序列。这样的程序可包括但不限于使用rEVE或其部分作为本领域中已知的各种核酸杂交方法的任一个中的探针，或作为本领域中已知的各种聚合酶链反应(PCR)程序的任一个中的引物。本文中所述的rEVE多核普酸分子可用于制备所关注重组蛋白的方法中。优选地，制备所关注重组蛋白的该方法包括如本文中所述的重组表达载体，其包含一个或多个编码所关注重组蛋白的重组基因和至少一种本文中所述的rEVE多核苷酸分子，和将重组表达载体上存在的一个或多个重组基因转录和翻译以产生所关注重组蛋白。一个或多个重组基因从表达载体的转录和翻译优选在包含表达载体的宿主细胞中进行，且在促进所关注重组蛋白的表达的条件下培养。rEVE多核普酸分子可用以增加一种或多种所关注重组蛋白从宿主细胞中的表达载体的表达水平，无"i仑通过瞬时表达(例如在经转染的COS或HEK293宿主细胞中)还是通过稳定表达(例如在转染的CHO宿主细胞中)。一个或多个重组基因从携带如本文中所述的rEVE的表达载体的转录和翻本文中所述的rEVE多核苷酸分子可用于制备宿主细胞，当表达水平已使用DHFR-甲氨喋呤扩增程序来扩增(提高)时，该宿主细胞稳定(与瞬时对比)表达高水平的重组蛋白。这样的宿主细胞为抗甲氨喋呤(抗MTX)细胞，其不仅当在甲氨喋呤存在下生长时，而且当在不存在曱氨喋呤时生长时，即，当不存在用于通过曱氨喋呤的存在所提供的增加表达的选择压力下生长时，继续表达高水平的重组蛋白。在一个优选实施方案中，产生曱氨喋呤抗性宿主细胞的该方法包括的步骤为将表达载体插入宿主细胞中，该表达载体包含编码所关注重组蛋白的重组基因，rEVE或其增加表达部分，和二氬叶酸还原酶(DHFR)基因，在甲氨喋呤存在下使宿主细胞生长，以选择表达所关注重组蛋白的曱氨喋呤抗性宿主细力包，和分离甲氨喋呤抗性宿主细胞；其中分离的甲氨喋呤抗性宿主细胞以比曱氨喋呤敏感性宿主细胞更高的水平表达所关注重组蛋白，且其中该甲氨喋呤抗性宿主细胞当在存在或不存在曱氨喋呤下生长时，稳定表达高水平的重组蛋白。优选地，rEVE包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或其增加表达部分。更优选地，rEVE包含SEQIDNO:2。本文中所述的rEVE多核苷酸分子还可用于改善表达重组蛋白的宿主细胞群体适应在甲氨喋呤存在下的生长能力的方法中。在一个优选实施方案中，该方法包括将表达载体插入宿主细胞中，该表达载体包含.编码所关注的蛋白的重组基因，.重组表达载体元件(rEVE)多核苦酸分子，其包含选自下列的序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:1的一部分、SEQIDNO:2的一部分及其组合，和.二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，其中当在曱氨喋呤存在下生长时，与携带缺乏该rEVE多核苷酸分子的表达载体的宿主细胞群体相比，含有表达载体的宿主细胞群体具有更高存活性和/或更高生长速率。本文中所述的rEVE多核普酸分子还可用以使用DHFR-曱氨喋呤扩增程序来增加重组蛋白在宿主细胞中的表达扩增(升高)。在一个优选实施方案中，该方法包括将表达载体插入宿主细胞中，该表达载体包含.编码所关注重组蛋白的重组基因，.rEVE多核苷酸分子，其包含选自下列的序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:1的一部分、SEQIDNO:2的一部分及其组合，和.二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，在甲氨喋呤存在下使宿主细胞生长，以选择表达所关注重组蛋白的曱氨喋呤抗性宿主细胞，和分离甲氨喋呤抗性宿主细胞，其中分离的曱氨喋呤抗性宿主细胞在曱氨喋呤存在下，以比含有缺乏该rEVE多核苷酸分子的表达载体的甲氨喋呤抗性宿主细胞更高的水平表达所关注重组蛋白。在使用用于所要重组蛋白的扩增表达的曱氨喋呤选择的本文中所述方法中，曱氨喋呤可在20nM至500nM的范围内使用。然而，有利地，本领域技术人员认识到，更低和更高的曱氨喋呤浓度(诸如5nM至10jiM)还可成功用于扩增表达的甲氨喋呤选择中(参见例如，Kaufman,说明书第23/46页R丄，MethodsinEnzymology,第185巻537-566(1990》。本发明还提供了减少、显著抑制或基本上沉默重组蛋白从表达载体的表达的方法。该方法可使用包含本文中所述的rEVE序列的一个或多个片段的表达载体，这样的片段提供比使用全长rEVE序列所提供的更低水平的特定重组基因产物的表达。该减少表达或抑制表达的rEVE衍生序列包括ARM2的序列的截短变体，其具有SEQIDNO:2的碱基1-1086或SEQIDNO:2的碱基1-461的碱基序列。显然，从这样的2种变体缺失的3'末端序列区的存在对重组蛋白的rEVE介导的增加表达而言是极其需要的。具有SEQIDNO:2的碱基1-461的ARM2截短序列的核酸分子尤其适用于抑制或基本上沉默重组蛋白从宿主细胞中的表达载体的表达。这样的方法可在许多情况下得以使用，这样的情况包括但不限于，当存在重组蛋白的表达可对宿主细胞有毒性的担心时，或当某表达水平可存在所要蛋白的纯化或分离的问题时，诸如存在蛋白凝集。因此，SEQIDNO:2的碱基462-2422的序列和SEQIDNO:2的碱基1087-2422的序列对最大ARM2rEVE介导的重组蛋白表达增加而言为最优选的。