专利名称：蛋白吸附材料及其制造方法
技术领域：
本发明涉及蛋白吸附材料及其制造方法。
背景技术：
以往，在医药品制造工序等的生物工艺中，对蛋白质等有价值的物质的吸附回收或者对杂质的吸附去除等吸附精制操作是通过将被处理液通入填充有粒径超过100 μ m的 多孔性凝胶珠作为吸附体的柱中来进行的。作为凝胶珠，多使用纤维素、右旋糖苷、琼脂糖 等多糖类系珠。这些珠为多孔性并在颗粒内部具有很多的细孔，通过设置细孔来增加比表 面积，从而确保了目的物质的吸附容量。将在培养等中得到的含有目的物和杂质的粗原料 液通入填充有上述多孔性凝胶珠的柱中，液体通过细孔时，利用被固定在细孔表面上的具 有蛋白质吸附能力的官能团来吸附分离目的物或杂质。但是，以往的凝胶珠对于物质向凝 胶珠颗粒内的移动的阻力大、即向细孔内的扩散的阻力大，因此若向柱中通入粗原料液的 速度变大，则细孔内的官能团不被用于吸附，仅凝胶珠颗粒的外表面的官能团被用于吸附， 因此吸附容量大幅度降低，难以高速地吸附精制，这种情况成为问题。另一方面，由仅利用被固定在颗粒的外表面上的官能团的非多孔性颗粒构成的凝 胶珠具有即使通液速度变快，吸附容量的降低也较少的优点。但是，这样的凝胶珠的比表面 积的绝对值小，因此难以确保能够用于工业生产这种程度的吸附容量，主要停留于分析用 途中的实用化。另外，对通过在精密过滤膜等多孔膜的细孔表面固定官能团，以利用过滤来强制 性地使被处理液通过细孔内的方法也进行了研究(例如，参考非专利文献1和2)。根据该 方法，即使高速通液，也能有效地利用细孔内的官能团，因此难以发生吸附容量的降低。非专利文献1 斋藤恭一等、《》彡力A工 > 夕二 ^〗J >夕’(化学工程)》、1996年 8月刊、25页 28页非专利文献2 久保田升、《放射線i産業(放射线和产业)》、1998年12月、No.80、 45页 47页
发明内容
但是，如非专利文献1和2所述的方法在利用多孔膜的情况下，利用过滤进行通 液，因此为了不使过滤压力变得过高，不得不某种程度地减薄多孔膜的膜厚。如此，难以加 大膜厚方向的吸附容量的绝对值。本发明目的在于提供蛋白吸附材料及其制造方法，该蛋白吸附材料不仅可用于分 析用途，而且，即使作为工业生产用，也同时兼具能应用的程度的吸附容量和高速处理性。本发明人为了解决上述问题进行努力研究，结果发现，通过将固定有具有蛋白质 吸附能力的官能团的高分子侧链以预定的比例固定在不为多孔质也可的高分子基材的表 面上，能够同时兼具高速吸附处理和高吸附容量，以及发现，通过使用放射线接枝聚合法， 能够制造这样的同时兼具高速吸附处理和高吸附容量的蛋白吸附材料。并且，本发明人进一步进行了深入研究，结果发现，在以往想不到的、极小的接枝率下能够将形成在基材表面的高分子侧链的量最大化，从而完成本发明。SP，本发明如下。(1) 一种蛋白吸附材料，该蛋白吸附材料含有高分子基材、被固定在该高分子基材 的表面上的高分子侧链、和被固定在该高分子侧链上的具有蛋白质吸附能力的官能团，相 对于上述高分子基材的质量，上述高分子侧链的质量为5% 30%。(2)如上述(1)所述的蛋白吸附材料，其中，上述高分子侧链是通过乙烯基单体的 聚合而得到的。(3)如上述(1)或(2)所述的蛋白吸附材料，其中，上述高分子侧链是通过与构成 上述高分子基材的高分子结合而被固定在上述高分子基材的上述表面上的，上述官能团是 通过结合在上述高分子侧链上而被固定的。(4) 一种蛋白吸附材料的制造方法，该方法包括活化高分子基材的第1工序；使 包含具有蛋白质吸附能力的官能团的乙烯基单体或包含能够将具有蛋白质吸附能力的官 能团导入的官能团的乙烯基单体与上述活化后的上述高分子基材接触，使上述乙烯基单体 聚合成的高分子侧链固定在上述高分子基材的表面上的第2工序；和在上述乙烯基单体不 包含上述具有蛋白质吸附能力的官能团的情况下，在上述乙烯基单体所具有的所述能够将 具有蛋白质吸附能力的官能团导入的官能团上导入具有蛋白质吸附能力的官能团的第3 工序；相对于上述高分子基材的质量，上述高分子侧链的质量为5% 30%。(5)如上述(4)所述的蛋白吸附材料的制造方法，其中，构成上述高分子基材的高 分子化合物含有聚乙烯，在上述第1工序中，对上述高分子基材以IkGy 20kGy的辐射剂 量照射放射线而活化上述高分子基材。