专利名称：通过树突细胞凝集素样氧化型ldl受体-1(lox-1)激活人抗原呈递细胞的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及免疫细胞活化领域，更具体而言，涉及用于通过 LOX-l受体激活免疫细胞的组合物和方法。
背景技术：
不限制本发明的范围，对与树突细胞活化相关的背景进行描述。 树突细胞通过提供可溶性的细胞间信号然后病原体识别而在控制先天 性和获得性免疫之间的界面中起关键作用。树突细胞的这些功能极大地依赖 于特定的表面受体"模式识别受体"(PRR),最显著的代表为toll样受体(TLR) 和C型凝集素或凝集素样受体(LLR)的表达(2-4)。
在当前模式中，TLR的主要作用是提醒DC产生白细胞介素12 (IL-12) 和其他炎症性细胞因子以起始免疫应答。C型LLR作为巨噬细胞和树突细 胞中强大的抗原捕获和摄取机制的组成部分起作用(2)。然而，与TLR相比， LLR可能具有更为广阔的生物学功能，包括细胞迁移(5)和细胞间相互作用 (6)。 LLR具有这些多重功能可能是由于不同于TLR， LLR能够识别自身和 非自身的事实。LLR的复杂性，包括在免疫细胞中表达大量LLR的冗余性， 这些已经成为了解各个LLR的详细功能的主要障碍之一。此外，大部分这 些受体的天然配体仍然未被确定。虽然如此，最近研究的证据表明，在微生 物感染过程中，LLR与TLR协作，对激活免疫细胞产生作用(7-15)。
发明概述
本发明包括用于靶向和使用抗人LOX-l单克隆抗体(mAb)的新的组合 物和方法，并表征了其生物学功能。证明所述抗LOX-l mAb及其片段对于 靶向、表征和活化免疫细胞是有用的。本发明的发明人认识到，尽管LOX-l 能够指导替代抗原内在化入人DC中，但是本发明鉴定并使用LOX-l的新生 物活性以在免疫系统中产生特别期望的变化， 一些改变在抗原4聂取(例如接 种疫苗)方面，其他通过LOX-l效应器的独特作用(单独或与其他免疫调节分 子一起)，该效应器能够通过DC、 B细胞、单核细胞上的该受体引发信号传 导。本发明公开了开发能够活化具有LOX-l的细胞的独特试剂(agent)的方法，以及在接受这些信号的细胞中产生的变化关于对免疫系统中其他细胞的 作用的影响。这些影响[单独或与其他信号一起(即共刺激)]对于某些疾病状 态的治疗结果或对于增强疫苗相关的保护性结果是高度预测的。
LOX-l最初作为内皮细胞上的氧化型低密度脂蛋白(OxLDL)受体被鉴 定，其与动脉粥样硬化的关系已被广泛研究。OxLDL介导的内皮活化、功 能异常和损伤在动脉粥样硬化的非常早期阶段的发展中起重要作用。已报道 LOX-l介导OxLDL信号传导，诱导活性氧物质产生，NF-kB活化介导的内 皮素-1、 MCP-1和粘附分子的表达上调以及细胞凋亡。虽然LOX-l被分类 为D型清道夫受体，但是已经表明，OxLDL通过巨噬细胞的胞吞作用，导 致泡沫细胞形成，主要由其他清道夫受体介导。已报道LOX-l能内化入细 胞凋亡/衰老细胞。LOX-l也能识别细菌成分。已在未成熟髓样DC以及单 核细胞衍生的DC、单核细胞、巨噬细胞和B细胞中观察到LOX-l的表达。
DC能交叉呈递蛋白抗原(Rock KL Immunol Rev. 2005 Oct; 207: 166-83)。 在体内，DC通过大量的受体摄取抗原，并呈递I类和II类两类抗原肽。具 体而言，LOX-l是"模式识别"受体，其有效:慑取抗原并交叉呈递抗原肽 (Delneste Y Immunity 2002 17:353)。实际上，在小鼠才莫型中，与抗LOX-l 结合的抗原足以诱导针对攻击肿瘤的免疫应答。然而，仅通过LOX-l (l)不 能观察到细菌成分的活化，已表明共定位的TLR2负责活化信号传导。在 LOX-l中，已知胞质酪氨酸残基和跨膜阳离子氨基酸均不具有信号传导功 能。 '
本发明包括用于增加LOX-l表达性抗原呈递细胞抗原呈递效力的组合 物和方法，包括分离能激活抗原呈递细胞的LOX-l特异性抗体或其片l^, 和使所述抗原呈递细胞与抗LOX-l特异性抗体或其片段接触，其中所述抗 原呈递细胞被活化。所述抗原呈递细胞可以是分离的树突细胞、外周血单核 细胞、单核细胞、髓样树突细胞及其组合。所述抗原呈递细胞可以是已在体 外与GM-CSF和IL-4、干扰素a、抗原及其组合一起培养的分离的树突细胞、 外周血单核细胞、单核细胞、B细胞、髓样树突细胞及其组合。所述方法还 可包括与GM-CSF和IL-4或干扰素a接触抗原呈递细胞活化的步骤，其中 与LOX-l特异性抗体或其片段接触增加抗原呈递细胞上的CD86和HLA-DR 的表面表达。例如，所述抗原呈递细胞可以是树突细胞，所述树突细胞已与 LOX-l特异性抗体或其片段、GM-CSF和IL-4或干扰素a接触以活化该树 突细胞，其中活化的树突细胞增加CD86、 CD80和HLA-DR的表面表达。 在另一个实例中，所述抗原呈递细胞可以是树突细胞，所述树突细胞已与 LOX-l特异性抗体或其片段、GM-CSF和IL-4或干扰素a接触以活化该树 突细胞，其中活化的树突细胞增加IL-12p40、 MCP-1、 IL-8、 TNFa、 IL-6、MIP-la和IL-lb及其组合的分泌，和/或可增加其与通过CD40信号传导有关 的活化。还已发现，所述抗原呈递细胞包括树突细胞，所述树突细胞已与 GM-CSF和IL-4或千扰素a接触，且LOX-l特异性抗体或其片段增加了树 突细胞的共刺激活性。在暴露于本发明的LOX-l特异性抗体或其片段时表 达谱(expressionprofile)改变的基因的特定实例包括图4中所示的一个或多个 基因。LOX-l特异性抗体或其片段的非限制性实例可选自克隆9D7-10-4、 8B4-10-2、 11C8-B7、 13B11-A8及其组合。LOX-l特异性抗体或其片段通过 LOX-l活化的树突细胞能够激活B细胞、T细胞及其组合。
本发明还包括重组抗体(rAb),其中LOX-l特异性抗体或其片段与 Cohesin/Dockerin对的一半结合。作为rAb —部分的LOX-l特异性抗体或其 片段可与Cohesin/Dockerin对的一半结合，该对的另一半可与一种或多种细 胞因子结合，所述细胞因子选自白细胞介素，转化生长因子(TGF)，成纤维 细胞生长因子(FGF),血小板衍生生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF),结 締组织活性肽(CTAP),成骨因子，以及这些生长因子的生物活性类似物、片 段和衍生物，B/T细胞分化因子，B/T细胞生长因子，促有丝分裂细胞因子， 趋化细胞因子和趋化因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-a, IFN-(3, IFN画y, IL1， IL2， IL3， IL4， IL5, IL6, IL7, IL8， IL9, ILIO， IL11, IL12, IL13, IL14, IL15， IL16, IL17, IL18等，瘦素(leptin),肌肉生长抑制素 (myostatin)，巨噬细胞刺激蛋白，血小板衍生生长因子，TNF-a， TNF-(3, NGF， CD40L, CD137L/4-lBBL，人淋巴毒素-p, G-CSF， M画CSF， GM-CSF, PDGF, IL-la， ILl-(3， IP-10, PF4， GRO， 9E3,促红细胞生成素，内皮抑 素(endostatin),血管抑素(angiostatin), VEGF,包括卩转化生长因子(例如 TGF-卩1、 TGF-卩2、 TGF-(33)在内的转化生长因子(TGF)超基因家族；骨形态 发生蛋白(例如BMP隱1、 BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP隱6、 BMP-7、 BMP-8、 BMP-9);肝素结合生长因子(成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长 因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF));抑制 素(例如抑制素A、抑制素B);生长分化因子(例如GDF-1);以及活化素(例 如活化素A、活化素B、活化素AB)。
本发明还包括表达LOX-l特异性抗体或其片段的杂交瘤，其中所述 LOX-l特异性抗体或其片段激活抗原呈递细胞以表达新的表面标记物、分泌 一种或多种细胞因子或表达新的表面标记物和分泌一种或多种细胞因子两 者。杂交瘤的非限制性实例包括克隆9D7-10-4、8B4-10-2、11C8-B7、13B11-A8 及其组合。
本发明还包括通过在抗原存在下用LOX-l特异性抗体或其片段触发树 突细胞上的LOX-l受体来增强B细胞免疫应答的方法，其中已与LOX-l活化的树突细胞接触的B细胞增加抗体产生、分泌细胞因子、增加B细胞活化表面标记物表达及其组合。使用本发明活化的B细胞可分泌IL-8、MIP-la、 IL-6、 TNFa及其组合，可以是浆细胞，活化B细胞以表达LOX-l,和/或触 发B细胞以增加IgG、 IgM、 IgA及其组合的产生。在另一种方法中，本发明包括通过用LOX-l特异性抗体或其片段触发B 细胞上的LOX-l受体来增强B细胞免疫应答，其中所述B细胞增加抗体产 生，分泌IL-8、 MIP-la、 IL-6、 TNFa及其组合，和/或增加IgG、 IgM、 IgA 及其组合的产生。本发明还包括通过用LOX-l特异性抗体或其片段触发树突细胞上的 LOX-l受体，并使T细胞与该LOX-l活化的树突细胞接触来增强T细胞活 化的方法，其中T细胞的活化被增强。所述树突细胞可与GM-CSF和IL-4、 干扰素a、抗原及其组合接触，并引起CD8十T细胞的活化。在一个实施方 案中，T细胞暴露于用抗LOX-l抗体或其片段活化的树突细胞时增殖。本发明还包括由哺乳动物细胞分泌的抗LOX-l免疫球蛋白或其部分和 与该免疫球蛋白结合的抗原，其中所述免疫5求蛋白耙向所述抗原至抗原呈递 细胞。该免疫球蛋白可包含一个或多个抗原特异性结构域，所述结构域选自 全长抗体、抗体可变区结构域、Fab片^:、 Fab，片革史、F(ab)2片段、和Fv片 段，以及Fabc片段和/或具有部分Fc结构域的Fab片段。该抗体或其片段可 用于生产疫苗，该疫苗包含用LOX-l特异性抗体或其片段活化的树突细胞。本发明还包括单独或与共激活剂一起结合(engage)免疫细胞上的LOX-l 受体，组合活化抗原呈递细胞的试剂用于治疗性应用的用途；免疫细胞上的 LOX-l结合剂用于制备疫苗的用途，所述LOX-l结合剂与或不与激活剂一 起与一个或多个抗原连接；抗LOX-l剂作为免疫细胞共激活剂用于增强通 过免疫细胞上表达的除LOX-l外的细胞表面受体引起的免疫应答的用途； 能够通过LOX-l受体结合并活化免疫细胞的抗LOX-l抗体V区序列的用途 和/或与一种或多种毒性剂连接的DC-LOX-l结合剂用于在已知或怀疑由经病理(pathogenic)细胞或组织的情况下的治疗性目的的用途。本发明还包括模块式rAb载体，其包含LOX-l特异性抗体结合结构域， 该结合结构域与一个或多个包含cohesin-dockerin结合对的一半的抗原载体 结构域连接。rAb的抗原特异性结合结构域包含抗体的至少一部分，例如， 抗原特异性结合结构域可以包含与cohesin-dockerin结合对的一半构成融合 蛋白的抗体的至少一部分。所述rAb可包含与抗原结合的cohesin-dockerin 结合对的互补性一半(complementary half)，其中该抗原与模块式rAb载体形 成复合物，或与抗原构成融合蛋白的cohesin-dockerin结合对的互补性一半。该抗原特异性结合域可以是全长抗体、抗体可变区结构域、Fab片段、Fab， 片段、F(ab)2片段、和Fv片段，以及Fabc片段和/或具有部分Fc结构域的 Fab片段。附图的简^^说明为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在参考发明详述以及附图， 在附图中
