专利名称：将感兴趣蛋白靶向宿主细胞包膜的方法和组合物的制作方法
将感兴趣蛋白靶向宿主细胞包膜的方法和组合物
背景技术：
已经尝试在细菌中表达重组真核膜蛋白，但这些方法因包括毒性和不溶性的原因 以及内含体不期望的形成而存在问题(Grisshammer等Biochem. J. 295 :571_576 (1993)； Tucker 禾口 Grisshammer Biochem. J. 317 891-899 (1996) ；Weiss 禾口 GrisshammerEur. J.Biochem. 269 :82-92(2002) ；Yeliseev 等 Protein Sci. 14 :2638_53(2005) ；Krepkiy 等 Protein Expr Purif.49 60-70(2006) ；Yeliseev 等 Protein Expr Purif. 53 153-163(2007))。另外，缺乏在大肠杆菌(E. coli)中重组膜蛋白过表达的可靠的方法。真核膜蛋白通过在N末端信号序列或C末端靶向序列中编码的地址而靶向真核细 胞中各区室(Emanuelsson 等 Nature Protocols 2:953-971 (2007))。在生物发生过程中 通常除去信号序列。在没有膜区室化的细菌中，大部分新翻译的膜蛋白——即使与核糖体相结合 时——被信号识别颗粒(SRP)和SRP受体蛋白识别，以靶向至围绕细菌细胞的内膜。在 大肠杆菌中研究的大部分内膜蛋白使用SRP通路和Sec移位酶来靶向至膜和膜装配。 另外，膜蛋白的亚型对YidC具有绝对要求，YidC为辅助膜插入过程的大肠杆菌的多 起源内膜蛋白。YidC对于大肠杆菌细胞生存力是必需的(Samuelson等Nature 406 637-641 (2000) ；Urbanus 等EMB0 Rep. 2 524-529 (2001) ；van Bloois 等 J. Biol. Chem. 280 12996-13003(2005))。蛋白——其依赖二硫键获得其天然结构——的稳定表达的选择方法是将新合成 的蛋白输出到含有二硫键催化酶(SRP-依赖性DsbA、DsbB、DsbC和DsbD)的大肠杆菌周质 中(Bardwell 等Cell 67 581(1991);叙111行&111等￡]\ 0 J. 11 57(1992) ；Novagen (now EMD Chemicals,Inc. ,Gibbstown,NJ)pET system manual (llthed. Jan. 2007) ；Missiakas 等 EMB0 J. 13 2013-2020 (1994)；以及 Zapun 等 Biochemistry34 :5075_5089 (1995))。输出到周质的候选蛋白可以使用信号肽搜索算法如Phobius(http://phobius. sbc. su. se/) (Kail 等，Nucleic Acids Res. 35 :W429_32 (2007))禾口 Signal P (http: //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/) (Emanuelsson 等 Nat Protoc. 2 (4) :953_71 (2007))通过 N末端信号肽来鉴定。然而，向周质输出受到Sec蛋白输出机器流通容量的限制(P6reZ-P6reZ等 Biotechnology 12(2) 178-80 (1994))，其中Sec转移酶可以变饱和并且导致天然分 泌蛋白的细胞质积聚和过表达感兴趣的蛋白(Wagner等Mo 1. Cell Proteomics6 (9) 1527-50(2007))。当感兴趣的蛋白对于大肠杆菌是非天然的和/或不是正常分泌的时，这 更普遍地被观察到。可选地，非天然蛋白可以在合成期间变得错误折叠，从而变得不适于 Sec-介导的跨内膜输出。发明概述本发明的实施方式提供导入具有细胞质区室(cytoplasmic compartment)和包膜 的原核宿主细胞中的重组DNA。该重组DNA编码N末端蛋白运载体，所述N末端蛋白运载体 将融合到该运载体的感兴趣的蛋白从细胞质区室运输到包膜，其中编码的蛋白运载体包括膜靶向肽、细胞质亲和结合结构域和跨膜区段。编码蛋白运载体的DNA优选与编码感兴趣 蛋白的DNA融合。在一个实施方式中，编码的膜靶向肽特征是对于21的窗口大小至少1.52的 Goldman-Engelman-Steitz (GES)疏水性分数。在另外的实施方式中，编码的膜靶向肽和编 码的跨膜区段——它们可以彼此不同——然而具有21个氨基酸的氨基酸窗口，以便在21 个氨基酸窗口内存在缺少Asp、Glu、Arg和Lys的至少9个氨基酸的疏水核心序列。在另外 的实施方式中，膜靶向肽是YidC依赖性的。YidC依赖性肽的实例是PVIII、Pf3外壳和亚基 C变体L31F。在另外的实施方式中，跨膜区段的21个氨基酸窗口在N末端侧翼是这样的氨 基酸序列，所述氨基序列包含总电荷为至少+1的至少9个氨基酸。另外，跨膜区段在C末 端侧翼可以是氨基酸连接序列，其可以含有信号肽酶切割位点。氨基酸连接序列可以 含有 异源蛋白酶切割位点。编码的跨膜区段可以是信号肽酶的TM2。在本发明的实施方式中，细胞质亲和结合结构域是糖结合结构域，例如壳多 糖_结合结构域或His标记和str印标记。在本发明的实施方式中，提供包含膜靶向肽、细胞质亲和结合结构域和跨膜区段 的融合蛋白。融合蛋白可以另外包含感兴趣的蛋白。例如，感兴趣的蛋白可以是膜蛋白或 毒蛋白，如重组限制性内切核酸酶，如Sau3AI或其同切点酶。在本发明的实施方式中，提供在革兰氏阴性菌宿主细胞中产生重组蛋白的方法， 该方法包括获得编码蛋白运载体的重组DNA，所述蛋白运载体特征如上并且融合到编码感 兴趣蛋白的DNA，以及用该DNA转化宿主细胞。重组蛋白可以通过将细胞质亲和结合结构 域结合到亲和性底物(基底)从宿主细胞纯化。亲和性底物可以用于检测、纯化和/或测 定表达的感兴趣蛋白的量。也可以测定表达的感兴趣蛋白的酶活性。感兴趣的蛋白实例包 括Sau3AI和BfuCI。在感兴趣的蛋白含有半胱氨酸而不需要二硫桥的情况下，宿主细胞因 dsbA基因中突变而优选具有DsbA—表型。在本发明的实施方式中，提供包含SEQ ID NO 23的核苷酸序列631-1986的DNA。在本发明的实施方式中，提供在上面所述Sau3AI或其同切点酶的同源甲基化 (cognate methylation)不存在的情况下产生限制性内切核酸酶的方法。另外提供包含上 述重组DNA的载体。也提供用载体转化的宿主细胞。附图简述图1显示PhoAl位于细胞质中的pVIII-PhoAl融合蛋白的膜拓扑结构。图2显示pVIII-TM2的膜拓扑结构，其中感兴趣的蛋白被输出到周质。(“TM2”是 任何跨膜区段的缩写。)图3显示pVIII-8His的膜拓扑结构，其中感兴趣的蛋白位于pVIII和融合连接 (fution junction)之间。图4显示证明各种膜靶向肽表达的抗pVIII免疫印迹。pVIII-P2是对照融合蛋 白，其表达自亲代表达克隆PVIII-P2。( “P2”是感兴趣的蛋白的缩写)。pVIII-8His含 有细胞质八个组氨酸亲和标记。PVIII-CBD含有细胞质壳多糖-结合结构域(CBD)亲和标 记。在不添加IPTG(-)的情况下，检测不到蛋白，这证实了 IPTG诱导型表达对照具有所有 PMS119衍生质粒。泳道(M)含有生物素化的蛋白梯(CellSignaling Technology#7727S, Beverly, MA)，其通过抗生物素、HRP连接的抗体来检测。
图5显示pVIII-CBD的膜拓扑结构。图6显示pVIII-CBD-PhoA9融合蛋白的膜拓扑结构。图7显示pVIII-CBD-Oxalp融合蛋白的膜拓扑结构，其中Oxalp是真核膜蛋白。图8显示pVIII-CBD-0xa8His融合蛋白的膜拓扑结构。图9显示VIII-CBD-Ek_0xa8His融合蛋白的膜拓扑结构。图10显示pVIII-CBD-TeV-0Xa8HiS融合蛋白的膜拓扑结构。(“His”是用于亲和 结合的组氨酸肽的缩写。“Tev”是烟草蚀刻病毒的缩写)。图11A显示抗pVIII单克隆抗体用于鉴定纯化的pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His融 合蛋白的免疫印迹。这样来制备用于电泳的所有样品添加SDS样品缓冲液(NewEngland Biolabs, Inc. (NEB) #B7703S, Ipswich MA)，然后在 37°C下加热 5min。泳道(M)含有生物素化的蛋白梯(CellSignaling Technology#7727S,Beverly, MA)，其通过抗生物素、HRP连接的抗体来检测。泳道(m)加载有在与n-十二烷基-0 -D-麦芽糖苷(DDM)完全溶解之前的膜制备 物样品。泳道(L)显示在DDM溶解和通过离心去除不溶性物质后加载样品的组成。泳道(ft)显示在与加载样品温育后镍-NTA树脂上清液(流通)的组成。泳道(el)显示在添加含400mM咪唑的80 y L洗脱缓冲液后洗脱的蛋白。泳道(e2)显示第二个80 y L洗脱馏分的组成。箭头表示纯化的 pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His蛋白，其具有62247道尔顿的计算分子量。图11B显示抗FLAG单克隆抗体用于证实pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His融合蛋白纯化 的免疫印迹。图11A的泳道描述适用于图11B。箭头表示纯化的pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His 蛋白，其具有62247道尔顿的计算分子量。图12A和12B是显示不同构建物的PhoA活性(图12A)和每个表达单位的PhoA 活性(图12B)的表。将DHB4细胞在30°C生长并且用ImM IPTG诱导lhr，以表达示例的融
合蛋白。