(6)如上述(5)所述的蛋白吸附材料的制造方法，其中，在上述第2工序中，在 30°C以下的上述乙烯基单体的溶液中使上述高分子侧链固定。(7)如上述(5)或(6)所述的蛋白吸附材料的制造方法，其中，在上述第2工序中， 在上述乙烯基单体的浓度被调制在10体积％以下的溶液中，使上述乙烯基单体与上述活 化后的上述高分子基材接触。(8)如上述(5) (7)任一项所述的蛋白吸附材料的制造方法，其中，上述乙烯基 单体含有甲基丙烯酸缩水甘油酯。根据本发明，能够提供蛋白吸附材料及其制造方法，该蛋白吸附材料不仅能够用 于分析用途，而且即使作为工业生产用，也同时兼具能应用的程度的吸附容量和高速处理 性。
具体实施例方式以下，对本发明的具体实施方式
(以下，称为“本实施方式”。)详细地进行说明。 需要说明的是，本发明并不受限于下述本实施方式，能在其要点的范围内变形并实施。本实施方式的蛋白吸附材料含有高分子化合物作为基材。本说明书中，将该基材 也记为“高分子基材”。作为高分子化合物，例如，可以举出聚乙烯、聚丙烯等聚烯烃、聚偏二氟乙烯等卤 化聚烯烃、烯烃与卤化烯烃的共聚物以及它们的混合物。这些之中优选高分子化合物含有聚乙烯。聚乙烯廉价并易获得，耐化学药品性和加工性优异，并且，原材料的吸湿性、吸水性低。除此以外，聚乙烯还难以发生放射线导致的分解，且在进行放射线接枝聚合的情况下容 易较丰富地具有保持自由基(该自由基通过放射线照射而产生并成为接枝聚合的反应起 点)的结晶部分，因此适合于放射线接枝聚合。上述高分子化合物中的聚乙烯的含有比例 优选为50质量％ 100质量％。聚乙烯大致可分类为低密度聚乙烯、高密度聚乙烯，但本实施方式中，低密度聚乙 烯、高密度聚乙烯均可使用。从高分子基材在实际应用的各种环境中的稳定性的角度出发， 比较优选结晶度高的高密度聚乙烯。聚乙烯可以是乙烯的均聚物，为了控制线性(linearity)和密度，也可以添加丙 烯、丁烯进行聚合。从高分子基材在实际应用的各种环境中的稳定性的方面出发，聚乙烯的分子量越 大越好，特别是重均分子量在100万以上的超高分子量型的聚乙烯由于在机械物性方面也 优异而优选。此处，重均分子量是将聚苯乙烯作为标准试样，利用凝胶渗透色谱测定得到 的。对高分子基材的形状没有特别限制，可以是颗粒状、无纺布状、织布状、线状等任 意形状。颗粒状的高分子基材因为能够在以往的柱中作为填充材而得到利用，因而是适合 的基材。其颗粒的形状可以是圆球状也可以是不定形。另外，基材可以是由一次粒子构成 的，也可以是多个一次粒子聚集并一体化的二次粒子，还可以是二次粒子的粉碎物。颗粒状的高分子基材的粒径以平均粒径计优选为10 μ m 80 μ m。该平均粒径是 利用50个以上的颗粒的粒径的算术平均值表示的。上述粒径是从颗粒的放大照片测定其 短径与长径，并利用其算术平均值表示的。若平均粒径大于80 μ m,则比表面积变小，因此 能导入基材中的官能团的量变少，具有蛋白吸附容量降低的倾向。若平均粒径小于ΙΟμπι， 则颗粒相互形成的间隙变小，在填充有蛋白吸附材料的柱中流通粗原料液时的压力损失变 大，因此具有在供于实用时需要过大的粗原料液的供给压力的倾向。优选以平均粒径计上 述粒径为10 μ m 40 μ m。高分子基材优选为多孔质，但也能使用不是多孔质的基材。为了也能将不是多孔 质的高分子基材用于蛋白吸附材料，就需要使蛋白吸附材料实现高速吸附处理和高吸附容 量的并存，并以最大效率吸附蛋白质。因此，最重要的是设计具有蛋白质吸附能力的官能团 在基材上的固定状态。为了在高分子基材上固定上述官能团，首先需要借助固定在该基材上的高分子侧 链来固定上述官能团。高分子侧链是通过例如接枝聚合而被固定在基材上的。通过如此固 定官能团，不仅在基材表面本身上能配置官能团，而且借助被固定在基材表面上的高分子 侧链而能够在离开基材表面的上空部分也配置官能团。利用在基材上固定官能团的通常的 方法，仅在基材表面本身的二维面固定官能团。与此相对，本实施方式的方法中，通过借助 固定在基材上的高分子侧链来固定官能团，能够在高分子侧链延及的范围将基材上空部分 的三维空间作为官能团的固定空间而加以利用。因此，与上述的现有方法相比，在确保吸附 容量的方面，压倒性地有利。