因此，尤其适用于增加重组蛋白的表达的rEVE多核苦酸包含SEQIDNO:2的碱基462-2422的序列和/或SEQIDNO:2的碱基1087-2422的序列。本发明的额外实施方案和特征将由以下非限制性实施例而显而易见。实施例实施例1.ARM1和ARM2重组表达载体元件(rEVE)的克隆和序列分析研究携带稳定整合的表达载体的DUXB11CHO细胞系的产生，以确定在表达载体上编码的重组抗IL-12抗体的格外高水平表达的可能基础，宿主CHO细胞用该表达载体转染。在该研究中，将旁侧被整合的表达载体的基因组DNA区域克隆且测序。简言之，用Xbal消化来从宿主细胞的基因组DNA，且使用基本上如通过Reynaud等人(丄Mo/./W:481-504(1980))所述的BioGelA-50管柱纯化具有大致5千碱基(kb)的平均尺寸的片段。通过将片段克隆至人DASH⑧克隆载体(Stratagene，LaJolla,California)中来制备纯化基因组片段的文库。将文库扩增且使用GIGAPACK⑧包装萃取物(Stratagene)来包装，且根据制备商方案转导至XL1-BlueMRA或XL1-BlueMRA(P2)大肠杆菌细胞中。随后，根据Stratagene方案，就抗IL-12抗体的重链可变区(Vh)的编码序列而言，用探针来筛选文库。XDASH克隆存21中的14.5kbXbal片段含有用于抗体表达载体的插入位点连同旁侧基因组序列。这些旁侧基因组区是指定为ARM1和ARM2。ARM1和ARM2区域的序列分别被测定为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的序列。关于CHO细胞基因组中的抗体表达载体的插入位点，ARMl位于插入位点的上游且为5'至抗体重链的载体基因的转录方向，ARM2位于插入位点的下游且为3'至抗体轻链的载体基因的转录方向。SEQIDNO:1和SEQIDNO:2相对CHO表达序列标记(EST)数据库的BLAST分析未能揭示任何相关编码序列，暗示ARMl和ARM2rEVE序列不含任何CHO编码序列。rEVE序列的BLAST分析还相对小鼠基因组序列来进行。未鉴定到与ARMl序列同源的小鼠基因组序列。然而，ARM2序列似乎与不含有已知编码序列的小鼠染色体14上的高度保守区域有关。使用载体NTI序列分析程序(Invitrogen),还就基质附着区(MAR)元件的各种代表性(即并非全部)核苷酸序列基序的样本的存在来筛选ARMl(SEQIDNO:l)和ARM2(SEQIDNO:2)的序列(参见例如，Michalowski等人，S,0c/^,'^7，12795-12804(1999))。通过计算机程序筛选的特定MARDNA序列基序显示于表1中(互补链序列未列出)。表1.代表性基质附着区(MAR)元件的核苷酸序列基序<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>配，但3'末端为G)或TAWAWWW(SEQIDNO:5的碱基l-7)(MRS的第一部分，无错配)十AWWRTAA丽WWG(SEQIDNO:5的碱基10-21)(MRS的第二部分，允许l个错配，但3'末端为G),其中第一和第二MRS部分经计数具有至多4个间插碱基(N,-4)或至多3个重叠碱基<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>*互补链序列未列出；缩写Y二T或C;W=A或T;N=A、T、G或C;R=G或A如下文表2中所示，在ARM1DNA序列(SEQIDNO:l)或其互补链序列中鉴定至少41个MAR元件序列，且在ARM2DNA序列(SEQIDNO:2)或其互补链序列中鉴定至少U4个MAR元件序列。表2.ARM1和ARM2DNA序列中的MAR序列位置<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*ARM1序列(SEQIDNO:l)或ARM2序列(SEQIDNO:2);"互补"=互补链序列；"群集"二特测序列中的指定MAR元件的超过一个拷贝表2中的ARM1和ARM2的MAR序列分析(包括互补链分析)的结果指示，各种MAR主要在ARMl(SEQIDNO:l)的3'末端部分中群集且在ARM2(SEQIDNO:2)的5'部分和3'部分中群集。ARM1具有比ARM2更少的这样的MAR位点。此外，ARM1中的大多数MAR序列在序列的3'区中，而ARM2的5'和3'区是由MAR序列群集(populated)。实施例2.用于研究ARM1和ARM2rEVE对重组蛋白的表达水平的影响的通用方案用于表达试验的细胞DUXB11CHO细胞系为二氢叶酸还原酶(DHFR，表达缺陷的CHO细胞系(参见，Urlaub,G.和Chasin，L.A.,尸rac.淑/."S.A，77:4216-4220(1980))。该细胞系的DHFR一表型允许使用标准二氬叶酸还原酶-甲氨喋呤系统(DHFR-MTX)方案以扩增已转染至这样的细胞中的表达载体的拷贝数量(参见例如，Kaufman，R丄，/"GeneticEngineering:PrinciplesandMethods(编者J.K.Setlow),第9巻，第155页(PlenumPublishing,NewYork,1987))。含有ARM1和ARM2rEVE序列的表达载体图1提供了质粒表达载体pA205的示意图。