专利名称：：使用编码bmp-7的重组载体的关节软骨基因疗法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及重组载体，包括此种重组载体的药物组合物，以及确保在脊椎动物中的软骨修复和/或减缓骨关节炎发展和/或逆转骨关节炎发展的方法。本发明还涉及能够在宿主中表达属于成骨蛋白质-1/骨形态发生蛋白质-7(ΟΡ-1/ΒΜΡ-7)蛋白质家族的生物学活性多肽的载体。本发明还涉及用此种载体的关节内基因疗法。
背景技术：
：骨关节炎(OA)是脊椎动物关节的慢性退行性疾病。疼痛是OA的主要表现症状。具有OA的包括人、哺乳动物，特别是运动马(athlectichorse)、犬和猫在内的脊椎动物具有一般伴随承重和活动而恶化并且伴随休息而改善的疼痛，以及在不活动时段后所涉及关节的晨僵和胶凝(gelling)。疾病的此种体征与症状通常以生活质量的下降而达到顶峰。这种疾病在部分身体关节中更频繁，特别是髋、膝、肩、肘、腕间和跗骨间(intertarsus)关节。可动关节是脊椎动物的运动器官。由于覆盖长骨接合表面的关节软骨的独特生物学、化学和机械性质，它们达到几乎无摩擦运动。关节在滑膜腔或关节间隙内发生，其内膜表面由滑膜衬里，并且在其内通常存在小容量的润滑滑液。特定关节例如膝具有另外的非关节软骨结构，称为半月板。滑膜衬有纤维囊，在其外存在支持关节结构的关节外肌群和韧带。在人类中目前的OA影响是巨大的，并且在许多方面比得上缺血性心脏病的影响。随着婴儿潮时期的人达到成年晚期并且肥胖流行盛行，OA将呈现对社会甚至更大的影响。在较年轻的群体中，参加接触性运动或活动例如过度赛跑的运动员也处于关于发展OA的高危险中。在兽医学中，OA在马和犬中是非常常见的，但也在猫中识别出，尽管处于较低程度。在马匹产业中，由于关节损伤和疾病的跛行是在赛马中运动功能减少和损耗的最普遍原因。总之，关节损伤和关节疾病代表马临床医生的绝大多数病例量。马OA可以来自各种原因，其中创伤和伴发性滑膜炎是马机能缺乏的最常见原因。通常OA起始于使运动马倾向于对软骨的不适当生物机械力的过度使用或构造机能不全。在犬中，OA是最常见的慢性肌肉骨骼疾病和跛行原因之一。它通常继发于先天性或获得性肌肉骨骼病症。数种关节病可以影响幼犬并且导致继发性OA，包括关节发育不良、剥落性骨软骨病、肘突离裂(ununitedanconealprocess)和膝盖骨脱臼。除发育异常外，存在与软骨退化相关的许多获得性肌肉骨骼病症。在某些情况下，创伤可能直接诱导分离的软骨损害，这可以是扩展的和进行性的退行性损害的开始。在韧带损害后，软骨损伤可能由于关节不稳定性在数周后出现。由于不完全骨折复位，关节内骨折通常并发于继发性软骨降解。关节脱位或脱位复位通常并发于韧带和囊伤害和/或软骨损害。越来越多地认为肥胖是对于犬OA的重要危险因素，如它在人类医学中一样。OA的特征在于生物化学和酶促变化、软骨断裂和损失、骨赘形成和骨质硬化。尽管并未完全了解OA的原因，但影响关节软骨和软骨下骨的生物化学应激、关节软骨和滑膜中的生物化学变化、以及遗传因素在OA发病机制中都是重要的。最通常地，炎症性过程在滑膜、软骨、关节囊或软骨下骨中开始，并且迅速起始来自最初创伤组织的炎症介质的级联。这通常引起炎症性过程进入次级组织内的“多米诺效应”，所述次生组织转而释放炎症介质。与物种无关，与OA相关的分子和细胞炎症事件涉及花生四烯酸代谢产物在细胞膜中的释放。这转而借助于前列腺素起始疼痛。透明质酸在关节液中的降解起因于炎症途径的化学引诱物和副产物、溶酶体酶、和由受损滑膜细胞加工的非溶酶体酶、以及来自嗜中性粒细胞和巨噬细胞的氧衍生自由基。关节软骨的降解视为OA的绝对必要条件。肉眼可见的发现包括关节软骨中的纤颤、侵蚀和磨损线。组织学特征包括浅表纤颤，这可以进展以形成下至软骨下骨的垂直裂缝。通常关节软骨的蛋白聚糖含量随同胶原的破坏一起减少。