比如说，在基材表面上未借助高分子侧链来固定官能团的以往 的方法是“平房型的吸附空间(平面型)”，相对于此，借助固定在基材上的高分子侧链来固定官能团的本实施方式的方法可以说是“高层建筑型的吸附空间”。需要说明的是，本说明书中高分子侧链向高分子基材上的固定以及官能团向高分 子侧链上的固定分别意味着高分子侧链与构成高分子基材的化合物的结合以及官能团与 高分子侧链的结合，作为结合的方式可以举出以共价键的结合。本说明书中，“高分子侧链”是指，将构成高分子基材的高分子化合物作为主链，能 够作为侧链结合在该高分子化合物上的高分子基团。作为高分子侧链，优选其交联结构少。 一般来说蛋白质的分子较大，对于具有如苯乙烯-二乙烯基苯这样的交联结构的高分子侧 链来说，蛋白分子难以进入到交联结构中或在交联结构中移动。其结果，仅高分子侧链的极 小部分参与吸附，实质上难以吸附蛋白质。作为高分子侧链，优选具有弯曲性高的亚甲基链 来作为主链。具有亚甲基链作为主链的高分子侧链例如可以通过向基材上接枝聚合乙烯基 单体而得到。特别适合的高分子侧链为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯链，该高分子侧链可以通 过作为乙烯基单体的甲基丙烯酸缩水甘油酯的聚合来形成。甲基丙烯酸缩水甘油酯在聚合 后也具有富含反应性的缩水甘油基，通过在缩水甘油基中的环氧环上开环加成而能够将各 种官能团导入，在这点上是非常方便的。
借助高分子侧链将具有蛋白质吸附能力的官能团固定在高分子基材上后，使高速 吸附处理和高吸附容量的并存以更高的水平得以实现，从而为了以最大效率吸附蛋白质， 重要的是高分子侧链的接枝率的设计以及高分子侧链的密度的设计。此处，高分子侧链的 接枝率(单位％)是根据公式(高分子侧链的质量(单位g))/(接枝聚合前的高分子基材的质量(单位 g)) XlOO计算出的。高分子侧链的密度是根据公式(高分子侧链的质量(单位g))/(接枝聚合前的高分子基材的表面积(单位 m2))计算出的。高分子侧链的质量(单位g)是根据公式(接枝聚合后的高分子基材和高分子侧链的合计质量(单位g))_(接枝聚合前的 高分子基材的质量(单位g))计算出的。通常考虑则认为，通过增大接枝率来较多地导入官能团对实现本发明的目的是非 常方便的。但是，意外地发现，若接枝率变得过大，则蛋白吸附材料的吸附容量和溶出率同 时降低，高分子侧链的密度存在更理想的适用范围。这些理由具体不清楚，但本发明人想到 了下述的原因作为其原因之一。即，可以示意性地理解被固定在高分子基材上的高分子侧 链为以“须状”被固定在基材表面的状态。若接枝率超过某一水平，则蛋白质难以进入到高 分子侧链的层中，由高分子侧链层构成的三维的高层建筑的吸附空间难以被有效地利用。 其结果，可以认为有效的吸附容量降低。另外，还可以认为，“进入”密度高的高分子侧链的 层中的若干比例的蛋白质在溶出时难以从高分子侧链的层中“逃脱”，溶出率或者回收率可 能降低。需要说明的是，“溶出率”是指，以百分数表示吸附在蛋白吸附材料上的蛋白质之 中利用溶出液从蛋白吸附材料中溶出的蛋白质的比例，相当于吸附在蛋白吸附材料上的蛋 白质的回收率。本实施方式的适宜范围的高分子侧链的接枝率和密度与至今所认为的适宜范围相比，明显小，但是作为其结果，却能增大吸附容量。可以说这是极其意外的，是在以往的想法的延长线上得不到的。被固定在高分子基材上的高分子侧链的接枝率在5 30%的范围。该接枝率更优 选在10 20%的范围。若接枝率小于5%，则得不到充分的蛋白质的吸附容量，若接枝率 大于30%，则溶出率降低，因此不优选。另外，被固定在高分子基材上的高分子侧链的密度优选为0. lg/m2以上且小于3g/ m2。该密度更优选为0. 2 1. 5g/m2，进一步优选为0. 3g/m2以上且小于1. Og/m2。若密度处 于小于0. lg/m2的范围，则具有难以充分得到蛋白质的吸附容量的倾向，若密度为3g/m2以 上，则具有溶出率降低的倾向，因此不优选。总之，相对于以往的利用接枝来赋予功能的技术，利用本实施方式的接枝率小，因 而导入到蛋白吸附材料中的官能团的量变少，虽然如此，但蛋白吸附性能被改良的事情可 以说是令人吃惊的结果。本实施方式的蛋白吸附材料含有具有蛋白质吸附能力的官能团。