专利名称：具有α-磷酸模拟物的核苷酸的制作方法
技术领域：
技术人员熟知可用作可^r测单元(例如在测序中)的合适的染料或分 子。它们的例子有荧光素、罗丹明、花青苷、部花青、羰花青和偶 氮以及多偶氮化合物，这些例子并不限制本发明的保护范围。
本发明核苷酸的生产
本发明也涉及a-位被修饰的核苷酸的生产方法，其特征在于， 使具有至少一个被保护羟基并位于核苷酸的5'位的三价磷原子与具 有N-N-N-Acc结构的叠氮化物反应，并裂开氮，
其中Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，并且R是任 一种有机取代基。
三价磷的羟基的保护基考虑采用(3-氰乙基、甲基、三烷基曱硅
烷基和烯丙基。
本领域技术人员可从文献中知晓被电子受体取代的叠氮化物。 一些叠氮化物可商业购得或者可通过简单合成反应来制得。Acc-叠氮 化物(诸如酰基叠氮和磺酰叠氮)可用叠氮化钠从酰基氯或磺酰氯制 得，或者用亚硝酸从酰肼制得(综述Brase, S.等，Angewandte Chemie 117 (2005) 5320-5374, 3,4和3.5.2)。
染料磺酰叠氮也可用于例如染色方法(例如DE 196 50 252)。叠 氮化氰可通过使叠氮化钠与溴化氰在乙腈中反应来简单地制得 (McMurry, J.E.等，J. Organic Chemistry 38(16) (1973) 2821-7)。杂芳基 叠氮化物可通过用叠氮化物对离素进行亲核取代来制得或者从杂芳 基肼来制得。前提条件是吸电子的氮处于相对于叠氮基的对位或邻 位，这是因为只有这样才可生成共振稳定的磷酸模拟物。在这方 面，邻位或对位叠氮化N-烷基吡啶徵特别合适。 一些酰基、磺酰基 和吡啶基叠氮化物也可商业购得。
Acc优选选自包括下述基团的群组a) - CN，
b) - S02 - R,
c) 缺电子的六元Nt杂环，其中至少一个氮原子被烷基化并 且处于邻位或对位，并且其中这些杂环可被R任选取代。
在"本发明的核苷酸，，一节中已经详细描述了特别优选的电子受 体Acc。
首先，具有a-磷酸模拟物的单核苦酸总是按照本发明通过该合 成方法来制得。随后，a-磷酸修饰型核普二磷酸和三磷酸可使用现有 技术基本已知的方法来制得。这优选采用酶促法进行。首先，使单 磷酸模拟物与ATP在NMP激酶(诸如腺甘酸激酶)存在下反应，生成 a-磷酸修饰型二磷酸模拟物。在额外步骤中，然后可使该产物与 ATP在肌酸激酶存在下反应，生成相应的a-磷酸修饰型同分异构纯 的(isomerically-pure)三磷酸模拟物。可替代地，该三磷酸可通过与焦 磷酸缩合来化学制备。此方法中生成两种非对映异构体，其可借助 HPLC来分离。
本发明也特别涉及一种方法，其中5，亚磷酰胺核苷与具有下式
结构的叠氮化物反应，
N = N = N - Acc 其中Acc可以是上述的本发明供选方案的电子受体。 正如用于常规寡核苷酸合成的3'亚磷酰胺一样，根据本发明所 使用的5'亚磷酰胺也可商业购得(GlenResearch; 5， CE亚磷酰胺)。它 们-波用于反向寡核苷酸合成(Wagner, T.和Pfleiderer, W., Nucleosides & Nucleotides 16(7-9) (1997) 1657-1660)。而且，这些分子也是制备具 有修饰型ct-磷的单磷酸的合适起始物质。为此，用四唑活化(脱氧)核 糖核苷的5-氰乙基亚磷酰胺并使后者与醇(例如氰乙醇)反应。这导致 生成了膦酸三酯，该膦酸三酯具有结合于核苷的酯和另两个结合于 被保护羟基的酯)。其中一个酯已经存在于亚磷酰胺，其它的酯通过 与醇反应而引入。随后，三价磷中间体与具有N = N = N - Acc结构
13的叠氮化物反应。氮在此过程中被切除作为副产物。羟基的保护基 可通过例如(3-氰乙基、曱基、烯丙基或甲硅烷基来生成，并且随后 通过用例如氨水来切除。
可替代地，膦酸三酯也可直接从核苷通过用二(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺进行亚磷酰化(phosphitylation)来制得(Graham, S.M. 和Pope， S.C.， Organic Letters 1(5) (1999) 733-736)。然后，如上所 述，使所生成的膦酸三酯与叠氮化物和氰乙基保护基反应，然后切 除保护基。然后，可在激酶的酶催化作用下，或者在缩合剂(诸如羰 基二咪唑)的作用下，使所得到的具有修饰型磷的单磷酸与磷酸或焦 磷酸进行反应，生成二磷酸或三磷酸。