这导致软骨中水摄取的增加，导致生物力学“更柔软的”软骨表面。这些发现还可以伴随软骨细胞坏死和关节软骨的最终全层丧失。病理变化也可以在关联结构中发生。软骨下骨骨硬化通常伴随软骨退化，并且透明和钙化关节软骨之间的分界线变得被血管所穿透。这些变化的慢性进展导致在关节边缘处关节周唇形变的形成，由于软骨和软骨下骨沿着关节边界的进行性过度生长。关节囊的滑液衬里和纤维层在OA中改变。滑膜变得充血、褪色和增厚。在组织学上，滑膜细胞显得肥大，并且淋巴质浆细胞和巨噬细胞可能存在于滑液组织的内膜下间质中。众多医学治疗已广泛用于治疗OA。迄今为止，大多数治疗已针对降低并且随后维持在伤害关节内炎症程度的降低。相对较少的注意力集中于如下治疗剂，其实际上保护关节组织，并且由InternationalLeagueAgainstRheumatism(ILAR)指导方针而分类为“疾病缓解”OA药物(DMOAD)。理论上，用这类药物的治疗应阻止、延缓或逆转OA的形态学软骨损害。非类固醇抗炎药(NSAID)和皮质类固醇已是抗炎疗法的主要方式。尽管非类固醇抗炎药通常提供症状缓解，但该药物对关节软骨提供很少的保护和再生，也不改变潜在的疾病过程。许多NSAID也与不希望有的副作用的显著发生相关，使得其长期使用成为问题。皮质类固醇也常用于治疗OA，并且是减少疼痛和炎症的有力介导物。然而，报告了对关节软骨的不利作用，包括受损的软骨细胞活性，减少的葡糖氨基聚糖和蛋白聚糖含量和减少的软骨弹性。在兽医实践中，上述疗法有时相组合用于对关节损伤的累加如果非协同的应答。通常NSAID或类固醇与透明质酸治疗相组合，以改善关节液的粘弹性和关节内软组织的边界润滑。患者也经常给予肠胃外以及经口多硫酸化葡糖氨基聚糖(PSGAG)，以支持或促进软骨细胞代谢活性且抑制细胞因子或前列腺素对软骨的有害作用。尽管没有良好控制的临床研究评估这种“猎枪(shotgun)”方法，但每种药物具有有利作用，并且迄今为止未报告来自使用这些疗法的许多不同模式的不良反应。OA中的治疗干预通过无法使治疗剂直接靶向进入关节内而部分地被进一步阻碍。一般的经口、静脉内和肌内途径相对无效，因为小分子通过被动扩散进入关节间隙，并且大分子(例如蛋白质)被排除关节间隙外。尽管关节内施用绕过这些限制，但直接施用到关节间隙内的大多数试剂的半衰期仍很短，并且需要频繁的关节内注射，以维持对于慢性疾病的延长治疗的生物学活性。总之，迄今为止，没有治疗剂有效且无副作用地消除OA的进展。因此存在对用于人类和兽医应用的真正创新DMOAD策略的迫切医学需要。近来，已证实先前已知促进骨形成和治愈的成骨蛋白质I(OP-I)，别名骨形态生成蛋白7CBMP-7)，在关节软骨再生和修复中起显著作用，潜在地充当DM0AD。各种研究已显示，当暴露于BMP-7时，间充质细胞具有潜能以分化成在表型上表现为软骨细胞的细胞。这些细胞在体外和体内产生具有对关节软骨特异的II型胶原和蛋白聚糖的基质。这个发现已在各种动物模型包括犬大型全层骨软骨缺陷模型中得到证实。已观察到所获得的修复组织具有透明样外观，并且在长期动物研究中得到维持。然而，BMP-7用于OA疗法的使用并非没有局限性和潜在的并发症。当仅注射到关节内时，由于通过滑液血管化从关节间隙中快速消除，在溶液中重组纯化的BMP-7蛋白质不提供预期治疗益处。蛋白质在关节内的短半衰期要求重组BMP-7蛋白质包括在合适的生物学载体材料内，以确保缓慢释放和持续的局部浓度。生物学载体进一步确保用于细胞和血管移植的移植稳定性和物理网络，导致软骨形成。包括在生物学载体中的高浓度重组蛋白质(例如在绵羊创伤后实验OA模型中通过关节内注射每一周施用2次的340μgOP-I输注(HurtigMB等人，ProceedingsCombinedOrthopaedicResearchSociety,070，2004年10月)，在牛衍生的I型胶原装置中的350μgBMP-7修复在犬科手术诱导的全层骨软骨缺陷的关节软骨缺陷(CookS.D.