双链锁核酸组合物的制作方法

专利名称：双链锁核酸组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域和免疫刺激剂。更具体地，本发明涉及双链 锁核酸组合物。所述核酸可包括dsRNA。
背景技术：
先天免疫系统既具有针对入侵病原体的第一道防线的作用，又有对 适应性免疫应答的支持作用。Toll样受体(toll-like receptor, TLR)是对 先天和适应性免疫应答的起始都具有关键作用的一类受体。TLR各自
应答于不同的传染原标记，例如，TLR4特异性应答于脂多糖，TLR9 偏好性地应答于曱基化的核酸(如含有CpG基序的核酸)，而dsRNA 是TLR3的优选激动剂。
双链RN A (dsRN A)是病毒感染的一种常见的复制中间体。当宿主中 发生病毒复制或者宿主暴露于病毒复制模拟物(如polyIC双链RNA) 时，TLR3起始非特异性先天免疫应答。TLR3的刺激导致NF-kB的激 活及其后炎性细胞因子(包括干扰素)的产生，所述细胞因子进而通过 刺激I类和II类MHC的表达提高来增强适应性免疫应答。
dsRNA的免疫刺激特性对癌症疗法的开发具有意义。polyIC作为佐剂 并与治疗剂组合使用的用途是众所周知的。此外，polyIC dsRNA已与其 他制剂组合来提高稳定性。美国专利4,346,538描述了 polyIC复合物 ("polyICLC")以及所述组合物的制备和使用方法，所述组合物中含有相对 高分子量的polyl:C、分子量范围在13-35 kDa的聚L-赖氨酸(一种多聚 阳离子的多肽)和羧甲基纤维素。还曾提出用polyICLC作为治疗剂来治 疗一些癌症和病毒性疾病(如HIV或埃博拉病毒)以及多发性硬化症(美 国专利7>开2006/0223742 )。还证明了另一些dsRNA也具有作为癌症治疗剂的潜力。例如，已描述 dsRNA与淋巴因子的组合在作为治疗黑素瘤的治疗剂时具有协同效应(EP 0281380)。还描述了 TLR3激动剂(包括polyIC和polyAU)用于癌症治 疗的改进方法(US 2006/0110746)。
Zhu等(J. Translational Medicine 2007 5:10 doi:10.1186/1479-5876國5國 10)描述了 polyICLC (肌内施用)和特异性肿瘤免疫原(与IFA组合于 皮下施用)的组合为患CNS神经胶质瘤的小鼠的一种有效治疗方法。
一些PolyI:C组合物已用于治疗慢性疲劳综合征、与抗病毒剂组合用 于治疗HIV感染变体(Thompson等，Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1996 Jul; 15(7):580-7; Gillespie等，In Vivo. 1994 May-Jun; 8(3):375-81; Strayer 等，Clin Infect Dis 1994 Jan;18 Suppl l:S88-95)。
还鉴定出另 一些特异性寡核苷酸基序具有免疫刺激效应，例如CpG 二 核普酸。DNA中一些未曱基化的CpG基序是TLR9的激动剂，已建议作 为癌症疗法(Krieg AM. 2007 J. Clin Invest 117:1184-94)。 US 7，148，191描述 了一种与小(6_20个氨基酸)抗原组合〗吏用的抗原性组合物，所述抗原组 合物包含多聚阳离子的多肽以及含有肌苷和胞嘧啶的核酸。WO 01/93905 描述了不含CpG基序的免疫刺激性寡脱氧核苷酸，提到了副作用(如高 系统性的TNF-a)以及缺乏特异性。
治疗性的核酸(包含RNA)可被其刺激引发的免疫应答所降解，所述 降解过程是先天病毒防御应答的一部分。US 6,194,388 (及其中的参考文 献)指出，将核酸组合物中的核糖核苷换成脱氧核糖核苷不能有效提高稳 定性，因为特定形式的核糖看来是免疫激活所必需的。提高剂量也不能规 避稳定性问题，因为毒性是剂量依赖性的。
期望得到稳定性改良的佐剂，该佐剂适合与至少一种治疗剂(例如但 不仅限于病毒性免疫原)组合共同施用，并能够增强病毒性免疫原的免疫 刺激活性。
发明概述
本发明涉及免疫刺激剂，并提供双链锁核酸(locked nucleic acid， LNA) 组合物。所述核酸可包括dsRNA。
9本发明的另 一 目标是提供一种改进的包含dsRNA的化合物。
本发明还提供下式的化合物
<formula>formula see original document page 10</formula>
式n
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，M是如果n-O则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，M是如果p一则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V、 W、 Z和Q;U壬意核苷；
画m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-SB苷、肌苷类似物核苷、腺噤呤或腺嘌呤类似物核苷；
-0^0&嘧啶、胞嘧咬类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；
画其中V、 S、 W、 Z、 D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸 (LNA)单体。
本发明还提供一种如上文定义的化合物，其中B为肌苷，D为胞嘧啶。
本发明涉及一种组合物，所述组合物包含如上文定义的化合物、多 聚阳离子多肽(如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸)和羧甲基纤维素。
本发明还提供包含任何上文所定义化合物和免疫原(如HspE7 )的 组合物。本发明还提供下式的化合物
I I I
Rk3-Zn- (Dm》-Qp—Rk4
式IIa
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，^Ht是如果n-0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，M是如果p一则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V、 W、 Z和Q可以独立地为通过核苷间连接基团连接的任意核糖核 苷，其中V能与Z成键，W能与Q成键；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-SB苷、肌苷类似物核苷、腺噤呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧咬类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；
國kp k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数;
-R可以独立地是通过核普间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核 苷，或者R可以不存在。例如，在一些实施方案中，第一链的5，R核糖核 苷能够与第二链的3，R核糖核苷成键；此外，
-其中V、 S、 D、 Z、 Q、 R和W中的一个或多个包含一个或多个 LNA单体。
式IIa代表一种双链RNA分子，该分子具有5，、 3'的突出碱基或者 同时具有5'和3'的突出碱基，还具有互补核苷成键(用单横线代表)的第一链Rk-Vn-(Sm)-Wp-Rk和第二链Rk-Zn-(D加)-Qp-Rk。第 一链以5，到3'
方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到
右显示为3'到5，)表示。
本发明还涉及治疗受试者中的癌症、与细菌性或病毒性病原体相关
的疾病或病症的方法，该方法包括对该受试者施用下式的化合物
Vn-(Sm)-Wp
Zn-(DJ-Qp
式n
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，M是如果n-0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，a是如果p一则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
画V、 W、 Z和Q;C任意核苷；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-S^J/L苷或肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-DAJJ&苷或胞嘧啶类似物核苷、尿苷或尿苷类似物核苷；
-其中V、 W、 S、 Z、 D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸 (LNA)单体。
本发明还涉及上文的方法，其中S是肌苷、D是胞嘧啶。此外，所 述化合物可以与免疫原(如HspE7) —起施用。
根据本发明的另一方面，提供增强受试者中针对免疫原之免疫应答的方法，该方法包括对该受试者施用含有免疫原和dsRNA(含有LNA) 的组合物。免疫原可以是灭活的完整生物体、蛋白质、肽、融合蛋白、 融合肽、重组蛋白或重组肽。免疫原可以是HspE7。含有LNA的dsRNA 实例包括但不限于本发明的式II-VII。
本发明含有dsRNA的分子中包含一个或多个LNA。这些含LNA 的dsRNA表现出稳定性提高的特性，同时保留了 dsRNA的活性。LNA 能与单链和双链核酸形成核苷碱基特异性双链体和三链体。这些复合物
表现出比由普通核酸形成的相应复合物更高的热稳定性。 本发明还提供下式的化合物
V"Sm)-Wp
式IVa
其中
画n是从0到10的任意整数，或其间的任意lt值，^Ht是如果n-0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
國p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，^是如果p-0则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V和W是任意核普、核糖核香、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖 核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
國m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-SB苷、肌苷类似物核苷、腺噪呤或腺噪呤类似物核苷；
-其中V、 S和W中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
本发明还提供下式的组合物Qp-(Dm)-Zn
式r/b
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，a是如果n-0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p=0则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-Z和Q^1任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖
核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-D是胞嘧啶、胞嘧咬类似物核苷、尿嘧啶、或尿嘧啶类似物核苷；
-其中Z、 D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
本发明还提供制备下式化合物的方法
vn-(sm)-wp
I I I
Zn-(Dm)-Qp 丄.
式II
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，^Ht是如果n,则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的4壬意整数，或其间的任意^t值，M是如果p=0则
14n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10; 國V、 W、 Z和Q是任意核苷；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-SB苷或肌苷类似物核苷、腺噪呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞苷或胞嘧啶类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧咬类似物核苷；
■其中V、 S、 W、 Z、 D和Q中的一个或多个包含一个或多个LNA 单体，所述方法包括
将符合式Vn-(SJ-Wp化合物的第一寡聚体和符合式Qp-(Dm)-Zn化合物
的第二寡聚体以约0.5-1.0到约1.0-0.5的摩尔比混合，并使所述第一和第 二寡聚体退火形成双^核酸。
本发明提供一种下式的化合物
Rk广V"Sm)國Wp-Rk2
式IVc
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，M是如果i^0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，^H^是如果p^则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V和W是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖
核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
國&和k2可独立地是0到10的任意整数，或者其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核香间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核 苷，或者R可以不存在。例如，在一些实施方案中，第一链的5，R核糖核 苷能够与第二链的3，R核糖核苷成键，其中V、 S、 R和W中的一个或多 个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
本发明提供下式的化合物
Rk4_ Qp-(Dm)- Z -Rw
式IVd
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，*是如果11=0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p峋则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-Z和Q;1任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖
核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-D是胞嘧咬、胞嘧咬类似物核苷、尿嘧啶、或尿嘧咬类似物核苷；
-k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或者其间的任意整数；■ R可以独立地为通过核普间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核 普，或者R可以不存在。在一些实施方案中，例如，第一链的5'R核糖核 苷能够与第二链的3，R核糖核苷成键，其中R、 Z、 D和Q中的一个或多 个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
本发明提供制备下式化合物的方法
<formula>formula see original document page 17</formula>
式na
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果11=0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，M是如果p^则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V、 W、 Z和Q^1任意核苷；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
國SB苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷； -D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷； 國kp k2、 h和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数; -R可以独立地为通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核
苷，或者R可以不存在，所述方法包括将符合式Rk-Vn-(Sn)-Wp-Rk化合物
的第一寡聚体和符合式Rk-Qp-(Dm)-Zn-Rk化合物的第二寡聚体以约0.5-1.0 到约1.0-0.5的摩尔比混合，并使所述第一和第二寡聚体退火形成双链核 酸。本发明提供下式的化合物:
Via:
VIb:
Vic:
VW:
I I I
Rk3一 (Qm) — (FlnA
R)a「 (D卞(E，
Rk3— (Sm) - (FlnA
Rkl- ( Sm) - (ELNA
Rk广(Dm) - (FLNA
Rkl— {Dm)' - (E， R)c3— (Sm) — (Flna
I I —(Sm)—Rk4
- (Sm) -R)c2
I I
一 (ru —Rk3
(Sm)-Rk2
I I
(Dm>—Rk4
- (Dm) -Rk2
一 (Sm) _Rk4
其中
-ELNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、 C、 G中的一个或多个是LNA;
-F^A是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、 C、 G中的一个或多个是LNA;
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
S^IJ/L普、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷;-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核普、尿嘧咬或尿嘧咬类似物核苷； -、、k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数; -R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。 本发明还提供下式中任一个的化合物
Vila: VIIb: VIIc: VIId: Vile: VIIf:
vng:
VIIh:
其中
國ELNA是CpG或CpG基序， C、 G中的一个或多个是LNA;
Rk3-(Sm)-(ELNA) Rk2画(DmHFLN八) Rk3-(Dra)-(E,) Rk广(Sm)-(FLNA) (ELNA)國(Sm)-Rk3 (FLNA)-(Dm)隱Rkl (ELNA)-(Dm)-Rk2 (FLNA)漏(Sm)- Rkl
其中组成该CpG或CpG基序的核普、
國FLNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、 C、 G中的一个或多个是LNA;
画m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
19-SB苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺噪呤类似物核苷； -D是胞嘧啶、胞嘧咬类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；
k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数; -R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。 才艮据本发明的一些方面， 國Elna是SEQ ID NO: 23， -F脆是SEQIDNO: 24。 本发明还提供下式中任一个的化合物
Vie:
Rki「 (Sm)|-Gl，-Tlna-Cujiji-Glna-Tlnjl-Tlna- (Dm) _Rk2
Rk3— (Dm) —ClnA-Alna一Glna-Cljja一Alna-AlnA- (Sm) -Rk4
VIf:
VIg:
Rki「 (^m)i-G，-T，-Cl，-Gl，-T，-TLNA- (Sm) _Rjc2 R)o- (Sm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Al;na- (Dm) -Rk4
Rki- (Sm) -Glna濕Tlna-Clna-Glna-Tlna-T乙na- (Sm) -Rk2 Rk3- (Dm) -Clna-Alna-Glua—Clna-Alna-Alna- (Dm) —Rfc4
Vlh:
Rki"* (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Gl，-Tlna-Tlna- -R，
其中
20-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-S^J/L苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧咬、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；
-&、 k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数;
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
本发明还提供下式中任一个的化合物
VIi: Rki- (Sm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Ti^a-Tlna- (Dm) -Rk2
VIj: Rk3-(Dm)-C惑A跳G
VIk: Rki- (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Sro) -Rk2
Wl: Rio-《Sm)-CLNA Alna Glna Clna Alna ALNA_ (Dm)-Rk4
VIhlK Rkl- (Sm) -Glna-TW-Clna-Glna-Tlna-TW- (Sra) -Rk2
VIn : Rk3-(Dm)-Clna Alna Glna CLNA Alna Alna-(Dm) -Rk4
VIo: R)ci- (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Dm) -R乂2
Wp: Rk3-(Sm)-Clna Alna Glna Clna Alna Alna_ (Sm)-Rk4
其中
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、
2126、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-SB苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧咬类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；
-ki、 k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数;
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
本发明提供制备下式化合物的方法(A)
Vie:<formula>formula see original document page 22</formula>
其中
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-S^J/L苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺噪呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；
画lq、 k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数;
-R可以独立地为通过核香间连接相连的任意核糖核普。
所述方法包括
将符合式VIi化合物的第一寡聚体和符合式VIj化合物的第二寡聚体以从约0.5:1.0到约1.0:0.5的摩尔比混合，并使所述第一和第二寡聚体退 火形成双链核酸。
VIlS Rki- (Sm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlma-Tlna- (Dm) -Rjc2
VIj: Rk3- (Dm) ,Clna Alna Glna Clna Alna Alna- (Sm) -Rk4,
本发明提供制备下式化合物的方法(B) VIf:
Rki— (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Gijja_Tlna_Tlna- (Sm) -Rk2
II III I I II I Rk3- (Sm) -Clna-Alna-Glna-Clkta-Alna-Alna- (Dm) -Rk4
其中
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-S^J/L苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧咬、胞嘧咬类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；
-b、 k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核香间连接相连的任意核糖核苷
所述方法包括
将符合式VIk化合物的第 一寡聚体和符合式VII化合物的第二寡聚 体以从约0.5:1.0到约1.0:0.5的摩尔比混合，并使所述第一和第二寡聚 体退火形成双链核酸。
VIk: Rki- (Dm》-Gl腿-Tlna-C區-Glna-IW-Txjja- (Sm)醒Rk2VII: Rk3_ (Sm) -Clna Alna Glna ClnA AlnA Alna_ (Dm) -Rk4
本发明提供制备下式化合物的方法(c)
VIg:
Rki- (Sm) -Glna-Tlna一Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Sm) -Rk2
III I IIIII I
Ric3- (Dm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alna- (Dm) -R"
其中
國m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-sAJ^苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷； -D是胞嘧咬、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷； -&、 k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数； -R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷 所述方法包括
将符合式Vim化合物的第一寡聚体和符合式VIii化合物的第二寡 聚体以从约0.5:1.0到约1.0:0.5的摩尔比混合，并使所述第一和第二寡
Vim : Rki- (Sm) -Glna-Tlna-Clna-Glna_Tlna-Tlna- (Sm) -R)c2
VIn : Rio- (Dm) -Clna Alna Glna Clna Alna Alna- (Dm) -Rk4
本发明提供制备下式化合物的方法(D)VIh:
<formula>formula see original document page 25</formula>其中
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-SB苷、肌苷类似物核苷、腺噤呤或腺噪呤类似物核苷；
-D是胞嘧咬、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苦；
■ k可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷
所述方法包括
将符合式VIo化合物的第 一寡聚体和符合式VIp化合物的第二寡聚 体以从约0.5:1.0到约1.0:0.5的摩尔比混合，并使所述第一和第二寡聚 体退火形成双链核酸。
VIo: Rki- (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Dm) -Rk2
VIp: Rk3- (Sm) -Clna Alna Glna Clna Alna Alna- ( Sm) -Rk4
本发明还提供下式的化合物
<formula>formula see original document page 25</formula>
式nia
本发明还提供制备式IIIa化合物的方法，该方法包括将各为SEQ IDNO:l和SEQ ID NO:2的寡聚体相组合，并使所述寡聚体退火以提供式 Ilia的双链化合物。
本发明还提供下式的化合物
C- Auja - C *T- AT^na - AC ijja 一 C 一 C 一 C 一 C 一 C 一 C — C 一 C -
式Va
Glna- I-I-I一工-工一工-I-工-工一工-工-I-工-工 - 工一G- tlna一GmA- a- t^^- a- tl a區-c論-u-a-t腿一a-c識-c-c-c-c一c-c—c-c-c-c-c-oc—c-c—c跳
式Vb
Tlna- Guja-I-I-工-I-I-I-I-I-I-工-I-I-工-I-工-G — TjjstA-GLUA-A-TujA-Au C—T -A—Tua—A- Clha- C陽C-C陽C一C-C-C-C-C一C一C-C-C-C一C一Cuja-Alka
式Vc
本发明还提供制备式Va、 Vb和Vc的化合物的方法，该方法包括 将SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、 或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的寡聚体相组合，并使所述寡聚体退 火以分别提供式Va、 Vb和Vc的双链核酸化合物。
(Ii5)-G-Tlna-Glna-A-Tlna_A-Tlna-Glna (Ci5)-Clna-A陽Tlna-A-Tlna-C陽Alna-Clna
(SEQ ID NO: 3) (SEQ ID NO: 4)
Glna-(I，5)-G-Tlna-Glna-A-Tlna-A-Tlna Clna-(Cis)- Clna曙A-Tlna-A-U-Clna-Alna
(SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6)
Tlna-Glna-(Ii5)-Tlna隱Tlna-A-Tlna-Alna Alna-Clna-(Ci5)-Clna-A- Tlna-A- Tlna-Clna
(SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 8)
G
T
A
A
G
G
Ic
—c
Ic
-1c
-1c
-— c
--c本发明还提供具有3，未配对末端的双链寡聚体。本发明还提供制备 具有3'未配对末端的双链寡聚体的方法，该方法包括将SEQ ID NO:9 和SEQ ID NO:IO、或SEQ ID NO:ll和SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:ll和SEQ ID NO:25的寡聚体相组合，所述寡聚体可被组合并退火 以分别提供式为Vd和Ve的双链核酸化合物。
Glna-Glna-(I)15-(A)i5(SEQ ID NO:9)
(C)15-Clna-Cu ja-(U)15(SEQ ID NO:10)
Glna-Glna-(I)io-(A)io(SEQ ID NO:11)
(U) io-Clna-Clna-(C) i o(SEQ ID NO:12)
(C)io-Clna-Clna-(U)io(SEQ ID NO:25)
本发明还提供含有CpG基序的双链寡聚体。本发明还提供制备双 链寡聚体的方法，该方法包括将SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、或 SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、 或SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的寡聚体相组合，并使所述寡聚体退火以分别提供式VIg、 VIh、 VIi、 VIj和VIk的dsRNA化合物。
Glna-Glna-(I)i5- Glna-Tlna-Cixa-Glna-Tlna-Tlna-(I)i5- Gu^-Glna (SEQ ID NO: 13) Clna—Clna—(C)，5— Alna陽Alna-Clna墨Glna-Alna-Clna-(C)i5-Clna-Clna (SEQ ID NO: 14) Glna-G諷-①15- Glna-Tlna-Clna-Guma-Tlna-Tlna- (SEQ ID NO: 15)
Alna-Alna-Clna-Gusja-Alna-Cusa-(C)15-Clna-Clna (SEQ ID NO: 16)
(I)i5- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna (SEQ ID NO: 17)
(C)15- A函-Alna-C歐G歐A歐Cu^a (SEQ ID NO: 18)
27Glna-(I)i5- Glna-Tlna-ClnA-Glna-Tlna-Tlna-
(SEQ ID NO: 19)
(SEQ ID NO: 20)
(SEQ ID NO: 21)
Glna-Clna-(C)i5- Alna-Alna-Q^a-Glna-Alna-Clna
(SEQ ID NO: 22)
如前述的本发明化合物包含具有一个或多个LNA的CpG基序。这 些含LNA的核酸表现出稳定性提高的特性，同时保留了 CpG相关的活 性。LNA能与单链和双链核酸形成核苷碱基特异性双链体和三链体。 这些复合物表现出比由普通核酸形成的相应复合物更高的热稳定性。
根据本发明的一些方面，在式VIa至式VId、式VIIa至式VIIh、 或式Villa至式VIIIh中任一个所定义的化合物中，
-E通是SEQIDNO: 23,
-F函是SEQIDNO: 24。
根据本发明的一些方面，在式II、式IIa至式IIe、式IVa至式IVd、 式Via至式VId、式Vie至式VIh、式Vli至式VIp、式Vila至式VIIh、 式Villa至式VIIIh中任一个所定义的化合物中，在上述定义的化合物 中S是肌苷、D是胞嘧啶。
根据本发明的一些方面，在上述式II、式IIa至式IIe、式III、式 IIIa至式IIId、式IVa至式IVd、式Va至式Vc、式VIa至式VId、式 Vie至式VIh、式Vli至式VIp、式Vila至式VIIh、式Villa至式VIIIh 中任一个所定义的化合物中还可含有多聚阳离子多肽(包括聚赖氨酸、 聚精氨酸、聚鸟氨酸)。
本发明还提供包含上述定义化合物(式II、式IIa至式IIe、式III、 式IIIa至式IIId、式IVa至式IVd、式Va至式Vc、式Via至式VId、 式VIe至式VIh、式VIi至式VIp、式Vila至式VIIh、式Villa至式 VIIIh)和免疫原(例如HspE7)的组合物。本发明还提供治疗受试者 的方法，该方法包括对该受试者施用药用可接受剂量的所述组合物。根据本发明的另一方面，提供增强受试者对免疫原的免疫应答的方 法，该方法包括对受试者施用含有免疫原和上述定义化合物的组合物，
所述化合物定义为式II、式IIa至IIe、式III、式IIIa至式IIId、式IVa 至式IVd、式Va至式Vc、式VIa至式VId、式Vie至式VIh、式VIi 至式VIp、式VIIa至式VIIh、式Villa至式VIIIh的任一个。免疫原 可以是灭活的完整生物体、蛋白质、肽、融合蛋白、融合肽、重组蛋白 或重组肽。免疫原可以是HspE7。
根据本发明的另一方面，提供了化合物，该化合物包含含有l至 500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧咬核糖核苷之组合以及1至10个锁 核酸残基的第一单链核苷酸多聚体；和含有1至500个肌苷、胞嘧啶或 者肌苷与胞嘧啶核糖核苷之组合以及1至10个锁核酸残基的第二单链 核苷酸多聚体；其中第一单链核苷酸多聚体和第二单链核苷酸多聚体通
核酸残基的双^区。
本发明还提供一种化合物，该化合物包含含有1至500个肌苷、 胞嘧咬或者肌苷与胞嘧咬核糖核苷之组合以及SEQ ID NO: 23核酸序 列的第一单链核苷酸多聚体；和含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷 与胞嘧咬核糖核苷之组合以及SEQ ID NO: 24核酸序列的第二单链核 苷酸多聚体；其中第一单链核苷酸多聚体和第二单链核苷酸多聚体通过
酸残基的双:区。
本发明还提供佐剂或佐剂组合物，所述佐剂或佐剂组合物包含含 有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷和胞嘧咬核糖核苷之组合以及SEQ ID NO: 23核酸序列的第一单链核普酸多聚体；和含有1至500个肌苷、 胞嘧啶或者肌苷和胞嘧咬核糖核苷之组合以及SEQ ID NO: 24核酸序 列的第二单链核苷酸多聚体；其中第 一单链核苷酸多聚体和第二单链核 苷酸多聚体通过氢键键合而形成双链核酸，该双链核酸包含双链polyIC 区和含有锁核酸残基的双链区。
本发明还提供佐剂或佐剂组合物，所述佐剂或佐剂组合物包含含 有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧啶核糖核苷之组合以及1至 10个锁核酸残基的第一单链核苷酸多聚体；和含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧咬核糖核苷之组合以及1至10个锁核酸残基的第 二单链核苷酸多聚体；其中第一单链核苷酸多聚体和第二单链核苷酸多 聚体通过氢键键合而形成双链核酸，该双链核酸包含双链poiyIC区和 含有锁核酸残基的双链区。