图13显示融合到真核膜蛋白(Oxalp)的突变体亚基C Foc(L31F)的膜拓扑结构。
图14显示 pVIII-PhoAl 序列5606bp(SEQ ID NO :1)。
图15显示 pVIII-EcoRI 序列4229bp(SEQ ID NO 2)。
图16显示 PVIII-TM2 序列:4415bp(SEQ ID NO 3)。
图17显示 pVIII-8His 序列:4415bp(SEQ ID NO :4)。
图18显示 pVIII-CBD 序列4580bp(SEQ ID NO 5)。
图19显示 pVIII-CBD-PhoA9 序列5957bp(SEQ ID NO 6)。
图20显示 pVIII-CBD-Oxalp 序列5662bp(SEQ ID NO 7)。
图21显示 pVIII-CBD-0xalp-8His 序列5686bp(SEQ ID NO 8)。
图22显示 pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His 序列5716bp(SEQ ID NO :9)。
图23显示 pVIII-CBD-Tev-0xalp-8His 序列5710bp(SEQ ID N0:10)。
图24显示 F。c(L31F)-PhoA9 序列5657bp(SEQ ID N0:11)。
图25显示 F。c(L31F-10His)-PhoA9 序列5687bp(SEQ ID NO: 12)。
图26显示用于包膜靶向的不同种类N末端蛋白运载体的图。(1)相应于膜靶向肽，其延伸穿过膜进入细胞质和任选地进入细胞外空间。(2)相应于细胞质蛋白结构域，其 中蛋白结构域能够结合亲和性底物。(3)相应于跨膜区段(TM2)，TM2经由抗蛋白酶细胞质 肽⑶连接到亲和结合结构域。感兴趣的蛋白是(4)。细胞外表位是(5)。(9)是任选含有 信号肽酶(SPase)切割(裂解)位点(7)或异源蛋白酶切割位点(6)的连接序列。图26A显示(4)粘连在细胞质外的空间中。图26B显示⑷最后可以在位于(5)和⑷之间的切割位点(6)处从(5)体内切 割。这需要以调节或组成型方式表达分泌到周质中的异源蛋白酶的菌株。靶向周质的异源 蛋白酶进行的体内切割可以涉及例如，肠激酶(Ek)或烟草蚀刻病毒(Tev)。图26C显示粘附至(5)的⑷最后可以在(3)和(5)之间的SPase识别序列(7) 处切割，留下连接到感兴趣蛋白(4)的细胞外表位。宿主细胞本身含有SPase，因此体内切 割是组成型的。图26D显示蛋白融合体，其中SPase在缺乏(5)的情况下在(3)和(4)之间于(7) 处直接切割。图27A和27B显示基因融合体，其结合有蛋白跨膜输出所期望的元件，其中 pVIII-CBD载体可以用于感兴趣蛋白的输出以及通过大肠杆菌SPase的组成型切割而释放 入周质中。图27A显示pVIII构建物的载体图。其包括选择的启动子(Ptac)、编码膜靶向肽 (pVIII)的DNA、编码亲和结合蛋白(CBD)的DNA、编码TM2的DNA、任选的SPase位点、任选 的编码表位(FLAG)的DNA、任选的编码蛋白酶切割位点(Ek)的DNA和编码感兴趣蛋白的 DNA。图27B显示克隆策略的线性图，其中输出的蛋白在大肠杆菌SPase体内切割后可 以与N末端FLAG表位一起表达。将pVIII-CBD载体的这种修饰称为pVIII-CBDspEk。缩写 “sp”表示SPase位点。缩写“Ek”表示包含FLAG表位(DYKDDDDK) (SEQ ID NO 13)和相应 的肠激酶蛋白酶切割位点(DDDDK) (SEQID NO 14)。图28A-C显示大肠杆菌中Sau3AI的克隆和输出策略。图28A 具有图26C中显示的构型的SPase切割后的Sau3FLAG(SEQ IDN0 17)。图28B 具有图26D中显示的构型的SPase切割后的Sau3Ala(SEQ ID NO 18)。图28C 具有图26D中显示的构型的SPase切割后的Sau3Met (SEQ ID NO 19)。图29显示Sau3AI输出。在SPase切割后期望的蛋白质量是58656道尔顿。在 SPase切割后，获得融合至FLAG的Sau3AI蛋白，如使用抗FLAG M2通过FLAG表位免疫印迹 所检测，其中 N 末端氨基酸是 AYEPFQIPSGSDYKDDDDKGSESYL. ... (SEQ ID NO: 17)。图30显示Sau3AI在非甲基化酶保护的大肠杆菌dsbA—宿主MB68中的表达。 DNA底物是T7基因组DNA(6个GATC位点)。在SPase切割后，Sau3AI蛋白的N末端是 AESYL. ... (SEQ ID NO: 18)。重复试验的结果显示在所标记的泳道a和b中。左侧泳道是 大小标记物，而右侧泳道是BfuCI的消化产物，其充当对照。图31显示Sau3AI在大肠杆菌dsbA_突变体中的表达。在SPase切割后，蛋白具
有N末端AESYL......(SEQ ID N0:18)。标记泳道并且每个样品重复四次。从左至右，使
用6个单位的纯化酶在37°C下显示底物切割的结果，并且BfuCI酶充当对照。dsbA—标题表示蛋白表达在菌株MB68中进行而标题dsbA+表示蛋白表达在野生型(wt) dsbA菌株DHB4 (MB68的同基因亲代株)中进行。每个泳道显示用2 μ 1细胞裂解物或 2μ1稀释的细胞裂解物消化IygA噬菌体基因组DNA的结果。因此4个泳道的每一组表 示2倍连续稀释系列。标题中的温度表示培养物生长晕(outgrowth)温度，而浓度表示用 于诱导Sau3AI表达的最终IPTG浓度。在Sau3AI诱导期期间将所有培养物变为20°C。右 侧泳道是BfuCI消化的产物，其充当对照。图32显示在dsbA-大肠杆菌菌株MB68中使用pVIII-CBDsp进行的wt Sau3AI输 出。Sau3AI表达自克隆135D或145A。底物是1 μ g T7基因组DNA(6个GATC位点)。在
SPase切割后，Sau3AI具有MESYL.......(SEQ ID NO 19)的N末端序列。显示了具有两种
不同克隆的结果。最左侧泳道是Ikb标记物(NEB，Ipswich, ΜΑ)。最右侧泳道是BfuCI消 化对照。显示了每个克隆裂解物的两倍连续稀释。每一系列泳道表示细胞裂解物的2-倍 连续稀释(以2 μ 1未稀释的裂解物开始)所产生的反应。图33显示在dsbA-大肠杆菌菌株ΜΒ68中使用pVIII-CBDsp进行的BfuCI输出。底
物是T7基因组DNA (6个GATC位点)。在SPase切割后，BfuCI的N末端是VFETE.......(SEQ
ID NO 20)。最右侧泳道是BfuCI对照消化。图 34 显示 pVIII-CBD-Ek-Pho 18DNA 序列(SEQ ID NO :21)。图 35 显示 pVIII-CBD-sp-Ek DNA 序列(SEQ ID NO 22)。图 36 显示 pVIII-CBD-sp-BfuCI DNA 序列(SEQ ID NO 23)。实施方式详述本发明的实施方式提供用于表达异源膜蛋白(感兴趣的蛋白)并且将异源膜蛋白 (感兴趣的蛋白)运输到内膜以及将包括毒蛋白在内的异源可溶性蛋白膜易位到宿主细胞 周质的方法和组合物。该方法包括表达编码N末端蛋白运载体的DNA，所述DNA融合到编码 感兴趣蛋白的DNA。表达的融合蛋白表达在细胞质中并且以YidC依赖性和/或SRP-依赖 性方式靶向内膜。组合物包括重组DNA，其编码N末端蛋白运载体和感兴趣的蛋白。N末端蛋白运载 体优选包括膜靶向肽、细胞质亲和结合结构域和跨膜区段。另外，N末端蛋白运载体可以含 有SPase位点，以便SPase的体内剪切释放可溶性的感兴趣蛋白或释放融合的感兴趣的膜 蛋白。另外地或可选地，N末端蛋白运载体可以包括异源蛋白酶位点如Tev蛋白酶切割位 点或肠激酶切割位点，以体内或体外切割和释放感兴趣的蛋白。基因工程DNA的表达发生在适于表达感兴趣的蛋白的宿主细胞中。例如，毒性可 溶性蛋白优选在dsbA_宿主细胞中表达，所述毒性可溶性蛋白含有半胱氨酸并且对于折叠 和活性不需要二硫键。使用上述方法的实施方式，毒性限制性内切核酸酶成功地表达并且 以活性形式输出到周质(不用保护基团如胞嘧啶或腺嘌呤甲基化修饰宿主基因组DNA)而 对宿主细胞没有毒性作用。感兴趣的蛋白“感兴趣的蛋白”指用于整合在宿主细菌细胞内膜中或用于跨内膜易位到周质空间中的期望的重组蛋白。感兴趣的蛋白实例包括DNA代谢酶，其不利地影响宿主细胞生存力(例如限制性 内切核酸酶)和其它细胞毒蛋白；蛋白酶，其影响宿主细胞生理(例如，ATP-依赖性蛋白 酶)；蛋白质，其正常分泌在自然宿主中，但其中表达和输出在大肠杆菌中是未知的(例如来自木薯单孢萎蔫病(Xanthomonas manihotis)的α-1，3_半乳糖苷酶)；以及蛋白质，其 当在细胞质中表达时易于形成聚集/包含体(例如，外周膜蛋白和正常存在于多蛋白复合 体中的蛋白)。这些蛋白质常常具有疏水性蛋白-相互作用表面，其当单独表达蛋白而没有 其伴侣时引起聚集。当靶向内膜表面时，这些蛋白可以更稳定地表达。将这种蛋白锚定于 内膜可以有助于融合蛋白的稳定表达。感兴趣的蛋白在此实例是Ρ2、多起源(polytopic)整合膜蛋白Oxalp或分泌的蛋 白PhoA以及还有毒性限制性内切核酸酶Sau3AI和BfuCI。宿主细胞