此处，“蛋白质吸 附能力”是指能够不使蛋白质的分子变性来吸附蛋白质的分子的能力。具有蛋白质吸附能 力的官能团大致分为以下四种(1)离子交换吸附型；(2)疏水性相互作用吸附型；(3)群 特异性亲和吸附型；(4)个别特异性亲和吸附型。作为具体例，可以例举如下。离子交换吸附型的官能团之中，作为阳离子基团，例如，可以举出磺酸基、羧酸基、 磷酸基，作为阴离子基团，例如，可以举出季铵盐基、吡啶盐基、叔 仲氨基，作为螯合基团， 例如，可以举出亚氨基二乙酸基、巯基、乙二胺基。作为疏水性相互作用吸附型的官能团，例如，可以举出苯基、烷基。作为群特异性亲和吸附型的官能团，例如，可以举出Cibacron BlueF3G_A、 Protein Α、伴刀豆球蛋白Α、肝素、单宁、金属螯合基团。作为个别特异性亲和吸附型的官能团，例如，可以举出抗原、抗体类。在固定于高分子基材上的高分子侧链上，可以单独固定这些具有蛋白质吸附能力 的官能团中的一种，也可以组合二种以上来固定。另外，在高分子侧链上不仅优选固定具有 蛋白质吸附能力的官能团，而且为了抑制蛋白质的非特异性吸附和非可逆性吸附，优选也 固定羟基。对于本实施方式的蛋白吸附材料，优选每质量(干燥质量)的蛋白吸附材料含有 0. lmmol/g以上的具有蛋白质吸附能力的官能团。如上所述，随着接枝率的降低，官能团的 量也变少，但如果被固定在高分子基材上的高分子侧链的量以接枝率计处于上述范围，则 固定在高分子侧链上的具有蛋白质吸附能力的官能团的量多时因吸附能力变高而优选。该 官能团的量实质上上限为0. 5mmol/g。本实施方式的蛋白吸附材料可以通过例如将高分子化合物用于基材并利用放射 线接枝聚合法进行制造。即，本实施方式的蛋白吸附材料的制造方法包括活化高分子基材 的第1工序；和使包含具有蛋白质吸附能力的官能团的乙烯基单体或包含能够将具有蛋白 质吸附能力的官能团导入的官能团的乙烯基单体与活化后的所述高分子基材接触，使乙烯 基单体聚合成的高分子侧链固定在高分子基材的表面上的第2工序。本实施方式的蛋白吸 附材料的制造方法还可以包括在乙烯基单体不包含具有蛋白质吸附能力的官能团的情况 下，在乙烯基单体所具有的能够将具有蛋白质吸附能力的官能团导入的官能团上导入具有蛋白质吸附能力的官能团的第3工序。作为在第2工序中使用的、包含具有蛋白质吸附能力的官能团的乙烯基单体，例如，可以举出具有磺酸基作为官能团的苯乙烯磺酸钠、具有羧基作为官能团的丙烯酸。另 夕卜，作为能够将具有蛋白质吸附能力的官能团导入的官能团，优选富含反应性的官能团，例 如，可以举出环氧环、羟基、氨基。其中环氧环富含与多种多用的分子的反应性，因此作为能 够将具有蛋白质吸附能力的官能团导入的官能团是特别有效的。作为包含能够将具有蛋白 质吸附能力的官能团导入的官能团的乙烯基单体，可以举出具有环氧环作为官能团的甲基 丙烯酸缩水甘油酯、具有通过水解可形成羟基的乙酸酯残基作为官能团的乙酸乙烯酯。这 些能单独使用一种或二种以上混合使用。优选上述乙烯基单体含有甲基丙烯酸缩水甘油 酯，在乙烯基单体的总量中，甲基丙烯酸缩水甘油酯的含有比例优选为50质量％ 100质 量％。另外，在第3工序中，作为将具有蛋白质吸附能力的各种官能团导入环氧环的方 法，采用在上述的非专利文献2等中记载的方法即可。乙烯基单体聚合成的高分子侧链是乙烯基单体通过接枝聚合而聚合成的高分子 侧链(以下，称为“接枝高分子链”。)。向该高分子基材上的固定是通过在第1工序中活化 基材表面以使乙烯基单体能够聚合而开始的。作为基材表面的活化，可以举出在基材表面 使自由基生成的方法。从而能够以该生成的自由基作为起点使乙烯基单体接枝聚合。作为 使自由基生成在基材表面的方法，从均勻地生成在整个基材表面的观点出发，通过照射放 射线使自由基生成的方法是特别适合的，以该自由基作为起点使接枝聚合链生成即可。适 合用于本实施方式的放射线为电离性放射线，可以列举出α、β、Y射线、电子射线，这些 放射线均可使用，但电子射线或Y射线特别适合。需要说明的是，为了将接枝高分子侧链以适当的密度固定在高分子基材上，重要 的是将成为接枝聚合的起点的自由基的产生量设定在适当的范围。具体地说，在第1工序 中对高分子基材照射放射线来将其活化的情况下，向基材照射的放射线的辐射剂量是很重 要的，本实施方式中，关键是与以往相比小的辐射剂量。