图1A、 1B和1C:体内和体外培养的DC均表达LOX-l。图1A:来自 正常供体的PBMC用抗CDllc、 CD14、 CD19和CD3以及抗LOX-l mAb 染色。对用各个抗体染色的细胞作门用于测量LOX-l的表达水平。图1B: 在GM-CSF与IL-4 (IL-4DC)或IFNa (IFNDC)存在下培养来自正常供体的单 核细胞，细胞用抗LOX-l mAb染色。髓样DC (Lin-HLA-DR+CD1 lc+CD123-) 通过FACS分选仪从血中纯化，并用抗LOX-l mAb染色。图1C显示在溶液中捕获LOX-l胞外结构域的结合等级次序 15C4〉10F9〉1G6》商购的抗LOX画l。 15C4-10画l是15C4.1来自最初15C4杂 交瘤的两个亚克隆的两个独立的抗体制备物。图2A和2B显示抗LOX-l mAb激活DC。将IFNDC在包净皮有不同克隆 的mAb的培养板中培养18小时。图2A:细胞用抗CD86染色。图2B:分 析培养物上清液，通过Luminex测定细胞因子和趋化因子。图3A和3B显示抗LOX-l mAb激活DC。图3A:用抗L0X-1刺激IL-4DC 24小时，随后细胞用抗CD86和HLA-DR染色。图3B:髓样DC通过FACS 分选从血中纯化，细胞用抗CD-86、 CD80和HLA-DR染色。图4显示基因表达谱，用抗L0X-1或对照mAb刺激IL-4DC 10小时。 用RNeasy柱(Qiagen)提取总RNA,用2100生物分析器(Agilent)分析。使用 Illumina totalprep标记试剂盒(Ambion)制备生物素标记的cRNA草巴标，杂交 至Sentrix Human6 BeadChips (46K转录物)上。这些微阵列由50mer寡核香 酸探针组成，该寡核苷酸探针附着于位于在硅片表面上蚀刻的微孔内的3um 珠上。用链霉抗生物素-Cy3染色后，用Illumina制造的亚微米分辨扫描仪 (Beadstation 500X)对阵列表面成像。使用基因表达分析软件程序GeneSpring, 7.1版本(Agilent)进行数据分析。图5A和5B显示用抗LOX-l活化的DC产生的细胞因子和趋化因子的 量增加。体外培养的IL-4DC和纯化的mDC(lxl05/200ul)，分别如图1A和 1B所示，在包被有抗LOX-l mAb(2ug/孑L)的平板中孵育18小时。分析培养 物上清液，通过Luminex测定细胞因子和趋化因子。图6A和6B显示抗LOX-l抗体和CD40配体协同激活DC。在可溶性 CD40L (20 ng/ml)存在或不存在下，在包被有抗L0X-1的96孔板中培养 IL-4DC (2xl05/200 ul/孔)18小时。还测试了对照mAb。 18小时后，细胞用 抗-CD83染色，分析培养物上清液，并通过Luminex测定细胞因子和趋化因子。图7A至7F显示在DC上表达的L0X-1有助于增强体液免疫应答。将 6天GM/IL-4 DC, 5xl0V孔，在包^皮有抗L0X-1或对照mAb的96孔板中培 养16-18小时，随后与用CFSE染色的lx105自体CD19+B细胞在20单位/ml IL-2和50 nM CpG的存在下共培养。图7A显示第6天用荧光标记的抗体染 色的细胞的染色。作门除去(gateout)CD3+和7-AAD+细胞。通过FACS分选 仪纯化CD38+和CFSE-细胞，并进行吉姆萨染色。图7B显示通过夹心ELISA 分^f第13天的培养物上清液的总IgM。图7C显示用5moi热灭活的流感病 毒(PR8)脉冲刺激，并与B细胞培养的DC。在第13天分析培养物上清液的 流感病毒特异性免疫球蛋白(Ig)。图7D显示在mAb包被的平板中在含50 nM CpG(下组)或不含(上组)下培养的来自血沉棕黄层的CFSE标记的5xl05 PBMC的结果。第7天用抗CD38染色细胞。作门除去CD3+和7-AAD+细胞。 图7E显示在第13天通过ELISA分析来自PBMC培养物的培养物上清液测 定总Ig。图7F是6天GM/IL-4 DC在mAb包被的平4反中培养48小时的结 果，APRIL的表达水平通过细胞的胞内染色测定。虚线是用对照抗体染色的 细胞。细和粗线分别代表在包被抗LOX-l或对照mAb的平板中孵育的细胞。 数据是每次使用来自3个不同正常供体的细胞进行的两个单独实验的代表。图8A到8C显示在B细胞上表达的LOX-l有助于B细胞活化和生产免 疫球蛋白。图8A显示来自血沉棕黄层的PBMC用抗CD19、抗CD3和抗 LOX-l或对照mAb染色。对CD19+细胞作门，通过流式细胞4义测定CD19+ B 细胞上的分子表达水平。图8B显示在包被mAb的平板中培养CD19+ B细 胞16-18小时，随后通过Luminex分析培养物上清液的细胞因子和趋化因子。 图8C显示lx105 CD19+ B细胞在包被有mAb的平板中培养13天。通过 ELISA测定总Ig水平。数据是使用来自3个不同正常供体的细胞进行的两 个单独实验的代表。图9A到图9D显示在DC上表达的LOX-l有助于增强细胞免疫应答。 图9A显示了 5xl03 6天GM/IL-4 DC在包被有抗LOX-l或对照mAb的平板 中培养16-18小时，随后与纯化的同种异源T细胞共培养。细胞用3[司脱氧 胸腺嘧啶核苦l uCi/孔脉冲18小时后收集。通过(3计数器测量s[H]-脱氧胸 腺嘧咬核香的吸收。图9B和9C显示在20 uM Mart-肽(A)或27 ug/ml Mart-l 重组融合蛋白(B)存在下，6天GM/IL-4 DC (5xl0"孔)在包被mAb的平板中孵育16小时。与2xl(^纯化的自体CD8T细胞共培养10天。在第2天，向 培养物中加入20单位/ml IL-2和10单位/ml IL-7。细胞用抗CD8和Mart-l 四聚体染色。图9C显示来自血沉椋黄层的5xl05PBMC,其在用mAb包被 的平板中与0.1 uM Flu Ml肽培养一周。细胞用抗CD8和Mart-l四聚体染色。 D.将IL- 4DC与10或1 nM抗LOX-l -Flu Ml或对照Ig-FIu Ml融合蛋白混 合2小时，与2xl04屯化的自体CD8T细胞共培养7天。细胞用抗CD8和 Flu Ml特异性四聚体染色。图IO显示来自非人灵长类(食蟹猴)的PBMC用抗L0X-1 mAb和细胞表 面标记物的抗体染色。图11显示典型rAb.抗原融合蛋白的还原型SDS-PAGE分析，所述蛋白 包括抗LOX-U5C4.PSA,其能指导前列腺特异性抗原(加亮的灰色)至抗原 呈递细胞的表面，用于针对前列腺癌的疫苗接种。图12显示抗LOX-l.Doc:Coh.Flu Ml复合物将Flu Ml递送至用LOX-l cDNA转染的CHO细胞表面。1 ug/ml (红点)的抗LOX-l.Doc rAb或对照 hlgG4.Doc rAb (绿点)与生物素化的Coh.Flu Ml (2 ug/ml)于室温下一起孵育 l小时，加入转染的CHO细胞，继续在冰上孵育20分钟。随后洗涤细胞， 用PE标记的链霉抗生物素染色。细胞随后进行PE焚光分析(X轴为强度)。 抗LOX-l.Doc复合物对未转染的CHO细胞数做图显示为黄色。图13显示人扁桃体切片的抗LOX-l mAb染色。染色为红色的细胞是生 发中心周围区域中的特定的含LOX-l细胞群。该组织和抗LOX-l mAb染色明开发^]于例如抗原乾向的mAb i特异性的，以及具有LOX-l的;田胞在体 内存在-是治疗性抗LOX-l剂的现成耙标。图14A和14B显示通过用抗LOX-l mAb活化的DC的B细胞的粘膜归果。图15显示抗LOX-l mAb有助于提高IgAl和IgA2的产生。图18显示抗LOX-l疫苗能引起DC亚型特异性的免疫应答。图19显示抗LOX-l抗体对短尾猴LOX-l的交叉反应性。图20显示来自短尾猴的4个序列变体(5U1-5U4)与人LOX-1的Clustal W比对。图21A至21D显示通过LOX-l递送的抗原导致抗原特异性的CD4 T细 胞应答。发明详述尽管以下详细讨论本发明的不同实施方案的制备及使用，但是应该理解 本发明提供了许多可以在多种特定情况下具体实施的可应用的发明构思。本 文讨论的特定实施方案仅仅是说明制备和使用本发明的特定方法，而不限定 本发明的范围。为便于理解本发明，许多术语定义如下。本文定义的术语具有与本发明 相关的领域中的普通技术人员通常理解的含义。术语诸如"一个"、"一种"、" 该"等不意欲仅仅指单数实体，而是包括其中特定实例可以用于例证的总的 类别。本文术语用于描述本发明的特定实施方案，但是它们的用法并不限制 本发明，除非在权利要求中概述的。如本文所用，术语"模块式rAb载体"用于描述重组抗体系统，该系统被 工程化以提供不同的抗原、活化蛋白质或其它抗体以受控的模块式方式加入 单一重组单克隆抗体(mAb),在本案中，抗LOX-l单克隆抗体。rAb可以是 使用标准杂交瘤技术、重组抗体展示、人源化单克隆抗体等制备的单克隆抗 体。模块式rAb载体可用于，例如，(通过一种针对例如人树突细胞受体的 内在化受体的原发重组抗体)靶向多个抗原和/或抗原与活化的细胞因子至树 突细胞(DC)。模块式rAb载体还可以用于以受控且确定的方式首尾相连地连 才妾两种不同的重组mAb。"模块式rAb载体"的抗原结合部分可以是一种或多种可变结构域、 一种 或多种可变结构域与第一恒定结构域，Fab片段、Fab'片段、F(ab)2片^殳和 Fv片段，以及Fabc片段和/或具有部分Fc结构域的Fab片段，同源的模块 式结合部分添加到氨基酸序列和/或与其结合。模块式rAb载体中使用的抗 体可以是任何同型或类别、亚类或者来自任何来源(动物和/或重组体)。在一个非限制性实施例中，模块式rAb载体被工程化为具有一种或多种 模块式cohesin-dockerin蛋白质结构域，用于制备在工程化的重组mAb情况 下的特异且明确的蛋白质复合物。mAb是包括一种或多种来自mAb的抗原 结合结构域的模块式cohesin-dockerin蛋白质结构域羧基的融合蛋白的一部 分。cohesin-dockerin蛋白质结构域甚至可以在翻译后，例如使用化学交联剂 和/或二硫键连接。本文使用的术语"抗原"指的是可以在该抗原的接受者中启动体液和/或 细胞免疫应答的分子。抗原可以用于本发明的两种不同情况中作为抗体或 rAb的其它抗原识别结构域的靶标或者作为分子，该分子通过模块式rAb载 体的dockerin/cohesin-分子补体的一部分的rAb运送到和/或进入细月包或輩巴 标。抗原通常是引起疾病的试剂，对于该疾病，疫苗接种可能是有益的治疗。 当抗原被呈递在MHC上时，该肽通常是约8到约25个氨基酸。抗原包括任 何类型的生物分子，包括，例如，筒单的中间代谢物、糖、脂质和激素以及大分子诸如复合碳水化合物、磷脂、核酸和蛋白质。抗原的常见种类包括但 不限于病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，原生动物及其他寄生虫抗原，肿瘤 抗原，自身免疫性疾病、过敏症和移植排斥中涉及的抗原，及其他各种抗原。
模块式rAb载体能够运载许多活化剂，例如抗生素、抗感染药、抗病毒
药、抗胂瘤药、解热药、镇痛药、抗炎药、骨质疏松症的治疗剂、酶、细胞 因子、抗凝血药、多糖、胶原、细胞及两种或更多前述活化剂的组合。使用 本发明递送的抗生素的实例无限制地包括四环素、氨基糖苷类、青霉素、头 孢菌素、磺胺类药物、氯霉素琥珀酸钠、红霉素、万古霉素、林可霉素、克
林霉素、制霉菌素、两性霉素B、金刚烷胺、碘苷、对氨基水杨酸、异烟肼、 利福平、放线菌素D、光辉霉素、道i若霉素、阿霉素、博来霉素、长春^^、 长春新碱、曱基千肼、咪唑曱酰胺等等。
使用本发明递送的抗肿瘤药的实例无限制地包括阿霉素、柔红菌素、紫 杉醇、氨曱喋呤等等。解热药和镇痛药的实例包括阿司匹林、美林(Motrin⑧) 布洛芬(Ibuprofen⑧)、萘普生、醋氨酚等等。
使用本发明递送的抗炎药的实例无限制地包括NSAIDS、阿司匹林、甾 族化合物、地塞米松、氢化可的松、泼尼爭>龙、双氯芬酸钠等等。
使用本发明递送的治疗骨质疏松症的治疗剂和作用于骨和骨骼的其它 因子的实例无限制地包括钩，阿仑膦酸盐，骨GLa肽，曱状旁腺激素及其活 性片段，组蛋白H4相关骨形成和增殖肽及其突变体、衍生物和类似物。
使用本发明递送的酶和酶辅因子的实例无限制地包括胰酶(pancrease)、 L-天冬酰胺酶、透明质酸酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、tPA、链激酶、尿 激酶、胰酶制剂、胶原酶、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、血纤维蛋白溶酶 原、链激酶、腺苷酸环化酶、过氧化物歧化酶(SOD)等等。