表达融合蛋白的宿主细胞优选是革兰氏阴性菌，如具有包膜的大肠杆菌。(“包膜” 指在细胞质空间和细胞外环境之间形成屏障的细菌细胞结构。其一般包括细菌的内膜和周 质)。宿主细胞优选是DsbA_表型——如果蛋白质具有半胱氨酸但对于折叠和活性不需要 二硫键。例如，Sau3AI含有3个半胱氨酸并且当在wt dsbA菌株中表达入周质时无活性， 而当在缺少周质DsbA的菌株(DsbA_)中表达入周质时有活性。限制性内切核酸酶BfuCI (2 个半胱氨酸)当在DsbA_宿主细胞中表达到周质时有活性。尽管不希望受理论的限制，但我们认为pVIIICBD-PhoA膜-靶向肽依赖于大肠杆 菌宿主细胞中的信号识别颗粒。这使用含有wt信号识别颗粒组分Ffh (ffh基因编码的54 同源物)的细胞或突变Ffh (从ffh77等位基因表达的蛋白突变体Ala37Pro)细胞(Tian等 (J Bacteriol. 184(1) :111_8 (2002))和 Huber 等(J Bacteriol. 187(9) :2983_91(2005) 报道的突变)来证明。我们用ffh77突变构建了 MC1061衍生物，以检查pVIII_CBD N末 端蛋白运载体的 SRP-依赖性。MC1061(ffh77)使用 Hamilton 等(JBacteriol. 171(9) 4617-22 (1989))描述的等位基因交换方法衍生自MC1061。当pVIII-CBD-Ek-PhoA18使用同 样的条件在MC106l(wtffh)和MC1061(ffh77)细胞中表达时，ffh77细胞中PhoA活性(1120 单位)发现仅仅是wt ffh细胞中表达水平(2860单位)的39%，这表明pVIII-CBD-介导 的PhoA输出利用共翻译SRP途径。膜靶向肽如本文所用，“膜靶向肽”指促进重组蛋白靶向内膜进行整合或膜易位的蛋白质、 多肽、肽、区段或结构域。膜靶向肽可以根据其在膜中的拓扑结构来描述。例如，指原核或真核蛋白拓扑结 构的术语“N-out，，含义是，该蛋白的N末端在含有该蛋白的膜的外部或从含有该蛋白的膜 向外部突出。(细菌中N-out位置是周质空间。)膜靶向肽在共翻译过程中被信号识别颗粒识别。这避免了向细胞质中释放易聚集 的疏水区段。本文使用的膜靶向肽根据下面所限定的疏水性从天然或合成蛋白质选择。本 文通过 GES 模型(Engelman 等 Annu. Rev. Biophys. Chem. 15 :321_353 (1986))来计算疏水 性。该计算可以使用 TopPred 算法(http://mobyle.pasteur.fr/cgibin/MobylePortal/ portal, py ？ form = toppred) (Claros 等 CABIOS 10 :685_686 (1994))来完成。经发现， 膜靶向肽特征在于21个氨基酸窗口(amino acid window)，其中存在缺少Asp、Glu、Arg和 Lys的至少9个氨基酸的疏水核心序列。使用该21个氨基酸的窗口，将GES疏水性分数赋 值给膜靶向肽。GES分数优选大于1.521 (全部窗口大小为21)。如本文所用，“窗口”指可 以通过计算机算法来鉴定的一段连续的氨基酸序列，该计算机算法被设计来检索特定长度的序列。这些膜靶向肽的实例是pVIII或在寡聚化中有缺陷的FlFo ATP合成酶亚基C的突 变体(F0c) (Kol 等 J.Biol. Chem. 281 :29762_29768 (2006))或 Pf3 外壳蛋白(Thiaudiere^ Biochemistry 32(45) 12186-96 (1993))。对于膜装配，这些蛋白依赖于YidC并且形成跨 膜区段(Chen 等 JBiol Chem 277(10) :7670_5 (2002) ；Samuelson 等 JBiol Chem. 276 (37) 34847-52(2001))。pVIII蛋白是基因Vlll(gVIII)表达的M13噬菌体的主要外壳蛋白。pVIII已经 进化成作为M13噬菌体生物发生过程的一部分而有效地插入到大肠杆菌的内膜中。pVIII 的前体形式(Procoat) (ThiaudiSre 等 Biochemistry 32(45) 12186-96 (1993))是 73 个氨 基酸，而成熟的外壳蛋白是50个氨基酸。pVIII前体形式在插入到内膜后被细菌的SPase 切割。前体pVIII蛋白优选插入在具有N-in、C_in拓扑结构的膜中。(“In”指细胞质 位置，而对于革兰氏阴性细胞中的这种蛋白，“out”指周质位置。“拓扑结构”指组成天然或 合成膜的脂双层中的取向)。pVIII膜靶向肽或其突变体或衍生物优选含有疏水区(ThiaudiSre等 Biochemistry 32(45) 12186-96 (1993)中所提供的 pVIII 前体形式的残基 44-64)，所述 疏水区已经被赋值1. 801的GES疏水性分数，(对于SRP-依赖性DsbA信号序列，明显高于
1.52的阈值)。因此，pVIII膜靶向肽被大肠杆菌信号识别颗粒所识别，这促进感兴趣的融 合膜蛋白的膜整合或帮助可溶性蛋白的膜易位。本发明的实施方式优选使用具有N-out拓扑结构的感兴趣的异源膜蛋白。在这些 情况下，N末端蛋白运载体的C末端优选在细胞质外。因此，使用标准技术设计和构建了一 系列靶向膜的构建物，其中使用细菌的SPase蛋白的区段来延伸pVIII (参见实施例2_4，图
2、3、5)。该区段优选包括SPase细胞质环的一部分以及第二TM2加延伸到周质中的多个氨 基酸。在pVIII-CBD-PhoA9融合蛋白的表达时，在实施例5中证明了 SPase TM2为有效的 输出信号，其中在通过SPase TM2调节(介导)跨内膜易位后，PhoA结构域是有活性的。C-out修饰的pVIII膜靶向肽命名为pVIII-TM2(图2)。在SPase切割后，pVIII 的成熟形式在具有N-out、C-in拓扑结构的膜中保持其位置。当感兴趣的膜蛋白融合到突入周质中的跨膜区段的C末端时，感兴趣的膜蛋白指 N-out膜蛋白。感兴趣的“N-out”蛋白可以通过可读框(ORF)诱变产生用于表达重组融合 蛋白的、融合到N末端蛋白运载体ORF的突变重组基因来衍生自感兴趣的“N-in”蛋白。例 如，可以构建重组融合蛋白0RF，以便感兴趣的蛋白的天然信号肽被编码本文描述的膜靶向 肽之一的ORF所替换。在本发明的实施方式中，提供产生具有正确拓扑结构的N-out真核 膜蛋白的方法，其通过作为融合蛋白来表达这样的蛋白进行，其中融合连接位于大肠杆菌 周质中(参见例如，实施例6-9，图7-10)。这和直接融合到膜靶向肽如pVIII C末端的蛋白或结构域不同(图1)。在这些 情况下，一旦融合蛋白的膜装配后，融合连接便在细胞质中。例如，通过将PhoA报道结构域 基因序列连接到pVIII ORF下游的EcoRI位点中来构建pVIII-PhoAl (pVIII细菌碱性磷酸 酶1)。融合蛋白PVIII-PhoAl (图1)的表达在细菌宿主细胞中是强烈的并且可以通过使 用PhoA单克隆抗体(Sigma，St. Louis,MO)来检测。发现这些细胞中PhoA活性是可以忽略的，这证明PhoA结构域如所期望的那样是在细胞质中。仅当输出到周质后Dsb系统形成需 要的二硫键时，PhoA功能上才有活性。将感兴趣的重组真核膜蛋白输送到宿主细菌内膜的N末端蛋白运载体可以包括 YidC依赖性ATP合成酶亚基C变体(F。c L31F)，其具有C末端突入周质中的两个跨膜区段。 C末端可以融合到感兴趣的靶标膜蛋白。其任选融合到C末端处的标记。亲和标记可以插 入亚基C变体两个跨膜区段之间的细胞质区域中(图13)。细胞质亲和结合结构域N末端融合伴侣中适合的细胞质蛋白-结合结构域包括糖结合结构域如壳多糖_结合结构域、纤维素_结合结构域和麦芽糖_结合结构域 ’聚_组氨酸标记、Strep标 记和适应于细胞质表达的任意其它蛋白标记。我们已经发现，将亲和标记添加到N末端融合伴侣的细胞质环，不干扰膜装配(图 3-6，实施例5-9)。例如，pVIII-TM2中的SPase-细胞质环部分被任意亲和标记或检测结构域如 CBD(图5)或His标记(图3)所替换。在图3中，pVIII_TM2在SPase的35-42位置处于 被突变从而在细胞质环中编码一段八个组氨酸的序列。PVIII-SHiS和pVIII-CBD有效的膜 装配使用单克隆抗体通过免疫印迹方法来证实，所述抗体在SPase体内膜插入和加工后优 选识别PVIII的成熟N末端(图4)。在另外的实例中，pVIII-CBD显示，调节PhoA9蛋白向大肠杆菌周质的易位。融合 蛋白pVIII-PhoA9的表达(图6)在细菌宿主细胞中是强烈的并且可以通过使用PhoA单克 隆抗体来检测或通过进行磷酸酶测定来测量(图12)—一因为二硫键形成激活周质PhoA结 构域。跨膜结构域“TM2”是具有限定的拓扑结构的任何跨膜区段的一般术语。对于21个氨基酸的氨 基酸序列窗口，该区段优选包含缺少Asp、Glu、Arg和Lys的至少约9个氨基酸的核心序列， 并且21个氨基酸窗口在N末端侧翼是包含具有至少+1总电荷的至少约9个氨基酸的氨基 酸序列。跨膜结构域的N末端优选位于细胞质中并且连接到细胞质亲和结合结构域。跨膜 结构域的C末端可以在某些情况下具有净负电荷。跨膜区的C末端可以经由氨基酸连接序 列连接到感兴趣的蛋白。连接氨基酸序列可以含有SPases和/或异源蛋白酶的切割位点。 连接体的组成和切割位点显示在图26和27中。在一个实例中，使用大肠杆菌SPase识别序 列。大肠杆菌SPase识别依赖于位于内膜中的TM区段以及也依赖于对于切割点在_3和_1 处的松弛型氨基酸共有序列(Nielsen等Protein Eng. 10(1) 1-6 (1997)) 在-3和-1处 最经常发现丙氨酸，但可以被其它小的中性侧链所取代。当脯氨酸存在于+1处时，SPase活 性可能被抑制(Barkocy-Gallagher 等 J Biol Chem. 267 (2) :1231_8 (1992))。然而，根据 对SPase功能的体内研究，在+1处的任意氨基酸均是可接受的(除脯氨酸外)(Dalbey等 Protein Sci.6(6) :1129-38(1997))。如果干扰TM2序列被并入pVIII和感兴趣的蛋白之间，则感兴趣蛋白的N末端区 域将易位到周质空间中(图2)。切割位点在本发明的实施方式中，切割位点或位点已经被改造入融合蛋白。改造的蛋白酶切割位点此处显示不干扰膜装配。证明这的实例包括具有在PVIII细胞质C末端改造的 切割位点的融合蛋白；以及突入周质的第二 TM2的C末端处的位点(Ek、Tev和/或SPase)。 因此，这能够从膜靶向肽释放感兴趣膜蛋白(被靶向的膜蛋白)的N末端。融合蛋白的蛋 白酶消化可以在体外或体内完成。m^r.为了表达的感兴趣蛋白的抗体检测，可以并入的可能的表位实例很多。例如，可以 使用抗CBD单克隆抗体和抗CBD血清(NEB，Ipswich ΜΑ)来检测并入的CBD。