图2提供质粒表达载体pA205Genomic的示意图，其中编码阿达木单抗的重链和轻链的基因的旁侧是ARM1和ARM2,以致ARM1序列位于阿达木单抗的重链基因的上游且ARM2序列位于阿达木单抗的轻链基因的下游。图3提供质粒表达载体pA205Al的示意图，其中ARM1序列位于阿达木单抗的重链基因的上游。图4提供质粒表达载体pA205A2的示意图，其中ARM2序列位于阿达木单抗的轻链基因的下游。图5提供了质粒表达载体pCHOEL246GGhum的示意图，该质粒表达载体含有人类抗-EL-选择蛋白抗体的重链和轻链的基因。图6提供质粒表达载体pA-Gen-EL-选择蛋白的示意图，其中编码抗-EL-选择蛋白抗体的重链和轻链的基因的旁侧是ARM1和ARM2序列，以致ARM1序列位于抗体重链基因的上游且ARM2序列位于抗体轻链基因的下游。图7提供了质粒表达载体pA205-eGFP的示意图，该质粒表达载体含有增强绿色荧光蛋白(eGFP)的基因。图8提供质粒表达载体pA205G-eGFP的示意图，其中编码增强绿色荧光蛋白的基因是的旁侧是ARM1和ARM2序列，以致ARM1序列位于eGFP基因的上游且ARM2序列位于eGFP基因的下游。图9提供了质粒表达载体pA205A2-Spe-trunc的示意图，该质粒表达载体基本上与图4中所示的表达载体pA205A2相同，除ARM2序列已经截短的ARM2变体"A2(bp1-1086)"置换外，该截短的ARM2变体是由于ARM2DNA—皮限制性核酸内切酶5^e/消化而具有SEQIDNO:2的碱基1-1086的核酸碱基序列。图10提供质粒表达载体pA205A2-Swa-trunc的示意图，该质粒表达载体基本上与图4中所示的表达载体pA205A2相同，除ARM2序列已经被截短的ARM2变体"A2(bpl-461)"置换外，该截短的ARM2变体是由于ARM2DNA被限制性核酸内切酶Swa/消化而具有SEQIDNO:2的碱基1-461的核酸碱基序列。培养基aMEM为最低必需培养基，a培养基(GIBCO⑧，Invitrogen,Carlsbad,California)。细胞生长和转染每次转染，用各自在10ml补充有5%透析FBS和H/T(GIBCO)的aMEM中的lxl()6个B3.2亲本DUXBllCHO细胞将3个10cm组织培养氺反4妾种。18小时(18h)后，根据CurrentProtocolsinMolecularBiology(A謂bel,F.V.,Brent,R.,Moore,D.M,Kingston,RE.,Seidman，J.G，Smith,J.A.和K.Struhl编)，(WileyInterscience，NewYork,1990))中所述的磷酸钙转染方案(具有下文所指示的若干修改)将这样的细胞转染。通过抽吸从培养板移除生长培养基，且将9ml的Ham氏F12培养基(Invitrogen)添加至各培养板中。在转染之前，在37。C下，将培养板培养2小时。磷酸钾转染方案将75微克(75pg)DNA溶于50ml锥形管中的1.35ml水中。添加150微升(150pl)的2.5MCaCl2,且将该DNA-4丐混合物逐滴添加至50ml锥形管中的1.5ml的2xHeBES(HEPES緩沖盐水)中。用微量吸管使HeBES鼓泡，同时用Pasteur微量吸管添加DNA-4丐混合物。通过涡旋5秒来混合混合物且在室温下将其培养20分钟。将1毫升(lml)DNA-钙混合物均匀分布在具有粘着细胞的各培养皿上，使其生长且备用于在如上所述的F12培养基中的转染，且随后在37。C下将培养物培养4小时。培养后，抽吸培养板，且将2ml在F12培养基中的10%二甲亚砜(DMSO)添加至各培养板中(DMSO休克处理)。DMSO休克持续1分钟，之后，通过将5mlPBS(磷酸盐緩冲盐水)添加至各培养板中来稀释DMSO。抽吸培养板且在PBS中再洗涤2次。添加10ml的aMEM/50/。FBS/HT,且在37。C下将培养板培养过夜。转染的细胞在96孔培养板中的接种与甲氨喋呤(MTX)扩增第二天，如下将细胞接种至96孔培养板中通过胰蛋白酶消化收获来自全部10cm培养板的细胞，且在aMEM/5Q/0FBS中以2000个细胞/ml的密度再悬浮。以10ml/板来接种96孔培养板，100ilU/孔。l周后，2周后且再次在其后5天改变96孔培养板上的培养基。所用培养基aMEM/5。/。FBS对表达DHFR的细胞有选择性。最后一次培养基改变后2天，1:40稀释培养物上清液且使用对人类IgGy链有特异性的ELISA来测试，以侦测阿达木单抗或抗-EL-选择蛋白抗体的表达。以2.0ml/孔的ocMEM/5o/()FBS,将得到最高ELISA信号的克隆从其96孔培养板转移至12孔培养板中。当长满(大致2-5天后)时，再次检定这样的物质，且将克隆分离至相同培养基+20nMMTX中用于扩增。最初在于12孔组织培养板中的aMEM/50/。FBS和20nMMTX中选择细胞。在该MTX水平下的初始选择后，经18天的平均时期，将这样的细胞在含有20nMMTX的生长培养基中传代最少2次以上。随后，将细胞系扩增至100nMMTX。在该培养期期间，培养物的阿达木单抗(人类抗-TNF-a抗体)或抗-EL-选择蛋白生产力增加。在100nMMTX水平下选择之后，经18天的平均时期，将细胞系在含有100nMMTX的生长培养基中传代最少2次以上。当有指示时，将细胞系进一步扩增至500nMMTX。