特别是为了有效地生成必要量的 自由基，在构成高分子基材的高分子化合物含有聚乙烯的情况下，辐射剂量优选为IkGy 20kGy、进一步优选为IkGy lOkGy。如上所述，本实施方式中固定在高分子基材表面的高 分子侧链的密度是很重要的。决定自由基(该自由基成为接枝高分子侧链的起点)的量是 辐射剂量，可以认为，通过将辐射剂量控制在上述范围，可以使高分子侧链的结构最佳化。作为对高分子基材使用放射线以进行接枝聚合的方法(以下，也称为“放射线接 枝聚合法”。)，例如，可以举出，预先对高分子基材照射放射线后，将所生成的自由基作为 起点使之与乙烯基单体接触的前照射法，以及在乙烯基单体溶液中照射放射线的同步照射 法。这些之中能稳定地接枝聚合的方法是前照射法。作为通过使乙烯基单体与产生在高分子基材上的自由基接触，以利用自由基聚合 进行接枝聚合的方法，可以举出，气相中使蒸腾的乙烯基单体与该自由基接触的气相法，以 及使液态的乙烯基单体直接与该自由基接触或在利用溶剂稀释液态的乙烯基单体后的液 体中与该自由基接触的液相法。从容易控制接枝量、即向基材上接枝的接枝高分子侧链的 密度的方面考虑，优选在利用溶剂稀释乙烯基单体后的液体中与该自由基接触的液相法。 作为溶剂，优选使用对构成基材的树脂(高分子化合物)的膨润性小的溶剂，这是因为，使用这种溶剂能够抑制在基材的内部深处(例如在使用颗粒状的基材的情况下颗粒内部深 处)发生接枝聚合反应，并将反应限制在基材的表面附近。具体地说，优选对构成基材的树 脂的膨润度为10%以下的溶剂。在构成基材的树脂为聚乙烯的情况下，作为溶剂，例如，优 选甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等醇。此处所说的“膨润度”是，在室温下“在溶剂中浸渍1小时 的树脂颗粒的粒径”与“浸渍前的树脂颗粒的粒径”的差除以“浸渍前的树脂颗粒的粒径” 所得到的值，该值以百分数表示。在使用醇作为上述溶剂、采用甲基丙烯酸缩水甘油酯作为乙烯基单体的情况下，为了在醇溶剂中使构成高分子基材的高分子化合物与甲基丙烯酸缩水甘油酯发生接枝反 应，优选在30°C以下的乙烯基单体的溶液中固定高分子侧链。若此时的乙烯基单体的溶液 的温度超过30°C，则反应速度变快，通过控制反应以达到预定的接枝率变难。乙烯基单体的 溶液的温度更优选为0°C 20°C。乙烯基单体的溶液中的乙烯基单体的浓度优选为10体积％以下，例如，醇溶剂中 的甲基丙烯酸缩水甘油酯的浓度优选为10体积％以下。如果是超过10体积％的浓度，则 趋于难以得到蛋白吸附容量大的蛋白吸附材料。可以认为反应混合液的温度和甲基丙烯酸缩水甘油酯的浓度对形成在高分子基 材表面的高分子侧链的密度带来很大的影响。即，可以认为，对形成蛋白分子更容易进入高 分子侧链之间的结构，这些是重要的因素。作为本实施方式的特别优选的具体的蛋白吸附材料的制造方法的例子，可以举 出，使用聚乙烯颗粒作为高分子基材、使用甲基丙烯酸缩水甘油酯作为乙烯基单体的放射 线接枝聚合法。聚乙烯颗粒的平均粒径优选为10 μ m 80 μ m，更优选为10 μ m 60 μ m， 进一步优选为10 μ m 40 μ m。作为放射线接枝聚合法，优选前照射法。向产生了自由基的 基材上接枝聚合甲基丙烯酸缩水甘油酯优选在甲基丙烯酸缩水甘油酯的醇溶液中进行。作 为醇，能适合使用甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇。优选使用作为对构成基材的树脂的膨润性小的 反应溶剂的醇，这是因为，如上所述，这种溶剂能够抑制在基材的颗粒内部深处发生接枝聚 合反应，并将反应限制在基材的表面附近。醇对聚乙烯的膨润度小。通过控制上述反应液中的反应温度和甲基丙烯酸缩水甘油酯的浓度以及反应时 间，能够控制接枝率。甲基丙烯酸缩水甘油酯的接枝率优选为5% 30%，更优选为10% 20%。通过 控制该接枝率，能够将固定在高分子基材上的高分子侧链的密度也控制在优选的范围。通过接枝聚合将甲基丙烯酸缩水甘油酯固定在高分子基材上之后，为了在作为高 分子侧链的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯侧链上导入具有蛋白质吸附能力的官能团，只要通过 对该高分子侧链中的缩水甘油基中的环氧环进行开环加成来导入官能团即可。