使用本发明递送的细胞因子的实例无限制地包括白细胞介素，转化生长 因子(TGF),成纤维细胞生长因子(FGF),血小板衍生生长因子(PDGF),表皮 生长因子(EGF),结締组织活化肽(CTAP)，成骨因子及这些生长因子的生物 活性类似物、片段和衍生物。细胞因子可以是B/T细胞分化因子、B/T细胞 生长因子、促有丝分裂细胞因子、趋化细胞因子、集落刺激因子、血管生成 因子、IFN-a、 IFN-卩、IFN画y、 IL1 、 IL2、 IL3、 IL4、 IL5、 IL6、 IL7、 IL8、 IL9、 ILIO、 ILll、 IL12、 IL13、 IL14、 IL15、 IL16、 IL17、 IL18等、瘦素、 肌肉生长抑制素、巨噬细胞刺激蛋白、血小板衍生生长因子、TNF-a、 TNF-卩、 NGF、 CD40L、 CD137L/4画1BBL、人淋巴毒素画卩、G隱CSF、 M-CSF、 GM-CSF、 PDGF、 IL-la、 ILl-卩、IP-IO、 PF4、 GRO、 9E3、促红细胞生成素、内皮抑 素、血管抑素、VEGF或其任何片段或组合。其它细胞因子包括转化生长因 子(TGF)超基因家族成员，包括卩转化生长因子(例如TGF-pi、 TGF-P2、TGF-P3);骨形态发生蛋白质(例如，BMP-1 、 BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP-7、 BMP-8、 BMP-9);肝素结合生长因子(例如成纤维细胞生 长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样 生长因子(IGF));抑制素(例如，抑制素A、抑制素B);生长分化因子(例如， GDF-1);以及活化素(例如，活化素A、活化素B、活化素AB)。
来源诸如^Mv哺乳动物细胞分离的，或可以合成地制备诸如通过重组DNA l支 术或通过多种化学方法制备的生长因子。此外，可以使用这些因子的类似物、 片段或衍生物，只要它们显示天然分子的至少一些生物活性。例如，可以通 过表达位点特异性突变或其它遗传工程技术改变的基因来制备类似物。
使用本发明递送的抗凝血药的实例无限制地包括华法林、肝素、水蛭素 等等。使用本发明递送的作用于免疫系统的因子的实例无限制地包括控制炎 症和恶性赘生物的因子以及攻击感染性微生物的因子，诸如趋化肽和緩激 肽。
病毒抗原的实例包括但不限于，例如，逆转录病毒抗原，诸如来自人免 疫缺陷病毒(HIV)的逆转录病毒抗原，诸如gag、 pol和env基因的基因产物， Nef蛋白，逆转录酶及其他HIV元件；肝炎病毒抗原，诸如乙型肝炎病毒的 S、M和L蛋白，乙型肝炎病毒和其它肝炎例如曱、乙和丙型肝炎病毒的pre-S 抗原，病毒元件诸如丙型肝炎病毒RNA;流感病毒抗原，诸如血球凝集素 和神经氨酸酶及其他流感病毒元件；麻渗病毒抗原，诸如麻渗病毒融合蛋白 及其他麻渗病毒元件；风渗病毒抗原，诸如蛋白El和E2及其他风渗病毒元 件；轮状病毒抗原，诸如VP7sc及其他轮状病毒元件；巨细胞病毒抗原，诸 如包膜糖蛋白B及其他巨细胞病毒抗原元件；呼吸道合胞体病毒抗原，诸如 RSV融合蛋白、M2蛋白及其他呼吸道合胞体病毒抗原元件；单纯性疱渗病 毒抗原，诸如立即早期蛋白质、糖蛋白D及其他单纯性疱渗病毒抗原元件； 水痘带状疱瘆病毒抗原，诸如gpl、 gpll及其他水痘带状疱渗病毒抗原元件； 日本脑炎病毒抗原，诸如蛋白E、 M-E、 M-E-NS1、 NS1、 NS1-NS2A、 80% E及其他日本脑炎病毒抗原元件；狂犬病病毒抗原，诸如狂犬病糖蛋白、狂 犬病核蛋白及其他狂犬病病毒抗原元件。关于病毒抗原的其他实例，参见 Fundamental Virology,第二版，编著Fields, B. N.和Knipe, D. M.(Raven Press, New York, 1991)。
可以使用本发明的rAb-DC/DC-抗原疫苗递送的抗原靶标包括编码抗原 诸如病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原的基因。病毒包括微小核 jf唐才玄酸病毒、冠一犬病毒、4皮盖病毒、黄病毒、^HM犬病毒、副粘病毒、正粘病 毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、疱渗病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒和海绵状病毒。其它病毒靼标包
括流感、单纯疱渗病毒1和2、麻渗、登革热、天花、脊髓灰质炎或HIV。
病原体包括锥虫、绦虫、蛔虫、蠕虫、疟疾。肿瘤标记物诸如胚胎抗原或前
列^^特异性抗原可以以这个方法靶向。其它实例包括HIVenv蛋白和乙型 肝炎表面抗原。根据本发明用于疫苗接种目的的载体的给予可能要求载体结 合的抗原是足够非免疫原性的以使得转基因能够长期表达，对此可期望强烈 的免疫应答。在一些情况下，个体的疫苗接种可仅是不经常地需要，诸如每 年或每两年一次，并提供对传染物的长期免疫保护。本发明用于载体中并最 终作为抗原的生物体、过敏原及核酸和氨基酸序列的特定实例可以在美国专 利6,541,011中找到，该专利的相关部分引入本文作为参考，尤其是可以用 于本发明的匹配生物体和特定序列的表格。
用于本文公开的rAb疫苗的细菌抗原包括但不限于，例如，细菌抗原， 诸如百曰咳毒素、丝状血球凝集素、百曰咳杆菌粘附素、FIM2、 FIM3、腺 苷酸环化酶及其他百日咳细菌抗原元件；白喉细菌抗原，诸如白喉毒素或类 毒素及其他白喉细菌抗原元件；破伤风细菌抗原，诸如破伤风毒素或类毒素 及其他破伤风细菌抗原元件；链球菌细菌抗原，诸如M蛋白及其他链球菌 细菌抗原元件；革兰氏阴性杆菌细菌抗原，诸如脂多糖及其他革兰氏阴性细 菌抗原元件；结核分枝杆菌细菌抗原，诸如霉菌酸、热-沐克蛋白65(HSP65)、 30 kDa主要分泌性蛋白、抗原85A及其他分枝杆菌抗原元件；幽门螺杆菌 细菌抗原元件；肺炎球菌细菌抗原，诸如肺炎球菌溶血素、肺炎球菌荚膜多 糖及其他肺炎球菌细菌抗原元件；流感嗜血杆菌细菌抗原，诸如荚膜多糖及 其他流感嗜血杆菌细菌抗原元件；炭疽细菌抗原，诸如炭疽保护性抗原及其 他炭疽细菌抗原元件；立克次氏体细菌抗原，诸如rompA及其他立克次氏 体细菌抗原元件。本文描述的细菌抗原还包括任何其它细菌、分枝杆菌、支 原体、立克次体或衣原体抗原。部分或完整的病原体还可以是流感嗜血杆 菌；镰状疾原虫；脑膜炎奈瑟氏球菌；肺炎链球菌；淋病奈瑟氏菌；伤寒沙 门氏菌血清型；志贺氏菌；霍乱弧菌；登革热；脑炎；日本脑炎；莱姆病； 鼠疫耶尔森氏菌；西尼罗河病毒；黄热病；兔热病；肝炎(病毒性；细菌性)； RSV(呼吸道合胞病毒)；HPIV 1和HPIV 3;腺病毒；天花；过敏物和癌症物 质。
用于本发明的组合物和方法的真菌抗原包括但不限于，例如，念珠菌属 真菌抗原元件；组织胞浆菌属真菌抗原，诸如热休克蛋白60(HSP60)及其他 组织胞浆菌属真菌抗原元件；隐球菌真菌抗原，诸如荚膜多糖及其他隐球菌 真菌抗原元件；球孢子菌真菌抗原，诸如小球体抗原及其他球孢子菌真菌抗 原元件；以及痺真菌抗原，诸如发癣菌素及其他球孢子菌真菌抗原元件。原生动物及其他寄生虫抗原的实例包括但不限于，例如，恶性疟原虫抗 原，诸如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、环子孢子抗原、配子母细胞/
配子表面抗原、红内期抗原pfl55/RESA及其他痦原虫抗原元件；弓形体属 抗原，诸如SAG-1、 p30及其他弓形体属抗原元件；血吸虫属抗原，诸如谷 胱甘肽-S转移酶、副肌球蛋白及其他血吸虫属抗原元件；利什曼原虫主要及 其他利什曼原虫抗原，诸如gp63、磷脂聚糖及与其相关的蛋白质及其他利什 曼原虫抗原元件；以及克氏4,虫抗原，诸如75-77 kDa抗原、56kDa抗原及 其他锥虫抗原元件。
可以使用本发明的rAb靶向的抗原通常基于许多因素选择，所述因素包 括内在化的可能性、免疫细胞特异性的水平、靶向的免疫细胞种类、免疫 细胞成熟的水平和/或活化等等。用于树突细胞的细胞表面标记物的实例包括 但不限于，MHCI类、MHCII类、B7-2、 CD18、 CD29、 CD31、 CD43、 CD44、 CD45、 CD54、 CD58、 CD83、 CD86、 CMRF-44、 CMRF-56、 DCIR和/或 DECTIN-1等等；而在一些情况下还缺失CD2、 CD3、 CD4、 CD8、 CD14、 CD15、 CD16、 CD 19、 CD20、 CD56和/或CD57。抗原呈递细月包的细月包表 面标记物的实例包括但不限于，MHCI类、MHCII类、CD40、 CD45、 B7-l、 B7-2、 IFN-y受体及IL-2受体、ICAM-1和/或Fcy受体。用于T细胞的细胞 表面标记物的实例包括但不限于，CD3、 CD4、 CD8、 CD14、 CD20、 CDllb、 CD16、 CD45和HLA-DR。
用于递送的细胞表面上的耙标抗原包括通常来源于肺瘤组织细胞的细 胞表面、细胞质、细胞核、细胞器等的肿瘤抗原特征性的那些抗原。用于本 发明的抗体部分的肺瘤靶标的实例无限制地包括血液癌诸如白血病和'淋巴 瘤；神经肺瘤诸如星形细胞瘤或恶性胶质瘤；黑色素瘤；乳癌；肺癌；头和 颈癌；胃肠肿瘤诸如胃或结肠癌；肝癌；胰腺癌；泌尿生殖器肿瘤如宫颈、 子宫、卵巢癌，阴道癌，睾丸癌，前列腺癌或阴茎癌；骨肿瘤；血管肿瘤； 或唇、鼻咽、咽和口腔、食道、直肠、胆嚢、胆道、喉、肺和支气管、膀胱、 肾、脑及神经系统的其他部分、曱状腺的癌症；霍奇金氏病；非霍奇金氏'淋 巴瘤；多发性骨髓瘤和白血病。
实例i"肿瘤蛋白，例如i变的癌基因':与;中:相关的病毒;白:'以及月中瘤
粘蛋白和糖脂。抗原可以是与肿瘤相关的病毒蛋白，其可以是来自上文指出 的各类别病毒的病毒蛋白。某些抗原可以是肿瘤特征性的(一个亚集，是肿 瘤前体细胞通常不表达的蛋白质)，或者可以是肿瘤前体细胞中通常表达的 蛋白质，但是具有肿瘤特征性的突变。其它抗原包括具有改变的活性或亚细 胞分布的正常蛋白质的突变型变体，例如，产生肿瘤抗原的基因突变。肿瘤抗原的特定的非限制性实例包括CEA，前列腺特异性抗原(PSA), HER-2/neu， BAGE， GAGE, MAGE 1-4、 6和12, MUC(粘蛋白)(例如MUC-1 、 MUC-2等)，GM2和GD2神经节苷脂，ras, myc，酪氨酸酶，MART(黑色 素瘤抗原)，Pmel 17(gpl00), GnT-V内含子V序列(N-乙酰葡糖氨基转移酶 V内含子V序列)，前列腺Capsm, PRAME(黑色素瘤抗原)，(3-连环蛋白， MUM-1-B(黑色素瘤遍在突变基因产物)，GAGE(黑色素瘤抗原)l, BAGE(黑 色素瘤抗原)2-10， c-ERB2(Her2/neu), EBNA(EB病毒核抗原)1-6, gp75，人 乳头瘤病毒(HPV)E6和E7， p53,肺抗性蛋白(LRP), Bcl-2，以及Ki-67。此 外，免疫原性分子可以是自身免疫性疾病的起始和/或进展中涉及的自身抗 原，该自身免疫性疾病的病理学主要是由于相关靶标器官、组织或细胞表达 的分子特异性的抗体的活性所引起，例如SLE或MG。在这些疾病中，可能 期望将进行中的针对相关自身抗原的抗体介导的(即Th2型)免疫应答指向细 胞(即Thl型)免疫应答。或者，可能期望在没有感染，但是疑似易感染相关 自身免疫性疾病的受试者中通过预防性诱导针对适当的自身抗原的Thl反 应来防止针对自身抗原的Th2反应的起始或降低其水平。耙标自身抗原无限 制地包括(a)对于SLE, Smkh蛋白、RNP核糖核蛋白、及SS-A和SS-B蛋 白；以及(b)对于MG，乙酰胆碱受体的抗原。在一种或多种类型的自身免疫 应答中涉及的其它各种抗原的实例包括，例如，内源性激素，诸如黄体生成 素、卯泡刺激素、睾丸激素、生长激素、催乳素及其他激素。
在自身免疫疾病、过每丈症和移植排斥中涉及的抗原可被用于本发明的组 合物和方法。例如，在任何一种或多种下列自身免疫疾病或障碍中涉及的抗 原可被用于本发明糖尿病(diabetes、 diabetes mellitus)，关节炎(包括类风湿 性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎)，多发性硬 化，重症肌无力，系统性红斑狼齊，自身免疫性曱状腺炎，皮炎(包括特应 性皮炎和湿渗性皮炎)，银屑病，斯耶格伦氏综合征，包括继发于斯耶格伦 氏综合征的干燥性角膜结膜炎，斑秃，由于节肢动物叮咬反应的过敏反应， 克罗恩氏病，口疮性溃疡，虹膜炎，结膜炎，角膜结膜炎，溃疡性结肠炎， 哮喘，过敏性哮喘，皮肤红斑狼療，硬皮病，阴道炎，直肠炎，药渗，麻疯 病逆向反应，麻风结节性红斑，自身免疫性葡萄膜炎，过敏性脑脊髓炎，急 性坏死性出血性脑病，特发性双侧累进性感觉神经性听力丧失，再生障碍性 贫血，单纯性红细胞贫血，特发性血小板减少，多软骨炎，韦格纳氏肉芽肿 病，慢性活动型肝炎，斯-约二氏综合征，自发性口炎性腹泻，扁平苔癣， 克罗恩氏病，格雷夫斯眼病，结节病，原发性胆汁性肝硬化，后葡萄膜炎和 间质性肺纤维化。在自身免疫性疾病中涉及的抗原的实例包括谷氨酸脱羧酶 65(GAD 65)、天然DNA、髓磷脂碱蛋白、髓磷脂蛋白脂质蛋白、乙酰胆碱受体元件、曱状腺球蛋白和促曱状腺激素(TSH)受体。在过敏症中涉及的抗