本发明还提供具有针对TLR3和TLR9受体的双受体激动剂活性的 佐剂或佐剂组合物，所述佐剂或佐剂组合物包含含有1至500个肌苷、 胞嘧咬或者肌苷和胞嘧咬核糖核苷之组合以及SEQ ID NO: 23核酸序 列的第一单链核苷酸多聚体；和含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷 和胞嘧咬核糖核苷之组合以及SEQ ID NO: 24核酸序列的第二单链核 苷酸多聚体；其中第一单链核苷酸多聚体和第二单链核苷酸多聚体通过
酸残基的双^区。
本发明概述未必描述了本发明的所有特征。在仔细阅读下文对本发 明具体实施方案的描述之后，本发明的其他方面和特征对本领域普通技
术人员来说将是很明显的。 附图简述
在下文参考附图进行的描述中，本发明的上述特征和其他特征会更 加显而易见，在附图中
图l显示，根据本发明的一个实施方案，式Vd和Ve的双链核酸化 合物。
图2显示，根据本发明的一个实施方案，式VIg至VIk的双链核酸。
图3显示，根据本发明的一个实施方案，含有polyA和polyU区的 双链核酸。
发明详述
本发明涉及免疫刺激剂，并提供双链锁核酸(LNA)组合物。所述 核酸可包括dsRNA。
说明书中所用实施例(包括术语实例)仅用于说明，并不旨在限制
30本发明实施方案的范围和意义。
本发明提供含有polyl和polyC或者polyA和polyU寡核苷酸多聚体的组合物，其中每个寡核苷酸多聚体中含有至少一个锁核酸(LNA)残基。所述dsRNA可包含大致等摩尔量的polyl和polyC寡核苷酸多聚体(polyl:C )，或者大致等摩尔量的polyA和polyll寡核苷酸多聚体(polyA:U )。
本发明还提供包含成对寡核苷酸多聚体的组合物，所述寡核苷酸多聚体各自含有I (肌普)和C (胞嘧啶)核苷的混合物，其中所述寡核苷酸多聚体对中的I和C核苷排列成使得该寡核苷酸多聚体对能杂交形成双链分子。
本发明还提供含有polyl和polyC或者polyA和polyU寡核苷酸多聚体的组合物，其中每个寡核苷酸多聚体中含有至少一个CpG基序和至少一个锁核酸(LNA)残基。所述CpG基序可包含至少一个LNA残基。所述dsRNA可包含大致等摩尔量的polyl和polyC寡核苷酸多聚体(polyl:C)，或者大致等摩尔量的polyA和polyU寡核苷酸多聚体(polyA:U )。
本发明还提供含有寡核苷酸多聚体的组合物，所述寡核苷酸多聚体含有至少一个CpG基序和至少一个LNA残基，以及I与C残基的组合或A与U残基的组合。所述寡核苷酸多聚体可以杂交形成双链分子，例如双链RNA (dsRNA)。例如，包含CpG基序和一个或多个LNA的dsRNA可以是含有一个或多个LNA的polyl:C化合物。所述dsRNA可能含有大致等摩尔量的polyl和polyC寡核苷酸多聚体(polyl:C)，或者大致等摩尔量的polyA和polyU寡核苷酸多聚体(polyA:U )。在另一个实施例中，寡核苷酸多聚体可包含含有一个或多个LNA的CpG基序以及I与C核普的混合物或A与U核苷的混合物，其中该对中每一寡核苷酸中的CpG基序以及I和C核苷排列成杂交而形成双链分子。
含有至少一个CpG基序和一个或多个LNA的本发明dsRNA可以用于多种目的，例如但不仅限于用作佐剂或免疫刺激剂或治疗剂。例如，含有至少一个CpG基序和一个或多个LNA的dsRNA可以是含一个或多个LNA的polyl:C化合物。免疫刺激剂是起始免疫应答或在起始免疫应答中提供催化作用的化合物或组合物。所述免疫应答可以完全是先天(或非适应性)免疫应答，如诱导细胞因子(例如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子等)的产生和分泌，所述细胞因子继而刺激巨噬细胞迁移，非特异性消化外来免疫原并呈递能为适应性免疫系统所识别的免疫原。或者，所述免疫应答可以是适应性免疫应答，其对特定免疫原(如由巨噬细胞(也称作抗原呈递细胞)所呈递的免疫原)的存在产生应答。
无数词修饰的名词均包含单数及复数的含义。
佐剂是一种免疫刺激剂，其本身不具有特异性免疫原性作用，而是刺激免疫系统提高或增强对特异性免疫原或免疫原组的应答。免疫原诱导先天或适应性免疫系统应答的能力被称为免疫原的"生物活性"。佐剂可以介导、增强或刺激免疫原的生物活性。在一些实例中，缺少佐剂时免疫原可能只有极低或可忽略的生物活性。
免疫原的生物活性可以通过本领域所熟知的任何测定方法来测定。
例如，对抗原特异性CD8+ T淋巴细胞的诱导可以通过使用ELISPOT测定法(Asai等2000 Clin. Diag. Lab Immunol 7:145-154)来定量。其他形式的ELISPOT测定法可用于其他细胞因子，参看如Kalyzhny等2005.Methods Mol Biol 302:15-31; Ott等J. Immunol. Methods. 2004 Feb15;285(2):223画35; Forsthuber等Science, 271: 1728- 1730。可用于监测针对免疫原之应答的其他T细胞测定方法包括胞内细胞因子流式细胞术、增殖测定法、抗体微阵列等。参看如Nagorsen等2004. Expert OpinBiol Ther 4:1677-84,或Handbook of Experimental Immunology,第I-IV巻，D. M. Weir和C. C. Blackwell编辑，1986， Blackwell ScientificPublications。干扰素a和p可以用干扰素ELISA试剂盒(Kim等2004.Nature Biotechnology 22:321-325)来定量。多重测定法例如基于珠子的系统(Luminex、 Panomics等)能够同时定量多种细胞因子。细胞因子的实例包括IL-la、 IL-ip、 IL-2、 IL画4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL画8、 IL-9、IL-IO、 IL-12(p70)、 IL-13、 IL-15、 IL-17、 IL-18、腦a、 IF邪、IFNy、GM-CSF、 TNFa、 G-CSF、 MIP-la、 MlP-lp、 MCP画1、 EOTAXIN、RANTES、 FGF-basic、 VEGF等。为明确起见，术语"细胞因子"包括替代性术语如淋巴因子、白细胞介素、趋化因子。
32术语"受试者"和"患者"可替换使用。"受试者"是指动物或哺乳动物，包括但不仅限于小鼠、大鼠、狗、猫、猪或灵长类(包括但不仅限于猴、猩猩或人)。受试者可以之前未接触过特定免疫原或免疫原组的，或者受试者可以之前接触过特定免疫原或免疫原组。之前的接触
可由以下原因所致以特定免疫原或免疫原组有意进行的免疫、接触含有特定免疫原或免疫原组的传染原、或对第一免疫原或免疫原组的交叉反应性接触(引发对第二免疫原或免疫原组的免疫应答)。所述第二免疫原或免疫原组可以与第 一免疫原或免疫原组相似、相同或不同。
本文所用的术语"LNA修饰的寡核苷酸"包括以一个或多个LNA单体全部或部分修饰的任意寡核苷酸。因此，LNA修饰的寡核苷酸可以完全由LNA单体组成，或者LNA修饰的寡核苷酸可以包含一个LNA单体。
术语"DNA单体"是指与含氮碱基键合的脱氧核糖，而术语"RNA单体"是指与含氮碱基键合的核糖。可构成本发明多种实施方案的组合物的DNA单体实例包括但不仅限于脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞普、脱氧肌香等。可构成本发明多种实施方案的组合物的RNA单体实例包括但不仅限于腺苷、鸟苷、5-曱基尿苷、尿苷、胞苷、肌苷等。根据本发明多种实施方案的其他DNA或RNA单体可含有本领域已知的其他含氮碱基。
本文所用术语"LNA单体"一般指具有如US 6,268,4卯、US 6,794,499和US 7,034,133 (均通过参考并入本文)描述的2，-4'环状连接的核苷。与未修饰的寡核苷酸相比，双环核苷(见下文)可对寡核苷酸提供构象上的限制，并提供多种杂交或稳定模式。
术语"核苷"是指通过糖环上的1号碳原子与含氮碱基键合的核糖或脱氧核糖。含氮碱基的实例包括噪呤(如腺嘌呤、鸟噪呤、6-硫鸟噪呤、次黄嘌呤和黄噤呤)和嘧啶(如胞嘧啶、胸腺嗜啶和尿嘧啶)。噤呤核苷的实例包括腺苷(A )、鸟苷(G )、肌苷(I )、 2，-0-甲基肌苷、2，-0-甲基腺苷、2'-0-甲基鸟嘌呤、2-氯脱氧腺苷、7-卤代-7-脱氮腺苷、7-卣代-7-脱氮-鸟噤呤、7-丙炔基-7-脱氮-腺苷、7-丙炔基-7-脱氮-鸟嘌呤、2-氨基-腺苷、7-脱氮肌苷、7-硫代-7,9-双脱氮肌苷、间型霉素B、 8-氮杂肌苷、9-脱氮肌苷、别嘌呤醇核苷、8-溴肌苷、8-氯肌苷、7-脱氮-2-脱氧-黄苷、7-脱氮-8-氮杂腺苷、7-脱氮-8-氮杂鸟苷、7-脱氮-8-氮杂脱氧腺苷、7-脱氮-8-氮杂脱氧鸟苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、7-脱氮脱氧腺苷、7-脱氮脱氧鸟苷、8-氨基腺苷、8-氨基脱氧腺苷、8-氨基鸟苷、8-氨基脱氧鸟苷、3-脱氮脱氧腺苷、3-脱氮腺苷、6-巯脱氧鸟苷、N6-异戊烯基腺苷、l-曱基腺苷、1-甲基假尿苷、l-甲基鸟苷、l-曱基肌苷、2，2-二曱基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、2-甲硫基N6-异戊烯基腺苷、N-((9-P-D-呋喃核糖基-2-甲基巯嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、N-((9-p-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-曱基氨甲酰基)苏氨酸、N-((9-P-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、wybutosine、wybutoxosine 等，以及在 Freier 等 1997(Nucleic Acids Res.25:4429-4443，通过参考并入本文)中描述的其他噤呤核苷。
嘧啶核苷的实例包括脱氧尿苷(dU)、尿苷(U)、胞苷(C)、脱氧胞苷(dC)、胸苷(T)、脱氧胸苷(dT)、 5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、2'-0-甲基尿苷、2'-0-甲基胞苷、5-碘尿嘧啶、5-甲氧基-乙氧基-甲基尿嘧啶、5-丙炔基脱氧尿苷、假异胞苷、5-氮杂胞苷、5-(l-丙炔基)胞苷、2，-脱氧假尿苷、4-硫代脱氧胸苷、4-疏代脱氧尿苷、4-乙酰胞香、5-(羧基羟曱基)尿苷)2'-0-曱基胞苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氢尿苷、2'-0-甲基假尿苷、3-甲基胞苷、5-曱基胞苷、5-甲氨基曱基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-胸苷、5-甲氧基羧基甲基-2-胸苷、5-甲氧基羧基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸、假尿苷、2-硫代胸苷、5-甲基-2-胸苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、2'-0-曱基-5-甲基尿苷、2'-0-甲基尿普、3-(3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷等，以及在Frder等1997(Nucleic Acids Res. 25:4429-4443)中公开的其他取代嘧啶。
噪呤或嘧啶核苷还包括用标准方法进行的寡核苷酸合成中所用的亚磷酰胺衍生物。
术语核苷还包括式(I)的双环核苷类似物，在例如US 6268490 (通过参考并入本文)中描述-B可以是任意含氮碱基，例如嘧咬或嘌呤核酸碱基，或其类似物。
-X和Y可以相同或不同，也可以是任意核苷间连接基团。
这种双环核普类似物也可称作"锁核酸单体"或"锁核苷单体"或"LNA单体"或"LNA残基"。含有LNA单体之核酸多聚体的合成和聚合方法描述于例如WO 99/14226、 WO 00/56746、 WO 00/56748、 WO01/25248、 WO01481卯、WO 02/28875、 WO 03/006475、 WO 03/09547、WO 2004/083430、 US 6，268，4卯、US 6,794,499、 US 7,034,133 (均通过参考并入本文)。
核苷类似物的其他实例(如WO 01/048190 (其通过参考并入本文)所公开的实例)包括非LNA双环核苷，例如但不仅限于
-含有额外的C-3',C-5，-乙氧桥(ethanobridge)的双环[3丄0核苷；
國含有额外的C画1,，C誦6，画或C画6'，C画4，甲氧桥(me他ano bridge)的X5L^环[3.1.0核苷；
-含有额外的C-2'，C國3，-二氧戊环(dioxalane)的双环[3,3.0和[4.3.0核苷，所述二氧戊环以含有未修饰核苷的二聚体形式合成，其中额外的环是取代天然磷酸二酯键的核苷间连接的一部分；所述二聚体包含具有C-2',C-3'-甲醇桥的双环[3.1.0核苷，上述曱醇桥是酰胺和磺酰胺型核苷间连接的一部分；
■通过formacetal核苷间连接掺入三链体中间的双环[3.3.0葡萄糖衍生核苷类似物；
-由两个五元环和一个三元环构成骨架的三环DNA;
35-1，5-失水己糖醇核酸；以及
-具有额外的C-2，,C-3，-连接的六元环和五元环的双环[3,3.0和[4.3.0核普。
"核苷"还包括具有取代核糖(双环或其他方式)的核苷。取代核糖的实例描述于例如Freier等1997(Nucleic Acids Res. 25:4429-4443)中，所述文献通过参考并入本文。
"核普酸"是指具有通过糖环上5号碳键合的核苷间连接基团的核普。例如，在天然核酸中，寡核苷酸"骨架"是指通过相邻糖分子的5号和3号碳共价键合的交替的核糖/磷酸链，该链由多个核苷酸聚合而成。此聚合过程可包括本领域所知的化学合成方法。参看，如Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, M. J. Gait编辑,1984，IRL Press, Oxford中的Gait第1-22页、Atkinson等第35-81页、Sproat等第83-115页和Wu等第135-151页，或Molecular Cloning: aLaboratory Manual第三版.Sambrook和Russell. CSHL Press, ColdSpring Harbour, New York (均通过参考并入本文)。
聚合过程也可以是酶促的。LNA核苷三磷酸也可以用作本发明一些实施方案的核酸化合物或组合物的酶促聚合底物。LNA核苷可在PCR反应或引物延伸测定中由聚合酶(如DNA或RNA聚合酶)掺入延伸的核酸多聚体中。合适聚合酶的实例包括但不仅限于PhusionTM高保真DNA聚合酶(Finnzymes )或9°NmTM DNA聚合酶。酶促掺入LNA核普的方法描述于例如Veedu RN等2007. Nucleic Acids Symposium51:29-30、 Veedu RN等2007. ChemBioChem 8:4卯-492和Veedu等2007.Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 26: 1207- 1210;均通过参考并入本文。
核苷间连接基团是指能够作为寡核苷酸骨架的一部分连接两个核苷的基团。核苷间连接基团的实例描述于Praseuth等(Biochimica etBiophysica Acta 1489:181-206，通过参考并入本文)，包括裤酸二酯(P04-)、硫代磷酸酯(P03s-)、氨基磷酸酯(N3'-P5') (P03NH)和甲基磷酸酯(P03CH3)、肽键("PNA")等。术语"核苷酸多聚体"、"寡核苷酸"、"寡核苷酸多聚体"、"寡核苷 酸"、"核酸"、"寡聚体"或"核酸多聚体"可互换使用，是指含有至少
两个核苷酸的多聚体。核苷酸多聚体可包含单一种类的DNA单体、RNA 单体，或可包含任意组合的两种或多种DNA单体、RNA单体。核酸可 以是单链或双链，例如，双链核酸分子可包含通过互补碱基配对而杂交 的两条单链核酸。
寡核苷酸"polyl"主要包含肌苷、肌苷类似物核苷或其组合。肌苷 类似物核普包括如7-脱氮肌苷、2，-0-甲基肌苷、7-硫代-7，9-双脱氮肌苷、 间型霉素B、 8-氮杂肌苷、9-脱氮肌苷、别嘌呤醇核苷、8-溴肌苷、8-氯肌苷等。
寡核普酸"polyC"主要包含胞苷、胞苷类似物核苷或其组合。胞 苷类似物核苷包括如5-甲基胞苷、2'-0-甲基胞苷、5-(l-丙基)胞苷等。
寡核苷酸"polyA"主要包含腺苷、腺苷类似物核苷或其组合。腺 苷类似物核苷包括如2-氨基腺苷、2'-0-曱基腺苷、2-氨基-脱氧腺苷、 7-脱氮-2'-腺普、7-脱氮-2，-脱氧腺苷等。
寡核苷酸"polyU"主要包含尿苷、尿苷类似物核苷或其组合。尿 普类似物核苷包括如脱氧尿苷(dU)、胞苷(C)、脱氧胞苷(dC)、胸苷(T)、 脱氧胸苷(dT)、 5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、2，-0-曱基尿苷、5-碘尿嘧啶、 5-甲氧基-乙氧基-甲基尿嘧啶、5-丙炔基脱氧尿苷等。
"CpG基序"或"CpG元件"或"CpG位点"是指核酸中含有与 鸟苷相邻的胞苷的核苷酸基序。核苷C和G被以常规5'-3，核苷键连接 它们的磷酸酯隔开。CpG基序一般可描述为XnCpGXn,其中X是任意 核苷，n是从l到约500的任意数字或其间的任意数值，例如，从约l到 约300或其间的任意数值，从约1到约250或其间的任意数值，从约l到 约200或其间的任意数值，从约1到约150或其间的任意数值，1、 5、 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、卯、100、 125、 150、 175、 200、 225、 250、 275、 300、 325、 250、 275、 400、 425、 250、 475、 500或其间的任意数值。 如本文所描述，优选CpG基序中一个或多个核苷、C、 G是LNA。
双链核酸(包括dsRNA )分子中的链通过氢键(也称作"Watson-Crick"威基配对)以有序方式相互作用。也可通过非常规的氬键(包括Hoogsteen 威基配对)发生改变的威基配对。在一些热力学、离子或pH条件下可能 出现三螺旋，尤其是对于核糖核酸而言。上述或其他改变的氩键或威基配 对为本领域所知，并可见于例如Lehninger - Principles of Biochemistry第 三版(Nelson和Cox编辑.Worth Publishers, New York;通过参考并入本文)。
在合适温度、离子和pH *下，本发明多个实施方案的polyl和polyC 或者polyA和polyU寡核苷酸可通过"Watson-Crick"氲键形成双链复合 体。本领域技术人员能够了解适于形成上述复合体的具体温度、离子和pH 条件为本领域技术人员所知，获知上述条件的方法、计算、技术等的实施 例可见于例如Freier(1997, Nucleic Acids Res. 25:4429-4443;通过参考并入 本文)。这种双链复合物的形成也可称作"杂交"。
根据本发明多个实施方案的^^有至少一个LNA的双链RNA( dsRNA) 分子一:^描述为式II:
V"Sm)-Wp
式II表示具有第一链Vn-(SJ-Wp和第二链Zn-(Dm)-Qp的双链RNA 分子，互补核苷之间的键以单横线表示。第一链以5，到3'方向(从左到 右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3， 到5')表示。