例如，将阳 离子交换基作为具有蛋白质吸附能力的官能团导入的情况下，可以在通过接枝聚合而固定 了的高分子侧链中的缩水甘油基上加成亚硫酸盐。更具体地说，可以采用使通过接枝聚合 而固定有甲基丙烯酸缩水甘油酯的基材与亚硫酸钠在水/异丙醇混合溶液中反应而将磺 酸基导入的方法。另外，例如，将阴离子交换基作为具有蛋白质吸附能力的官能团导入的情 况下，可以通过使三甲胺盐酸盐与通过接枝聚合而固定了的高分子侧链中的缩水甘油基反 应来导入季铵基。需要说明的是，高分子基材的表面积可以利用水银压入法求得。另外，蛋白吸附材料也可以是形成珠状的蛋白吸附珠。实施例以下，通过实施例更具体地说明本实施方式，但本实施方式并不仅限于这些实施 例。[实施例1]准备出已测定了质量的平均粒径35 μ m的超高分子量聚乙烯颗粒(Ticona社制造；⑶R-2126、比表面积0. 18m2/g)作为高分子基材。对该聚乙烯颗粒照射IOkGy的电子
射线，使自由基产生。将自由基产生后的聚乙烯颗粒浸渍在2体积％的甲基丙烯酸缩水甘油酯/1-丁醇 溶液中，通过在5°C振荡150小时，进行接枝聚合反应。将所得到的颗粒用醇清洗后，进行干 燥并测定质量，然后计算出接枝率，该接枝率为17%，高分子侧链的密度为0. 9g/m2。将所得到的颗粒浸渍在亚硫酸钠异丙醇纯水=10 15 75(质量％ )的溶 液中，在80°C振荡12小时，从而将磺酸基作为具有蛋白质吸附能力的官能团导入缩水甘油 基中。将导入了磺酸基的颗粒干燥并测定质量，从所增加的质量求得固定了的磺酸基的量。 固定了的磺酸基的量为0. 3mmol/g。进一步，将导入了磺酸基的颗粒浸渍在0. 5mol/L的硫 酸水溶液中，在80°C振荡2小时，从而将未反应的缩水甘油基进行二醇化。如此，得到了作 为蛋白吸附材料的阳离子型的蛋白吸附珠。将所得到的蛋白吸附珠填充在截面积0. 39cm2的柱(填充高度3cm)中，进行以下 的吸附性能试验。首先，将2g/L的溶菌酶溶液(IOmrnol碳酸钠/氢氧化钠水溶液缓冲液、 PH = 9)作为蛋白质溶液、即粗原料液，以2001^的空速从柱上至柱下通液，进行溶菌酶的 吸附操作。从柱下的出液口采样出口液，采用吸光光度法(吸光波长280nm)监控出口液 中的溶菌酶浓度。出口液中的溶菌酶浓度最初为零，但随着通液量的增加，慢慢地溶菌酶漏 出，溶菌酶浓度上升。进行吸附操作，直到出口液中的溶菌酶浓度达到与原液中的浓度相同 的浓度(2g/L)。将直到出口液中的溶菌酶浓度达到原液中的1/10为止的吸附量作为动态 吸附容量，将直到出口液中的溶菌酶浓度达到与原液中相同为止的吸附量作为平衡吸附容 量。吸附操作终止后，在柱中通入缓冲液进行清洗，然后将0. 5mol/L的氯化钠水溶液作为 溶出液通入柱中，以将吸附在蛋白吸附材料上的溶菌酶溶出。溶出率根据公式“100X(溶 出量)/(平衡吸附量(与溶出量相同的单位))”算出。其结果，动态吸附容量为39mg/mL(每 柱填充容积，以下相同。)，平衡吸附容量为60mg/mL，溶出率为100%。[比较例1]如下实施辐射剂量大、接枝率大的情况的比较例。将电子射线的辐射剂量从IOkGy 变更为IOOkGy,将进行接枝聚合反应的时间从150小时变更为24小时，除此之外，与实施例 1相同地进行，得到阳离子型的蛋白吸附珠。其接枝率为45%，高分子侧链的密度为2. 5g/ m2。固定了的磺酸基的量为1.2mmol/g。对于所得到的蛋白吸附珠，与实施例1相同地进行吸附性能试验，结果动态吸附 容量为14mg/mL，平衡吸附容量为22mg/mL，溶出率为90%，吸附容量不到实施例1中得到的 吸附容量的一半。[比较例2]如下实施反应温度高、接枝率大的情况的比较例。将接枝聚合反应的反应温度从5°C变更为40°C，将反应时间从150小时变更为2小时，除此之外，与实施例1相同地进行，得到阳离子型的蛋白吸附珠。其接枝率为41%，高分子侧链的密度为2. 3g/m2。固定了的 磺酸基的量为1. lmmol/g.对于所得到的蛋白吸附珠，与实施例1相同地进行吸附性能试验，结果动态吸附 容量为20mg/mL，平衡吸附容量为31mg/mL，为实施例1中得到的一半左右。另外，溶出率为 85%，难以充分回收被吸附的蛋白质。[实施例2]准备出已测定了质量的平均粒径35 μ m的超高分子量聚乙烯颗粒(Ticona社制 造；⑶R-2126、比表面积0. 18m2/g)作为高分子基材。对该聚乙烯颗粒照射IOkGy的电子