在500nMMTX水平下选择之后，经18天的平均时期，将细胞系在含有500nMMTX的生长培养基中传代最少2次以上。携带包含ARM1核酸序列(SEQIDNO:1)、ARM2核酸序列(SEQIDNO:2)或ARM1和ARM2序列的组合的表达载体的转染的CHO细胞的培养物在曱氨喋呤存在下，与缺乏这样的rEVE序列的相同表达载体转染的CHO细胞相比，适应更好，即，具有更高存活性和/或更高生长速率。实施例3.ARM1和ARM2序列对转染的CHO细胞中的抗-TNF-a的表达水平的影响在该试验中，检查ARM1和ARM2序列对稳定转染的CHO细胞中的人类抗-TNF-a抗体(阿达木单抗)的表达的影响。在用表达载体pA205(无ARM序列)、pA205Genomic(含有ARM1和ARM2)、pA205Al(含有ARM1)或pA205A2(含有ARM2)稳定转染的CHO细胞中，比较阿达木单抗的表达水平。表3显示，阿达木单抗在具有来自在指定扩增水平(甲氨喋呤"MTX"的浓度)下的各载体转染之前3个产生克隆的粘着培养物中的平均产生水平。表3.稳定转染的CHO细胞中的阿达木单抗表达水平载体0nMMTX20nMMTX100nMMTXpA2051.57吗/ml4.20|_ig/ml5.53昭/mlpA205Genomic4.60|xg/ml14.80吗/ml21.03吗/mlpA205Al3.13(ig/ml9.卯|xg/ml17.3吗/mlpA205A24.53|xg/ml24.23ng/ml20.8ng/ml表3中的数据指示，与缺乏ARM序列的载体(pA205)转染的细胞中所见相比，单独或呈组合的ARM1和ARM2序列增加阿达木单抗的表达水平。总之，单独的ARM2(p205A2)相对于所有其它转染子而言提供最大水平的增加表达，而单独的ARMl(p205Al)提供最少的表达增加水平。数据显示，具有ARM1序列(SEQIDNO:1)或ARM2序列(SEQIDNO:2)的分离核酸分子为代表性重组表达载体元件(rEVE),其当插入表达载体中时可增加由表达载体编码且从表达载体表达的重组蛋白36的表达。还在不存在曱氨喋呤扩增时，在悬浮液培养物中l周和4周后，比较阿达木单抗通过上述载体转染的个别克隆的表达水平。结果显示于表4中。表4.在不存在甲氨喋呤时1周和4周后，在稳定转染的CHO细胞的个别克隆的悬浮液培养物中的阿达木单抗表达水平<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表4中的数据显示，将ARM2并入不具有ARM1(pA205A2)的pA205中增强所增加阿达木单抗表达水平随时间的稳定性。详细来说，在ARM1和ARM2(pA205Genomic)两者或ARMl(pA205Al)单独存在时，最初在培养物中观察到阿达木单抗的增加的表达水平，但该水平可经大约数周快速下降至低得多的水平(参见表4)。相反，在ARM2单增加的表达水平在4种培°养物的3种中稳定地;iM争4周的时期。因此、,ARM2可稳定地维持阿达木单抗在转染的CHO细胞的悬浮液培养物中的表达水平的显著升高。实施例4.ARM1和ARM2序列对转染的CHO细胞中的抗-EL-选择蛋白抗体的表达水平的影响在该试验中，检查ARM1和ARM2序列对人类抗-EL-选择蛋白抗体(结合E-和L-选择蛋白)在稳定转染的CHO细胞中的表达的影响。在用表达载体pCHOEL246GGhum(无ARM序列)或用表达载体pA-Gen-EL-选择蛋白(含有ARM1和ARM2)稳定转染的CHO细胞中比较该抗选择蛋白抗体的表达水平。表5显示，抗选择蛋白抗体于具有来自在指定扩增水平(甲氨喋呤"MTX"的浓度)下的各载体转染之前3个产生克隆的粘着培养物中的平均产生水平。表5.稳定转染的CHO细胞中的抗-EL-选择蛋白抗体的表达水平载体0nMMTX20nMMTX100nMMTX500nMMTXpCHOEL246GGhum7.93略/ml15.47ng/ml17.27昭/ml22.30吗/mlpA-Gen-EL-选择蛋白6.27.吗/ml19.87吗/ml26.63吗/ml44.13|ag/ml表5中的数据显示，ARM1和ARM2序列(pAGen-EL-选择蛋白)在增加抗-EL-选择蛋白抗体在稳定转染的CHO细胞的曱氨喋呤扩增培养物中的表达水平上是有效的。实施例5.ARM1和ARM2序列对增强绿色焚光蛋白(eGFP)在转染的CHO细胞中的表达水平的影响如上所述，将含有编码增强绿色焚光蛋白(eGFP)的基因构建体转染至CHO细胞中，例外的为，细胞与pcDNA3.1-hygro共转染以提供用于稳定转染子的选择性标记，即潮霉素抗性。表达载体peGFP提供eGFP在CMV启动子的转录控制下的表达的阳性对照。质粒pA205-eGFP含有不具有ARM1或ARM2序列的pA205表达载体上的eGFP基因(图7)。质粒pA205Gen-eGFP(图8)含有在编码eGFP的基因旁侧的ARM1和ARM2。在这样的质粒的任一个中不存在DHFR选择基因。因此，不采取DHFR-甲氨喋呤扩增步骤。用浓度为400pg/ml的潮霉素选择转染子历时2周，必要时分离，且随后通过FACS分选以测定表达水平。细胞最初分选成各类型载体的池，且使表达细胞再生长2周，且随后再分选。38表6.