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，#^是如果11=0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，M是如果p^则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V、 W、 Z和Q是任意核苷、核糖核普、脱氧核糖核苷、核普类似物、
核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；-m可以是从1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数， 包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-S B苷或肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧咬或胞嘧啶类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；
一其中V、 S、 W、 Z、 D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸 (LNA)单体。
根据本发明多个实施方案的含有至少一个LNA并且还含有R的双 链RNA (dsRNA)分子一般描述为式IIa:
R『Vn- (Sra) _Wp-Rk2 Rk3-Zn- (Dm) -Qp-Rk4
式na
式IIa表示具有5'、 3'或者同时具有5'和3'突出威基、并具有第一链 Ria-Vn-(Sm)-Wp-Ru2和第二链Rk3-Zn-(Dm)-Qp-Rk4的双链RNA分子，互补 核普之间的键以单横线表示。第一链以5'到3'方向(从左到右)表示， 而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3，到5，)表示。
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，*是如果11=0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p=0则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V、 W、 Z和Q可以独立地为通过核苷间连接基团连接的任意核糖核 苷，其中V能与Z成键，W能与Q成键；
-m可以是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括 5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100; -S ;U/L苷或肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D AJife嗜咬或胞嘧啶类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧咬类似物核苷； 誦ki、 k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地是通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核 苷，或者R可以不存在。在一些实施方案中，例如，第一链的5，R核糖核
苷能够与第二链的3，R核糖核苷成键；并且，
-其中R、 V、 S、 W、 Z、 D和Q中的一个或多个包含一个或多个LNA 单体。
含有polyl:C的核酸
本发明还提供式II (其中S和D是I和C )的dsRNA化合物(式
lib ):
Vn-(Im)-Wp I I I
Zn-(Cm)-Qp
式IIb
式lib表示具有第一链Vn-(Im)-Wp和第二链Zn-(Cm)-Qp的双链RNA 分子，互补核苷之间的键以单横线表示。第一链以5，到3'方向(从左到 右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3， 到5，)表示。
國n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，糾是如果11=0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
國p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，4Hf是如果p^则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
40-V、 W、 Z和Q可以独立地为通过核苷间连接基团连接的任意核苷， 其中V能与Z成键，W能与Q成键；
-m可以是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括 5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-1是肌苷或任意肌苷类似物核苷，其通过核苷间连接基团连接到V、 W和相应的肌苷或肌苷类似物核普；
-C是胞嗜咬或任意胞嘧啶类似物核苷，其通过核苷间连接基团连接 到v、 w和相应的胞苷或任意胞苷类似物核苷；并且，
-其中V、 I、 W、 Z、 C和Q中的一个或多个包含一个或多个LNA 单体。
本发明的另一些dsRNA分子包括式II (其中S和D是I和C,并 含有R的化合物)，其定义如下(式IIc):
Rki-Vn- (Im) —Wp-Rk2
I I I
Rk3-Zn- (Cm) -Qp—Rk4
式IIc
式IIc表示具有5，、 3，或者同时具有5，和3'突出M、并具有第一链 Rk-Vn-(Im)-Wp-Rk和第二链Rk-Zn-(Cm)-Qp-Rk的双链RNA分子，互补核苷 之间的键以单横线表示。第一链以5，到3'方向(从左到右)表示，而第 二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3，到5，)表示。
画n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，糾是如果11=0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从o到io的任意整数，或其间的任意数值，a是如果p^则
n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
- V、 W、 Z和Q可以独立地为通过核苷间连接基团连接的任意核糖核苷，其中V能与Z成键，W能与Q成键；
-m可以是1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包 括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-1可以是肌苷或任意肌苷类似物核苷，其通过核苷间连接基团连接到 V、 W和相应的肌苷或肌苷类似物核苷；
-C可以是胞嗜咬或任意胞嘧啶类似物核糖核苷，其通过核苷间连接 基团连接到V、 w和相应的胞苷或任意胞苷类似物；
國ka、 k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地是通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核 苷，或者R可以不存在。在一些实施方案中，例如，第一链的5，R核糖核 苷能够与第二链的3'R核糖核苷成键；此外，
■其中R、 V、 I、 W、 Z、 C和Q中的一个或多个包含一个或多个LNA 单体。
^^有至少一个LNA的双链RNA (dsRNA)分子包括式II (其中S 和D是A和U)的化合物，其定义如下(式IId): —般也描述为式IId:
<formula>formula see original document page 42</formula>
式lid
式IId表示具有第 一链Vn-(Am)-Wp和第二链Zn-(Um)-Qp的双链RNA 分子，互补核苷之间的键以单横线表示。第一链以5，到3'方向(从左到 右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3， 到5')表示。
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，#^是如果11=0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，^ff是如果p^则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
隱V、 W、 Z和Q可以独立地为通过核苷间连接基团连接的任意核苷， 其中V能与Z成键，W能与Q成键；
-m可以是1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包 括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或綱j
-A可以是腺普或任意腺普类似物核苷，其通过核苷间连接基团连接到 V、 W和相应的腺苷或腺苷类似物；
-U可以l泉嘧咬或任意尿嘧啶类似物核苷，其通过核苷间连接基团 连接到V、 W和相应的尿苷或任意尿苷类似物；并且，
-其中R、 V、 A、 W、 Z、 U和Q中的一个或多个包含一个或多个 LNA单体。
本发明的另一些dsRNA分子包括式II (其中S和D是A和U，并 含有R)的化合物，其定义如下(式lie):其中该dsRNA的至少一个核 苷是LNA<formula>formula see original document page 43</formula>
式IIe
式lle表示具有5'、 3，或者同时具有5'和3'突出^、并具有第一链
RkrVn-(L)-Wp-Rk2和第二链Rk4-Zn-(Cm)-Qp-Rk3的双链RNA分子，互补核
苷之间的键以单横线表示。第一链以5'到3'方向(从左到右)表示，而 第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3'到5，)表示。
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，M是如果n一则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，4Ht是如果p-0则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V、 W、 Z和Q可以独立地为通过核苷间连接基团连接的任意核苷， 其中V能与Z成键，W能与Q成键；
-m可以是1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包 括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或,
-A可以是腺苷或任意腺苷类似物核苷，其通过核苷间连接基团连接到 V、 W和相应的腺苷或腺苷类似物；
-U可以是尿嘧咬或任意尿嘧咬类似物核苷，其通过核苷间连接基团 连接到V、 W和相应的尿苷或任意尿苷类似物；并且，
画kp k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地是通过核普间连接基团连接到相应核苷的任意核苷， 或者R可以不存在。在一些实施方案中，例如，第一链的5'R核苷能够与 第二链的3'R核苷成键；此外，
-其中R、 V、 A、 W、 Z、 U和Q中的一个或多个包含一个或多个 LNA单体。
根据式II、 IIa、 IIb、 IIc、 IId、 lie的化合物可在R、 V、 W、 Z、 Q中的一个或多个中包含一个或多个LNA分子。例如， 一个或多个LNA 分子可以位于式II、 IIa、 IIb、 IIc、 1Id或IIe的5，端的V、 Q或者V和Q 中， 一个或多个LNA分子可以位于式II、 IIa、 IIb、 IIc、 IId或lie的3， 端的Z、 W或者Z和W中，或者一个或多个LNA分子可以位于式II、 IIa、 IIb、 IIc、 1Id或IIe的5，和3，端的V、 W、 Z、 Q或其组合中。
本发明还提供根据式II、 IIa、 IIb、 IIc、 IId或IIe的化合物，其中 V和W是LNA核苷(分别为Vlna、 Wlna ), Z和Q是LNA核苷(分别 为Z^a、 QLNA), IAJ化苷，C^IJ&苷，n和p为2， m如上述定义，可以 是从1到500或其间的任意数值(例如m是从约10到约50或其间的任意数值，例如m是约l、 2、 5、 7、 10、 12、 14、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 32、 35、 40、 45、 50、 60、 70、 80、卯、100或其间的任意数值，例如m可以是18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25),其间的核普间连接基团是磷酸二酯。这种化合物的非限制性实例 表示为式III:
Vlna-Vlna-(Ihi)-Wlna-Wlna
zlna-zlna-(Cm)-qlna-qlna
式in
本发明dsRNA的非限制性实例也可以表示为式IIIa、 IIIb、 IIIc或 IIId中的任一个，其中G是鸟嘌呤核苷、C是胞嘧咬核苷、m是22:
Glna-Glna-(!22)-Glna-Glna
Clna-Clna-(C22)-Clna-Clna
Glna"Glna-(I22)-Clna陽Clna Clna-Clna-(C22)-Glna-Glna
Qj^a-Clna-(I22)-Clna-Clna Glna-Glna-(C22)-Glna-Glna
Clna-Clna-(!22)-Glna-Glna Glna-Glna-(C22)-Clna-Clna
式UIa
式nib
式nic
式nid
根据本发明多个实施方案的含有至少一个LNA的单链核酸分子或 单链RNA (ssRNA)分子一般描述为式IVa:
Vn-(Sm)-Wp
式IVa式IVa表示具有Vn-(SJ-Wp构造(从左到右以5'到3'方向表示) 的单链核酸分子
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果11=0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p=0则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V和W是任意核普、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖
核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m可以是1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包 括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；此外，
-其中V、 S和W中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
根据本发明多个实施方案的含有至少一个LNA的单链核酸分子或 单链RNA (ssRNA)分子一般描述为式IVb:
Q"Dm)-Zn
式IVb
式IVb表示具有第一链Qp-(Dm)-Zn (从左到右以5，到3'方向表示) 的单链RNA分子。
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，糾是如果n一则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;誦p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，M是如果p-0则 ii-l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-Z和Q是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖
核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m是从1到500的任意整数，或其间的任一数值；
-D是胞嘧咬或胞嗜咬类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧咬类似物核苷；并
且，
-其中Z、 D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
在本发明的一些实施方案中，组合物可能以不同摩尔比含有式IVa 或式IVb或者同时含有式IVa和式IVb的单链RNA分子。例如，在一些 实施方案中，式IVa和式IVb的单链RNA分子可以大致约等摩尔比相组 合。式IVa和式IVb的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链 RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVa的单链RNA分子可以约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式IVb的单链RNA分子组合到组合 物中。式IVa或式IVb的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单 链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVb的单链RNA分子可以约10。/。、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式IVa的单链RNA分子组合到组合 物中。式IVa或式IVb的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单 链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
根据本发明多个实施方案的含有至少一个LNA的单链核酸分子或 单链RNA (ssRNA)分子一般描述为式IVc:Rkl-Vn-(Sm)-Wp-Rk2
式IVc
式IVc表示具有R!d-Vn-(SnO-Wp-Rk2构造(从左到右以5，到3'方向
表示)的单链RNA分子。 其中
誦n是从O到IO的任意整数，或其间的任意数值，糾是如果11=0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，^Hf是如果p一则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V和W是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖
核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m可以是1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包 括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100)
-S;U/L苷或肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-&和k2可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地是通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核 普，或者R可以不存在。在一些实施方案中，例如，第一链的5'R核糖核 苷能够与第二链的3'R核糖核苷成键，并且；