用于多-His 检测的抗体产品可以商业获得。成熟PVIII融合蛋白的极N末端的识别可以用pVIII单克 隆抗体 B62-FE2 进行(Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg Germany)，以评价全长蛋白 的表达(Kneissel等J. Mol. Biol. 288 :21-28 (1999))。适合细胞外表位是抗FLAG抗体可 以识别的 FLAG (Sigma, St. Louis, MO)。N末端蛋白运载体pVIII-CBD融合伴侣对于表达膜蛋白的有效性可以通过在细菌宿主中测定来确 立，该在细菌宿主中内源YidC表达被抑制并且在缺乏补体蛋白的情况下影响生存力(van Bloois 等 J. Biol Chem 280 :12996_13003 (2005))。在测定中，补体蛋白此处由 Oxalp提供， 其作为与pVIII-CBD N末端蛋白运载体的融合体表达。Oxalp是真核膜蛋白，为YidC的功 能同源物以及发现于真核细胞的线粒体内膜中。只有当Oxalp融合体正确表达和插入细菌 内膜中时，该细菌才可以存活。图7-10显示以有功能形式表达并且插入大肠杆菌内膜中的 融合蛋白的图。这些结果例证了 pVIII-CBD融合伴侣对异源膜蛋白表达的效用。融合蛋白纯化可以采用使用亲和标记来结合在树脂、珠(包括磁性珠)或本领域已知的基质上 显示的固定底物进行融合蛋白纯化的方法，以纯化表达的膜蛋白。分离感兴趣的膜蛋白也可能需要通过蛋白酶消化(例如，肠激酶)来去除pVIII 或亚基C变体膜靶向肽。在偶联到不同于第一亲和标记的第二亲和标记的(PVIII)-(亲和 标记)-(蛋白酶底物序列)-(膜蛋白)体外消化后，可以通过将混合物过柱或使用磁性珠 分离消化的融合蛋白。细胞质环中的亲和标记可以用于融合蛋白纯化(在缺乏SPase位点的构建物中)。 在表达的TM2后有SPase位点的融合蛋白中，可以使用pVIII序列和TM2之间的细胞质环 中的亲和标记，以去除未加工的融合蛋白。例如，在SPase输出和释放感兴趣蛋白的应用 中，期望输出通路和SecYEG蛋白移位酶饱和后，一些未加工的全长融合蛋白可以保留在细 胞质中。在这种情况下，可以采用N末端融合伴侣(例如pVIII-CBD)中的亲和标记，以从 复合细胞裂解液中感兴趣的可溶性蛋白去除非期望的融合蛋白。pVIII-CBD-sp融合体的输出通过SDS-PAGE分析容易进行监测——因为SPase的体内切割去除19kDa pVIII-CBD N末端伴侣。相反，通过SDS-PAGE监测典型的信号肽切 割常常因天然信号肽的较小的大小(例如18-27个氨基酸)而存在问题。使用大肠杆菌 SPase来体内切割过表达的融合蛋白是新颖的并且消除对昂贵的和常常存在问题的体外蛋 白酶加工步骤的需求。蛋白的表达可以使用编码N末端蛋白运载体，如pVIII-CBD、pVIII-8His和FoC突变体L31F的DNA——其融合到编码感兴趣蛋白DNA，来通过使用本文描述的系统表达许多真核和原核蛋白。
了本发明实施方式的各个方面。图1-10描述如下膜靶向肽，其并入到细菌宿主内膜中，其中膜靶向肽和靶标膜蛋白之间的融合连 接位于细胞质中(图1)；第二蛋白的第二跨膜区段(TM2)在其C末端处融合到感兴趣的膜蛋白或感兴趣 的可溶性蛋白，其中膜靶向肽C末端和感兴趣的蛋白的N末端之间的融合连接位于周质中 (图2)。CBD或His标记示例的亲和标记可以并入第一和第二 TM区段之间(图3、5、6、7、 8、9和10)。另外的亲和标记可以在靶标膜蛋白C末端处融合到靶标膜蛋白(图8、9、10)。表达有膜靶向肽的改造的融合蛋白的实例包括pVIII-PhoAl (细胞质融合)； pVIII-TM2(添加来自SPase的TM2以将C末端延伸到周质)；pVIII-CBD(细胞质CBD)； pVIII-CBD-PhoA9(细胞质 CBD，周质 PhoA) ；pVIII_8His (细胞质 8His) ；pVIII-CBD-Oxalp ； pVIII-CBD-0xalp-8His ；pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His ；pVIII-CBD-Tev-0xalp-8His ；wt C-PhoA9 ；G23D 亚基 C-PhoA9 ；L31F 亚基 C_PhoA9 ；以及 L31F 亚基 C (IOHis) _PhoA9。这些衍 生自表达克隆 pVIII_P2(在 Samuelson 等 J. Biol. Chem. 276 :34847_34852 (2001)中称为 Procoat-Lep)。存在制备DNA融合体的多种不同方法，所述DNA融合体编码蛋白表达构建物。此处 描述的方法意图不受限制。该方法包括介质拷贝PMS119质粒，其含有IPTG可诱导的Ptac 启动子和IacIq基因(Furste等Gene 48:119—131(1986))。任何可诱导的蛋白表达载体 可以通过并入本文描述的任意N末端蛋白运载体的核苷酸_编码序列来使用。例如，该方 法可以含有T7启动子和IacI基因，以用于表达T7RNA聚合酶的许多宿主菌株之一中。这 些表达构建物编码M13基因VIII 5’非翻译区(M13噬菌体基因组的位置1250-1300)，以给 细菌宿主细胞中蛋白表达提供有效的Shine-Delgarno序列。5’ -GTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTC-3’ (SEQ ID NO: 24)有下划线的为基因VIII Shine-Delgarno序列。应该注意的是，可以使用具有大 肠杆菌Shine-Delgarno序列的任何5’非翻译区，以启动细菌宿主细胞中pVIII融合或亚 基C融合蛋白表达。本文引用的所有文献，以及2007年8月21提交的美国临时申请60/965，649和 2007年8月22提交的60/965，729通过引用而并入。
实施例下列细菌菌株用于本实施例中。质粒DNA的克隆和繁殖发生在NEB 10_β_感 受态大肠杆菌中(NEB#C3019H，Ipswich MA)。NEB 10-β菌株的基因型是fhuAmcrA f80dlacZDM15 DlacX74 endAl recAlaraD139 D(ara, leu)7697 galU galK rpsLnupG D(mrr-hsdRMS-mcrBC)。DHB4 用于碱性磷酸酶(PhoA)测定(Jander 等 J. Bacteriol. 178 3049-3058 (1996))。MB68 是具有 dsbA 基因剔除的 DHB4。JS7131 用于 YidC-互补测定(Samuelson 等 Nature 406 :637_641 (2000))。MC1061 用于蛋白表达(Casabadan 和 Cohen J. Mol. Biol. 138 179-207 (1980))
MG1655用作大肠杆菌基因克隆的基因组DNA源(Blattner等Science277 1453-74(1997))。缩写P2指大肠杆菌SPase的可溶性P2结构域。信号肽酶缩写为L印或SPase。实施例1 质粒DVIII-PhoAl的构建从质粒pVIII-P2 构建质粒 pVIII-PhoAl (图 14)。用 EcoRI 消化 pVIII_P2 以切 除 P20RF。剩余的载体片段 pVIII-EcoRI(图 15)用 Antarctic 磷酸酶(NEB，IpswichMA)处 理，以准备连接PhoA基因片段。引物344-112和344-113用于从MG1655基因组DNA扩增 PhoA报道基因。MfeI克隆位点用下划线表示引物 344-1135， -CCACCACAATTGGTCCTGTTCTGGAAAACCGGGCTG-3>(SEQ ID NO:25)引物 344-1145，-CCACCACAATTGCCGGCAGCGAAAATTCACTGCC-3，(SEQ ID NO :26)。PhoA基因的PCR扩增根据推荐的热循环条件用Phusion高保真性DNA聚合酶 (NEB#F-540S, Ipswich ΜΑ)来完成。PhoA 基因片段用 MfeI (NEB#R0589S, Ipswich ΜΑ) 进行消化并且连接入pVIII载体的EcoRI位点中。对连接克隆进行测序，以确证整个 pVIII-PhoAlORF。在 pVIII_P2 和 pVIII-PhoAl 蛋白融合中，pVIII 氨基酸 73 从 Ser 突 变成 Arg。在 PVIII-P2 融合蛋白中，连接区是 Arg73-Gly-Ile-Arg(SEQ ID N0:27)，其符 合 Furin 蛋白酶识别序列Arg-X-X-Arg (SEQ ID NO 28) (NEB#P8077S, Ipswich ΜΑ)。在 pVI I I-PhoAl 中，氨基酸连接序列是 Arg73-Gly-Ile-Gly(SEQ ID NO :27)，其就在 PhoA 的 Pro6之前。该连接体可以被改变来包括蛋白酶识别位点。例如，连接序列可以包括Furin 的Arg-X-X-Arg(SEQ ID NO 28)识别序列，以能够从感兴趣的蛋白体外去除pVIII靶向肽。 原则上，任何蛋白酶识别序列可以在C末端连接到pVIII的位置处插入细胞质连接区域中， 以有助于分离感兴趣的蛋白。融合蛋白pVIII-PhoAl的大肠杆菌表达(图1)在添加IPTG后在菌株 DHB4(AphoA)中是强烈的。通过分析对硝基苯磷酸酯(PNPP)水解使用标准的方法来测量 碱性磷酸酶活性(Michaelis等J. Bacteriol. 154 :366_375 (1983))。这些细胞中报道的活 性是可以忽略的(图12)，这表明如所期望的那样PhoA结构域在细胞质中表达。实施例2 表达载体pVIII-TM 2的构建从质粒pVIII-P2构建表达载体pVIII_TM2(图16)，如下使用Taq DNA聚合酶以 及引物342-239和342-240，从MG1655基因组DNA扩增大肠杆菌1印B基因(编码SPase) 区段。