稳定转染的CHO细胞中的eGFP的表达水平载体平均荧光单位peGFP(阳性对照)239.03pA205誦eGFP17.36pA205Gen画EGFP104.86表6中的数据指示，与用相同但缺乏ARM序列的eGFP表达载体(pA205-eGFP)转染的细胞中的表达水平相比，ARM1和ARM2序列在显著增加eGFP在转染的CHO细胞中的表达水平上是有效的。实施例6:ARM2的缺失突变体对阿达木单抗在转染的CHO细胞中的表达水平的影响在pA205A2载体中，将ARM2序列(SEQIDNO:2)的3'末端区截断成Spel分裂位点(在SEQIDNO:2的碱基1086处)或Swal分裂位点(在SEQIDNO:2的碱基461处)以分别产生pA205A2-Spe-trunc(含有SEQIDNO:2的碱基1-1086的序歹')和pA205A2-Swa-trunc(含有SEQIDNO:2的碱基1-461的序列)。将所得质粒转染到如上所述的CHO细胞中且扩增至20nMMTX。表7显示，在具有来自在各扩增水平下的各转染之前3个产生克隆的粘着培养物中的平均表达水平。表7.稳定转染的CHO细胞中的阿达木单抗的表达水平载体0nMMTX20nMMTXpA2051.80pg/ml1.57ng/mlpA205A26.10吗/ml15.73(xg/mlpA205A2-Spe-tr薦3.57|xg/ml3.00(ig/mlpA205A2-Swa-trunc0.83(ig/ml0.90吗/ml表7中的数据显示，与用pA205A2载体转染的CHO细胞相比，用含有ARM2DNA的5'末端1086石咸基对的表达载体pA205A2-Spe-trunc转染的CHO细胞以更低的增加表达水平来产生阿达木单抗。惊人地，用含有ARM2DNA的5'末端461碱基对的表达载体pA205A2-Swa-trunc转染的细胞，以比用不含有ARM序列的pA205示，从ARM2DNA的3'末端缺失的区域对重组蛋白在宿主细胞中的增加表达尤其重要。另外，ARM2DNA的相对较小(即，461碱基对)5'末端片段的单独存在，实际上似乎减少重组基因产物在转染宿主细胞中的表达，且可尤其适用于大体上减少或沉默重组基因产物的表达。当(例如)在某些培养条件下，基因产物在宿主细胞中的表达将有毒性或另外非所要时，可需要该应用。实施例7.来自前述研究的个别转染子的表达水平下文所示的表提供通过在前述研究中产生的个别转染克隆来产生的重组蛋白的表达水平。表8.用pA205转染的CHO细胞中的阿达木单抗的表达水平<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>680.01690.01700.01710.009720.007730.007740.007750.006760770780表9.用pA205Genomic转染的CHO细胞中的阿达木单抗的表达水平pA205Genomic克隆#0nMMTX20nMMTX100nMMTX500nMMTX19.319.161.040.626.916.559.740.236.515.152.028.645.7013.636.023.955.613.225.964.60.720.774.310.319.684.19.817.694.109.716.3104.009.515.6113.98.911.4123.67.69.3133.56.98.1143.46.48153.365.9162.94.50.1172.93.10.04182.702.5192.602.4202.51.6212.41.4222.21.1232.20.05242.20252.20026227228l.卯42291.90301.8311.80321.7331.7341.6351.6361.6371.50381.4391.4401.40411.3421.3431.30441.30451.2461.1471.1481.1491501.00510.80520.7530.7540.7550.6560.60570.5580.5590.5600.5610.5620.5630.4640.4650.4660.3670.3680.3690.3700.2710.243<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表10.用pA205Al转染的CHO细胞中的阿达木单抗的表达水平<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表11.用pA205A2转染的CHO细胞中的阿达木单抗的表达水平<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表12.用pA205A2-Spe-trunc转染的CHO细胞中的阿达木单抗的表达水平pA205A2-Spe-trunc克隆#0nMMTX20nMMTX15.54.723.12.332.12.0422.01.31.961.21.871.1.481.11.2911.0100.90.8110.90.4120.90.2130.80140.7050.70160.7170.6180.5190.4200.4210.4220.4230.4240.3250.2260.246表13.用pA205A2-Swa-trunc转染的CHO细胞中的阿达木单抗的表达水平<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表14.