-其中V、 S、 R和W中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA) 单体。
根据本发明多个实施方案的含有至少一个LNA的单^^酸分子或 单链RNA (ssRNA)分子一般描述为式IVd:Rk3- Qp画(Dm)- Zn -Rk4
式IVd
式IVd表示具有Rk3-Qp-(DJ-Zn-Rk4构造(从左到右以5'到3'方向 表示)的单链RNA分子
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，*是如果11=0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，M是如果p=0则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-Z和Q是任意核香、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖
核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m可以是1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包 括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100)
-D是胞嘧咬或胞嘧啶类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧咬类似物核苷；
-k3和b可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地是通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核
苷，或者R可以不存在。在一些实施方案中，例如，第一链的5'R核糖核 苷能够与第二链的3'R核糖核苷成键；此外，
-其中R、 Z、 D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA) 单体。
在本发明的一些实施方案中，组合物可以以不同摩尔比含有式IVc 或式IVd或者式IVc和式IVd的单链RNA分子。例如，在一些实施方案 中，式IVc和式IVd的单链RNA分子可以以大致等摩尔比相组合。式IVc 和式IVd的 一些或所有单链RNA分子可以与另 一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，根据式IVc的单链RNA分子可以约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90。/。的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或lO倍的倍数过量与式IVd的单链RNA分子组合 到组合物中。式IVc或式IVd的一些或所有单链RNA分子可以与另一互 补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVd的单链RNA分子可以约10。/0、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90。/。的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式IVc的单链RNA分子组合到组合 物中。根据式IVc或式IVd的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补 的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
本发明单链核酸的非限制性实例可以表示为式IVe、 IVf、 IVg、 IVh、 IVi或IVj中的任一个(从左到右以5'到3'方向表示)，其中I是2'-0-甲基 肌苷，C是2'-0-甲基胞苷，G是2'-0-甲基鸟苷，T是2，-0'曱基胸苷，A 是2'-0-甲基腺苷，U是2'-0-甲基尿苷，Tj^a是带有LNA核糖的胸苷， G^a是带有LNA核糖的鸟苷，d^a是带有LNA核糖的胞苷，A^a是一 个LNA核糖的腺普，m为15:式IVe 式IVf
Glna_(Ii5)_G-Tlna-Glna-A-Tlna-A-Tlna
式IVg 式IVh
Tlna-Glna-GisKTlna-Tlna-A-Tlna-Alna
式IVi
alna-c[^a*(Ci5)-clna-A- Tlna-A Tuvu-Q^a
式iyj
在本发明的一些实施方案中，组合物可以以不同摩尔比含有式IVe 或式IVf或者式IVe和式IVf的单链RNA分子。例如，在一些实施方案中， 式IVe和式IVf的单链RNA分子可以以大致等摩尔比相组合。式IVe和 式IVf的一些或所有单链RNA分子可以与另 一互补的单链RNA分子杂交 形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVe的单链RNA分子可以约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式IVf的单链RNA分子组合到组合 物中。式IVe或式IVf的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单 链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVf的单链RNA分子可以约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式IVe的单链RNA分子组合到组合 物中。式IVe或式IVf的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单 链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在本发明的一些实施方案中，组合物可能以不同摩尔比含有根据式IVg或式IVh或者式IVg和式IVh的单链RNA分子。例如，在一些实施 方案中，式IVg和式IVh的单链RNA分子可以以大致等摩尔比相组合。 式IVg和式IVh的一些或所有单链RNA分子可以与另 一互补的单链RNA 分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVg的单链RNA分子可以约10。/。、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式IVh的单链RNA分子组合到组合 物中。式IVg或式IVh的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单 链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVh的单链RNA分子可以约10。/。、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式IVg的单链RNA分子组合到组合 物中。式IVg或式IVh的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单 链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在本发明的一些实施方案中，组合物可能以不同摩尔比含有根据式 IVi或式IVj或者式IVi和式IVj的单链RNA分子。例如，在一些实施方 案中，式IVi和式IVj的单链RNA分子可以以大致等摩尔比相组合。式 IVi和式IVj的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分 子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVi的单链RNA分子可以约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或lO倍的倍数过量与式IVj的单链RNA分子组合到组合 物中。式IVi或式IVj的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链 RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVj的单链RNA分子可以约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式IVi的单链RNA分子组合到组合 物中。式IVi或式IVj的一些或所有单链RNA分子可以与另 一互补的单链 RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。在一些实施方案中，单链核酸对(如式IVe和IVf、式IVg和IVh 或者式IVi和IVj)可在一定热力学、离子或pH条件下杂交和/或串联。
含有CpG基序的核酸
根据本发明多个实施方案的含有CpG基序的双链核酸分子(其中 CpG基序含有至少一个LNA) —般描述为式VIa-VId:
Rk广(Sm) - (ELNA) - (Dm) -Rk2 I I I I I
Rk3_ (Dm) - (FLNA) - (Sm) _Rk4
式VIa
式Via表示具有第一链Rkl- (Sm) - (ELNA) - (Dm) - Rk2和第二链R^-(Dm) - (FLNA) - (Sm) - Rk4的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表 示。第一链以5'到3'方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向 平行的方向(从左到右显示为3，到5，)表示。
Rkl- (Dm) - (ElnA) 一 (Sm) -Rk2
I I I I I
Rk3_ (Sm) _ (FlnA) _ (Dm) -Rk4
式Mb
式VIb表示具有第一链Rkl- (Dm) - (ELNA)國(Sm)國Ru2和第二链 (Sm) - ( FLNA) - (Dra) - Rk4的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表 示。第一链以5，到3'方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向 平行的方向(从左到右显示为3，到5，)表示。
Rk广(Sm) - (ELNA) - (Sm) -Rk2
II I I I
Rio- (Dm) - (FLNA) - (Dm) -Rk4
式Vic
式VIc表示具有第一链Rk广(Sm)國(ELNA) - (Sm) - Rk2和第二链R^ (Dm) - ( FLNA) - (Dm) - Rk4的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表 示。第一链以5'到3'方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向 平行的方向(从左到右显示为3'到5，)表示。<formula>formula see original document page 54</formula>
式VId
式VId表示具有第一链Rkl- (Dm)画(ELNA)画(Dm) - Rk2和第二链Rk3-(Sm) - ( FLNA) - (Sm) - Rk4的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表示。第一链以5，到3'方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3'到5')表示。
对式VIa-VId中的每一个而言
國ELNA是CpG或CpG基序，C、 G中的一个或多个是LNA;
國FLNA是CpG或CpG基序，C、 G中的一个或多个是LNA;
其中组成该CpG或CpG差^序的核普、其中组成该CpG或CpG基序的核苷、
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-S是肌苷或肌苷类似物核苷、腺噪呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧咬或胞嘧咬类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧咬类似物核香；
-&、 k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
在不应认为以任何方式进行限制的一些本发明实施方案中，CpG基序可以包含LNA核苷的两条六聚体序列
Elna = 5' - Glna Tlna Clna Glna T lna TLNA - 3'(SEQ ID NO: 23);和Flna = 5' - ALna ALna ClnaGlna ALna CLna ■ 3'(SEQ ID NO: 24)。这些序列的非限制性实例一般描述为式Vie到VIh:<formula>formula see original document page 55</formula>式VIe
式Vie表示具有第一链VIi和第二链VIj的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表示。
VIi:Rki- (Sm) -GLNA-TLNA-CLNA-Glna-Tlna-T^na- (Dm) -Rk2
VIj:Rjc3- (Dm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alna- (Sm) -Rk4
第一链以5'到3'方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3'到5')表示。
Rk:l- (Dm) -GluA-Tlna-ClnA-Glna-Tlna-TLNA- (Sm) -Rk2
I I I I I I I I I I
Rk3- (Sm) _Clna_Alna_Glna-Clna_Alna-Alna_ (Dm) -Rk4
式VIf
式VIf表示具有第一链VIk和第二链VII的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表示。
VIk: Rki- (Dm) -Glna_Tlna-Clna-Glna-TLNA_TLNA_ (Sm) _Rk2
VII:Rk3- (Sm) -CLNA-Alna_Glna_Clna-Alna_Alna_ (Dm) -Rk4
第一链以5，到3'方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3，到5')表示。
<formula>formula see original document page 55</formula>式VIg
式VIg表示具有第一链Vim和第二链VIn的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表示。
Vim: Rkl- (Sm) -GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA- (Sm) -Rk2VIll: Rk3- (Dm) _Clna_Alna-Glna_Clna-Alna-Alna- (Dm) -Rk4
第一链以5，到3'方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3，到5，)表示。
Rki— (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Glwa-Tlna-Tlna- (Dm) -Rk2
I I I I I I I I I IRfc3- (Sm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alwa- (Sm) -Rk4
式VIh
式VIh表示具有第一链VIo和第二链VIp的双链核酸分子，互补核
苷杂交的键以单横线表示。
VIo: Rk广(Dm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlma-TLNA_ (Dm) -Rk2
VIp: Rk3- (Sm) _Clna_Alna-Glna_Clna_Alna_Alna_ (Sm) -Rk4'
第一链以5'到3'方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3'到5，)表示。
对式VIe-VIh和VIi-VIp中的每一个而言
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-SB普、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-DAJ!fc嘧啶、胞嗜咬类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；
-kr k2、 &和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
在本发明的一些实施方案中，含有至少一个CpG基序(其含有至少一个LNA核苷)的双链核酸可以含有未配对的核苷，形成"粘末端"，并可形成串联体。式VIIa-VIIh (下文以5'到3'方向显示，从左到右)表示根据序列互补性杂交而形成双链核酸(如上述式VIa-VIh所述)的单链核酸。才艮据本发明的一些实施方案，含有"粘末端"的双链核酸也可称作串联多聚体的单体。下文显示式VIIa-VIIh，其后为含有式VIIa-VIIh的核酸组合的实例。
式VIla
式VIIb
>式VHc
式VIW
丫式VIIe
(flna)-(Dm)-Rlt2式VUf
式VHg
(FlnaHSib)陽Rk2式VIlh
对式VIIa-VIIh中的每一个而言
-Elna是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、 G中的一个或多个是LNA;
-FtNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、 G中的一个或多个是LNA;
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-S;U^苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嗜啶、胞嘧咬类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；國kp k2、 ks和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核普间连接相连的任意核糖核苷。