有下划线的是ApoI限制性位点342-2395 ’ -CCACCAGAATTTCGCGTCAGGCAGCGGCGCAGGCGGCT-3 ’ (SEQ ID NO :29)。342-2405 ’ -CCAGAATTCGAGGATCCTGACGGGATCTGGAACGGTTC-3 ’ (SEQ ID NO :30)。将1印B基因片段用ApoI消化并且连接到实施例1中描述的pVIII-EcoRI载体片段的相容性EcoRI位点中。通过用在Ptac启动子(NEB#sl260s，Ipswich ΜΑ)处退火的 引物对质粒克隆进行测序，来分析连接克隆的IepB基因片段的适当取向。克隆c含有期 望的0RF，其中pVIII被大肠杆菌SPase蛋白区段延伸。该区段(SPase氨基酸34-91)包 括部分SPase细胞质环和整个第二跨膜区段(TM2)加推测延伸入周质中的十个氨基酸。 该氨基酸区段被选择，是因为SPase TM2的膜拓扑结构被充分证明并且SPase TM2已知是SPase周质催化结构域的有效输出信号(von Heijne等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 3363-3366(1988))。1印B基因片段编码序列的末端通过将引物342-240设计成编码BamHI 位点和EcoRI位点来进行修饰，以产生PVIII-TM20RF的符合读框的遗传融合。遗传融合序 列设计在PUC19的多连接序列之后，其中BamHI/EcoRI位点编码氨基酸SGSSNS(SEQ ID NO 31)——一种理想的柔性氨基酸连接序列。构建表达载体PVIII-TM2的最后步骤是除去紧 随Ptac启动子之后的BamHI识别序列将克隆c用BamHI进行部分消化，用Klenow片段填 充和被连接来以再闭合载体。具有单一 BamHI位点(在融合连接处)的最后期望的表达载 体称为 pVIII_TM2(图 16)。实施例3 表汰载体DVIII-8His的构建从质粒pVIII-TM2构建表达载体pVIII-8HIS(图17)。pVIII_8HIS在细胞质环中 含有多-His序列，以能够进行蛋白纯化或免疫检测。对PVIII-TM2进行突变以在细胞质环 中编码一段八个组氨酸的序列(替换氨基酸QAAAQAAA(SEQ IDNO :32)，相当于SPase的位 置35-42)。这种表达的膜靶向肽称为pVIII-SHis (图3)，并且有效的膜装配使用pVIII单 克隆抗体通过免疫印迹方法来证实，所述单克隆抗体优选识别膜插入和SPase体内加工后 的PVIII的成熟N末端(图4)。实施例4 表汰载体dVIII-CBD的构建如下所述证明了，亲和性结构域被插入PVIII-TM2的细胞质环中而不干扰膜装配。pVIII-CBD(图5)是由表达克隆pVIII_CBD(图18)编码的膜靶向肽，其中CBD从 环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)获得并且插入在pVIII_TM2的细胞质环中。使用 Phusion DNA聚合酶(NEB，Ipswich，MA)，通过反向PCR诱变来扩增表达载体pVIII_TM2，以 分离连接到CBD基因片段的载体片段。引物342-890和342-891用于扩增pVIII_TM2载体 片段。使用引物 342-888 和 342-889，从 NEB (Ipswich ΜΑ)载体 pTYBll (位置 5798-5950)扩 增CBD 0RF。两个片段在适当取向上的平端连接导致产生CBD ORF的51个氨基酸插入在 PVIII-TM2的细胞质QAAAQAAA(SEQ ID NO :32)序列之后。实验结果显示，pVIII-CBD靶向蛋 白在添加IPTG后高度过表达并且大部分蛋白位于大肠杆菌膜部分(fraction)。pVIII_CBD 靶向蛋白与壳多糖树脂(NEB#S6651S，Ipswich ΜΑ)的结合在0. 氚核Χ-100——一种在 膜蛋白纯化期间使用的典型浓度的洗涤剂——存在的情况下被证实。弓丨物 342-8905，-GGCAGCCGCCTGCGCCGCTG-3，(SEQ ID NO 33)。引物 342-8915，-GGGGACTCACTGGATAAAGCAACG-3，(SEQ ID NO 34)。弓丨物 342-8885，-ACGACAAATCCTGGTGTATCCGCTTG-3，(SEQ ID NO 35)。弓丨物 342-8895，-ATGGCCACCTTGAAGCTGCCAC-3，(SEQ ID NO 36)。实施例5 :pVIII-CBD-PhoA9 的构建从表达载体pVIII-CBD构建表达克隆pVIII-CBD-PhoA9 (图19)，以评价膜靶向 肽——pVIII-CBD——的膜拓扑结构。pVIII-CBD-PhoA9融合蛋白被设计来含有氨基酸序列YEPFQIPSGSSNC(SEQ ID NO 37)作为SPase TM2和PhoA报道结构域Pro6之间的周质 连接体。使用Phusion DNA聚合酶(NEB，Ipswich, ΜΑ)以及实施例1中描述的正向引物 344-112和反向引物344-114，UMG1655基因组DNA扩增phoA基因片段。引物 344-1125’ -CCACCACAATTGCCCTGTTCTGGAAAACCGGGCTG-3>(SEQ ID NO :38)。有下划线的是MfeI位点。PCR扩增的phoA基因片段用MfeI进行消化并且连接到通过EcoRI消化所制备的 载体ρVIII-CBD中。在适当取向上编码PhoA基因的克隆称为pVIII_CBD_PhoA9。来自该克隆 的融合蛋白的表达在添加IPTG后是强烈的。用ImM IPTG在30°C下诱导pVIII-CBD-PhoA960 分钟后，在DHB4 (AphoA)细胞中测量碱性磷酸酶活性。在该实验中，活性被记录为2090单 位，比pVIII-PhoAl表达的水平高59倍(图12)。这显示，pVIII-CBD-PhoA9融合蛋白被整 合到具有正确C-out拓扑结构的内膜中(如图6中所显示)——因为PhoA结构域具有活 性。实施例6 :pVIII-CBD-Oxalp的构津和Oxalp膜蛋白体内功能的证明从pVIII-CBD构建表达克隆pVIII-CBD-Oxalp (图20)，以证明功能性真核膜蛋白 在大肠杆菌中的表达。Oxalp是自然存在于线粒体内膜中的整合膜蛋白。Oxalp发挥膜蛋 白插入酶的功能并且对于整合膜呼吸复合物的装配是必需的(Luirink等FEBS Lett. 13 1-5(2001)。大肠杆菌的YidC整合膜蛋白是Oxalp的同源物并且在细菌膜蛋白生物发生 中具有类似的功能(van der Laan 等 Proc. Natl. Acad. Sci. USAlOO :5801_5806 (2003))。 vanBloois 等(J. Biol. Chem. 280 12996-13003 (2005))证明了，YidC-Oxalp 嵌合体能够弥 补大肠杆菌中YidC的损失。我们创建了 pVIII-CBD和成熟Oxalp (缺乏N末端基质靶向 肽)之间的嵌合融合，以测试pVIII-CBD的膜靶向潜力。菌株JS7131的生长依赖于阿拉伯 糖诱导的YidC表达(Samuelson等Nature406 :637_641 (2000))。相反，提供葡萄糖作为碳 源则关闭YidC表达，并导致生存力丧失。因此，通过仅仅将转化体涂布在含有关闭YidC表 达的葡萄糖和诱导YidC补体蛋白表达的IPTG的LB琼脂上，来进行YidC互补研究。使用Phusion DNA聚合酶(NEB, Ipswich, ΜΑ)以及正向引物354-1110和反向 引物 354-1098，从酿酒酵母(S. cerevisiae)菌株 BY4734(ATCC#200896)扩增 oxal 基因。 反向引物354-1098含有沉默突变，以破坏oxalORF末端附近天然存在的EcoRI位点。使 用Phusion DNA聚合酶(NEB, Ipswich, ΜΑ)以及实施例2中描述的引物354-1097和引物 342-240，通过反向PCR扩增来制备pVIII-CBD载体。两个扩增的片段都用EcoRI进行消化 并且被连接起来以创建表达克隆pVIII-CBD-Oxal。该表达克隆表达Oxalp (在Asn43处开 始)为与靶向蛋白pVIII-CBD的融合体，其中融合连接突入周质中(图7)。将菌株JS7131用表达克隆pVIII-CBD-Oxalp转化并且涂布在含0. 1 %葡萄糖的 LB琼脂上。仅当ΙΟμΜ IPTG包括在LB-葡萄糖平板中时，才获得转化体。通过将来自10 μ M IPTG板的转化体划线到含O或10 μ M IPTG的板上，进行互补的确证。还有，仅在10 μ M IPTG 板上观察到细胞生长。该结果显示，JS7131生长需要pVIII-CBD-Oxalp的表达，以及当表 达为与pVIII-CBD的融合体时Oxalp发挥整合膜蛋白的功能。实施例7 :pVIII-CBD-0xalp-8His的构建和Oxalp膜蛋白体内功能的证明在表达克隆pVIII-CBD-Oxal中存在的Oxalp ORF被修饰来编码C末端八个组氨酸序列，以有助于蛋白纯化。这使用Phusion DNA聚合酶(NEB，Ipswich, ΜΑ)以及引物 358-145和358-154通过反向PCR诱变来完成。引物 358-1455’ -CACCATCACCATTGAATTCAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’(SEQ ID NO 39)。引物 358-1545’ -ATGGTGATGGTGTTTTTTGTTATTAATGAAGTTTGATTTGTGAAC-3’(SEQ ID NO :40)。序列证实的表达克隆称为pVIII-CBD-0Xalp-8His (图21)。使用实施例6中描述 的YidC-互补测定来测试表达蛋白的体内功能。得出的结论是，pVIII-CBD-0xalp-8His通 过利用图8中显示的拓扑结构在体内起作用。