用pCHOEL246GGhum转染的CHO细胞中的抗-EL-选择抗体的表达水平<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表15.用pA-Gen-EL-选择蛋白转染的CHO细胞中的抗-EL-选择蛋白抗体的表达水平—<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>-化-13抗体在培养物内的稳定转染的哺乳动物细胞中rEVE介导的表达增力口。使用标准方法，将编码具有人类IgGyl同型的人源化抗-IL-13单抹抗体的重链和轻链的DNA分子(参见美国第11/899,819号，其以引用的方式并入本文)插入表达载体质粒pBJ(—种DHFR-MTX可扩增表达质粒)中，以产生表达质粒pBJ-13C5.5(亲本表达质粒)。随后将包含ARM2序列(SEQIDNO:2)的rEVE多核普酸插入质粒pBJ-13C5.5中，以产生含rEVE的表达质粒pA2-13C5.5(ARM2rEVE表达质粒)。按照先前实施例中所述的通用转染方案，用亲本表达质粒pBJ-13C5.5或含A固2的rEVE表达质粒pA2-13C5.5转染CHO细胞，以获得稳定转染的CHO细胞。转染后24小时，将来自各转染的细胞接种至48个96孔培养板中(200个细胞/孔)。就人类IgG的表达而言，通过ELISA筛选个别孔的培养基。在用ARM2rEVE表达质粒转染的细胞的培养物(孔)中，光密度比用亲本表达质粒转染的细胞稍微更高。与用亲本质粒pBJ-13C5.5转染的细胞的每培养板平均68个集落相比，当细胞用ARM2rEVE质粒pA2-13C5.5转染时，每培养板平均74个集落(孔)在选择过程中存活。随后使来自各转染的15个稳定转染的克隆经受DHFR-甲氨喋呤(MTX)扩增。扩增之前，乂人ARM2rEVE质粒转染克隆获得的抗-IL-13抗体的平均表达水平比从亲本质粒转染克隆的平均表达水平高两倍。随后，通过2种方案中的任一个扩增抗体表达。使用用于如上文实施例2中所述的DHFR-MTX扩增的基本方案，首先使克隆在20nMMTX的浓度下经受选择，接着进一步在100nMMTX下选择。在另一扩增方案中，直接在100nMMTX下选择克隆，而无中间MTX浓度下的介入选择。下文表16显示，在含有指定水平的扩增(甲氨喋呤"MTX"的浓度)的培养基中的2次继代后，在具有来自各转染之前3个产生的克隆的培养物中的抗-IL-13抗体的平均产生水平。表16.转染的CHO细胞中的人源化抗-IL-13抗体水平表达载体0nMM丁X20nMMTX100nMMTXpBJ-13C5.52.63(ig/ml2.00^g/ml3.04^g/mlpBJ陽13C5.52.63|Lig/mlN.A.1.72pg/mlpA2-13C5.54.35pg/ml5.85^g/ml14.94(ig/mlpA2-13C5.54.35(ig/mlN.A.14.33^g/mlN.A-不适用，不为扩增方案的部分表16中的数据清楚显示，与从携带缺乏ARM2rEVEDNA的亲本表达质粒的转染子获得的表达水平相比，ARM2rEVE将人源化抗-IL-13抗体的表达水平增加大约3倍至5倍。另外，当在100nMMTX的扩增水平下生长时，ARM2rEVE表达质粒转染子的一个次纯是以高达95pg/ml的水平和21.74pg/细胞/天的比生产率表达人源化抗-IL-13抗体。当在MTX选择下生长时，通过用ARM2rEVE表达质粒转染的克隆的抗-IL-13抗体的扩增的表达水平易于维持历时至少3周。实施例9.ARM1和ARM2rEVE多核普酸分子对阿达木单抗在瞬时表达系统中的表达的影响该研究经设计以确定rEVE多核苷酸分子是否将增加重组蛋白在瞬时表达系统中的表达水平。用表达质粒载体pA205、pA205Genomic、pA205Al、pA205A2、pA205A2-Spec-trunc和pA205A2-Swa-trimc转染HEK293细胞。根据公开条件(Durocher等人，iVwc/e,cJc,A尺m.,3(7:E9)用与聚乙烯亚胺复合的质粒DNA转染在Freestyle293表达培养基(GIBCO⑧，Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养的HEK293细胞。不执行用于载体整合的选择。转染后，将细胞培养7天，且如上所述测试培养物上清液的等分试样的阿达木单抗浓度。3次转染的结果显示于表17中。对第3次转染而言，一式三份来测试表达水平。51表17.转染的HEK293细月包中的阿达木单抗的表达水平*转染pA205pA205GenomicpA205AlpA205A2pA205A2-Spe-truncpA205A2-Swa-trunc12.15.45.43.325.320.320.39.934.311.911.910.22.21.24.115.715.72.31.33.014.214.22.31.0*阿达木单抗的(ig/ml表17中的结果显示，当ARM1和ARM2序列单独地(pA205Al、pA205A2)或以组合形式(pA205Genomic)存在于表达质粒载体上时，其可增加阿达木单抗在HEK293细胞中的表达水平。在该HEK293瞬时表达系统中，ARM1赋予比ARM2更大程度的阿达木单抗表达增加。相反，在CHO稳定表达系统中(参见上文实施例3)，ARM2赋予比ARM1更大程度的阿达木单抗表达增加。