原的实例包括花粉抗原诸如日本柳杉花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麦草花粉抗原，动物来源的抗原诸如灰尘螨抗原和猫科抗原，组织相容性抗原和青霉素及其他治疗性药物。在移植排斥中涉及的抗原的实例包括移植入移植物接受者的移植物的抗原性元件，诸如心脏、肺、肝脏、胰、肾和神经的移植物元件。抗原可以是对治疗自身免疫性疾病有用的改变的肽配体。
如同本文使用的，术语"表位"指的是包括与位于由病原体DNA或RNA编码的多种病原体多肽之任何一种中的表位相似的一级、二级或三级结构的肽或蛋白质抗原。相似性的水平通常达到这样的程度，即针对上述多肽的单克隆或多克隆抗体也会与该肽或蛋白质抗原结合、反应或识别该肽或蛋白质抗原。多种免疫测定方法可以和上述抗体一起使用，例如蛋白质印迹法、ELISA、 RIA等，所有这些都为本领域技术人员所知。适于在疫苗中使用的病原体表位和/或它们的功能等价物的鉴定是本发明的一部分。 一旦分离和鉴定，可以容易地获得功能等价物。例如，可以使用如美国专利号4,554,101中讲授的Hopp的方法，其教导根据亲水性从氨基酸序列鉴定和制备表位，该文献S1入本文作为参考。其它 一些论文中描述的方法及基于其的软件程序也可以用于鉴定表位核心序歹'J(参见，例如，Jameson和Wolf， 1988; Wolf等，1988;美国专利号4,554,101)。然后可以容易地通过运用肽合成或重组技术把这些"表位核心序列"的氨基酸序列引入肽中。
可以把包含编码本发明的抗原的核酸作为活性成分的疫苗组合物制剂制备为注射剂，为液体溶液或悬浮液；也可以制备适于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式。可以把制剂乳化，包封在脂质体中。通常把活性免疫原性成分与药学上可接受并与活性成分相容的载体混合。
术语"药学上可接受的载体"指的是在给予的受试者中不引起过敏反应或其它副作用的载体。合适的药学上可接受的载体包括，例如，水、盐水、磷酸盐緩冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合中的一种或多种。此外，如果需要，疫苗可以包含少量的辅助性物质，诸如润湿或乳化剂、pH緩冲剂和/或增强疫苗效力的佐剂。可能有效的佐剂的实例包括但不限于氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、 N-乙酰-nor-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、 MTP-PE和RIBI，其包含在2。/。鲨烯/Tween 80乳剂中的三种细菌提取成分，单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐剂的其它实例包括DDA (溴化二曱基双十八烷基铵)、弗氏完全和不完全佐剂以及QuilA。此外，免疫调节物质，诸如淋巴因子(例如，IFN-y、 IL-2和IL-12)或合成的IFN-y诱导物(诸如聚I:C)可以和本文描述的佐剂联合使用。如本发明所描述的，药品可以包括具有单一或多拷贝的特定核苷酸序列的棵多核苷酸，该特定核苷酸序列与存在于血浆脂蛋白上的载脂蛋白的特定
DNA结合位点结合。多核香酸可以编码生物活性肽、反义RNA或核酶并以生理学上可接受的可给药形式提供。可来自本发明的另一种药品以生理学上可接受的可给药形式包括根据本文描述的方法从患者血液或其它来源分离的高度纯化的血浆脂蛋白部分和预先结合到纯化的脂蛋白部分的、包含与存在于血浆脂蛋白上的载脂蛋白的特定DNA结合位点结合的单一或多拷贝的特定核苷酸序列的多核苷酸。
另一种药品以生理学上可接受的可给药形式包括高度纯化的血浆脂蛋白部分，该血浆脂蛋白部分包括含有单一或多拷贝的特定DNA结合基序的重组载脂蛋白片段，其预先结合到包括单一或多拷贝的特定核香酸序列的多核苷酸上。另 一种药品以生理学上可接受的可给药形式包括高度纯化的血浆脂蛋白部分，该血浆脂蛋白部分包括含有单一或多拷贝的特定DNA结合基序的重组载脂蛋白片段，其预先结合到包括单一或多拷贝的特定核苷酸序列的多核苷酸上。
给药剂量在很大程度上取决于治疗的受试者的体重和身体健康状态以及给药途径和治疗频率。包括预先结合到高度纯化的脂蛋白部分的棵多核芬酸的药物组合物可以按1 (ig到1 mg多核苷酸和1 )ig到100 mg蛋白质的量给药。
rAb和rAb复合物给予患者可以遵循用于化学疗法给药的一般方案，如果有的话，考虑载体的毒性。预料根据需要重复治疗周期。还考虑，多种标准治疗以及外科干预可以与所述的基因治疗联合施用。
在考虑基因治疗临床应用的情况下，需要制备复合物作为适于目的应用的药物组合物。通常这需要制备基本上不含热原以及任何其它对人或动物有害的杂质的药物组合物。通常还期望使用适当的盐和緩冲液以使复合物稳定和允许复合物被靶标细胞摄取。
本发明的水性组合物可以包括有效量的化合物，其溶解或分散在药学上可接受的载体或水介质中。这些组合物也可以称作接种物。用于药物活性物质的介质和试剂的使用在本领域中为大家所熟知。任何常规介质或试剂除非与活性成分不相容，否则其在治疗组合物中的使用被考虑。补充性活性成分也可以加入组合物中。本发明的组合物可以包括典型的药物制剂。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和在油类中制备分散体。在通常的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
疾病状态。取决于要治疗的特定疾病，根据本发明的治疗组合物的给予可以经任何常规途径进行，只要经该途径可达到靶标组织以使最大化递送抗原到位点来达到最大的(或在一些情况下最小的)免疫应答。通常可以经原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射给药。递送的其它部位包括口、鼻、颊、直肠、阴道或局部的。局部给药对于皮肤癌的治疗可能是特别有益的。所述组合物通常作为包括生理学上可接受的载体、緩冲液或其它赋形剂的药学上可接受的组合物给药。
本发明的疫苗或治疗组合物可以经注射胃肠外例如皮下或肌内给予。适于其它给药方式的另外的制剂包括栓剂，以及在一些情况下口服制剂或适于
分配的制剂如气雾剂。对于口服制剂，使用佐剂的T细胞亚型操作，抗原包
装或添加单独的细胞因子到多种制剂中产生具有最佳化免疫应答的改良口服疫苗。对于栓剂，常规的粘合剂和载体可以包括，例如，聚亚烷基二醇或
甘油三脂；这些栓剂可以由包含0.5%到10%,优选1%-2%范围内的活性成分的混合物形成。口服制剂包括通常使用的赋形剂，例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶嚢、緩释制剂或散剂的形式并且包含10%-95%的活性成分，优选25-70%。
本发明的编码抗原的核酸可以作为中性的或盐的形式配制入疫苗或治疗组合物中。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成的)，其为与无才几酸例如盐酸或磷酸或与有才几酸诸如醋酸、草酸、酒石酸、马来酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以源自于无机^喊例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁和有机碱诸如异丙胺、三曱胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
疫苗或治疗组合物以与给药制剂相容的方式，以及以预防和/或治疗有效的量给予。要给予的量取决于要治疗的受试者，包括例如受试者的免疫系统对合成抗体的容量，以及期望保护或治疗的程度。合适的剂量范围为每次疫苗接种具有约几百微克级的活性成分，范围为约0.1 mg到1000 mg,诸如约1 mg到300 mg的范围，以及优选约10 mg到50 mg的范围。合适的初始绍^药和强化注射方案也是变化的，但是典型的是初始给药然后是后续的接种或其他给药。给药要求的活性成分的精确量取决于医师的判断且可能为每个受试者所特有。本领域技术人员清楚，本发明的核酸分子或融合多肽的治疗有效量尤其取决于给药方案，给药抗原的单位剂量，核酸分子或融合多肽是否和其它治疗剂联合给药，接受者的免疫状态和健康状态，以及特定核酸分子或融合多肽的治疗活性。
组合物可以以单一剂量方案或以多次剂量方案提供。多次剂量方案中疫苗接种的初始时程可以包括，例如1-10个单独的剂量，随后在以维持和或加强免疫应答要求的后续时间间隔给予其它剂量，例如在l-4个月给予第二剂量，以及如果需要在数月之后给予后续剂量。需要每隔l-5年，通常3年的定期加强剂量来维持需要的保护性免疫水平。免疫时程可以继之以与
ESAT6或ST-CF共培养的外周血淋巴细胞(PBL)的体外增殖测定，以及测量致敏淋巴细胞释放的IFN，水平。可以使用常规的标记物诸如放射性同位素、酶、荧光标记物等进行测定。这些技术为本领域技术人员所知并且可以在美国专利号3,791,932、 4,174,384和3,949,064中找到，这些文献的相关部分通过引用并入本文。
才莫块式rAb载体和/或结合的rAb载体-(cohesion/dockerin和/或dockerin-cohesin)-抗原复合物(rAb-DC/DC-抗原疫苗)可以以 一种或多种"单位剂量"提供，这取决于是否使用核酸载体，最终纯化的蛋白质，或使用的最终的疫苗形式。把单位剂量定义为包含计算以产生与该治疗组合物给药即适当的途径和治疗方式相关的期望反应的预定量的治疗组合物。给药量以及特定的途径和制剂在临床领域技术人员的范围之内。还可以评估待治疗的受试者，尤其是，受试者免疫系统的状态和需要的保护。单位剂量不需要以单一注射给药，而是可以包括经设定的一段时间内的连续输注。本发明的单位剂量可以方便地用DNA/kg(或蛋白质/Kg)体重来描述，以约0.05、 0.10、 0.15、0.20、 0.25、 0.5、 1、 10、 50、 100、 l，OOO或更多mg/DNA或蛋白质/kg体重的范围给药。同样地，递送的rAb-DC/DC-抗原疫苗的量可以从约0.2到约8.0mg/kg体重变化。因此，在特定实施方案中，可以把0.4mg、 0.5 mg、 0.8mg、 1.0 mg、 1.5 mg、 2.0 mg、 2.5 mg、 3.0 mg、 4.0 mg、 5.0 mg、 5.5 mg、6.0 mg、6.5 mg、7.0 mg和7.5 mg的疫苗递送到个体体内。给药的rAb-DC/DC-抗原疫苗的剂量在很大程度上取决于治疗的受试者的体重和身体健康状态以及给药途径和治疗频率。包括预先结合到脂质体或病毒递送载体上的棵多核苷酸的药物组合物可以按从l昭到lmg多核苷酸到lpg到100mg蛋白质的量给药。因此，特定组合物可以包括在约1 jig、 5 [ig、 10 pg、 20昭、30吗、40 (ig、 50 |ig、 60吗、70吗、80 ng、 100吗、150吗、200昭、250 jig、 500吗、600 (ig、 700吗、800吗、900吗或1,000吗之间的多核苷酸或蛋白质，该多核苷酸或蛋白质独立地与l吗、5吗、10吗、20吗、3.0吗、40(ig、 50昭、60吗、70 |ig、 80 |ig、 100 fig、 150吗、200吗、250路、500吗、600吗、700 jig、 800 )ig、 900 jig、 1 mg、 1.5 mg、 5 mg、 10 mg、 20 mg、 30 mg、 40 mg、50mg、 60mg、 70 mg、 80 mg、 90 mg或100 mg载体结合。