实施例8 :pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His的构津和Oxalp膜蛋白体内功能的证明表达克隆pVIII-CBD-0xalp-8His中的融合蛋白ORF被修饰以编码就在与Oxalp 的融合连接之前的Ek蛋白酶(NEB#P8070S，Ipswich ΜΑ)识别序列。这通过用BamHI消化 质粒表达克隆和连接由寡核苷酸互补对358-155和358-204组成的双链插入物来完成。引物 358-1555 ’ -GATCGGACTACAAAGATGACGATGACAAAG-3’(SEQ ID NO :41)。引物 355-2045 ’ -GATCCTTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCC-3’(SEQ ID NO :42)。该寡核苷酸对的正确连接产生表达克隆pVIII-CBD-Ek-0Xalp-8His(图22)。将 独特的BamHI限制性位点保持在DNA融合连接处，以能够克隆膜蛋白基因代替oxalp基因。 在融合连接处插入的“Ek”氨基酸序列是DYKDDDDKGS(SEQ IDNO :43)。使用实施例6中描述 的YidC-互补测定，测试表达蛋白的体内功能。pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His (图9)显示在体 内起作用。注意到，Ek在氨基酸序列DDDDK(SEQ ID NO 14)之后切割。还有，FLAG M2单 克隆抗体(Sigma F1804,St. Louis,MO)特异性识别氨基酸序列 DYKDDDDK (SEQ ID N0:13)。 因此，插入的“Ek”序列能够进行融合蛋白的特异性免疫检测以及能够用肠激酶蛋白酶体内 或体外消化融合蛋白。融合蛋白的体内消化需要将肠激酶蛋白酶表达到大肠杆菌周质中。实施例9 :pVIII-CBD-Tev-0xalp-8His的构建和Oxalp膜蛋白体内功能的证明存在于表达克隆pVIII-CBD-0xalp-8His的融合蛋白ORF被修饰来编码就在与Oxalp的融合连接之前的Tev蛋白酶识别序列。插入的“Tev”序列ENLYFQGS (SEQID NO 67)能够用Tev蛋白酶体内或体外消化融合蛋白。融合蛋白的体内切割需要将Tev蛋 白酶表达到大肠杆菌周质中。pVIII-CBD-0xalp-8His表达克隆通过用BamHI消化克隆 pVIII-CBD-0xalp-8His以及连接由寡核苷酸互补对358_307和358-308组成的双链插入 物来构建。弓丨物 358-3075，-GATCGGAGAACCTGTACTTCCAGG-3，(SEQ ID NO 44)。弓丨物 355-3085，-GATCCCTGGAAGTACAGGTTCTCC-3，
(SEQ ID NO :45)。该寡核苷酸对的正确连接产生表达克隆pVIII-CBD-TeV-0Xalp-8His(图23)。 将独特的BamHI限制位点保持在DNA融合连接处，以能够克隆膜蛋白基因代替oxalp基 因。使用实施例6中描述的YidC-互补测定，测试表达蛋白的体内功能。结果显示， pVIII-CBD-Tev-0xalp-8His融合蛋白通过利用图10中显示的拓扑结构在体内起作用。
实施例10 :pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His融合蛋白的表汰和体外纯化将表达克隆pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His转化到大肠杆菌菌株MC1061中。将单个转 化体于 30°C培养在加 100 μ g/mL氨苄青霉素的 Terrific Broth (Tartof 和Hobbs，Bethesda Res. Lab. Focus 9:12(1987))中，直至达到 0D_ = 0. 4。温度降至 20°C并且用 100 μ M IPTG 诱导蛋白表达4小时。将细胞收获并且冷冻。如下制备细胞膜部分将来自250mL培养物 的细胞沉淀(1. 2g)重悬浮在5mL原生质球缓冲液[33mMTris-HCl (pH 8. 0)，20%蔗糖]中。 添加溶菌酶至最终浓度为0. 01mg/mL并且添加ImM的EDTA，通过在4°C下缓慢搅拌30分钟 来产生原生质球。通过在4°C下12，OOOg离心20min分离原生质球。将原生质球用5mL原 生质球缓冲液再悬浮。以每毫升20单位添加DNaseI (NEB#M0303S，Ipswich MA)，添加2mM MgCl2以及添加蛋白酶抑制剂混合物(Sigma P8849，St. Louis, MO)，然后用French压碎器 (以8，OOOpsi进行2次)破坏原生质球。将该混合物瞬时在冰上温育，以使DNase I降低粘 度。通过以24，OOOg于4°C离心15min，除去完整的细胞和任何不溶性蛋白。将该上清液进 行超速离心，以沉淀膜部分。超速离心使用Beckman Τ 70离心机以40，OOOrpm(147, 000g) (Beckman-Cou 11er, Fu 11 erton, CA)进行。将膜沉淀重悬浮于 50mMHEPES-K0H(pH 8. 0)、50mM KCl、10%甘油、0. 05% DDM中。将膜部分等分成100 μ L单位并且在_80°C下快速冷冻。蛋白纯化如下进行添加DDM至100 μ L膜部分的等分试样。在4°C下温和混合 管形瓶1小时，以溶解整合膜蛋白。添加缓冲液A[10mM Tris-HCl(pH 8. 0) UOOmM KC1U0% 甘油、0. l%DDM、10mM咪唑]，以制作用于镍螯合色谱的加载样品。镍-NTA琼脂糖树脂用缓 冲液A预洗涤3次。添加加载样品(400 μ L)至Eppendorf管中的100 μ L预洗涤镍-NTA 树脂并且4°C下温和混合1小时。除去树脂空体积并且将树脂用200 μ L洗涤缓冲液[IOmM Tris-HCKpH 8. 0) UOOmM 1((1、10%甘油、0· 1 % DDM、40mM 咪唑]洗涤 3 次。用两个 80 μ L 体积的洗脱缓冲液[IOmM Tris-HCl (pH 7. 0)、100KC1、10%甘油、0. 1 % DDM、400mM咪唑]洗 脱组氨酸标记的蛋白。采用抗PVIII和抗FLAG单克隆抗体通过免疫印迹方法，分析洗脱部 分(el和e2)以及整个纯化过程中得到的其它样品以鉴定pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His的存 在性(图11)。图11显示，pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His融合蛋白可以使用标准方法从大肠 杆菌转化体的膜部分纯化。而且，图IlA和IlB中显示的相同洗脱曲线表明，pVIII-CBD膜 靶向肽不遭受体内或体外蛋白水解降解。得出该结论是因为FLAG抗体检测到与pVIII抗 体相同的单一蛋白种类，所述PVIII抗体特异性识别pVIII的N末端(Kneissel等J. Mol. Biol. 288 :21-28(1999))。实施例11 使用ATP合成酶亚基C变体L31F将PhoA靶向到周质测试三种F。c蛋白(wt，G23D和L31F)的膜靶向和PhoA结构域易位。制成表的 结果显示在图12中。L31F突变体F。c-PhoA9融合表达水平与wt F。c_PhoA9融合蛋白表 达水平相同。然而，F。c(L31F)-PhoA9融合报道高于52%的碱性磷酸酶活性。该结果解释 如下1)L31F突变体对于C末端融合蛋白的膜靶向和膜易位具有优良的特性和/或；2)缺乏亚基C-介导的寡聚作用使C末端融合蛋白更容易装配成有功能的形式。整合膜蛋白也 可以融合到寡聚作用-缺陷的F。C突变体的C末端并且以功能形式被靶向入细菌膜(参见 假定的实施例12)。而且，亲和性和/或检测表位可以并入F。c突变体膜靶向肽的细胞质 环中。例如，将10个组氨酸的标记并入F。c(L31F)-PhoA9(图24)的细胞质环中，以产生 F。c(L3IF-IOHis)-PhoA9(图 25)。将 F。c (L31F_10His) _PhoA9 模型蛋白的 10 个组氨酸的标 记放置在F。c氨基酸序列的R41和Q42之间。发现F。c (L3IF-IOHis)-PhoA9融合体的PhoA 活性是F。c(L31F)-PhoA9(非His标记的蛋白)的PhoA活性的80%。这显示，亲和标记并 入并不严重影响膜装配。结论是本领域中已知的其它亲和标记或检测结构域可以插入亚基 C的细胞质环中，而不影响融合蛋白的膜装配。棚列12身表汰艦輕· Rc ■革F,·白麵示膜蛋白表达克隆可以构建成与突变体F。c基因的基因融合体，突变体F。c基因已知 表达缺乏寡聚作用的F。c突变体蛋白。可以根据实施例2至9来构建克隆。编码突变体F。c 的基因可以置换编码PVIII-TM2的基因。因此，在融合蛋白表达时，融合连接会存在于周质 中。图13显示F。c(L31F)融合到Oxalp这样一个实施例。优选地，蛋白酶切割位点如实施 例8、9和10中所述在融合连接处编码。另外，并入一个或更多个亲和性结构域，以在从F0C 突变体靶向蛋白切割后能够进行膜靶向肽的最终纯化。这些融合体的蛋白酶切割可以发生 在体 内或体外。实施例13 :pVIII-CBD-Ek-PhoA18 和 pVIII-CBD-sp-Ek-PhoA 载体的构津pVIII-CBD-Ek-PhoA18 表达构建物源自 pVIII-CBD_PhoA9 构建物(图 19)，以便能 够通过肠激酶进行体内或体外融合蛋白切割。缩写“Ek”表示包含FLAG表位(DYKDDDDK) (SEQ ID NO 13)和相应的肠激酶(Ek)蛋白酶切割位点(DDDDK) (SEQ ID NO 14)。每一种构 建物中的PhoA基因插入物可以用感兴趣的基因置换，所述感兴趣的基因编码预定输出到 周质的膜蛋白或可溶性蛋白。编码Ek/FLAG氨基酸序列的DNA插入质粒pVIII-CBD-PhoA9 独特的BamHI位点中。