如在CHO稳定表达系统(上文实施例6)中所见，ARM2的增加效应还在用携带Spel-或Swal-截短ARM2序列的表达质粒载体转染的HEK293细胞中明显降低，包括表达降低至在经pA205对照(无ARM序列)质粒表达载体转染的细胞中所见以下的程度。上文引用的所有专利、申请和公开是以引用的方式并入本文。所明白:且本发明的所有这样的变体和^代性实施例意欲i盖于上述描述和下文的申请专利范围中。5权利要求1.一种分离的重组表达载体元件(rEVE)多核苷酸分子，其包含选自下列的核苷酸碱基序列SEQIDNO1的核苷酸碱基序列、SEQIDNO2的核苷酸碱基序列、与任何前述序列互补的序列、任何前述序列的增加表达部分及其组合。2.根据权利要求1的分离的rEVE多核苷酸分子，其中所述rEVE多核苷酸分子包含选自下列的SEQIDNO:2序列的增加表达部分SEQIDNO:2的碱基462-2422的序列和SEQIDNO:2的碱基1087-2422的序列。3—种重组载体，其包含如权利要求1或2中所描述的rEVE多核苦酸分子。4.根据权利要求3的重组载体，其中所述重组载体为重组表达载体。5.根据权利要求4的重组表达载体，其选自重组质粒表达载体、重组真核病毒表达载体、重组噬菌体表达载体、重组酵母微型染色体表达载体、重组细菌人工染色体表达载体和重组酵母表达质粒载体。6.根据权利要求4的重组表达载体，其中所述重组表达载体包含一个或多个编码一种或多种重组蛋白的功能重组基因。7.根据权利要求6的重组表达载体，其中所述一种或多种重组蛋白选自可溶性蛋白、膜蛋白、结构蛋白、核糖体蛋白、酶、酶原、抗体分子、细胞表面受体蛋白、转录调节蛋白、翻译调节蛋白、染色质蛋白、激素、细胞周期调节蛋白、G蛋白、神经活性肽、免疫调节蛋白、血液组分蛋白、离子门蛋白、热休克蛋白、二氢叶酸还原酶(DHFR)、抗生素抗性蛋白、任一前述蛋白的功能片段、任一前述蛋白的含表位片段及其组合。8.根据权利要求7的重组表达载体，其中所述抗体分子选自抗-TNF-a抗体、抗-EL-选择蛋白抗体、抗-IL-13抗体以及双可变域免疫球蛋白分子。9.根据权利要求8的重组表达载体，其中所述抗-TNF-a抗体为阿达木单抗。10.根据权利要求4-9中任一项的重组表达载体，其中所述重组表达载体包含编码二氢叶酸还原酶的基因的至少一个拷贝。11.一种宿主细胞，其包含根据权利要求3-10中任一项的载体。12.根据权利要求11的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真核宿主细月包或原核宿主细月包。13.根据权利要求12的宿主细胞，其中所述宿主细胞为选自下列的真核宿主细胞哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞、真核藻类宿主细胞、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和鱼类宿主细胞。14.根据权利要求13的真核宿主细胞，其中所述真核宿主细胞为哺乳动物宿主细月包。15.根据权利要求14的哺乳动物宿主细胞，其中所述哺乳动物宿主细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人类胚肾(HEK293)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Hela细胞、人类B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3纟田胞、HEPG2细胞、PerC6细胞和MDCK细胞。16.根据权利要求15的哺乳动物宿主细胞，其中所述哺乳动物宿主细月包为CHO细胞。17.根据权利要求13的真核宿主细胞，其中所述真核宿主细胞为真菌宿主细胞。18.根据权利要求17的真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞选自曲霉属0^perg/〃w)、链孢霉属(AAewm^ora)、酵母菌属(Sacc/zaramycw)、毕赤酵母属(尸/c/na)、汉森酵母属(7/a朋e"w/a)、裂殖酵母属(Sc/n'msacc/^謹少ce力、克鲁维酵母属(《/w"eram少ce力、耶氏酵母属(KaTravWa)和念珠菌属(Ca"t^'t/a)。19.根据权利要求18的酵母菌属宿主细胞，其为酿酒酵母(S.cereWw'—宿主细月包。20.根据权利要求13的真核宿主细胞，其中所述真核宿主细胞为原生动物宿主细^<。21.根据权利要求20的原生动物宿主细胞，其中所述原生动物宿主细胞为蜥蜴利什曼原虫(Le^/zmam'a^reWo/ae)宿主细月包。22.—种制备所关注重组蛋白的方法，所述方法包括转录和翻译存在于根据权利要求4-10中任一项的重组表达载体上的一个或多个编码所关注重组蛋白的基因。23.根据权利要求22的方法，其中所述转录和翻译发生在无细胞的转录/翻译系统中或在宿主细胞中。24.根据权利要求23的方法，其中所述转录和翻译发生在宿主细胞中。25.根据权利要求24的方法，其中所述宿主细胞为CHO宿主细胞。26.—种制备稳定表达高水平所关注重組蛋白的宿主细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求10的重组表达载体插入宿主细胞中，使所述宿主细胞在甲氨喋呤存在下生长，以选择表达该所关注重组蛋白的甲氨喋呤抗性宿主细胞，和分离所述甲氨喋呤抗性宿主细胞，其中所述分离的曱氨喋呤抗性宿主细胞表达该所关注重组蛋白的水平高于甲氨喋呤敏感性宿主细胞，并且其中所述曱氨喋呤抗性宿主细胞在曱氨喋呤存在或不存在下生长时，稳定表达高水平的所述重组蛋白。