在体外细胞系统中测试本发明，该体外细胞系统测量Flu抗原靶向的树突细胞对人Flu特异性T细胞的免疫刺激。本文显示的结果证明在该系统中单独使用无效的抗原剂量下这些抗原特异性细胞的特异性扩增。本发明还可以用于制备模块式rAb载体，该模块式rAb载体例如是与来自蓖麻毒素、炭疽毒素和葡萄球菌B肠毒素的保护性抗原复合的重组人源化mAb(抗特异性人树突细胞受体)。该实体的潜在市场是所有军事人员的疫苗接种和储备待用给大居民点服药以应对任何与这些试剂相关,生,威胁^
兴趣的工业包括制药和生物:技术工业。
本发明包括包含疫苗的组合物和方法，其特异性靶向(递送)抗原至抗原
发针对衍生所述抗原的活性剂(病原体或癌症)的保护性或治疗性免疫应答。此外，本发明产生了这样的试剂，其直接或与其他试剂一起通过它们与在抗原呈递细胞上表达的LOX-l受体的特异性结合而具有治疗性作用。
才才泮+和方法
抗体和四聚体-用于DC和B细胞表面染色的抗体(Ab)，包括同型对照Ab，购自BD Biosciences (CA)。用于ELISA的Ab购自Bethyl (TX)。 ^元-BLyS和抗-APRIL来自PeproTech (NJ)。四聚体HLA-A承0201-GILGFVFTL (Flu Ml)和HLA-A*0201-ELAGIGILTV (Mart-1)购自Beckman Coulter (CA)。
细胞和培养物-来自正常供体的单核细胞(lxloVml)在含有GM-CSF (100ng/ml)和IL-4(50ng/ml)(R&D, CA)的Cellgenics (France)培养液中培养。对于第3天和第6天的DC,分别在第1天和第3天将相同量的细胞因子添加到培养液中。B细胞用阴性分离试剂盒(BD)纯化。CD4和CD8 T细胞用包被抗CD4或CD8的磁珠(Milteniy, CA)纯化。使用PercollTM梯度(GEHealthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK)通过密度梯度离心从血沉棕黄层中分离PBMC。对于DC活化，将lx105 DC在用mAb包被的96孔平板中培养16-18h。在碳酸盐緩冲液pH 9.4中的mAb (l-2jig/孔)在37。C下培养至少3h。收集培养物上清液，细胞因子/趋化因子通过Luminex(Biomd， CA)测定。对于基因分析，DC在mAb包被的平板中培养8h。在一些实验中，将可溶性50 ng/ml CD40L (R&D， CA)或50 nM CpG (InVivogen， CA)添加到培养液中。在DC和B细胞共培养中，将重悬在含有10% FCS和抗生素的RPMI1640(Biosource, CA)中的5xl03 DC首先在mAb包被的平板中培养至少6h，然后加入lxl()5用CFSE (Molecular Probes, OR)标记的纯化自体B细胞。在一些实验中，DC用5 moi (感染复数)热灭活流感病毒(A/PR/8 H1N1)脉沖攻击2h,然后与B细胞混合。对于DC和T细胞共培养，将5xl03 DC与lx105纯化的自体CD8 T细胞或者混合的同种异体T细胞一起培养。在培养的最后18h，用lpCi/孔3[司-胸苷脉冲攻击同种异体T细胞，然后通过用Y-计数仪(Wallac，画)测定cpm。以5xl05 PBMC/孔在mAb包被的平板中培养。分别在第10天和第7天，通过用抗CD8和四聚体染色细胞来测定Mart-l和Flu Ml特异性CD8 T细胞的频率。将10 pM的Mart-l肽(ELAGIGILTV)和20 nM的含Mart-l肽的重组蛋白(参见下文)添加到DC和CD8 T细'胞培养物中。将20 nM纯化的重组Flu Ml蛋白(参见下文)加到PBMC培养物中。
单克隆抗体-通过常规技术制备小鼠mAb。筒而言之，用含有Ribi佐剂的20吗受体胞外结构域.hlgGFc融合蛋白对6周龄的BALB/c小鼠进行i.p.免疫，然后在第IO天和第15天，用20昭抗原进行加强免疫。3个月后，在取出脾脏的前3天，再对小鼠加强免疫。或者，在30天至40天的期间内，每3-4天用在Ribi佐剂中的l-10吗抗原注射小鼠足垫。在最后加强免疫后的3 -4天，收集引流的淋巴结，来自脾脏或淋巴结细胞的B细胞与SP2/0-Ag14纟田胞融合。对杂交瘤上清液进行篩选，与单独的融合伴倡或与碱性磷酸酶融合的受体胞外结构域(16)比较，分析受体胞外结构域融合蛋白的Ab。然后在FACS中使用用编码全长受体cDNA的表达质粒瞬时转染的293F细胞对阳性孔进行筛选。选择的杂交瘤是在CELLine瓶(Intergra, CA)中克隆和扩增的单个细胞。杂交瘤上清液与等体积的1.5M甘氨酸、3MNaCl、 lxPBS,pH7.8混合，并用MabSelect树脂滚动。用结合緩冲液洗涤树脂，并用0.1 M甘氨酸，pH2.7洗脱。接着用2 MTris中和，用PBS透析mAb。
ELISA-进行夹心ELISA来测量总IgM、 IgG和IgA以及flu特异性免疫球蛋白(Ig)。含有已知量的Ig的标准人血清(Bethyl)和人AB血清分别用作总Ig和flu特异性Ig的标准。样本中的Flu特异性Ab滴度，单位被确定为具有相同的光密度的AB血清的稀释系数。用ELISA试剂盒(BenderMedSystem, CA)测定BAFF和BLyS的量。
RNA纯化和基因分析-用脂easy柱(Qiagen)提取总RNA,并用2100Bioanalyser (Agilent)分片斤。生物素沖示"i己的cRNA革巴才示用Illumina totalprep才示记试剂盒(Ambion)制备并杂交到Sentrix Human6 BeadChips (46K的转录本)上。这些微阵列由附着在3pm珠上的50mer寡核香酸探针组成，所述珠固定在硅片表面上蚀刻的微孔中。用链霉抗生物素-Cy3染色后，用Illumina(Beadstation 500X)生产的亚微米分辨扫描仪成像。用基因表达分析软件程序GeneSpring, Version 7.1 (Agilent)进行数据分析。
重组Flu Ml和MART-1蛋白的表达和纯化-用PCR扩增流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1) Ml基因的ORF,同时加入起始密码子远端的Nhe I位点以及终止密码子远端的Not I位点。将消化片段克隆到pET-28b(+) (Novagen)中，并在Ml ORF读框内插入His6标签，从而编码His.Flu Ml蛋白质。编码插入在Nco I和Nhe I之间的来自热纤4炎菌(CAermoce〃wm)(未公开)的N端169个残基cohesin结构域的pET28b(+)衍生物表达Coh.His 。
为表达 Cohesin-Flex-hMART-l-肽 A-His ， 序列
(SEQ ID NO.: 1) ( 编 码
DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP (SEQ ID NO.: 2)-带阴影的残基是免疫显性的HLA-A2-限制性肽，而该肽周围带下划线的残基来自MART-1)被插入到上述载体的Nhel位点和Xho I位点之间。蛋白在大肠杆菌菌抹BL21(DE3) (Novagen)或者T7Express (NEB)中表达，这些菌抹在37。C下在LB中培养，以卡那霉素抗性(40pig/ml)选择，并以200转/分钟摇并瓦直至生长到对数中期，同时添加120mg/L IPTG。 3h后，通过离心收集细胞，保存在-8(TC下。将来自每1L发酵物中的大肠杆菌细胞重悬在30 ml含有0.1 ml蛋白酶抑制剂Cocktail II(Calbiochem, CA)的水冷的50 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0 (緩沖液B)中。在冰上超声处理细胞2次，每次5分钟，设定值为18 (Fisher SonicDismembrator 60),其中有5分钟静止期，然后在4。C下以17,000 r.p.m. (SorvallSA-600)离心20分钟。为了纯化His.Flu Ml,使50 ml细胞裂解物上清液部分通过5 ml Q琼脂糖珠，将6.25 ml 160 mM Tris、 40 mM咪唑、4 M NaCl pH7.9添加到Q琼脂糖流动液中。将其以4 ml/分钟速度上样到5 ml带有Ni++的H汀rap螯合HP柱上。结合柱的蛋白质用20 mM NaP04 , 3 00 mM NaCl pH7.6 (緩冲液D)洗涤，接着用100 mM H3COONa pH 4.0再洗涤一次。结合的蛋白质用100 mM H3COONa pH 4.0洗脱。合并峰值馏分，以4 ml/分钟的速度上样到用100 mM H3COONa pH 5.5平衡的5 ml HiTrap S柱上，用平衡緩冲液洗涤，接着用在50 mM NaP04 pH 5.5中的梯度为0-1 M的NaCl洗脱。合并用约500 mM NaCl洗脱的峰值馏分。为了纯化Coh.Flu Ml.His,如上所述将来自2L培养物的细胞裂解。离心后，将2.5 ml Triton29 XI14加到上清液中，在冰上培育5分钟。在25。C下再温育5分钟后，在25。C下进行离心，从Triton XI14中分离上清液。重复提取操作，将上清液通过5ml的Q琼脂糖珠，在Q琼脂糖流动液中添加6.25 ml 160 mM Tris、40 mM咪唑、4 M NaClpH7.9。如上所述，用Nr螯合的层析柱纯化蛋白质，并用在緩冲液D中的0-500 mM ，咪唑洗脱。
抗LOX-l mAb-本发明包括以下所示的对应于抗LOX-l单克隆抗体的特定氨基酸序列，它们是治疗性或保护性产品中的期望成分(在例如人源化重组抗体的情况下)。以下是在嵌合小鼠V区(下划线)人C区重组抗体中的所
述序列。这些小鼠V区可容易地被人源化，即LOX-l结合区由任何本领域 技术人员移植到人v区框架序列上。此外，所述序列也可表达为融合蛋白，
其保留了抗体的功能，但加入了例如抗原、细胞因子或毒素以用于需要的治 疗性应用。
QEGNVFSCSVMHEAL丽HYTQKSLSLSLGKAS (SEQ ID NO.: 5) [mAnti-LOX—1—10F9K-LV-hlgGK誦C]SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO.: 6)
RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (SEQ ID NO.: 7) [mAnti-LOX-l—15C4K-LV画hlgGK-C]
YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO.: 8)。
本发明包括v区序列和相关序列，其由本领域技术人员修饰，以例如增 强LOX-l的亲和力，和/或被整合入人V区框架序列中，以工程化入表达载 体中指导能够结合抗原呈递细胞上的LOX-1的蛋白质形式的表达。此外，
的)其他mAb可通3过类似的方法(始于PCR克隆和小鼠杂交"V区;则序)i入 编码类似重组抗体(rAb)的表达构建体中。这种抗LOX-1 V区还可由本领域 技术人员人源化(即将小鼠特异性的结合序列移植到人V区框架序列上)以最 小化所述治疗性rAb可能的免疫反应性。
工程化重组抗LOX1重组抗体-抗原融合蛋白(rAb.抗原)是有效的体外原 型疫苗-表达载体可采用不同的蛋白编码序列构建，例如与H链编码序列框 内融合。例如，抗原如流感病毒HA5、流感病毒Ml、 HIV gag或来自癌抗 原的免疫显性肽或细胞因子可随后表达为rAb.抗原或rAb.细胞因子融合蛋 白，在本发明的情况下，其能够具有使用抗LOX-1 V区序列将抗原或细胞 因子(或毒素)直接带至具有LOX-1的抗原呈递细胞表面的用处。其容许例如 抗原的内在化-有时与受体的活化和随后治疗或保护性作用的起始(例如通过 起始有效的免疫应答，或通过杀死靶细胞)相关。基于该构思的典型原型疫 苗可使用H链载体例如rAB-pIRES2[mAnti-LOX-l—15C4H-LV-hIgG4H-C-Flex-FluHA5-l-6xHis],其指导H链小鼠mAb V区(下划线)-人IgG4 C区-Flu HA5-1 (粗体)融合蛋白的合成。与类似的轻链表达质粒(编码上述的序列)共表达产生多功能的重组抗体(rAb)，该重组抗体结合LOX-l ，并递送Flu HA5-1 抗原至细胞表面用于DC活化、抗原内在化、抗原加工、抗原呈递和特异性 抗Flu HA5-1 B和T细胞的发育和扩充。
KASDTTEPATPTTPVTTDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKH
NGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDL
CYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPY(3GKSSFF
RNWWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTY
ISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEY
AYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKY
VKSNRLVLAHHHHHH (SEQ ID NO.: 9)
类似地，rAB-pIRES2[mAnti-LOX-1—15C4H-LV-hlgG4H-C-Dockerin]编 码与dockerin融合的抗LOX-l H链(序列如下)。Dockerin允许与cohesin-抗 原(coh.抗原)融合蛋白的强的特异性非共价相互作用-提供可选择的递送抗原 至DC和其他抗原呈递细胞的方法。
KASNSPQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNADVNR DGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI (SEQ ID NO.: 10)VESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV
KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV應EALHNH YTQKSLSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTPTTTLLAPLILSRIVGGWECEKHSQPW QVLVASRGRAVCGGVLVHPQ曹LTAAHCIRNKSVIIXGRHSLFHPEDTGQV F()VSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDL PTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVT KFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYT KWHYRKWIKDTIVANP (SEQ ID NO: 11) 关于克隆和表达重组抗体(rAb)和rAb.抗原的方法
cDNA克隆和嵌合小鼠/人mAb的表达-从杂交瘤(RNeasy试剂盒，Qiagen) 制备总RNA,并用于cDNA合成和PCR (SMART RACE试剂盒，BD Biosciences),釆用^是供的5'引物和基因特异的3'引物 mlgGK, 5'ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3， (SEQIDNO.: 12); mlgGX, 5'ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgaccttc3' (SEQ ID NO.: 13);
mlgGl, 5'gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3， (SEQ ID NO.: 14); mlgG2a, 5'ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3， (SEQ ID NO.: 15);和 mlgG2b, 5,ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt3， (SEQ ID NO.: 16)。
克隆PCR产物(pCR2.1 TA试剂盒，Invitrogen),并通过DNA测序鉴定。 使用衍生的序列用于小鼠H和L链V区cDNA,使用特异性引物PCR扩增 信号肽和V区，同时将用于克隆的侧翼限制性位点插入编码下游人IgGK或 IgG4H区的表达载体中。通过扩增由Xho I和Not I位点侧翼的残基 401-731(别631019371),并将其插入pIRES2-DsRed2 (BD Biosciences)的Xho I-Not I间隔区来建立用于表达嵌合mVK-hlgK的载体。使用PCR扩增mAb Vk 区，从起始密码子开始，添加NheI或Spel位点，随后CACC,至编码区(例 如gil76779294i的残基126),添加XhoI位点。随后将PCR片段克隆入上述 载体的 Nhe I- Not-I 间隔区。 通过将序列 5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggcccactcgag3' (SEQ ID NO.: 17)插入到上述载体的Nhe I - Xho I间隔区来建立使用mSLAM导引部分的用于嵌合mVK-hlgK的载体。使用 PCR扩增在预测的成熟N端密码子(使用SignalP 3.0 Server定义)(Bendtsen, Nielsen et al. 2004)和mVK区(如上文所定义)的末端之间的间隔，同时附加 5'tcgtacgga3'。将用Bsi WI和Xho I消化的片段插入到上述载体的相应位点 中。对照hlgK序列相应于别49257887|残基26-85和别21669402|残基67-709。 对照hlgG4H载体相应于别19684072|残基12-1473,具有S229P和L236E取 代，其稳定了二硫键并消除了残基FcR结合(Reddy, Kinney等，2000),插 入到pIRES2-DsRed2载体的Bgl II和Not I位点之间，同时添加序列 5'gctagctgattaattaa3'代替终止密码子。使用PCR扩增mAb VH区，从起始密 码子开始，添力。CACC,随后添加BgIII位点，直至编码gill9684072l残基 473的区域。随后将PCR片段克隆入上述载体的Bgl II - Apa I间隔。通过将 序 列 5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcg tacggattaattaag ggccc3' (SEQ ID NO.: 18)插入上述载体的Nhe I - Apa I位点来 建立使用mSLAM导引部分的用于嵌合mVH-MgG4序列的载体。使用PCR 扩增预测的成熟N端密码子以及mVH区的末端之间的间隔，同时附加有 5'tcgtacgga3'。将用Bsi WI和Apa I消化的片殺:插入到上述载体相应的位点。 附录2详细列出了本研究中使用的各种mVK和mVH区的核香S复序列。
将不同抗原编码序列插入到H链载体的Nhe I - Pac I - Not I间隔区，该 抗原编码序列两侧为近端Nhe I位点和终止密码子后的远端Not I位点。Flu HA1-1由曱型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34(HlNl))红细胞凝集素gi|21693168| 残基 82-1025 (C982T 改变)编码，该残基具有近端 5 'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa3 '序列(Nhe I位点,然后为编 码cipA cohesin-cohesin接头残基)和远端5'caccatcaccatcaccattgagcggccgc3'序 列(编码His6、终止密码子和Not I位点)。Flu HA5-1由gil50296052l曱型流 感病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))红细胞凝集素残基49-990编码，该残 基结合有与Flu HA1-1相同的序列。Doc由gi|40671|celD残基1923-2150编 码，该残基具有近端Nhe I位点和远端Not I位点。PSA由gp4784812l前列 腺特异性抗原残基101-832编码，该残基具有近端序列 亏'gctegcgatacaacaga3cctgca3C3cctacaacacctgtaac3ac3ccgacaacaacacttctagcgc3' (SEQ ID NO.: 19) (Nhe I位点和cipA间隔区)和远端Not I位点。Flu Ml-PEP 由 5'gctagccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctgaccgtgcccagcga acgcaagggtatacttggat tcgttttcacacttacttaagcggccgc3' (SEQ ID NO.: 20)编码。这个 以及所有其他肽编码序列通过具有适于克隆入Nhe I和Not I限制性H链载来产生。总是使用优选的人密码子，除了限制性位点需要加入或在CipA间 隔区序列中的情况。
采用L链和H链构建体各 2.5昭和上述的方案，在5 ml瞬时转染物中 检测rAb表达构建体的生产水平。用抗MgG ELISA (亲和纯化的山羊抗人 IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch)分析上清液。在该方案的检测中，分泌 性rAb的产生不依赖于H链和L链载体浓度，各DNA浓度在~ 2倍的范围 内(即系统是DNA饱和的)。
在本文中，本发明的发明人证实，作为LLR之一的LOX-1在细胞(包括 DC)活化方面单独或与其他细胞信号一起是功能性的。LOX-1介导的细胞活 化由特定的抗LOX-1 mAb诱导，因此此类抗人LOX-1 mAb对于开发针对疾 病的试剂中是有效的。
本发明包括新的抗人LOX-1剂及其在发现新的生物学中的用途，这是 本发明的基础及其应用。筒言之，开发了新的抗LOX-1单克隆抗体(mAb) 并用于揭示先前未知的与该发现于抗原呈递细胞上的细胞表面受体相关的 生物学。该新的生物学高度预测了活化该受体的抗LOX-1剂在不同治疗性 和保护性应用中的应用。下面给出的数据有力的支持了最初的预测，并证明 了将本文的发现用于临床应用的途径。
针对人LOX-1高亲和力单克隆抗体的开发制备受体胞外结构域上IgG (人IgGlFc)和AP (人胎盘碱性磷酸酶)融合蛋白分别用于免疫小鼠和筛选单 抗。先前描述了用于DCIR胞外结构域.IgG的表达构建体(16),以及使用小 鼠SLAM (mSLAM)信号肽定向分泌(17)。还通过使用PCR扩增AP残基 133-1581 (gb|BC009647|),添加近端才匡内Xhol位点和远端TGA终止密码子 和Not I位点来产生DCIR胞外结构域.AP的表达载体。该Xho I - Not I片段 在上述的DCIR胞外结构域.IgG载体中替换了 IgG编码序列。在相同的Ig 和AP载体系列中的LOX-1胞外结构域构建体含有编码(bp 224-874, gill8490152l)的插入物。使用FreeStyle 293表达系统(Invitrogen)，根据厂 商说明(l mg总质粒DNA与1.3 ml 293 Fectin试剂/L转染物)产生LOX-1融 合蛋白。为生产rAb，共转染等量编码H和L链的载体。转染的细胞培养3 天，收集培养物上清液，加入新鲜的培养基，继续培养2天。通过过滤澄清 合并的上清液。通过HiTrap蛋白A亲和层析纯化受体胞外结构域.hlgG，用 0.1 M pH 2.7的甘氨酸洗脱，随后对PBS透析。使用HiTrap MabSelecFM柱 类似地纯化rAb (后面描述的重组抗体)。小鼠mAb通过常规细胞融合技术生 产。简言之，6周龄的BALB/c小鼠腹膜内用20 (ig受体胞外结构域.hIgGFc 融合蛋白与Ribi佐剂免疫，随后在IO天和15天后用20 (xg抗原加强。3个月后，小鼠在取脾脏前3天再次加强。或者，在30至40天期间内，每3-4 天小鼠足垫内注射1-10 )ig在Ribi佐剂中的抗原。最后一次加强后3至4天， 收集引流淋巴结。使用常规技术将来自脾脏或淋巴结细胞的B细胞与 SP2/0-Ag 14细胞(18)融合。使用ELISA筛选杂交瘤上清液，与单独的融合 伴侣或与AP融合的受体胞外结构域(16)相比，筛选针对受体胞外结构域融 合蛋白的抗体。阳性孔随后用FACS筛选，使用用编码全长受体DNA的表 达质粒瞬时转染的293F细胞。选择的杂交瘤是单细胞克隆的，使适应无血 清培养基，并在CELLine烧瓶(Integra, CA)中扩增。杂交瘤上清液与等体积 的1.5M甘氨酸、3MNaCl、 lxPBS, pH7.8混合，用MabSelect树脂滚动。 该杉t脂用结合緩冲液洗涤，以0.1 M甘氨酸，pH2.7洗脱。用2 M的Tris中 和后，对PBS透析mAb。