等人，J.BoneJointSurgery,2003，85(3)116-123))。就实践而言，使大量纯化蛋白质与合适生物学材料复合的成本和复杂性使得该操作在兽医学中并非经济上可行的。此外，从安全观点来看，大量强力骨诱导性蛋白质的使用增加异位骨形成的可能性，特别是当植入位点并非良好包含时。基因转移是避开纯化重组蛋白质所面临的局限性的有吸引力的策略。因为基因可以在关节内局部递送并表达，所以最高浓度的治疗蛋白质可以在关节内原位产生，从而使不利副作用的可能性减少至最低限度，因为非靶器官将接受较少的暴露。滑膜是用于基因表达的有吸引力的靶组织，因为它的大表面及其与关节间隙的直接接触。尽管关节软骨是在关节内的另一个可用靶组织，但缺乏渗透通过细胞外基质的载体被视为重要的技术局限性。可以考虑将基因转移给关节的2种方法离体和体内基因转移。离体基因转移指收获细胞、其体外遗传修饰及其后续移植回关节内。事实上，在马软骨缺陷模型中用表达BMP-7的Ad5离体转导的软骨细胞移植后已证实加速的软骨修复。因为这种技术允许在身体外的遗传操作，所以它与增加的安全特性相关。然而，该方法面临多种实践问题，因为它对于收获、处理且再植入细胞是费时且耗资源的。此外，重组蛋白质表达在软骨细胞移植物中的寿命仍是限制因素，并且需要极高初始剂量或反复治疗。此种策略的临床可应用性是复杂且麻烦的，显著限制在兽医学中的商业化潜力。相比之下，体内基因转移指直接靶向关节其自身内的滑膜细胞或软骨细胞，这可使用合适载体在临床水平上达到。然而，这种后述策略也受显著局限性限制，其确切性质依赖于考虑的具体载体系统。腺病毒作为基因疗法载体具有许多优点，包括易于产生高滴度的重组病毒，对通过此种病毒的有效转导敏感的广泛范围的细胞类型，包括不分裂细胞。所谓的第一代重组人腺病毒血清型5(Ad5)是基于病毒基因组的El和潜在地E3区的缺失。这些修饰提供用于转基因插入的基因座，还导致在靶物种中病毒复制所依赖的晚期基因激活的阻止。此种优点已导致Ad5载体在临床前和临床研究中的广泛应用。然而，在1999年暴露于极大Ad5剂量的人类患者的死亡已使腺病毒载体的安全记录出现污点。迄今，全身施用的Ad5载体的安全被许多人视为存在问题。然而，这种载体用于关节中的临床使用的实用性面临显著局限性或不确定。抗Ad5免疫应答的触发剂可能干扰转基因递送和长期表达，还可能引起病理状态，通常为炎症。事实上在小鼠、大鼠、兔或马中关节内递送的重组Ad5已注意到有免疫和炎症干扰。尽管可能涉及批次间变异和纯度，但关节内注射的病毒颗粒的量看起来是驱动关于关节内基因疗法的Ad5相关炎症的关键方面。因为Ad5载体触发转基因在关节内表达的功效可以与所注射的剂量成比例，所以选择关于关节基因疗法的功效和安全之间的合适平衡仍是技术挑战。与重组蛋白质在关节内的长期表达相容的Ad5剂量的限定根据现有参考文献并不明确。事实上，当将表达IGFl的Ad5注射到马的球关节内时，仅对于接受极高剂量(50xl01(l病毒颗粒(VP))的那些马可检测出IGFl在滑液中的显著表达(GoodrichLR等人，GeneTherapy，2006，13:1253-1262)。对于较低剂量未注意到显著表达。这种高Ad5剂量与滑液中白血细胞(WBC)的增加相关，证实显著的局部炎症。在这些条件下，IGFl的表达在注射后第4天时达到峰值，并且其后下降。在使用Ad5作为递送载体的其他研究中已观察到转基因表达经过2-4周时间段的暂时下降。尽管暂时升高在前4周和可能更长时间内可以正向影响软骨治愈，但对表达蛋白质数月而不是数周的载体的需要在参考文献中被许多作者视为优选的。事实上，寻求延长基因表达的大多数研究者目前将其努力再次确定为备选现有载体系统，例如腺伴随病毒(AAV)或慢病毒。