27.根据权利要求26的方法，其中所述曱氨喋呤是以5nM至10^M范围内的浓度存在。28.根据权利要求26的方法，其中所述宿主细胞为CHO宿主细胞。29.—种用于扩增重组表达载体上编码的所关注重组蛋白在宿主细胞中表达的二氢叶酸还原酶(DHFR)-甲氨喋呤方法，其中所述重组表达载体包含编码该所关注重组蛋白的基因和编码DHFR的基因，其改善在于所述重组表达载体还包含#4居权利要求1或2的rEVE多核苷酸分子，其中含有所述表达载体的宿主细胞在甲氨喋呤存在下生长以选择且产生甲氨喋呤抗性宿主细胞，所述甲氨噪呤抗性宿主细胞在甲氨喋呤存在或不存在下生长时，以扩增水平稳定表达该所关注重组蛋白。30.根据权利要求29的方法，其中所述曱氨喋呤是以5nM至10范围内的浓度存在。31.根据权利要求29的方法，其中所述宿主细胞为CHO宿主细胞。32.—种改善或增强表达重组蛋白的宿主细胞群体适应在甲氨喋呤存在下生长的能力的方法，所述方法包括以下步骤将重组表达载体插入宿主细胞内，所迷重组表达载体包含编码所关注重组蛋白的重组基因，重组表达载体元件(rEVE)多核普酸分子，其包含选自下列的序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:1的一部分、SEQIDNO:2的一部分及其组合，和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因；其中在曱氨喋呤存在下生长时，与携带缺乏所述rEVE多核苷酸分子的相同重组表达载体的宿主细胞群体相比，含有所述重组表达载体的宿主细胞群体具有更高存活性和/或更高生长速率。33.根据权利要求32的方法，其中所迷曱氨喋呤是以5nM至10范围内的浓度存在。34.根据权利要求32的方法，其中所述宿主细胞为CHO宿主细胞。35.—种制备表达高水平重组蛋白的甲氨喋呤抗性宿主细胞的方法，所述方法包括将重组表达载体插入宿主细胞内，所述重组表达载体包含编码所关注重组蛋白的重组基因，重组表达载体元件(rEVE)多核苦酸分子，其包含选自下列的序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:1的一部分、SEQIDNO:2的一部分及其组合，和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因；使所述宿主细胞在甲氨喋呤存在下生长，以选择表达该所关注重组蛋白的甲氨喋呤抗性宿主细胞；和分离所述甲氨喋呤抗性宿主细胞；其中所述分离的曱氨喋呤抗性宿主细胞在甲氨喋呤存在下表达该所关注重组蛋白的水平高于含有缺乏rEVE序列的表达载体的曱氨喋呤抗性宿主细月包。36.根据权利要求35的方法，其中所述甲氨喋呤是以5nM至10pM范围内的浓度存在。37.根据权利要求35的方法，其中所述宿主细胞为CHO宿主细胞。38.—种增加存在于笫一核酸分子中基质附着区(MAR)序列的数量的方法，所述方法包括将第二核酸分子插入所述第一核酸分子中，所述第二核酸分子包含选自下列的核苦酸序列SEQIDNO:1、包含至少一个MAR序列的SEQIDNO:1的一部分、SEQIDNO:2、包含至少一个MAR序列的SEQIDNO:2的一部分及其组合。39.根据权利要求38的方法，其中所述笫一核酸分子选自载体分子、真核细胞染色体、真核病毒基因组、原核细胞染色体、原核病毒基因组、酵母人工染色体和细菌人工染色体。40.根据权利要求39的方法，其中所述第一核酸为载体分子。41.根据权利要求40的方法，其中所述载体分子为重组表达载体分子。42.根据权利要求41的方法，其中所述重组表达载体包含一个或多个功能基因。43.根据权利要求42的方法，其中所述一个或多个功能基因编码一种或多种选自下列的蛋白可溶性蛋白、膜蛋白、结构蛋白、核糖体蛋白、酶、酶原、抗体分子、细胞表面受体蛋白、转录调节蛋白、翻译调节蛋白、染色质蛋白、激素、细胞周期调节蛋白、G蛋白、神经活性肽、免疫调节蛋白、血液组分蛋白、离子门蛋白、热休克蛋白、二氢叶酸还原酶(DHFR)、抗生素抗性蛋白、任一前述蛋白的功能片段、任一前述蛋白的含表位片段及其组合。44.根据权利要求43的方法，其中所述抗体分子选自抗-TNF-a抗体、抗-EL-选择蛋白抗体、抗-IL-13抗体以及双可变域免疫球蛋白分子。45.根据权利要求44的方法，其中所述抗-TNF-a抗体为阿达木单抗。46.—种减少、显著抑制或基本上沉默重组蛋白从表达载体表达的方法，所述方法包括将核酸分子插入包含一个或多个编码一种或多种重组蛋白的重组基因的表达载体中，所述核酸分子包含SEQIDNO:2的石咸基1-461的核苷酸碱基序列或SEQIDNO:2的碱基1-1086的核苷酸碱基序列。47.根据权利要求46的方法，所述方法还包括将所述表达载体插入宿主细胞内。全文摘要本发明描述了包括用于增加重组蛋白表达水平的重组表达载体元件(rEVE)的组合物和方法。本发明还描述了用于减少、显著抑制或基本上沉默重组蛋白表达的其它组合物和方法。文档编号C07H21/04GK101652379SQ200880011023公开日2010年2月17日申请日期2008年3月28日优先权日2007年3月30日发明者G·R·卡森,H·高,W·R·焦恩,Y·Z·库尼斯申请人:艾博特公司