射线，使自由基产生。将自由基产生后的聚乙烯颗粒浸渍在2体积％的甲基丙烯酸缩水甘油酯/1-丁醇 溶液中，通过在5°C振荡120小时，进行接枝聚合反应。将所得到的颗粒用醇清洗后，进行干 燥并测定质量，然后计算出接枝率，该接枝率为13%，高分子侧链的密度为0. 7g/m2。将所得到的颗粒浸渍在50体积％的二乙胺水溶液中，在30°C振荡24小时，从而将 二乙氨基作为具有蛋白质吸附能力的官能团导入缩水甘油基中。将导入了二乙氨基的颗粒 干燥并测定质量，从所增加的质量求得固定了的二乙氨基的量。固定了的二乙氨基的量为 0. 6mmol/g。接着，将导入了二乙氨基的颗粒浸渍在50体积％乙醇胺/甲醇溶液中，在30°C 浸渍24小时，从而将未反应的缩水甘油基进行羟乙基氨基化。如此，得到了作为蛋白吸附 材料的阴离子型的蛋白吸附珠。将所得到的蛋白吸附珠填充在与实施例1中使用的柱相同的柱(填充高度3cm) 中，进行以下的吸附性能试验。首先，将lg/L的牛血清白蛋白溶液(20mmol Tris-HCl缓冲 液、PH = 8)作为蛋白质溶液、即粗原料液，以2001^的空速从柱上至柱下通液，进行白蛋白 的吸附操作。从柱下的出液口采样出口液，采用吸光光度法(吸光波长280nm)监控出口 液中的白蛋白浓度。出口液中的白蛋白浓度最初为零，但随着通液量的增加，慢慢地白蛋白 漏出，白蛋白浓度上升。进行吸附操作，直到出口液中的白蛋白浓度达到与原液中的浓度相 同的浓度(lg/L)。将直到出口液中的白蛋白浓度达到原液中的1/10为止的吸附量作为动 态吸附容量，将直到出口液中的白蛋白浓度达到与原液中相同为止的吸附量作为平衡吸附 容量。吸附操作终止后，在柱中通入缓冲液进行清洗，然后将lmol/L的氯化钠水溶液作为 溶出液通入柱中，以将吸附在蛋白吸附材料上的白蛋白溶出。溶出率根据公式“100X(溶 出量)/(平衡吸附量(与溶出量相同的单位))”算出。其结果，动态吸附容量为37mg/mL， 平衡吸附容量为43mg/mL，溶出率为100%。[实施例3]将反应溶液中的甲基丙烯酸缩水甘油酯的浓度从2体积％变更为15体积％，除此 之外，与实施例2相同地进行，得到阴离子型的蛋白吸附珠。接枝率为20%，高分子侧链的 密度为1.2g/m2，固定了的二乙氨基的量为1. lmmol/g。对于所得到的蛋白吸附珠，与实施例2相同地进行吸附性能试验，动态吸附容量 为18mg/mL，平衡吸附容量为66mg/mL，与平衡吸附容量相比，动态吸附容量较低。另外，溶 出率为95%。[实施例4]
准备出已测定了质量的平均粒径35 μ m的超高分子量聚乙烯颗粒(Ticona社制 造；⑶R-2126、比表面积0. 18m2/g)作为高分子基材。对该聚乙烯颗粒照射IkGy的电子射
线，使自由基产生。将自由基产生后的聚乙烯颗粒浸渍在10体积％的甲基丙烯酸缩水甘油酯/1- 丁 醇溶液中，通过在30°C振荡2小时，进行接枝聚合反应。将所得到的颗粒用醇清洗后，进行 干燥并测定质量，然后计算出接枝率，该接枝率为21%，高分子侧链的密度为1. 2g/m2。与实施例1相同地将磺酸基作为具有蛋白质吸附能力的官能团导入所得到的颗 粒上。固定了的磺酸基的量为0.5mmol/g。进一步，与实施例1相同地将未反应的缩水甘油基进行二醇化。如此，得到了作为 蛋白吸附材料的阳离子型的蛋白吸附珠。对于所得到的蛋白吸附珠，与实施例1相同地进行吸附性能试验，结果动态吸附 容量为38mg/mL，平衡吸附容量为55mg/mL。另外，溶出率为98%，能大致完全地回收蛋白。[实施例5]准备出已测定了质量的平均粒径35 μ m的超高分子量聚乙烯颗粒(Ticona社制 造；⑶R-2126、比表面积0. 18m2/g)作为高分子基材。对该聚乙烯颗粒照射IOkGy的、射