在本发明的一些实施方案中，组合物中可以含有式VIIa-VIIh中一种或多种核酸的单链RNA分子，或者以多种摩尔比含有式VIIa-VIIh中至少两种或更多种核酸的组合。例如，在一些实施方案中，式Vila和式VIIb的单链RNA分子可以以大致等摩尔比相组合。式VIIc、式VIId、式VIIe、式VIIf、式VIIg或式VIIh的一些或所有单链RNA分子可以与另一条互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式Vila的单链RNA分子可以约10%、 20%、30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩尔过量或以约2、 3、 4、5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍数过量与式VIIb的单链RNA分子组合到组合物中。式Vila或式VIIb的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另 一些实施方案中，式VIIc的单链RNA分子可以约10%、 20%、30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯°/。的摩尔过量或以约2、 3、 4、5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式VIId的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIc或式VIId的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIe的单链RNA分子可以约10%、 20%、30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩尔过量或以约2、 3、 4、5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式VIIf的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIe或式VIIf的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIg的单链RNA分子可以约10%、 20%、30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩尔过量或以约2、 3、 4、5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式VIIh的单链RNA分子组合到組合物中。式VIIg或式VIIh的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIg的单链RNA分子可以约10%、 20%、30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式VIId的单链RNA分子组合到组合 物中。式VIIg或式VIId的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的 单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式Vila的单链RNA分子可以约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式VIIf的单链RNA分子组合到组合 物中。式Vila或式VIIf的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单 链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式Vile的单链RNA分子可以约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90。/。的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式VIIb的单链RNA分子组合到组合 物中。式VIIe或式VIIb的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的 单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIc的单链RNA分子可以约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式VIIh的单链RNA分子组合到组合 物中。式VIIc或式VIIh的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的 单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
示例性碱基配对排列图示如下。本发明多个实施方案中双链核酸的 其他配对和排列对本领域的技术人员而言是很明显的。对图示如下的每个 示例性配对方式而言，根据本领域的常M左到右，第一链以5'到3'方向 提供，第二链以3，到5，方向提供。
59Rk3- (Sm) - (E lna)
(F咖)—(DJ
式Vila式VIIb
Rm- (DJ - {E LNA)
I
(F - (Sm) -Riu
(E跳》-(Sm>-R3kRki- (DJ _ (F LNA)
Rkl - (Sm ) _ (F lna )
式VIIa-VIIh的替代性配对方式，其中kmfO:
Rk3- (Sm) — (E ujA)
(F LNA) - (Dm) —Rk2
Rk3- (DTO) - (E LNA)
(F LNA) - (STO) —Rki
(E lna) _ (Sm) —Rk3
(E LNA) — (Dm) -Rk2
Rkl— (Sm) - (F lna)
式VIIc式VIW
式Vile式VIff
式VIIg
式vnh
式Vila式VIIb
式VIIc式VIId
式Vile式VIIf
式VIIg
式vini
上述单体可以串联形成更长的或环状的双链核酸多聚体。
在本发明一些实施方案中，式VIIa-VIIh的单链核酸分子可碱基配对，以形成平末端的双链核酸分子。示例性威基配对排列图示如下。<formula>formula see original document page 61</formula>
在上述实例中，k"3，4是从l到10的(非零)整数，R可以是如前
述定义的任意核苷或核4组，其中第一和第二链中的各至少一个核苷形成
氢键>5^配对。
在一些实施方案中，单链核酸对(如式VIIa和VIIb、或式VIIc和VIId、或式Vile和VIIf、或式VIIg和VIIh、或式VIIg和VIId、或式VIIa和VIIf、或式VIIe和VIIb、或式VIIc和VIIh)在一定热力学、离子或pH^Ht下可发生串联。
在本发明的一些实施方案中，含有至少一个CpG基序(其含有至少一个LNA核苷)的双链核酸可含有未配对的核苷，形成"粘末端"，还可以形成串联体。式VIIIa-VIIIh (以5'到3'方向如下表示，从左到右)表示根据序列互补性杂交而形成双链核酸(例如上述式VIa-VIh所述)的单链核酸，如上述式VIIa-VIIh所述。根据本发明的一些实施方案，含有"粘末端"的双链核酸也可称作串联多聚体的单体。式VIIIa-VIIIh如下表示，其后为含有式VIIIa-VIIIh的核酸组合的实施例。(Sm)- Rki— (Elna)式Villa
(Dm)- Rk2墨(FlnA)式vnib
(Dm)- RkT(Eu4A)式vine
(Sm)- Rk4- (FlNA)式Vllld
(elna)画Rk广(Sm)式VIIIe
(FlNA) -Rk2 (Dm)式vim
(ELNA) -Rk2-(Dm)式VIIIg
(Flna)-Rk2 -(Sm)式vmh
对于式Villa-VIIIh中的每一个
画ELNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、 C、 G中的一个或多个是LNA;
誦FLNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、 C、 G中的一个或多个是LNA;
-m可以是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括 5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-SB苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；
-lq、 k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核普间连接相连的任意核糖核苷。
在本发明的一些实施方案中，组合物可含有式VIIIa-VIIIh中一种或
62多种核酸的单链RNA分子，或者以多种摩尔比含有式Villa-VIIIh中至少 两种或更多种以上核酸的组合。例如，在一些实施方案中，式Villa和式 VIIIb的单链RNA分子可以以大致等摩尔比相组合。式VIIIc、式VIIId、 式VIIIe、式VIIIf、式VIIIg或式VIIIh的一些或所有单链RNA分子可 以与另 一条互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂 交。
在另一些实施方案中，式Villa的单链RNA分子可以约10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍数过量与式VIIIb的单链RNA分子组合到组 合物中。式Villa或式VIIIb的一些或所有单链RNA分子可以与另 一互补 的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另 一些实施方案中，式VIIIc的单链RNA分子可以约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式VIIId的单链RNA分子组合到组 合物中。式VIIIc或式VIIId的一些或所有单链RNA分子可以与另 一互补 的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIIe的单链RNA分子可以约10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍数过量与式VIIIf的单链RNA分子组合到组 合物中。式VIIIe或式VIIK的一些或所有单链RNA分子可以与另 一互补 的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIIg的单链RNA分子可以约10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90。/。的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍数过量与式VIIIh的单链RNA分子组合到组 合物中。式VIIIg或式VIIIh的一些或所有单链RNA分子可以与另 一互补 的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VHIg的单链RNA分子可以约10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70o/o、 80%、卯％的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍数过量与式VIIId的单链RNA分子组合到组 合物中。式VIIIg或式VIIId的一些或所有单链RNA分子可以与另 一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式Villa的单链RNA分子可以约10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍数过量与式VIIIf的单链RNA分子组合到组 合物中。式VIIIa或式VIIIf的一些或所有单链RNA分子可以与另 一互补 的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIIe的单链RNA分子可以约10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍数过量与式Vlllb的单链RNA分子组合到组 合物中。式VIIIe或式VIIIb的一些或所有单链RNA分子可以与另 一互补 的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIIc的单链RNA分子可以约10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩尔过量或以约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍数过量与式VIIIh的单链RNA分子组合到组 合物中。式VIIIc或式VIIIh的一些或所有单链RNA分子可以与另 一互补 的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
示例性威基配对排列图示如下。根据本发明多个实施方案的双链核 酸的其他配对和排列对本领域的技术人员而言是很明显的。对图示如下的 每个示例性配对方式，根据本领域的常皿左到右，第一链以5，到3'方向 提供，第二链以3，到5'方向提供。
64<formula>formula see original document page 65</formula>式Villa-VIIIh的替代性配对方式<formula>formula see original document page 65</formula>
这些单体可串联形成更长的或环状的双链核酸多聚体。
在本发明一些实施方案中，式VIIIa-VIIIh的单链核酸分子可碱基配 对形成平末端的双链核酸分子。示例性威基配对排列图示如下。< Sro) -Rm一 (E uja)
II !
(Dm) -Ria- (F lwa)
(F LNA) -Rk2- (DJ
(Dm) -Rk3- (E LWA) I I I
式VHIg 式VHId
式VHIa
式vinf
式VIIIe
式vinb 式vine
式VHIh
说明书第59/73页
在上述实例中，k^，3，4可为0到10的整数，R可以是如前述定义的 任意核苷或核苷组。在k;于0的一些实施方案中，第一和第二链中各至 少一个核苷R形成氬键碱基配对。
在一些实施方案中，单li核酸对(如式Villa和VIIIb、或式VIIIc 和VIIId、或式VIIIe和VIIIf、或式VIIIg和VIIIh、或式VIIIg和VIIId、 或式Villa和VIIIf、或式VIIIe和VIIIb、或式VIIIc和VIIIh)在一定热 力学、离子或pH^Hf下可发生串联。
根据本发明多个实施方案的佐剂或佐剂组合物包含本文所述的 一个 或多个核酸种类。所述核酸种类可以是单链或双链。佐剂或佐剂组合物中 可存在单链与双链种类的组合。
佐剂或佐剂组合物可以是TLR3或TLR9的选择性激动剂。在本发 明一些实施方案中，佐剂或佐剂组合物是TLR3和TLR9两者的激动剂。 含有TLR3和TLR9 二者的双链核酸的实例包括含有两个或多个式 VIIa-h、或式VIIIa-h、或式VIIa-h和式VIIIa-h的核酸。
根据本发明一些实施方案的双链核酸(如包括含两个或多个式 VIIa-h、或式VIIIa-h的核酸)可包含于佐剂或佐剂组合物中，以提供具 有TLR3和TLR9两者之激动剂活性的佐剂或佐剂组合物。TLR3和TLR9两者的激动剂活性可以由单个双链核酸种类4^供。
可使用IP-10测定来评估佐剂组合物提供TLR-3激动剂活性的能力。 由于TLR-3激动剂的刺激，人HT29细胞向培养上清液中分泌IP-IO。培 养上清液中的IP-10可以通过例如ELISA来定量。作为另一个实例，由于 TLR-3激动剂的刺激，外周血单核细胞(PBMC)向上清液中分泌细胞因子。 所分泌的细胞因子，例如干扰素-a、 -p和/或-y可以通过例如ELISA来定 量。作为另一个实例，可以评估免疫效应细胞(如树突细胞)的成熟。
还可使用体外测定方法来评估佐剂组合物提供TLR9激动剂活性的 能力。例如，双链核B合物的活性可通过B细胞增殖测定或者巨噬细胞 或树突细胞的细胞因子产生来评估。上述测定的实例描述于例如Jiang W 等2006. Methods Mol Med 127:55-70。
根据本发明多个实施方案的组合物(包括佐剂组合物)可以以约 0.1ug/kg到约20mg/kg核酸(根据受试者的体重)或其间任意量的剂量施 用，例如，每毫升约lug到约2000ug核酸或其间的任意量，约10ug到约 1000ug核酸或其间的任意量，约30ug到约1000ug核酸或其间的任意量。 例如，可使用约O.l、 0.5、 1.0、 2.0、 5.0、 10.0、 15.0、 20.0、 25.0、 30.0、 35.0、 40.0、 50.0、 60.0、 70.0、 80.0、 90.0、 100、 120、 140、 160180、 200、 250、 500、 750、 1000、 1500、 2000、 5000、 10000、 20000 ug核酸的剂量。
本文中使用的佐剂"有效量"是指与免疫原(所述免疫原证实具有 生物活性)共同施用时具有免疫刺激效应所需的佐剂量。免疫原可以以约 0.1ug/ml到约20mg/ml或其间任意量或者lug/ml到约2000ug/ml或其间 任意量存在。佐剂可以以约0.1ug/ml到约20mg/ml或其间任意量或者 lug/ml到约2000ug/ml或其间任意量存在。免疫原可以是灭活的完整生 物体、蛋白质、肽、融合蛋白、融合肽、重组蛋白或重组肽。免疫原可 以是HspE7。
根据本发明多个实施方案的佐剂可以与多种可药用赋形剂中的任一 种配制在一起，通常配制在含水介质中，如注射用水、乳酸;M^液、等渗 生理盐水等)中。可药用赋形剂包括如盐、緩冲剂、抗氧化剂、#剂、 张度剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、助悬剂、乳化剂、抗微生物剂、防腐 剂、螯合剂、粘合剂、表面活性剂、润湿剂、非水栽体如不挥发油或者用于持续和控制释放的聚合物。参看如Berge等(1977. J. Pharm Sci. 66:1-19)、或Remington- The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition. Gennaro等编辑.Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia (所述文献都 通过参考并入本文)。
赋形剂也可以是羧曱基纤维素或多聚阳离子多聚体。多聚阳离子多 聚体的实例包括但不仅限于聚L-赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸或者主要 含阳性氨基酸的多肽。这些赋形剂的分子量、浓度和制备方法可见于例 如US 4,349,538 (通过参考并入本文)。
包含本发明多个实施方案之佐剂的组合物可以通过多种途径中的任 一种施用，所述途径包括例如皮下注射、J^M内注射、肌内注射、静脉注 射、表皮或透皮给药、粘膜给药、经口、经鼻、直肠或阴道给药。参看， 例如Remington画The Science and Practice of Pharmacy,第二十一版 Gennaro等编辑Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia。可根据施用 途径来选择或修饰载体配方。
根据本发明多个实施方案的组合物可以以单位剂量形式或者适于在 使用时配制和稀释的大量形式4C供。
根据本发明多个实施方案的组合物可以以单剂量或者按时间施用的 多剂量施用于受试者。给药方案可取决于例如受试者的状况、年龄、性别、 体重、施用途径、配方或一般健康状况。用于人受试者的给药方案可以通 过测定受试者中的吸收、分布、代谢、排泄和毒性来计算，或者可以通过 对实验动物(例如兔或鼠)的测定来外推。剂量和治疗方案的优化讨论于 例如Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics第 十一版.2006. LL Brunton编辑.McGraw國Hill， New York,或Remington-The Science and Practice of Pharmacy,第二十一版.Gennaro等编辑. Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia.