通过直接ELISA进行纯化的抗LOX-l单克隆抗体表征下图显示通过 ELISA 4企测一些抗LOX-l mAb相对亲和力的实例(即将LOX-l.Ig蛋白固定 于微量滴定板表面，并通过剂量滴定系列检测抗体结合LOX-1 .Ig的能力(如 通过抗小鼠IgG.HRP结合试剂4全测)。这些组为(左边)对LOX-l.Ig蛋白的 mAb反应性；(右边)对hlgGFc蛋白的mAb反应性，以及(下面)对LOX-l. 碱性磷酸酶融合蛋白的mAb反应性。在后一情况下，单抗是板结合的(通过 抗小鼠IgG试剂)，并与在溶液中恒定量的LOX-LAP结合。抗LOX-l mAb 与LOX-l胞外结构域特异性反应，其亲和力超过商用的抗LOX-l单抗。
体内DC和体外培养的DC均表达LOX-l:图1显示正常供体的PBMC 上LOX-l的表达水平。如图la中所示，抗原递呈细胞，包括CDllc+DC、 CD14+单核细胞和CD19+ B细胞，表达LOX-l 。 CD3+ T细胞不表达可检测 到的表面LOX-l。图lb中显示体外培养的DC和纯化的血髓样DC (mDC) 上LOX-l的表达水平。IL-4和IFNDC均表达显著水平的LOX-l。尽管mDC 表达高水平LOX-l,但pDC未表达LOX-l (未显示)，表明通过LOX-l操作 DC会引起独特的应答，因为这些DC亚型在体内具有不同的功能。
通过LOX-l的信号传导活化DC，并刺激DC产生细胞因子和趋化因子 树突细胞是初级免疫细胞，依赖于其活化决定免疫应答的结果为诱导或耐受 (19)。 LOX-l在DC活化中的作用未知。我们制备了产生小鼠抗hLOX-1 mAb 的8个不同克隆，并且我们通过测定DC表型和DC分泌的细胞因子和趋化 因子来检测各个mAb是否激活DC。图2A中的数据显示PABl、 4、 5、 8 和10能活化DC，但其他抗LOX-l单抗或对照单抗不活化DC(数据未显示)。 此外，各mAb刺激DC产生不同水平的细胞因子和趋化因子，不过图2中 显示的所有mAb均能诱导DC成熟。图3显示通过LOX-l的信号传导能够导致DC活化。用对LOX-l特异 性的mAb刺激IL-4DC，图3a中的数据显示通过LOX-l的信号能够活化 IL-4DC，导致CD86和HLA-DR表达增加。LOX-l也能活化IFNDC (未显 示)。为检测LOX-l是否能在体内活化DC,用抗LOX-l刺激纯化的mDC24 小时，随后用抗CD86、 CD80和HLA-DR(这些为DC活化的标记物)染色细 胞。如图3b中所示，LOX-l还能活化体内衍生的mDC,使得CD86、 CD80 和HLA-DR表达水平增加。后一数据尤其重要，因为它们代表某些抗LOX-l 单抗对离体细胞(直接从血液中分离)的直接生物学效应。
通过LOX-l的信号传导诱导独特的DC活化为更详细的表征通过 LOX-l的DC活化，进行微阵列基因表达分析。图4显示抗LOX-l mAb刺 激DC上调或下调不同种类的基因，表明通过LOX-l的信号导致DC活化的 独特模式。当与通过DC-ASGPR和CLEC-6信号传导(未显示)比较时，数据 显示各细胞表面DC凝集素递送独特的信号以活化DC。因此，我们预期通 过不同信号活化的DC会导致不同的免疫应答。
通过LOX-l的信号传导激活DC分泌细胞因子和趋化因子用LOX-l 特异性mAb刺激的DC多个基因表达水平上升，包括共刺激分子以及趋化 因子和细胞因子相关的基因(图5a和b)。当用抗LOX-l mAb刺激时，体外 培养的IL-4DC和mDC均产生显著增加量的分泌IL-12p40、 MCP-1和IL-8。 包括TNFa、 IL-6、 MIP-la和IL-lb在内的其他水平增加的细胞因子和趋化 因子也在用抗LOX-l刺激的DC培养物上清液中观察到。先前已描述LLR 在TLR2和TLR4介导的免疫细胞活化中的可能贡献。
通过LOX-l的信号传导增强通过CD40DC的信号传导通过LOX-l的 信号传导可与通过CD40的信号传导协同作用用于增强DC的活化(图5)。 CD40-CD40L作用过程中的LOX-l结合导致活化标记物CD83在细胞表面表 达的显著增加(图6a),以及IL-12p70和Il-12p40分泌增加(图6b)。这表明 LOX-l可在体内DC活化中用作共刺激分子，并广泛^提示通过LOX-l活化 的试剂(mAb例如本文中描述的那些，或者天然或替代LOX-l配体)的治疗 作用。总体而言，图1至图6中的数据表明通过LOX-l的信号传导能活化 DC, LOX-l是用于DC活化的新的共刺激分子。
通过LOX-l刺激的DC诱导有力的体液免疫应答DC通过为T依赖的 和非T依赖的B细胞应答提供信号(21-24)以及传递抗原至B细胞(25， 26)在 体液免疫应答中起重要作用。除DC外，作为第三信号的通过TLR9的信号 传导对于有效的B细胞应答是必须的(27, 28)。 LOX-l在TLR9配体CpG存 在下可影响DC介导的体液免疫应答。用抗LOX-l单抗刺激6天IL-4DC, 随后共培养纯化的B细胞。如图6a中所示，与对照mAb刺激的DC相比，用抗LOX-l单抗活化的DC导致显著增加的B细胞增殖(通过CFSE稀释显 示)和浆细胞分化(CD38+CD2(T增加)。CD38+CD2(T B细胞具有典型的浆细胞 形态学，但其不表达CD138。大部分增殖细胞不表达CCR2、 CCR4、 CCR6 或CCR7。
通过ELISA测定产生的总免疫球蛋白(Ig)量(图7b)。与图7a中的数据一 致，用抗LOX-l刺激的DC培养的B细胞导致总IgM的产生显著增加。除 了总Ig增加以外，通过触发LOX-l活化的DC比用对照mAb刺激的DC更 有效地使B细胞产生流感病毒特异的IgM、 IgG和IgA (图7c)，表明LOX-1-介导的DC活化对总的和抗原特异性的体液免疫应答均有作用。
DC-衍生的B淋巴细胞刺激子蛋白(BLyS， BAFF)和增殖诱导配体 (APRIL)是重要的分子，通过它们DC可直接调节人B细胞增殖和功能 (29-32)。图6d中的数据表明通过LOX-l刺激的DC表达水平增加的细胞内 APRIL和分泌性APRIL,而非BlyS (未显示)。测定了混合培养物中B细胞 上的BlyS和APRIL受体的表达水平，但没有显著的变化(未显示)。这由图 7e中的数据证实。在DC和B细胞共培养中，BAFF受体(BAFFR)、 TACI 和BCMA的结合被可溶性受体-Fc融合蛋白阻断。当TACI或BCMA被阻 断时，IgM和IgA产生均显著下降。当向培养物中加入BAFFR-Fc时，未观 察到这一现象，表明用抗LOX-l刺激的DC产生的APRIL在免疫球蛋白产 生增加中起重要作用。
上述发现极大地提示通过LOX-l特异性活化的试剂例如作为疫苗佐剂 或作为免疫受损个体中的免疫系统刺激剂的治疗性应用。另外，所述发现预 期阻断通过LOX-l的天然或异常调节的活化可能具有应用(例如引发移植器 械的耐受或改善自身免疫疾病)。
抗LOX-l mAb活化B细胞CD19+ B细胞表达LOX-l (图1和图8a), 这预测B细胞上表达的LOX-l的作用。图8b中的数据表明，触发B细胞上 的LOX-l导致分泌性IL-8和MIP-la产生增加，提示LOX-l可对B细胞活 化有直接作用。除了 IL-8和MIP-la夕卜，与对照mAb相比，当用抗LOX-l mAb 刺激B细胞时，IL-6和TNFa也有轻微增加。图8c显示用抗LOX-l mAb活 化的B细胞总IgG、 IgM和IgA的分泌量增加。
上述关于通过LOX-l结合直接作用于B细胞的发现补充了上述通过 LOX-l起作用或针对LOX-l的试剂的治疗性应用的范围。
LOX-l在T细胞应答中的作用通过LOX-l刺激的DC表达的共刺激 分子的水平提高，细胞因子和趋化因子的产生也升高(图1和3),表明LOX-l 对细胞免疫应答以及体液免疫应答起作用。这通过混合淋巴细胞反应(MLR) 测试。用LOX-l特异性mAb刺激的DC显著增强了纯化的同种异体T细胞增殖(图9a)。通过LOX-l活化的DC比用对照mAb刺激的DC更有效地致 敏(prime) Mart-l特异性CD8T细胞(上组的图9b中)。更重要的是，通过 L0X-1的信号传导允许DC将Mart-l肽交叉致敏至CD8T细胞中(下组的图 9c中)。图9b和9c右组分别显示来自5和4个不同正常供体中的细胞产生 的数据，这表明LOX-l在增强DC功能方面具有重要作用，导致改善的致敏 和抗原交叉致敏至CD8T细胞中。抗LOX-l mAb和抗原融合蛋白也比对照 mAb融合蛋白诱导更有力的抗原特异性CD8T细胞应答。用10或1 nM的 mAb与Flu Ml蛋白的结合物负载IL-4DC，与自体CD8+ T细胞共培养7天。 细胞用抗CD8和Flu Ml四聚体染色。图9d中的数据显示抗LOX-l融合蛋 白诱导了显著增强的Flu Ml特异性CD8T细胞应答。
已发现LOX-l活化的DC影响邻近的T细胞，指导其增殖增加。此外， 当抗原在该相互作用中存在时，LOX-l活化的DC导致抗原特异性T细胞的 扩增增加。这表明LOX-l活化例如在疫苗环境下可指导抗原特异性初始T 细胞的选择性扩增-其与上述LOX-l活化对B细胞的直接和间接的作用一 起，清楚地预测了抗原-特异性B细胞的扩增以及由此抗原特异性抗体的产 生。关于抗LOX-l用途的另一个证明是当抗原通过抗LOX-l mAb结合物直 接集中于DC时，所述DC指导该抗原特异性记忆CD8+细胞的扩增。
非人灵长类动物体内DC表达LOX-l-为测试非人灵长类(食蟹猴)血DC 是否被抗人LOX-l mAb识别，用抗LOX-l mAb和对其他细月包标记物CD3、 CD14、 CDllc、 CD27、 CD56和CD16的抗体染色猴PBMC。图10中的数 据显示CD14和CDllc+细胞均被抗人LOX-l mAb染色。与CD14+和CDllc十 细胞不同，CD3+、 CD16+、 CD27+和CD56+细胞不表达LOX-l 。该数据表 明某些抗人LOX-l mAb对猴抗原呈递细胞具有交叉反应性。这大大地有利 于本文所描述的发明用于实际，因为猴可用作用于预想的人治疗的有效且安 全研究的有效模型。
图11显示了典型rAb抗原融合蛋白的还原SDS.PAGE分析一包括抗 LOX-1—15C4.PSA，其能够指导前列腺特异性抗原(高亮的灰色)至抗原呈递 细胞表面，用于针对前列腺癌的疫苗接种。
图12和13直接表明抗LOX-l rAb递送连接的抗原至含LOX-l细胞的 表面的能力。
图14A和14B显示B细胞通过抗LOX-l mAb活化的DC的粘膜归巢。 图14B显示测定了 B细胞上的粘膜同源受体的表达水平。与用抗LOX-l激 活的DC共培养的原初B细胞增殖要好于与用对照免疫球蛋白(Ig)刺激的DC 培养的B细胞(图14A中的上两组)。与用抗LOX-l mAb刺激的DC共培养 的原初B细胞表达CCR10，该原初B细胞具有增强的增殖和浆细胞分化能力。那些B细胞可迁移响应CCL28。尽管已知CCR10是远端肠归巢受体， 但是最近的研究显示呼吸粘膜也表达显著量的CCL28。因此，CCR10现已 证实是粘膜归巢受体。
图14B显示，与经LOX-l活化的DC相互作用的B细胞^t程序化归巢 至粘膜。与显示该DC活化B细胞增殖、分化为浆样细胞以及提高免疫球蛋 白的分泌(包括当LOX-l活化与通过LOX-l的抗原靶向相关时的抗原特异性 Ig)的数据一起，该B细胞CCR10表达的增加表明LOX-l活化和抗原靶对提 高抗原特异性粘膜免疫的高度可能性。
图15显示，抗LOX-l mAb有助于提高IgAl和lgA2的产生。下一步， 确定用抗LOX-l mAb活化的DC是否能诱导原初B细胞产生IgAl和IgA2。 通过FACS分选纯化原初B细胞(IgD+CD27-)。图15显示用经抗LOX-l活 化的DC培养的原初B细胞导致IgAl和IgA2的产生显著增加。IgM和IgG 水平也都被经抗LOX-l刺激的DC显著提高。总之，通过DC-凝集素，尤其 是LOX-l活化DC,可导致提高的体液免疫应答。特别地，所述DC诱导的 B细胞表达粘膜归巢受体CCR10,并可产生IgAl和IgA2。因此，用抗LOX-l 制备的疫苗能诱导强的粘膜免疫应答。