可替代地，其它包含三价磷原子的核苷亚磷酸也可用作起始物 质。为此，用 2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧杂磷杂环己烯 (benzodioxaphosphorin)4-酮将被保护的核苷亚磷酰化。随后使其与焦 磷酸反应生成环状三亚磷酸，然后使该环状三亚磷酸与叠氮化物反 应。随后，将所生成的三偏磷酸水解并将保护基切除，从而获得了 a-修饰型三磷酸(Ludwig， J.和Eckstein, F., Journal of Organic Chemistry 54(3) (1989) 631-35)。此方法也可应用于商业可得的固定于CPG的核 苷(WO 03/008432),也可用于制备寡核苷酸三磷酸。作为2-氯-4H-1,3，2-苯并二氧杂磷杂环己烯-4-酮的替代物，也可用氧杂硫代磷杂环 戊》克(oxathiophospholane)进4亍亚石庳酰^匕(Misiura, K.， Szymanowicz， D., Stec, W丄，Organic Letters 7(11) (2005) 2217-2220)。
其它低化合价的磷前体是H-膦酸。这些H-膦酸也可与叠氮化物 反应，生成按照本发明修饰的单磷酸(Zhu, S.Z.等，Chinese Journal of Chemistry 19 (2001) 1259-1262)。
申请的范围
本发明的a-磷酸模拟核苷酸和a-磷酸模拟核苷单磷酸、二磷酸 或三磷酸，相比于现有技术已知的修饰型a-酰胺化物、a-硫代磷酸和a-硼烷磷酸(alpha-branophosphates)而言，具有许多优点。首先，本发 明的结构不是氧化敏感型。与酰胺化物相比，本发明的化合物对于 水解也不敏感，因此在水溶液中更加相当稳定。而且，与硫代磷酸 和硼烷磷酸相比，本发明的化合物适于用可检测单元来标记核香 酸，这是因为借助于具有N-N^N-S02-R结构的叠氮化物，可通 过相对简单的合成方法将几乎任一种可检测单元偶联于任一种核芬 酸。
因此，本发明也涉及本发明的核苦酸三磷酸作为聚合酶催化核 酸合成的底物的应用。
在第一实施方案中，核酸合成是借助RNA聚合酶(诸如T7 RNA 聚合酶或SP6 RNA聚合酶)的体外转录，其中本发明的核糖核苷三 磷酸被掺入新生的RNA。通过这种方法，可生产出大量的可用于分 析目的(诸如阵列杂交)的被标记的RNA。
在第二实施方案中，核酸合成是逆转录酶反应，其中本发明的 脱氧核糖核苷三磷酸被掺入cDNA，该cDNA是借助于RNA依赖性 DNA聚合酶(诸如AMV逆转录酶或具有逆转录活性的热稳定性聚合 酶)合成得到的(例如T.th, Roche Applied Science Cat. No. 11 480 014 001)。用这种方法制得的被标记的cDNA也可用作杂交探针来进行众 多分析应用。
在第三实施方案中，本发明的脱氧核糖核苷三磷酸被掺入DNA 链，该DNA链是借助于DNA依赖性DNA聚合酶(诸如克列诺聚合 酶)新合成的。用这种方法制得的被标记的cDNA也可用作杂交探针 来进行分析应用。
本发明的a-磷酸模拟dNTP也可有利地应用于测序方法中。因 此可经新合成的DNA链标记，作为Sanger测序的部分。
然而，本发明的a-磷酸模拟dATP特别有利于应用于焦磷酸测 序反应。焦磷酸测序原理基于以下事实在将测序引物退火至模板 DNA之后，引物在DNA聚合酶作用下延伸，其中在多个循环中循序地加入四种不同的脱氧核苷三磷酸。在所有情况下由于掺入单磷 酸而作为反应副产物生成的焦磷酸，通过反应级耳关以时间分辨方式
被检测出来。在此过程中，硫酸化酶催化腺普5'磷酸硫酸(adenosine 5， phosphosulphate)与所生成的焦磷酸反应，生成ATP。然后通过焚 光素酶，在所生成的ATP的作用下使荧光素反应生成氧化萤光素， 产生可检测的化学发光信号(US 6,210,891, US 6，258，568)。为了将腺 苷残基掺入新生的DNA，有必要使用dATP类似物，这是因为dATP 与ATP—样是被荧光素酶识别的共同底物(co-substrate),因而不可用 于焦磷酸测序。
然而，现有技术中使用的a-硫代-dATP在室温中相对不稳定， 因此在应用于测序反应方面仅具有有限的适用性。因此，本发明的 主旨特别在于应用本发明的a-磷酸模拟三磷酸腺苷作为焦磷酸测序 反应中的底物。已经证明其中受体对位阻方面的要求较低的实施方 案特别适用于这一目的。氰基和曱磺酰基特别适合作为受体。