互补的寡核苷酸358-155和358-204以1微摩尔浓度在NEB T4连 接酶缓冲液(NEB，Ipswich, ΜΑ)中退火。358-155Ek正向寡核苷酸5，P-GATCGGACTACAAAGATGACGATGACAAAG-3，(SEQ ID NO 46)358-204Ek反向寡核苷酸5，P-GATCCTTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCC-3，(SEQ ID NO 47)其中P =磷酸化的核苷酸。将该短寡核苷酸双链体连接到通过BamHI消化和Antarctic磷酸酶处理 (NEB#M0289S)所制备的质粒 pVIII-CBD_PhoA9。克隆 pVIII-CBD-Ek_PhoA18 含有期望的 DNA插入，所述期望的DNA插入导致表达的融合蛋白连接区域发生下列改变pVIII-CBD-PhoA9 连接体Y(18CI)EPFQIPSGS (SEQ ID NO :48)，其中“GS”编码区是感 兴趣基因的克隆位点(BamHI)。pVIII-CBD-Ek-PhoA18连接体:Y_、EPFQIPSGSDYKDDDDKGS(SEQ IDNO :49)，其中最 终的“GS”编码区是感兴趣基因的克隆位点(BamHI)。有下划线的是FLAG表位和肠激酶识 别位点。从pVIII-CBD-Ek载体构建pVIII-CBD-sp-Ek表达载体，以能够通过大肠杆菌SPase进行体内融合蛋白切割(图26C)。因此，名称“sp”表示在融合构建物的TM2末 端处包含SPase切割位点以引起组成型体内融合蛋白切割。pVIII-CBD-sp融合蛋白可 以被设计来在SPase识别序列之后的+1处具有除脯氨酸(praline)外的任何氨基酸。 pVIII-CBD-sp-Ek载体被改造来在TM2末端在相对于SPase切割位点的位置_6至-1处编 码氨基酸 SPSAQA(SEQ ID NO :50)。SPSAQA(SEQ ID NO :50)序列是共有 SPase 识别位点 (Meindl-Beinker等EMBO Rep. 7(11) 1111-6 (2006))和 Nilsson等J Cell Biol. 126(5) 1127-32(1994))；然而，可以有效地加工其它序列。因此，L(173)IVRSFIYE(181) (SEQ ID NO 51) 的pVIII-CBD-Ek-TM2编码序列被改变来产生氨基酸序列L(173)IVSPSAQA~YE(183)(SEQ ID NO 52)和创建pVIII-CBD-sp-Ek融合载体，其中~表示SPase切割位点。使用反向PCR引物 366-361和366-362通过反向PCR诱变来将编码序列突变，以用Phusion DNA聚合酶(NEB) 扩增载体。366-361TM2 正向引物5，P-GCACAGGCGGCATATGAACCGTTCCAGATCCCGTC-3，(SEQ ID NO 53)366-362TM2 反向引物5，P-AGACGGGGACACAATCAATACGATAGCCAGTAC-3，(SEQ ID NO 54)在用引物366-361和366-362扩增后，突变的载体通过连接而重新环化，以获得感 兴趣的pVIII-CBD-sp-Ek载体。(对于spEk连接区的图，参见图27)。来自pVIIICBDspEk 载体的融合蛋白表达在经大肠杆菌SPase体内加工后导致具有N末端FLAG标记的感兴趣 的蛋白产生(实施例14，图28-29)。可以通过扩增pVIII-CBD-sp-Ek载体来创建基因融合体(缺乏Ek/FLAG序列)，以 产生独特的EagI限制性内切核酸酶克隆位点(实施例15)或下面实施例17和18中所述 的USER (NEB，Ipswich, ΜΑ)相容的单链突出端。这样的融合构建物称为pVIII-CBD-sp融 合体。EagI基因融合克隆在SPase切割后于感兴趣蛋白的+1和+2处产生AE、AD或AG氨 基酸对。当应用克隆的USER 方法(NEB，Ipswich, ΜΑ)时，产生无接缝的pVIII-CBD-sp融 合蛋白，其在感兴趣蛋白的+1和+2处具有任何期望的序列(实施例17，图33)。实施例14.利用N末端FLAG标记熔Sau3AI限制性内切核酸酶输出到细菌的周质因Sau3AI核酸内切酶的毒性，Sau3AI限制修饰系统在大肠杆菌细胞质中的常规 表达存在问题。保护性Sau3AI甲基化酶修饰5’ -GATC-3’序列的胞嘧啶残基(Seeber等 Gene 94(1) :37_43 (1990))。然而，对大肠杆菌基因组DNA的完全Sau3AI保护性甲基化在 指数生长期间无法实现。为克服这些问题，使用本文描述的方法将Sau3AI输出到大肠杆菌菌株的周质，而 不需通过Sau3AI甲基化酶修饰基因组DNA。第一次对Sau3AI表达的努力采用pVII I-CBD-sp-Ek载体，以便通过抗FLAG免 疫印迹法监测表达和输出。图27显示克隆sau4BE的连接区。克隆sau4BE表达称为 pVIII-CBDOsp-Sau3FLAG的融合蛋白。在输出和SPase切割后，预测该Sau3AI变异体 的N末端显示FLAG表位以及预测加工的蛋白为58656道尔顿。预测未输出和未加工的 pVI I I-CBD-sp-Sau3FLAG融合蛋白为77512道尔顿。使用引物370-097和368-219 (参见下 面)从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)基因组DNA扩增sauBE基因(BE = BamHI 和EcoRI克隆位点)并且连接到用BamHI和EcoRI消化的载体pVII I-CBD-sp-Ek中。注意到BamHI克隆位点(GGATCC)相应于Ek位点之后的Gly和Ser密码子(参见图27)。引物 370-097:5’ -CCAGGATCCGAAAGTTATTTGACAAAACAAGCCGTAC-3’ (SEQ IDNO 55)有下划线的是BamHI限制位点。引物 368-219:5’ -CAAGAATTCACAATAAATCTTCAACTTGCTTTTTTATGTAG-3’(SEQ IDNO 56)有下划线的是EcoRI限制位点。将sauBE 重组克隆转化到 C2523 (NEB Express)细胞(NEB，Ipswich, MA)中。将包 括sau4BE的9个单个克隆在加100 μ g/mL氨苄青霉素的LB中37°C下生长至0D600 = 0. 4， 然后用0. ImM IPTG在20°C下诱导3小时。在收获后，通过0. lmg/mL溶菌酶处理将细胞溶解 并且在超声处理缓冲液 A[IOmM Tris-HCKpH 7. 5)、50mM KC1、0. ImM EDTA、5mM β -巯基乙 醇]中超声处理。在λ DNA上测试细胞裂解物的限制性活性。然而，对于限制性活性，包括 sau4BE的所有克隆均是阴性的。通过抗FLAG免疫印迹分析来分析相同诱导的细胞sauBE4 克隆(Sau3FLAG蛋白)表达。图29显示正确质量(58656道尔顿)的蛋白在IPTG诱导后被表达。结论是，缺乏限制性活性的原因是3个半胱氨酸在输出到周质后通过天然Dsb氧 化系统在Sau3AI中形成二硫键，所述Dsb氧化系统主要由DsbA氧化还原酶来调节。对于 细菌细胞质酶来说，具有二硫键是不正常的，因此有理由假定天然Sau3AI活性不需要二硫 键(或多个)。实际上，确定的是，DsbA-介导的二硫键形成可以导致错误折叠的无活性的 限制性内切核酸酶。实施例15. Sau3AI限制性内切核酸酶表达到dsbA=菌株的周质菌株MB68是缺乏dsbA基因和缺乏周质DsbA氧化还原酶的大肠杆菌菌株。构建 pVIII-CBD-sp-Sau3AI克隆，其不含Ek/FLAG连接体，在MB68中表达。使用引物368-218和 368-219以及Phusion DNA聚合酶(NEB，Ipswich，MA)，从金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增 sau3AI 基因。用引物 368-220 和 365-074 以及 Phusion DNA 聚合酶(NEB，Ipswich, ΜΑ) 扩增pVIII-CBD-sp-Ek载体，以在基因融合连接处创建独特的EagI限制位点。Sau3AI 正向引物 368-218 5， -CAACAACGGCCGAAAGTTATTTGACAAAACAAGCCGTAC-3’(SEQ ID NO 57)。有下划线的是EagI位点。Sau3AI 反向引物 368-219 5， -CAAGAATTCACAATAAATCTTCAACTTGCTTTTTTATGTAG-3>(SEQ ID NO 58)。有下划线的是 EcoRI 位点。spEk 载体 EagI 弓丨物 368-220 5， -CAACAAGCGGCCGCCTGTGCAGACGGGGACACAATC-3’(SEQ ID NO 59)。有下划线的是EagI位点。spEk 载体 EcoRI 弓丨物 365-074 5’ -CGGGAATTCAGCTTGGCTGTTTTGGC-3 ’ (SEQ ID NO 60)有下划线的是EcoRI位点。在载体/插入物连接后，表达的感兴趣的蛋白(Sau3Ala)期望含有代替天然Sau3AI中发现的起始Met的丙氨酸。如实施例13中所述和图28中所示，EagI基因融合克 隆在SPase切割后在Sau3AI的+1和+2处产生丙氨酸(A)和谷氨酸(E)氨基酸。DNA测序 证实，克隆“saul”和“sau4”编码期望的EagI基因融合体。将含有saul和sau4基因的相 同的克隆转化到MB68中并且生长、诱导蛋白表达以及如实施例14中所述制备细胞裂解物。 将两微升细胞裂解物与1微克噬菌体T7基因组DNA —起在1 XNEB缓冲液4 (NEB, Ipswich, ΜΑ)存在的情况下温育60分钟(37 °C )。 图30显示，当与对照消化相比时，[MB68] sau 1和[MB68] sau4裂解物含有活 性Sau3AI限制性内切核酸酶，所述对照消化使用具有相同GATC特异性的6单位纯化的 BfuCI (NEB#R0636S,NEB, Ipswich, ΜΑ)。图31证明，dsbA-菌株突变对于在大肠杆菌周质中 产生活性Sau3AI是优选必需的，因为在相应于wt DsbA宿主细胞的泳道1_8中没有可测量 的λ DNA底物碎片化作用。实施例16. H有与天然Sau3AI相同的N末端M某酸序歹U的周质Sau3AI表汰