图16显示负载抗LOX-l和流感病毒血凝素(HAl, H1N1, PR8)的重组融 合蛋白的DC诱导原初B细胞分泌flu特异性的IgM。与抗LOX-l相比，抗 ASGPR和抗CLEC6的HAl融合蛋白导致弱的应答。与负载抗LOX-1-HA5 的DC共培养的原初B细胞也产生HAl特异性的IgM。总之，由抗凝集素 mAb和抗原制备的疫苗可诱导预防病毒感染的强粘膜IgAl和IgA2应答。
图17显示抗LOX-l-HA5耙向的DC也能扩增HA5-特异性CD4+ T细 胞，进一步证实了本发明作为有效疫苗的用途。
图18显示抗LOX-l疫苗能引发DC-亚型特异性的免疫应答。确定是否 用抗LOX-l-HA5疫苗靶向的不同DC亚型引发不同范围的免疫应答，该免 疫应答通过定义为用HA5肽刺激的HA5特异的T细胞扩增来证明。因此， 基于抗LOX-l的疫苗通过将同一抗原靶向至不同的DC细胞亚型导致针对该 抗原广泛的免疫应答。这些数据也显示了抗LOX-l靶向疫苗在引发抗原特 异性T细胞应答中所需要的性质，所述细胞应答被高度预测为特征为它们产 生IFNy的效应细月包。
图19显示抗LOX-l抗体对短尾猴LOX-l的交叉反应性。从短尾猴中分 离相应于4个变体LOX-l cDNA的cDNA克隆，并将其设置入哺乳动物表 达载体中。图19显示三个特别期望的抗人LOX-l抗体对用这些表达载体转 染的293F细胞与用人LOX-l表达载体转染的293F细胞比较的FACS分析。 结果显示所有测试的两种mAb (15C4和11C8)对所有三种短尾猴LOX-l变体均显示交叉反应性，而10F9与一种变体交叉反应。这种交叉反应性是期 望的，因为其允许在人临床试验前在NHP模型中进行基于机制的毒性和效 价试验。
图20显示4个来自短尾猴的变体序列(5U1-5U4)与人L0X-1的Clustal W比对。
图21A至图21D显示通过LOX-l的抗原递送导致抗原特异性的CD4T 细胞应答。测试抗L0X-1-HA1和对照IG-HA1的结合亲和力(图21A)。抗 L0X-1-HA1和对照Ig-HA1均可与单核细胞衍生的IFNDC结合，但抗 L0X-1-HA1比对照Ig-HA1与DC结合得稍好一些。测量了负载抗 L0X-1-HA1或对照Ig-HA1的DC诱导的CD4 T细胞增殖。图21B显示负 载抗L0X-1-HA1的IFNDC诱导的CD4 T细胞增殖(69%)比用对照Ig-HA1 诱导的CD4 T细胞增殖(7%)更大。
为确定增殖的CD4 T细胞是否为抗原(HAl)-特异性的，用负载HA1肽 池的IFNDC再刺激用负载抗L0X-1-HA1的DC扩增的CD4 T细胞。图21C 显示肽池37-48导致产生IFNy的CD4 T细胞的频率相对4交高。还测定了 CD4 T细胞对肽池37-48中单个肽的反应性。图21D显示CD4 T细胞对三种肽， 肽43、肽44和肽45应答产生细胞内IFNy。总之，这些数据显示用抗 LOX-1-HA1革巴向人DC能诱导抗原特异性的CD4T细胞应答。
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权利要求
1.一种用于增加LOX-1-表达性抗原呈递细胞抗原呈递效力的方法，所述方法包括使所述抗原呈递细胞与抗LOX-1特异性抗体或其片段接触，其中所述抗原呈递细胞被活化。
2. 权利要求1的方法，其中所述抗原呈递细胞包括分离的树突细胞、外 周血单核细胞、单核细胞、髓样树突细胞及其组合。
3. 权利要求1的方法，其中所述抗原呈递细胞包括已在体外与GM-CSF 和IL-4、干扰素a、抗原及其组合一起培养的如下细胞分离的树突细胞、 外周血单核细胞、单核细胞、B细胞、髓样树突细胞及其组合。
4. 权利要求l的方法，所述方法还包括活化与GM-CSF和IL-4或干扰 素a接触的抗原呈递细胞的步骤，其中与所述LOX-l特异性抗体或其片段 的接触增加抗原呈递细胞上的CD86和HLA-DR的表面表达。
5. 权利要求l的方法，其中所述抗原呈递细胞包括树突细胞，所述树突 细胞已与GM-CSF和IL-4或干扰素a接触以活化该树突细胞，其中所述活 化的树突细胞增加CD86、 CD80和HLA-DR的表面表达。
6. 权利要求1的方法，其中所述抗原呈递细胞包括树突细胞，所述树突 细胞已与GM-CSF和IL-4或干扰素a接触以活化该树突细胞，其中所述活化的树突细胞增加IL-12p40、 MCP-l 、 IL-8、 TNFa、 IL-6、 MIP-la和IL-lb及其组合的分泌。
7. 权利要求1的方法，其中所述抗原呈递细胞包括树突细胞，所述树突 细胞已与GM-CSF和IL-4或干扰素a接触，且所述LOX-l特异性抗体或其 片段增加与通过CD40的信号传导有关的活化。
8. 权利要求1的方法，其中所述抗原呈递细胞包括树突细胞，所述树突 细胞已与GM-CSF和IL-4或干扰素a接触，且所述LOX-l特异性抗体或其 片段增加了树突细胞的共刺激活性。
9. 权利要求1的方法，其中与所述LOX-l特异性抗体或其片段接触的 树突细胞的在一个或多个基因的表达谱发生变化，所述基因选自图4中的那 些基因。
10. 权利要求1的方法，其中LOX-l特异性抗体或其片段选自克隆 9D7-10-4、 8B4-10-2、 11C8-B7、 13B11-A8及其组合。
11. 权利要求1的方法，其中以LOX-l特异性抗体或其片段通过LOX-l 受体活化的树突细胞激活B细胞、T细胞及其组合。
12. 权利要求1的方法，其中LOX-l特异性抗体或其片段与 Cohesin/Dockerin对的一半结合。
13. 权利要求1的方法，其中LOX-l特异性抗体或其片段与 Cohesin/Dockerin对的一半结合，且该对的另 一半与一种或多种细胞因子结 合，所述细胞因子选自白细胞介素，转化生长因子(TGF),成纤维细胞生长 因子(FGF),血小板衍生生长因子(PDGF),表皮生长因子(EGF),结締组织活 性肽(CTAP),成骨因子，以及这些生长因子的生物活性类似物、片段和衍生 物，B/T细胞分化因子，B/T细胞生长因子，促有丝分裂细胞因子，趋化细 胞因子和趋化因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-a, IFN-P, IFN-y， IL1, IL2, IL3, IL4, IL5， IL6, IL7, IL8， IL9, IL10, IL11, IL12, IL13， IL14， IL15, IL16, IL17， IL18等,瘦素，肌肉生长抑制素，巨噬细胞刺激 蛋白，血小板衍生生长因子，TNF-a, TNF-(3， NGF, CD40L， CD137L/4-1BBL, 人淋巴毒素-P， G-CSF, M-CSF, GM陽CSF， PDGF, IL-la, IL1画卩，IP-10, PF4, GRO, 9E3,促红细胞生成素，内皮抑素，血管抑素，VEGF,包括(3 转化生长因子(例如TGF-pi、 TGF-(32、 TGF-(33)在内的转化生长因子(TGF) ^!&因家族；骨形态发生蛋白(例如BMP-1 、 BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP-7、 BMP-8、 BMP-9);肝素结合生长因子(成纤维细胞生长因 子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长 因子(IGF));抑制素(例如抑制素A、抑制素B);生长分化因子(例如GDF-1); 以及活化素(例如活化素A、活化素B、活化素AB)。
14. 一种表达LOX-l特异性抗体或其片段的杂交瘤，其中所述LOX-l 特异性抗体或其片段活化抗原呈递细胞以表达新的表面标记物、分泌一种或 多种细胞因子或表达新的表面标记物和分泌一种或多种细胞因子两者兼具。
15. 权利要求14的杂交瘤，其中所述杂交瘤选自克隆9D7-10-4、 8B4-10-2、 11C8-B7、 13B11-A8及其组合。
16. —种用于增强B细胞免疫应答的方法，所述方法包括在抗原存在下 用LOX-l特异性抗体或其片段触发树突细胞上的LOX-l受体，其中已与LOX-l活化的树突细胞接触的B细胞增加抗体产生、分泌细胞因子、增加B细胞活化表面标记物表达及其组合。
17. 权利要求16的方法，其中所述B细胞分泌IL-8、 MIP-la、 IL-6、 TNFa及其组合。
18. 权利要求16的方法，其中所述B细胞包括浆细胞。
19. 权利要求16的方法，其中由抗LOX-l抗体活化的B细胞归巢至粘膜。
20. 权利要求16的方法，其中所述活化的B细胞表达LOX-l。
21. 一又利要求16的方法，其中所述B细胞增加IgG、 IgM、 IgA及其组 合的产生。
22. —种用于增强B细胞免疫应答的方法，所述方法包括以LOX-l特 异性抗体或其片段触发B细胞上的LOX-l受体，其中所述B细胞增加抗体 产生。
23. 权利要求22的方法，其中所述B细胞增加分泌性IL-8、 MIP-la、 IL-6、 TNFa及其组合的产生。
24. 权利要求22的方法，其中所述B细胞增加IgG、 IgM、 IgA及其组 合的产生。
25. 权利要求22的方法，其中所述B细胞增加IgAl和lgA2的产生。
26. —种用于增强T细胞活化的方法，所述方法包括以LOX-l特异性抗 体或其片段触发树突细胞上的LOX-l受体，并使T细胞与该LOX-l活化的 树突细胞接触，其中T细胞活化被增强。
27. 权利要求26的方法，其中所述树突细胞进一步与GM-CSF和IL-4、 干扰素a、抗原及其组合接触。
28. 权利要求26的方法，其中增加CD8+T细胞的活化。
29. 权利要求26的方法，其中所述T细胞在暴露于用抗LOX-l抗体或 其片段活化的树突细胞时增殖。
30. —种抗LOX-l免疫球蛋白或其部分，其由哺乳动物细胞分泌并且该 免疫球蛋白与抗原结合，其中所述免疫球蛋白将所述抗原靶向至抗原呈递细 胞，且该抗原呈递细胞刺激CD4+细胞的增殖。
31. 权利要求30的免疫球蛋白，其中所述抗原特异性结构域包括全长抗 体、抗体可变区结构域、Fab片段、Fab，片段、F(ab)2片段、Fv片段，以及 Fabc片段和/或具有部分Fc结构域的Fab片段。
32. 权利要求30的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其部分包含SEQ ID NO.: 1-11中的至少一个。
33. —种疫苗，其包含用LOX-l特异性抗体或其片段活化的树突细胞。
34. —种模块式rAb载体，其包含LOX-l特异性抗体结合结构域，该抗 体结合结构域与一个或多个包含cohesin-dockerin结合对的一半的抗原载体 结构域连接。
35. 权利要求34的rAb,其中所述抗原特异性结合结构域包含抗体的至 少一部分。
36. 权利要求34的rAb，其中所述抗原特异性结合结构域包含与 cohesin-dockerin结合》于的一半构成融合蛋白的4元体的至少一部分。
37. 权利要求34的rAb,其还包含与抗原结合的cohesin-dockerin结合 对的互补性一半，其中该抗原与模块式rAb载体形成复合物。
38. 权利要求34的rAb,其还包含与抗原构成融合蛋白的 cohesin-dockerin结合只于的互氺卜'1"生一半。
39. 权利要求34的rAb,其中所述抗原特异性结构域包括全长抗体、抗 体可变区结构域、Fab片段、Fab，片段、F(ab》片段、Fv片段，以及Fabc片 段和/或具有部分Fc结构域的Fab片段。
40. 单独地或与共激活剂一起结合在免疫细胞上的LOX-l受体、联合活 化抗原.呈递细胞的试剂用于治疗性应用的用途。
41. 免疫细胞上的LOX-l结合剂用于制备疫苗的用途，所述LOX-l结 合剂与或不与激活剂 一起与 一个或多个抗原连接。
42. 抗LOX-l剂作为免疫细胞共激活剂用于增强通过免疫细胞上表达 的除LOX-l外的细胞表面受体引起的免疫应答的用途。
43. 能够通过LOX-l受体结合并活化免疫细胞的抗LOX-l抗体V区序 列的用途。
44. 与一种或多种毒性剂连接的DC-LOX-l结合剂用于在已知或怀疑由 的病理细胞或组织的情况下的治疗性目的的用途。
全文摘要
本发明包括用于靶向免疫细胞上LOX-1受体的组合物和方法，以及抗LOX-1抗体的用途。
文档编号C07K16/00GK101668772SQ200880013222
公开日2010年3月10日 申请日期2008年2月22日 优先权日2007年2月23日
发明者G·祖拉夫斯基, J·F·班彻罗, S·吴, S·祖拉夫斯基, 李大鹏 申请人:贝勒研究院