在位阻要求较高的残基的情况下，聚合酶可通过例如CSR手段 来改良从而使其适于底物(Ghadessy， F丄和Holliger, P., Methods in Molecular Biology 352 (2007) 237-248 (Protein Engineering Protocols (蛋白质工程方案))，(Totowa, NJ, United States), Compartmentalized self-replication: a novel method for the directed evolution of polymerases and other enzymes (区室化自我复制聚合酶和其它酶的定向进化的 新方法))。由于在a-磷酸上可引入任一种残基，因此允许酶促合成高 度多样性的适体。
本发明的三磷酸也可借助末端转移酶用于酶促标记寡核苷酸。 如果在所有情况下二脱氧A、 G、 C、 T的a-磷酸被标记上不同染 料，那么这种三磷酸酯，类似于先前的碱基-标记三磷酸，也可用于 所谓的染料终止测序。
通过以下实施例和出版物进一步阐述本发明，本发明的保护范 围来自发明的权利要求书。所描述的方法应理解为示例，其即使在改进之后仍描述本发明的主题。 实施例1
2，-脱氧胸苷单氰亚氨基单磷酸(2，-deoxythymidine monocyaniminomonophosphate)
在氩气气氛下将370 mg (0.5 mmol) 3，-二曱氧基三苯曱基 (dimethoxytriyl)-2，-脱氧胸普、5'-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰 胺(GlenResearch)溶解于2.5 ml无水乙腈，然后连续地依次添加2.2 ml的0.45 M四唑的乙腈溶液(Fluka)和150 |il (1.5 mmol) 3-轻基丙 腈。在室温下搅拌反应混合物20分钟，然后加入1.56 ml的0.32 M 叠氮化氰的乙腈溶液(叠氮化氰根据McMmry， J.E.等，J. Organic Chemistry 38(16) (1973) 2821-7中所述方法来制备)。在30分钟后用 乙酸乙酯稀释此溶液，然后用水振荡出来(shake out)。用硫酸钠干燥 有机相并且在旋转蒸发器中蒸发溶剂。向残留物中加入8 ml 7 N的 氨的甲醇溶液，并使其在室温下在密封容器中静置5小时。去除溶 剂，向残留物添加水，然后也去除水。将油状残留物溶解于40 ml 的80 %醋酸溶液，然后在室温下搅拌15 min。在旋转蒸发器中去除 醋酸。将残留物溶解于10 ml的37 %氨水中，其后去除氨并且通过 DEAE Sephadex A25阴离子交换柱(洗脱液梯度在U0分钟内，从 0.1 M醋S吏铵溶液pH=7至1 M醋酸铵溶液pH巧)纯化产物。Mass (ESI) M/e 347.1 (Cl 1H15N407P计算值345.2), 1H雨R (D20， ppm) 7.76 (s， 1H), 6.34 (t, 1H), 4.42 (m, 1H), 4.16 (m, 1H), 4.04 (m, 2H), 2.36 (m, 2H), 1.94 (s, 3H)， 31P應R (D20, ppm) 1.5。
实施例2
2，-脱氧胸苷单氰亚氨基三磷酸(酶促合成)
将2 mg 2，-脱氧胸苷单氰亚氨基单磷酸溶解于lml水中，然后加 入4mg磷酸肌酸x 4 H20、 lmg醋酸镁x 4 H20和O.Olmg ATP。用 稀氢氧化钠将pH调至7.3，随后加入lmg从野兔肌肉获得的肌酸磷酸激酶(EC2.7.3.2)(185U/mg))和lmg dTMP激酶(EC 2.7.4.9)(32 U/mg)。在37。C下将它们全部细心搅拌。在1小时后在65。C下使酶 变性15分钟，将溶液过滤并通过DEAE Sephadex A25阴离子交换柱 (洗脱液梯度在120分钟内，从0.01 M醋酸铵溶液pH=7至1 M醋 酸铵溶液pH二7)进行纯化。Mass (ESI) M/e 504.18 (C11H17N4013P3 计算值506.2), 1H丽R (D20, ppm) 7.73 (s, 1H)， 6.34 (t, 1H), 4.72 (m, 1H)， 4.21 (m， 3H), 2.37 (m, 2H), 1.92 (s， 3H)。
实施例3