克隆saul (Sau3Ala蛋白)被突变来创建相应于对于SPase切割位点的+1氨基酸 的ATG密码子。该实施例的目的是产生具有与天然Sau3AI相同N末端的Sau3Met蛋白，所 述天然Sau3AI是根据Seeber等(Gene 94(1) =37-43(1990))中报道的基因序列。使用引 物 372-913 和 372-915 用 Phusion DNA 聚合酶(NEB，Ipswich, ΜΑ)在反向 PCR 反应中扩 增克隆saul以产生Ala+lMet突变SauMet 正向引物 372-913 5，P-ATGGAAAGTTATTTGACAAAACAAGCC-3，(SEQ ID NO 61)SauMet 反向引物 372-915 5，P-CGCCTGTGCAGACGGGGACACAATCAATAC-3，(SEQ ID NO 62)对克隆135D和145A进行测序证实了期望的Ala+lMet密码子突变。然后将克隆 135D和145A转化到MB68中以确证Sau3AI限制性内切核酸酶表达和活性。将MB68培养 物在加100 μ g/mL氨苄青霉素的LB中37°C下生长直至0D600 = 0. 4，然后变为20°C以用 0. ImM IPTG诱导3小时。通过0. lmg/mL溶菌酶处理，然后在超声处理缓冲液A中超声处理 来制备细胞裂解物。图32显示，通过在dsbA_菌株中表达Sau3Met(+l)蛋白获得了 Sau3AI 限制性活性。实施例17.使用与USERn克隆相容的pVIII-CBD-sp载体产生活性BfuCI限制性 内切核酸酶来自梭形芽孢杆菌(Bacillus fusiformis) 1226的BfuCI限制性内切核酸酶在大 肠杆菌中不过表达。BfuCI具有与Sau3AI相同的GATC特异性并且因与实施例14中所述的 相同原因而当表达在大肠杆菌中时被预期是有毒的。在该实施例中，BfuCI表达自用于输出 到周质的pVIII-CBD-sp USER 载体。扩增pVIII-CBD-sp-Ek载体(不含Ek连接编码区)， 以创建USER 酶产生的单链粘性末端的。pVIII-CBD-sp-Ek用PfuCx聚合酶(Stratagene， LaJo 11 a, CA)以及引物 372-072 和 372-073 进行扩增，然后与 USER 酶(NEB，Ipswich, MA) 一起温育30分钟。使用PfuCx聚合酶和引物372-074和372-075从梭形芽孢杆菌1226基 因组DNA扩增bfucl基因，然后与USER 酶一起温育30分钟。引物 372-072 :5，-AGGTACC(dU)GAATTCAGCTTGGCTGTTTTGG-3，(SEQID NO 63)引物 372-073 :5，-AGCCTGTGC(dU)GACGGGGACACAATCAATAC-3，(SEQID NO 64)
引物 372-074 :5，-AGCACAGGC(dU)GTTTTTGAAACTGAAGAGGCACTT-3，(SEQ ID NO 65)引物 372-075:5，-AGGTACC(dU)TATTTGACTTCCTTTACTATTTCTGC-3，(SEQ ID NO 66)混合载体和插入物溶液以能够经由8和10个碱基相容末端进行片段装配，然后直接转化入C2523感受态大肠杆菌细胞中。DNA测序证实，克隆BfuC5编码在SPase切割位 点之后的期望BfuCI氨基酸序列(VFETE. · ·) (SEQ ID NO 20)(图33)。克隆BfuC5被设计 来以天然蛋白的+2位置开始表达入周质中。进行该作用过程，原因是当在位置+2处编码 缬氨酸时，期望通过宿主细胞质酶甲硫氨酸氨基肽酶除去天然BfuCI的甲硫氨酸(Meirmel 等 Biochimie. 75(12) 1061-75 (1993))。图 33 显示，在菌株 MB68 中活性 BfuCI 表达自克 隆BfuC5。培养物生长、蛋白表达、裂解物制备、反应条件和结果表示与实施例16中所述的 相同。
权利要求
组合物，其包含编码N末端蛋白运载体的重组DNA，所述N末端蛋白运载体用于将融合到所述运载体的感兴趣蛋白从细胞质区室运输到原核细胞包膜；编码的蛋白运载体，其包含膜靶向肽、细胞质亲和结合结构域和跨膜区段；编码蛋白运载体的DNA，其被融合到编码感兴趣蛋白的DNA。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述编码的膜靶向肽特征是对于21个氨基酸窗 口大小至少1. 52的Goldman-Engelman-Steitz疏水性分数。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述编码的膜靶向肽具有21个氨基酸的氨基酸 窗口，以便在21个氨基酸窗口内存在缺乏Asp、Glu、Arg和Lys的至少9个氨基酸的疏水核 心序列。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述编码的膜靶向肽是YidC依赖性的。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述编码的膜靶向肽选自pVIII、Pf3外壳和亚 基C变体L31F。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述编码的细胞质亲和结合结构域是糖结合结 构域。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述编码的细胞质亲和结合结构域是壳多 糖-结合结构域。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述编码的细胞质亲和结合结构域选自His标 记禾口 str印标记。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述编码的跨膜区段具有N末端和C末端，所述 区段具有21个氨基酸序列窗口，以便在所述21个氨基酸窗口内存在缺乏Asp、GlU、Arg和 Lys的至少9个氨基酸的核心序列，并且所述21个氨基酸窗口在N末端侧翼是包含具有至 少+1总电荷的至少9个氨基酸的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述21个氨基酸窗口在C末端侧翼是氨基酸 连接序列。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述连接序列含有信号肽酶切割位点。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述连接序列含有异源蛋白酶切割位点。
13.根据权利要求9所述的组合物，其中所述编码的跨膜区段是信号肽酶的TM2。
14.融合蛋白，其包含膜靶向肽、细胞质亲和结合结构域、跨膜区段和感兴趣的蛋白。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述感兴趣的蛋白是毒蛋白。
16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其中所述毒蛋白是限制性内切核酸酶。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述限制性内切核酸酶是Sau3AI或同切点酶。
18.在革兰氏阴性菌宿主细胞中生产重组蛋白的方法，包括(a)获得具有权利要求1中所述特征的重组DNA，其融合到编码感兴趣蛋白的DNA;以及(b)转化所述宿主细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述重组蛋白通过将所述细胞质亲和结合结构 域结合到亲和性底物而从所述宿主细胞纯化。
20.根据权利要求18所述的方法，进一步包括测试所述转化的宿主细胞，以通过经由所述细胞质亲和结合结构域结合亲和性底物来检测所述感兴趣的蛋白。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述宿主细胞具有DsbA_表型。
22.根据权利要求21所述的方法，进一步包括测试所述转化的宿主细胞，以测定所述 感兴趣蛋白的酶促活性和结合活性中的至少一种。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是Sau3AI。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是BfuCI。
25.DNA，其包含:SEQ ID NO 23中的核苷酸序列631-1986。
26.方法，包括根据权利要求18在同源甲基化不存在的情况下产生限制性内切核酸酶。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述限制性内切核酸酶是Sau3AI或其同切点酶。
28.载体，其包含权利要求1所述的DNA。
29.宿主细胞，其包含权利要求28所述的载体。
全文摘要
提供通过将表达的蛋白靶向宿主细胞包膜从导入原核宿主细胞中的重组DNA产生膜蛋白或毒蛋白的方法和组合物。所述方法和组合物使用融合至感兴趣蛋白的蛋白运载体。所述融合蛋白可以含有一个或更多个蛋白酶切割位点以体内或体外从所述蛋白运载体分离所述感兴趣的蛋白。所述蛋白运载体的特征是被包含细胞质亲和结合结构域的细胞质氨基酸序列分隔的膜靶向肽和跨膜区段。
文档编号C07K14/195GK101835798SQ200880112464
公开日2010年9月15日 申请日期2008年8月14日 优先权日2007年8月21日
发明者J·C·塞缪尔森, J·罗 申请人:新英格兰生物实验室公司