线，使自由基产生。将自由基产生后的聚乙烯颗粒浸渍在4体积％的甲基丙烯酸缩水甘油酯/1- 丁醇 溶液中，通过在5°C振荡100小时，进行接枝聚合反应。将所得到的颗粒用醇清洗后，进行干 燥并测定质量，然后计算出接枝率，该接枝率为10%，高分子侧链的密度为0. 5g/m2。将所得到的颗粒浸渍在亚硫酸钠异丙醇纯水=10 15 75(质量％ )的溶 液中，在80°C振荡12小时，从而将磺酸基作为具有蛋白质吸附能力的官能团导入缩水甘油 基中。将导入了磺酸基的颗粒干燥并测定质量，从所增加的质量求得固定了的磺酸基的量。 固定了的磺酸基的量为0. 2mmol/g。进一步，将导入了磺酸基的颗粒浸渍在0. 5mol/L的硫 酸水溶液中，在80°C振荡2小时，从而将未反应的缩水甘油基进行二醇化。如此，得到了作 为蛋白吸附材料的阳离子型的蛋白吸附珠。对于所得到的蛋白吸附珠，与实施例1相同地进行吸附性能试验，结果动态吸附 容量为28mg/mL，平衡吸附容量为41mg/mL，溶出率为100%。本申请基于2007年11月26日提出的日本专利申请(日本特愿2007-304826)，以 参考的形式将其内容引入本说明书中。工业实用性根据本发明，能提供一种蛋白吸附材料，该蛋白吸附材料在医药品制造工序等的 生物工艺中，适合于蛋白质等有价值的物质的吸附回收或杂质的吸附去除等吸附精制操 作，能以高速且高容量进行吸附精制。更详细地说，本发明的蛋白吸附材料能够将在吸附 材料内部的物质移动、向细孔内的扩散的阻力带来的制约降低，能吸附精制如蛋白质那样 的大分子。因此，可提供能够同时兼具可用作工业生产用或分析用的吸附容量(此处的吸 附容量不是平衡吸附容量，而是在吸附处理时吸附漏损不能忽视这种程度的所能吸附的容 量，即动态吸附容量)和高速处理性的蛋白吸附材料及其制造方法。
权利要求
一种蛋白吸附材料，该蛋白吸附材料含有高分子基材、被固定在该高分子基材的表面上的高分子侧链、和被固定在该高分子侧链上的具有蛋白质吸附能力的官能团；相对于所述高分子基材的质量，所述高分子侧链的质量为5％～30％。
2.如权利要求1所述的蛋白吸附材料，其中，所述高分子侧链是通过乙烯基单体的聚 合而得到的。
3.如权利要求1或2所述的蛋白吸附材料，其中，所述高分子侧链是通过与构成所述高 分子基材的高分子结合而被固定在所述高分子基材的所述表面上的，所述官能团是通过结 合在所述高分子侧链上而被固定的。
4.一种蛋白吸附材料的制造方法，该方法包括以下工序活化高分子基材的第1工序；使包含具有蛋白质吸附能力的官能团的乙烯基单体或包含能够将具有蛋白质吸附能 力的官能团导入的官能团的乙烯基单体、与所述活化后的所述高分子基材接触，使所述乙 烯基单体聚合成的高分子侧链固定在所述高分子基材的表面上的第2工序；和在所述乙烯基单体不包含所述具有蛋白质吸附能力的官能团的情况下，在所述乙烯基 单体所具有的所述能够将具有蛋白质吸附能力的官能团导入的官能团上导入具有蛋白质 吸附能力的官能团的第3工序；相对于所述高分子基材的质量，所述高分子侧链的质量为5% 30%。
5.如权利要求4所述的蛋白吸附材料的制造方法，其中，构成所述高分子基材的高分 子化合物含有聚乙烯，在所述第1工序中，对所述高分子基材以IkGy 20kGy的辐射剂量 照射放射线而活化所述高分子基材。
6.如权利要求5所述的蛋白吸附材料的制造方法，其中，在所述第2工序中，在30°C以 下的所述乙烯基单体的溶液中使所述高分子侧链固定。
7.如权利要求5或6所述的蛋白吸附材料的制造方法，其中，在所述第2工序中，在所 述乙烯基单体的浓度被调制在10体积％以下的溶液中，使所述乙烯基单体与所述活化后 的所述高分子基材接触。
8.如权利要求5 7任一项所述的蛋白吸附材料的制造方法，其中，所述乙烯基单体含 有甲基丙烯酸缩水甘油酯。
全文摘要
本发明的目的在于提供蛋白吸附材料及其制造方法，该蛋白吸附材料不仅能够用于分析用途，而且即使作为工业生产用也同时兼具可适用的程度的吸附容量和高速处理性。本发明提供蛋白吸附材料，该蛋白吸附材料含有高分子基材、被固定在该高分子基材的表面上的高分子侧链、和被固定在该高分子侧链上的具有蛋白质吸附能力的官能团；相对于上述高分子基材的质量，上述高分子侧链的质量为5％～30％。
文档编号C07K1/16GK101827648SQ20088011180
公开日2010年9月8日 申请日期2008年11月18日 优先权日2007年11月26日
发明者久保田昇, 古本五郎, 斋藤恭一 申请人:旭化成化学株式会社