在本发明的上下文中，本文使用的术语"治疗"、"处理"、"治疗用 途"或"治疗方案"可以互换使用，意在涵盖本发明组合物的预防、緩解 和治疗模式，并包括权利要求所述组合物的任何及所有以下用途，其用于 治疗由基于炎症的病状、癌症、感染性疾病、变态反应、过免^^应或其 他待治疗疾病或紊乱所引起的疾病状态、病症、症状、体征或紊乱，或用
68于预防、阻碍、延迟或逆转上述疾病相关的症状、体征、病症或紊乱。因 此，本发明涵盖对不期望的疾病状态、症状、病症、体征或紊乱(与基于 炎症的病状或其他疾病或紊乱相关)或者受益于积i体免疫应答刺激的其他 疾病或病症进行的任何预防、改善、緩和、逆转或完全消除。治疗可包括 以单独或与免疫原组合施用有效量的本文所述组合物。
根据本发明多个实施方案的组合物还可包含一种或多种免疫原，例 如病毒或细菌("病原体")免疫原。免疫原可以由灭活的完整生物体("灭 活疫苗")制备，或者可由病原体的特异性蛋白质、肽或其他结构制备。或 者，免疫原可以是融合蛋白，该融合蛋白含有来自病原体的完整或部分蛋 白质或肽，其与另一非病原体蛋白质或肽(例如"组氨酸标签"或其他可 用于纯化该免疫原的部分)相融合。特异性蛋白质或肽可以用分子生物学 技术或方法("重组"蛋白质或肽)生产。重组分子生物学中的常用技术
和方法描述于例如Molecular Cloning: a Laboratory Manual第三版. Sambrook和Russell. CSHL Press, Cold Spring Harbour, New York; Current Protocols in Molecular Biology, 2007 Ausubel等编辑.Wiley InterScience, New York; Current Protocols in Immunology, 2006 Coligan et al editors. Wiley InterScience, New York。
免疫原的实例包括但不仅限于包含热激蛋白、来自细菌、真菌或病 毒病原体之抗原的蛋白质，或者包含来自细菌、真菌或病毒病原体之抗原 的热激蛋白融合蛋白(例如但不仅限于HspE7， WO 99/07860， US 7,157,089， 二者都通过参考并入本文)。细菌、真菌或病毒病原体的实例包 括但不仅限于如下疾病的致病因子乳头状瘤、生殖器疣、流行性感冒、 甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、巨细 胞病毒、EB病毒、AIDS、 AIDS相关复合体、水痘、普通感冒、巨细胞 病毒感染、科罗拉多壁虱热-登革热、埃博拉出血热、手足口病、肝炎、单 纯疱渗、带状疱渗、HPV、流行性感冒(流感)、拉沙热、麻渗、马尔堡 出血热、感染性单核细胞增多症、腮腺炎、脊MA质炎、进行性多灶性脑 白质病、狂犬病、风療、SARS、天花(痘症)、病毒性脑炎、病毒性肠胃炎、 病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗病、黄热病、炭疽、细菌性脑膜炎、 肉毒中毒、普鲁氏菌病、弯曲菌病、猫抓病、霍乱、白喉、流行性斑療伤 寒病、、淋病、脓疱病、军团杆菌病、麻疯病、细螺旋体病、李斯特菌病、 莱姆病、类鼻疽、MRSA感染、诺卡菌病、百日咳、鼠疫、大叶性肺炎、
69鸚鹬热、Q热、落基山斑渗热(RMSF)、沙门氏菌病、猩红热、志贺氏菌 病、梅毒、破伤风、沙眼、结核病、野兔病、伤寒症、斑渗伤寒症、M 感染、曲霉病、蛙粪霉病、念珠菌病、隐球菌病、球孢子菌病、脚縳、癣 菌病、组织胞浆菌病、真菌血症、副球孢子菌病、肺孢子虫性肺炎等。重 组免疫原可以用重组表达系统(例如细菌、酵母、杆状病毒、哺乳动物细 胞或植物表达系统)来表达。
在本发明一些实施方案中，根据本发明多个实施方案的组合物可用 于治疗与细菌或病毒病原体相关的疾病或紊乱。与细菌或病毒病原体相关 的疾病或紊乱包括但不仅限于细菌或病毒病原体的活跃性或潜伏性感染、 与细菌或病毒病原体的活跃性或潜伏性感染一起发生或之后发生的自身 免疫应答、与细菌或病毒病原体的活跃性或潜伏性感染一起义生或之后发 生的副作用。
在本发明一些实施方案中，免疫原可以是肿瘤抗原或者癌症相关抗原。
术语"癌症"有许多种定义。梠》据American Cancer Society,癌症 是特征在于异常细胞失控生长(并有时扩散)的一组疾病。尽管经常被称 作单个疾病，但实际上它包含了多于200种不同疾病。癌的生长能杀死(当 上述细胞阻止生命必需器官的正常功能时)机体或在整个机体中传播，损 伤基本系统。本发明的组合物可用于治疗动物或受试者中易感赘生物的方 法中，所述方法包括对有此需要的动物或受试者施用有效量的本发明化合 物或组合物。
本发明化合物可作为其有效治疗剂的不同类型癌症的非限制性实例 包括癌，如中枢神经系统赘生物，包括多形性成胶质细胞瘤、星形细胞 瘤、少突神经胶质细胞瘤、室管膜和脉络丛肿瘤、松果体瘤、神经元瘤、 成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤和髄膜肉瘤；眼部赘生物，包括基底 细胞瘤、鳞状细胞瘤、黑素瘤、横紋肌肉瘤和视网膜神经M瘤；内分泌 腺赘生物，包括垂体赘生物、曱状腺赘生物、肾上腺赘生物、神经内分泌 系统赘生物、胃肠胰内分泌系统赘生物和生殖腺赘生物；头颈部赘生物， 包括头颈癌、口腔及咽喉部赘生物和牙原性肿瘤；胸部赘生物，包括大细 胞肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤和胸腔原始生 殖细胞瘤；消化道赘生物，包括食道、胃、肝、胆嚢、外分泌胰腺、小肠、阑尾和腹膜的赘生物、结直肠腺癌和肛门赘生物；泌尿生殖道赘生物，包 括肾细胞癌、骨盆、输尿管、膀胱、尿道、前列腺、阴茎、睾丸的赘生物; 以及女性生殖器官，包括外阴和阴道、宫颈的赘生物、子宫内膜癌、卵巢 癌、妇科肉瘤和乳腺赘生物；皮肤赘生物，包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、 皮肤纤维肉瘤、Merkd细胞瘤和恶性黑素癌；骨骼和软组织赘生物，包括 骨源性肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、原始神经外 胚叶瘤和血管肉瘤；造血系统赘生物，包括骨骼增生异常综合征、急性髓 细胞样白血病、慢性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、HTLV-1 和5、 T细胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞性白血病、 霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤和肥大细胞白血病；以及儿童赘生物，包括急 性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、成神经细胞瘤、骨瘤、横紋 肌肉瘤、淋巴瘤、肾瘤等。
在本发明一些实施方案中，免疫原可以是变应原。变应原是当受试 者暴露于该变应原时诱导受试者中的变态反应的物质。在吸入变应原引发 的变应性和哮喘病症中观察到的慢性炎症很大程度上是由于嗜酸性粒细 胞的局部组织渗透和组织对变应原的高反应性所导致的。可以通过4吏用皮 质类固醇和/或支气管扩张剂来减轻炎症，但这些不能治疗根源原因。如 WO 99/07860讨论的，变应原特异性T淋巴细胞选择性富集于高反应组织， 这一敏感性可能取决于童年或嬰儿期的早期抗原接触。
在对^V免疫原的个体免疫应答中的特异性Thl及Th2样记忆细胞 的选择发生在从气道引出的局部淋巴结中。这种选择可以由抗原特异性 CD4+和CD8+ T细胞所产生的多种细胞因子来调节。这种T细胞选择过 程可被传染原所影响呼吸道粘膜的感染可以动员和激活局部组织(肺泡) 巨噬细胞，所述巨噬细胞移动到该局部淋巴结并分泌Th2抑制性细胞因子
(如IL-12和a-干扰素)。此外，它们可通过激活自然杀伤细胞而提高周 围环境中的Y-干扰素水平。净结果是产生CTL (主要是CD8+细胞)。y-干扰素抑制Th2细胞的产生，因而抑制IL-4和IL-5、体液(IgE )和细胞
(嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞)变态反应的关键性细胞因子 的产生(Anderson, G P.和Coyle, A. J., Trends Pharmacol. Sci， 15:324-332 (1995); Stam, W. B., van Oosterhout, A. J. and Nijkamp， F. P" Life Sci, 53: 1921-1934 (1993))。在哺乳动物中，应激蛋白已经显示诱导体液和细胞免疫应答。当与 应激蛋白混合、化学缀合或融合的可溶性抗原施用于哺乳动物时，细胞介
导的溶细胞免疫应#显著增强。这些应答主要是由于CD8+ T细胞所致。 因此，对CD4+细胞针对抗原自身以及针对与混合或偶联应激蛋白之抗原 的应答进行的比较给出了预测的模式与应激蛋白混合或连接的可溶性抗 原产生高比例的CTL (主要为CD8+ T细胞)，这是前述刺激Thl途径的 一种度量，因为这些CTL由于对Thl型抗原特异性T细胞的诱导而产生。 这些Thl细胞产生抑制Th2细胞的Y-干扰素。因此，Th2细胞因子IL-4 和IL-5不再能支持IgE和嗜酸性粒细胞的产生。IgE效价降低时，肥大细 胞和嗜碱性粒细胞的直接抗原性刺激会下降。此外，IL-5产生的减少将 导致嗜酸性粒细胞产生、分化和激活的减少。这种模式会导致相关组织炎 症的减少，并导致高>^应(哮喘)时间减少。
因此，施用混合物可以影响特应性患者中Thl与Th2的比值，恢复 更为正常的平衡并导致变应性或哮喘反应降低，所述混合物中含有与以下 制剂相组合的已知变应性抗原(变应原)或应激蛋白或组合物(其含有与 应激蛋白化学连接或融合的变应原)式II和IIa-e、式III和IIIa-d、式 IVa-j，以及式IVa-j、式Va到Vc、式Via到VIh、式VIj到VIo、式Vila 到VIIh、式VIIIa到VIIIh中至少两种的多种摩尔比的组合。
因此，本发明提供TLR3激动剂或TLR9激动剂或者作为TLR3和 TLR9双激动剂的组合物，以及含有TLR3激动剂或TLR9激动剂或者作 为TLR3和TLR9双激动剂的组合物的佐剂或佐剂组合物。
在本发明一些实施方案中，免疫原包括HspE7。生产HspE7融合蛋 白的方法描述于WO 99/07860和US 60/803,606，所述两个文献都通过参 考并入本文。
序列
对于SEQIDNO: 1的序列，残基G1、 G2、 G25和G26是LNA残 基；3到24位^是肌苷核糖核苷酸。
对于SEQIDNO:2的序列，残基C1、 C2、 C25和C26是LNA残基；残基C3到C24是核糖核普酸。
对于SEQIDNO:3的序列，瓶基T17、 G18、 T20、 T22和G23是 LNA残基；1到15位^是肌苷核糖核苷酸；残基G16、 A19和A21可
对于SEQIDNO:4的序列，残基C16、 T18、 T20、 A22和C23是 LNA残基；残基Cl到C15是核糖核苷酸；残基A17、 A19和C21可以是
对于SEQ ID NO: 5的序列，残基G1、 T18、 T19、 T21和T23是 LNA残基；1到17位残基B苷核糖核苷酸；残基G17、 A20和A22可 以是核糖核苷酸或脱氧核糖核普酸。
对于SEQ ID NO: 6的序列，残基Cl、 C17、 T19、 C22和C23是 LNA残基；残基C2到C16是核糖核苷酸；残基A18、 A20和U21可以是 核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
对于SEQIDNO: 7的序列，残基Tl、 T2、 T18、 T19、 T21和A22 是LNA残基；3到17位残基是肌苷核糖核苷酸；残基A19和A21可以是 核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
对于SEQIDNO:8的序列，残基A1、 C2、 C18、 T20、 T22和C23 是LNA残基；残基C3到C17是核糖核苷酸；戎基A19和A21可以是核
对于SEQ ID NO: 9的序列，残基Gl和G2是LNA残基；2到17 位^lS^O/L苷核糖核苷酸，A18到A32是核糖核苷酸。
对于SEQIDNO:10的序列，残基C16和C17是LNA残基；^ Cl到C15、 U18到U32是核糖核苷酸。
对于SEQIDNO:ll的序列，残基Gl和G2是LNA残基；3到12 位残基4J^苷核糖核苷酸，A13到A22是核糖核苷酸。
对于SEQIDNO: 12的序列，残基Cll和C12是LNA残基；残基 Ul到U10和C13到C22是核糖核苷酸。
73对于SEQIDNO: 13的序列，残基G1、 G2、 G18、 T19、 C20、 G21、 Tll、 T23、 G39和G40是LNA残基；3到17位和24到38位残基^J/L苷 核糖核苷酸。
对于SEQIDNO:14的序列，残基C1、 C2、 A18、 A19、 C20、 G21、 A22、 C23、 C39、 C40和C23是LNA残基；残基C3到C17、 C24到C38 是核糖核苷酸。
对于SEQIDNO: 15的序列，残基G1、 G2、 G18、 T19、 C20、 G21、 T22和T23是LNA残基；3到17位^^普核糖核苷酸。
对于SEQIDNO: 16的序列，^t^Al、 A2、 C3、 G4、 A5、 C6、 C22和C23是LNA残基；残基C7到C21是核糖核普酸。
对于SEQIDNO:17的序列，残基G16、 T17、 C18、 G19、 T20和 T21是LNA残基；1到15位残基是肌苷核糖核苷酸。
对于SEQIDNO:18的序列，残基A16、 A17、 C18、 G19、 A20和 C21是LNA残基；残基Cl到C15是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO: 19的序列，残基G1、 G17、 T18、 C19、 G20、 T21和T22是LNA残基；2到16位^J^是肌香核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO: 20的序列，残基Cl、 A17、 A18、 C19、 G20、 A21和C22是LNA残基；残基C2到C16是核糖核香酸。
对于SEQIDNO: 21的序列，残基Cl、 G2、 G18、 T19、 C20、 G21、 T22和T23是LNA残基；3到17位残基;U/L苷核糖核苷酸。
对于SEQIDNO: 22的序列，残基Gl、 C2、 A18、 A19、 C20、 G21、 A22和C23是LNA残基；瓶基C3到C17是核糖核香酸。
对于SEQIDNO:23的序列，全部六个残基都是LNA残基。
对于SEQ ID NO: 24的序列，全部六个残基都是LNA残基。
对于SEQ ID NO: 25的序列，残基C2和C3是LNA残基；残基Cl 到CIO和U13到U23是核糖核苷酸。对于SEQ ID NO: 26的序列，残基Gl和G2是锁核酸残基；C3、 G4、 T5、 C6、 G7、 T8、 T9、 A10、 T26、 G27、 T28、 C29、 G30、 T31、 T32、 G33 ;Ut氧核糖核香酸；All到A25是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO: 27的序列，Ul到U15的残基是核糖核苷酸；残 基T16、 A17、 A18、 C19、 G20、 A21、 C22、 G23、 C26、 A27、 A28、 C29、 G30、 A31、 C32和A33 M氧核糖核普酸；C24和C25是锁核酸残基。
与单字母>5^名称(A、 C、 G、 T、 U、 I)组合的"LNA"下标表 示相关核苷^A含有前述2'-4'的锁核酸残基。
实施例1:制备双链寡聚体GCLNA-polyIC-GCLNA
按照生产商的方案(Glen Research, Sterling VA )，使用2'-OMe-I-CE 亚磷酰胺、2，-OMe-C-CE亚鳞酰胺、5-Me-Bz-C-LNA-CE亚磷酰胺和 dmf-G-LNA-CE亚磷酰胺根据标准技术合成SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2的寡聚体。
G歐Glna-(I22)-G隱Glna (SEQ ID NO:l)
和
Clna國Clna-(C22)画Clna-Clna (SEQ ID NO:2).