2，-脱氧胸苷单-(4-乙酰氨基笨晴酰基)亚氨基三磷酸(化学合成)
在氩气气氛、0。C下，将溶解于1.8ml 二甲基曱酰胺的200 mg (0.99 mmol) 2-氯-l，3，2-苯并-二氧杂磷杂环己烯-4-酮(Aldrich)和150jil 嘧咬加入240 mg (0.5 mmol) 2，-脱氧-3，-叔丁基二笨基曱硅烷基-胸 苷。在0。C下搅拌溶液5分钟，接着在室温下搅拌30分钟，随后加 入2 ml的0.7 M 二(三丁基铵)-焦磷酸的二曱基曱酰胺溶液和280 pl 三乙胺的混合物。在1小时后在室温下加入360 mg (1.5 mmo)对乙 酰氨基苯磺酰叠氮，并在室温下再搅拌1小时。向反应混合物中加 入5ml水并搅拌15分钟。在旋转蒸发器中去除溶剂，使残留物溶于 乙酸乙酯，然后用水萃取。去除水相中的水并将残留物悬浮于四氢 吹喃中，然后加入4 ml的1 M氟化四丁基铵的四氢呋喃溶液，并在 室温下搅拌2小时。去除溶剂并且通过DEAE Sephadex A25阴离子 交换柱(洗脱液梯度在120分钟内，从0.1 M醋酸铵溶液pH=7至 1 M醋酸铵溶液pH=7)纯化产物。Mass (ESI) M/e 678.0 (C18H25N4016P3S计算值678.4)。
实施例4
延伸试验
按照标准方法，使10 pi的2.5juM 39聚体的模板脱氧寡核苷酸
18以及5^1的5 |iM 20聚体的引物脱氧寡核苦酸(该引物脱氧寡核苦酸 与模板寡核苷酸的3，末端互补)彼此杂交，以便产生部分双链的DNA 分子。
然后，加入20 (il的lmM 2，-脱氧腺苷a单氰亚氨基三磷酸钠 盐、10 pi ThermoPol反应緩冲液BioLabs (M0257S)和0.5 pi (2U/|il) Vent (exo》DNA聚合酶BioLabs (M0257S)。将其在55。C下保温20 min。
随后，样品通过Vivaspin 500 - 10.000 MWCO凝胶过滤旋转柱 进行纯化，并通过Vivaspin 500 - 5.000 MWCO凝胶过滤旋转柱进行 脱盐。
对于延伸了的引物脱氧寡核苷酸，质谱分析揭示分子量为(ESI) M/e7403，对应于计算值7401，9。
权利要求
1.具有下述结构的核苷酸其中B是天然核碱、修饰型核碱或核碱类似物，S是糖单元，Y是单磷酸或二磷酸，其特征在于，α-磷酸的氧原子被-N-Acc取代，其中Acc是选自于包括下述基团的群组的电子受体a)-CN，b)-SO2-R’，其中R’包含至少一个氨基取代的烷基、任选被取代的芳基或任选被取代的杂环，c)以及选自于包括吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓的群组的缺电子的6元N+-杂环。
2. 权利要求1的核苷酸，其特征在于，R或R，包含可检测单元或官能团。
3. 权利要求1-2的核苷酸，其特征在于，糖单元是核糖、脱氧核糖或二脱氧核糖。
4. 权利要求4的核苷酸，其中，3'位选自于包括H、 OH、保护基、可检测标记、单核苷酸、多核苷酸或固相的群组。
5. a位被修饰的核苷酸的生产方法，其特征在于，使位于核苷酸的5，位并具有至少一个被保护羟基的三价磷原子与具有N = N = N - Acc结构的叠氮化物反应，其中Acc是选自于包含下述基团的群组的电子受体a) <formula>formula see original document page 3</formula>b) 以及选自包含吡啶输、嘧啶输和喹啉输的群组的缺电子的6元N+-杂环。
6. 权利要求5的方法，其特征在于，5，亚磷酰胺核苷与具有N=N = N - Acc结构的叠氮化物进行反应。
7. 权利要求'1-4的核苷酸的应用，其是用作聚合酶催化核酸合成的底物的应用。
8. 权利要求7的应用，其是用于合成修饰型核酸的应用。
9. 权利要求8的应用，其是用作焦磷酸测序反应中的底物的应
全文摘要
本发明涉及修饰型核苷酸及它们的生产方法，其中这些核苷酸包含P＝N-Acc结构至少一次，其中Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，并且R是任一种有机取代基。
文档编号C07H19/10GK101663313SQ200880012629
公开日2010年3月3日 申请日期2008年4月16日 优先权日2007年4月18日
发明者D·海因德尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司