将各等摩尔量的第一和第二寡聚体相组合，并使其退火产生dsRNA 化合物GCLNA-polyIC-GCLNA，表示为式Ilia:
Glna-Glna-(I22)-Glna-Glna Clna-Clna-(C22)-Clna-Clna
式IIIa
实施例2:制备具有未配对3，端的双链寡聚体
可以按照生产商的方案(Glen Research, Sterling VA)，使用5画Me-Bz画C-LNA画CE亚磷酰胺、Bz誦A-LNA陽CE亚磷酰胺、dmf- G画LNA-CE 亚裤酰胺、T-LNA-CE亚磷酰胺、2'-OMe小CE亚磷酖胺、2，-OMe-C-CE 亚裤酰胺、2，-OMe-A-CE亚罅酰胺、2，-OMe-G>CE亚磷酰胺和 2'-OMe-U-CE亚裤酖胺根据标准技术合成SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8的寡聚体。
(1,5)-G-T^a-Glna-A-Tlna-A-Tlna-Glna (SEQ ID NO: 3)
(Cis)-Clna-A- T歐A-Tlna-C-A歐Clna (SEQ ID NO: 4)
Glna-Q^-G-Tlna-Glna-A-Ti^a-A-Tlna (SEQ ID NO: 5)
ClnA-(C15)- C歐A-Tlna-A-U-C歐Alna (SEQ ID NO: 6)
Tlna-Glna-(I5)-T歐T歐A-T歐Alna (SEQ ID NO: 7)
Alna-Clna^CW-Clna-A- Ti^A-A- TlnA-Ci^a (SEQ ID NO: 8)
可将各等摩尔SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4或者SEQ ID NO: 5 和SEQ ID NO: 6或者SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8相组合，并使其退 火产生双链核酸化合物，分别表示为式Va、 Vb、 Vc:
工—工一I一工一 I墨工-1 - -工-工-工-1-I-I^GTLjmGLNA-ATmA-A-Tu^-C賜-A區-CTlha-AT織-AC區-OC-C-C-C-C-c-c-c-c-c-c-c-c-c
式Va
Glna一工一I一工一I墨工一 工一工一I一工—工一工匿工一工—I —I—G—*TIina—Glna—A—Tlha—A_-T:jia Alna-Clna-U-A-T區-A-C咖- C-C-C-OC-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C咖
式Vb
Tlma- Guja一工- 工- 工-工-工-工-工-工-I-工-工-工-工-工-工-G - Tuu、-GrjiA-A-Tlwa墨A腿 C-T濕-A-T皿-A- C咖-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C膨A識
式Vc实施例3:制备具有未配对3，端的双链寡聚体
可以按照生产商的方案(Glen Research, Sterling VA)， 4吏用 5-Me画Bz-C-LNA-CE亚罅酰胺、Bz-A-LNA-CE亚裤酰胺、dmf國G-LNA-CE 亚裤酰胺、T-LNA國CE亚罅酰胺、2，國OMe-I國CE亚裤酖胺、2，-OMe國C画CE 亚裤酰胺、2'-OMe-A-CE亚磷酰胺、2，-OMe-G>CE亚磷酰胺和 2'-OMe隱U-CE亚磷酖胺才艮据标准技术合成SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的寡聚体。
Gln a-GlN a-(I) 15醫(A) 15 (C) 15-ClNA-ClNA-(U) 15
Glna-Glna-(I)io誦(A)io
(U)io-Clna-Clna-(C)io
(C)io-Clna-Clna-(U)io
(SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 25)
可将各等摩尔SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10或者SEQ ID NO: 11 和SEQ ID NO: 12或者SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 25相组合，并使其 退火产生双链核酸化合物，分别表示为式Vd和Ve (

图1 )。
实施例4:与免疫原组合的dsRNA的体外生物活性
可对根据US 60/803,606 (通过参考并入本文)的方法生产的含有 HspE7的组合物以及根据上述实施例1生产的GCLNA-polyIC-GCLNA测 试其体外生物活性。
可在GCLNA-polyIC-GCLNA存在下测定HspE7诱导E7特异性 CD8+ T淋巴细胞(作为示例性抗病毒治疗途径)能力的增强。可对初次 接受实验的C57B1/6小鼠皮下注射单独的HspE7或者HspE7加 GCLNA-polyIC-GCLNA。 一段时间(例如5天)之后，从小鼠中摘除脾 脏并通过ELISPOT测定E7特异性脾细胞的数目，例如用E7特异性I类
77MHC结合肽E749-57 (RAHYNIVTF; Dalton Chemical Laboratories )或 对照肽HBCAg93國100 (MGLKFRQL; Dalton Chemical Laboratories )作 为记忆抗原。
实施例5:与免疫原组合的dsRNA的体内生物活性
可对根据PCT公开WO 2007/137427 (通过参考并入本文)的方法 生产的含有HspE7的组合物以及根据上述实施例1生产的 GCLNA-polyIC-GCLNA测试其体内生物活性。
在癌症治疗的一个示例性方法中，首先在初次接受实验的C57B1/6 小鼠中建立TC-1肿瘤。将6 x 104个TC-1肿瘤细胞注射入鼠的侧腹部。 在第七天时，可对带有TC-1肿瘤的小鼠在后颈部皮下注射稀释剂、单独 的纯化HspE7，或者与不同剂量GCLNA-polyIC-GCLNA混合的纯化 HspE7分级剂量。在额外的时间(如42天)对小鼠的肿瘤生长进行, ——在此实施例中，在肺瘤^V时间之后49天无肿瘤的小鼠可认为是无肺 瘤的。
实施例6:制名^^有CpG基序的双链寡聚体
按照生产商的方案(Glen Research, Sterling VA),使用2'-OMe-I-CE 亚磷酰胺、2'-OMe-C-CE亚磷酰胺、5-Me-Bz-C-LNA-CE亚砩酰胺和 dmf-G-LNA-CE亚磷酰胺根据标准技术合成SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22的寡 聚体。
7813)
Clna-Clna_(C)i5- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna-(C)i5-Clna-Clna(SEQ ID NO:14)
Glna_Glna-(I)i5- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna-(SEQ ID NO:15)
Alna-Alna_Clna-Glna-Alna-Clna-(C)i5-Clna-Clna(SEQ ID NO:16)
(I)i5- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna(SEQ ID NO:17)
(C)is- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna(SEQ ID NO:18)
Gln八-(I) 15- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna-(SEQ ID NO:19)
Clna-(C) 15- Alna_Alna-Clna-Glna_Alna-Clna(SEQ ID NO:20)
Clna-Gln八-(I)is- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna(SEQ ID NO:21)
Glna-Clna-(C) 15- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna(SEQ ID NO:22)
将各等摩尔的SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14、或者SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16、或者SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18、或者SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20、或者SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22相 组合，并使其退火产生式VIg、 VIh、 VIi、 VIj和VIk (图2)的dsRNA 化合物。
实施例7:制^^有CpG和poly A:U基序的双链寡聚体
按照生产商的方案(Eurogentec North America K吏用2，-OMe-A-CE 亚裤酰胺、2'-OMe-U-CE亚裤酰胺、DMT-dA-亚鳞酰胺、DMT-dC-罅酰 胺、DMT-dG-亚裤酰胺、DMT-dT-裤酰胺、5-Me-Bz-C-LNA-CE亚裤酰胺 和dmf-G-LNA-CE亚磷酰胺才艮据标准技术合成才艮据SEQ ID NO: 26和 SEQ ID NO: 27的寡聚体。GLNA-GLNA-dC國dG-dT-dC-dG-dT-dT-dA-(rA),5-dT-dG-(iT-dC-dG-dT誦dT-dG (SEQ ID NO: 26)
(rU)15-dT-dA-dA-dC-dG-dA-dC-dG-CuvfA-CL^A-dC-dA-dA-dC-dG-dA-dC-dA (SEQ ID NO: 27)
可将各等摩尔的SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 27相组合，并使其 退火产生在任一末端具有一段未配对核苷的双链核酸化合物(示于图3)。 所述未配对核普可允许进行混合物的串联。
所有引文均通过参考并入本文。
已通过实施例描述了一个或多个目前优选的实施方案。对本领域技 术人员而言很明显的是，可以对本发明进^i午多变更和修改，而不脱离在 权利要求中定义的本发明范围。
权利要求
1.下式的化合物式IIa其中-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；-V、Z、Q和W是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；-m是从1到500的任意整数，或其间的任意数值；-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；-R可以独立地为通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在；并且-其中V、S、D、Z、Q、R和W中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
2. 下式的化合物R"-Vn墨(Sm)-Wp-Rk2式IVc其中-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，4Ht是如果n-0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，M是如果p^则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-V和W是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖 核普类似物或脱氧核糖核苷类似物；-m是从l到500的任意整数，或其间的任意数值；-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；-&和k2可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；-R可以独立地为通过核香间连接基团连接到相应核普的任意核糖核 苷，或者R可以不存在；并且-其中V、 S、 R和W中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA) 单体。
3. 下式的化合物<formula>formula see original document page 3</formula>式IVd其中-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，^是如果11=0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-p是从0到10的任意整数，或其间的任意lt值，4Hf是如果p=0则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-Z和Q是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖 核普类似物或脱氧核糖核香类似物；-m是从l到500的任意整数，或其间的任意数值；-D是胞嘧啶、胞嗜咬类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；-k3和b可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；-R可以独立地为通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核 苷，或者R可以不存在，在一些实施方案中，例如，第一链的5'R核糖核 苷能够与第二链的 3，R核糖核苷成键，并且；-其中R、 Z、 D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA) 单体。
4. 制备下式化合物的方法，<formula>formula see original document page 4</formula>Rk3-Zn- (DJ -Qp隱Rk4式IIa其中國n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，糾是如果n-0则 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，M是如果p^则 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;國V、 W、 Z和Q^K壬意核苷；画m是从1到500的任意整数；-SB苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；-D是胞嘧啶、胞嘧咬类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧咬类似物核苷；-b、 k2、 k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；-R可以独立地为通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核 苷，或者R可以不存在，在一些实施方案中，例如，第一链的5'R核糖核 苷能够与第二链的3'R核糖核苷成键，并且；-其中V、 S、 W、 Z、 D和Q中的一个或多个包含一个或多个LNA 单体，所述方法包括以约0.5-1.0到约1.0-0.5的摩尔比将根据权利要求2之化合物的寡聚 体与根据权利要求3之化合物的寡聚体相混合，并使所述第一和第二寡聚 体退火形成双链化合物。
5. 权利要求l-3中任一项的化合物，其中S是肌苷且D是胞嘧啶。
6. 含有权利要求5的化合物、聚L-赖氨酸和羧甲基纤维素的组合 物。
7. 含有权利要求5的化合物和免疫原的组合物。
8. 下式的化合物，Rki- (Sm) - (Elna) - (Dm) -，2Rk3- (Dm) — (Flna) - (Sm) -Rk4式ViaRkl- (Dm) - (Elna) - (Sm) _R)c2 Rk3- (Sm) — (Flna) — (DJ -Rk4式VIbRk广(Sm) - (Elna) - (Sm) -Rk2Rk3- (Dm) - (Flna) - (Dm) -Rk4式Vic或Rki- (Dm) — (Elna) 一 (Dm) -Rk2 II I I IRk3一 (Sm) - (Flna) 一 (Sm) -R]c4 ,式VId其中國Elna是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、 G中的一个或多个是LNA;画FLNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、 C、 G中的一个或多个是LNA;-m是从l到500的任意整数，或其间的任意数值；-SA^L苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；-0^0&嘧啶、胞嘧咬类似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶类似物核苷；-kp k2、 b和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数;-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
9. 根据权利要求8的式VIa、 VIb、 VIc或VId的化合物，其中S 是肌苷且D是胞嘧啶。
10. 含有权利要求9的化合物和免疫原的组合物。
11. 一种化合物，其包含第一单链核苷酸多聚体，其包含1到500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷 与胞嗜咬核糖核苷的组合，以及l到IO个锁核酸残基；和第二单链核普酸多聚体，其包含1到500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷 与胞嘧啶核糖核香的组合，以及1到10个锁核酸残基；含有锁核酸残基的双链区。
12. —种化合物，其包含第一单链核普酸多聚体，其包含1到500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷 与胞嘧咬核糖核苷的组合，以及根据SEQ ID NO: 23的核酸序列；第二单链核苷酸多聚体，其由1到500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与 胞嘧咬核糖核苷的组合，以及才艮据SEQ ID NO: 24的核酸序列；其中所述第 一单链核苷酸多聚体与所述第二專过氢^含有锁核酸残基的双链区区以及
13. 含有权利要求ll之化合物的佐剂组合物。
14. 含有权利要求12之化合物的佐剂组合物。
15.含有权利要求12之化合物的TLR3和TLR9激动剂
全文摘要
提供了免疫刺激剂，包括具有一个或多个锁核酸(LNA)核苷的核酸。所述核酸还可包含CpG基序。该核酸可以是双链的，并可包含dsRNA。
文档编号C07H21/00GK101687900SQ200880014144
公开日2010年3月31日 申请日期2008年3月7日 优先权日2007年3月7日
发明者彼得·埃姆蒂奇 申请人:恩文塔生物制药公司