重组BMP-7蛋白质用于软骨修复的体内使用的先前报告指出需要极高量的重组蛋白质(例如在绵羊创伤后实验OA模型中通过关节内注射每一周施用2次的340μgOP-I输注(HurtigMB等人，ProceedingsCombinedOrthopaedicResearchSociety,070,2004年10月)，在牛衍生的I型胶原装置中的350μgBMP-7修复在犬科手术诱导的全层骨软骨缺陷的关节软骨缺陷(CookS.D.等人，J.BoneJointSurgery，2003，85(3)116-123))。这些量显著高于在使用上述Ad5IGFl的研究中报告的峰量(73ng/ml)(GoodrichLR等人，GeneTherapy，2006,13:I253-I262)。因此，使用Ad5载体用于关节基因疗法的先前经验不支持Ad5BMP_7载体在体内达到治疗浓度的使用。进一步相关的是，在免疫活性大鼠中高剂量Ad5BMP7用于体内骨形成的先前使用是不成功的，而确切相同的重组病毒在免疫功能低下大鼠中能够触发显著的骨形成(LiJZ等人，GeneTherapy，2003，10:1735-1743)。这个例子进一步举例说明Ad5BMP7在体内的功效预测的复杂性。待解决的技术问题是确保关节软骨修复，并且从而减缓且潜在逆转在哺乳动物中的骨关节炎疾病进展。关节软骨覆盖关节中骨部分的接合表面。软骨允许关节中的移动而无直接的骨与骨接触，从而防止相对骨表面的磨损和伤害。关节软骨不具有骨化趋势。软骨表面肉眼看起来是平滑和珍珠似的，并且在高倍放大率下是精细颗粒状的。此种软骨称为透明软骨，与纤维软骨和弹性软骨相对比。关节软骨看起来部分从邻近滑膜的脉管中，部分从它覆盖的骨的脉管中获得其营养物。关节软骨与II型和IX型胶原以及各种充分表征的蛋白聚糖的存在相关，并且与X型胶原的不存在相关，所述X型胶原与软骨内骨的形成相关。关于关节软骨微观结构的详细描述，参见例如，Aydelotte和Kuettner，Conn.Tiss.Res.18205(1988)；Zanetti等人，J.CellBioLlOl53(1985)；和Poole等人，J.Anat.138:13(1984)。在成年哺乳动物中其他类型的永久性软骨包括纤维软骨和弹性软骨。在纤维软骨中，粘多糖网络与占优势的胶原束交织，并且软骨细胞比在透明软骨中更广泛分散。在这样的关节中发现关节间纤维软骨，所述关节最多暴露于剧烈震动且遭受频繁移动，例如膝的半月板。此种关节的例子包括颞-下颂、胸-锁骨、肩-锁骨关节。弹性软骨包含在组织学上类似于弹性蛋白纤维的胶原纤维。此种软骨在人体中在外耳的耳廓、耳咽管、小角软骨和会厌中发现。骨形态生成蛋白-7CBMP-7，或成骨蛋白质_1，ΟΡ_1)是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员。ΒΜΡ-7与激活素受体I和II型结合，但不与TGF-β受体I、II和III型结合。单体ΒΜΡ-7具有17至19kDa的分子量，并且通过其诱导易位骨形成的能力而被鉴定。BMP-7多肽作为同二聚体分泌，具有约35-36kDa的表观分子量。然而，因为BMP-7在体内具有短半衰期(约30分钟)，所以在纯化蛋白质注射后，维持在循环中持续水平的外源蛋白质需要多次短间隔施用，造成非常显著的实践挑战。此种多注射疗法的成本太高而无法在兽医学中应用。尽管基因递送已成功地作为用于各种疾病治疗的蛋白质疗法的备选方案提出，但它通过BMP-7多肽在体内表达用于骨关节炎预防和/或治疗的可应用性先前未得到提议，并且它的潜在有效性仍不确定。事实上，BMP-7同二聚体的低分子量(即约35kDa)在理论上将允许快速肾小球过滤。在体内表达的BMP-7水平是否可以达到治疗上有效的血浆浓度根据现有参考文献无法预测或测定。为了使体内表达的BMP蛋白质的评估进一步复杂化，依赖于所治疗动物的免疫状态，结果可以是可变的，在免疫活性和非活性动物之间具有显著差异。因此，当就整体而言综合考虑时，参考文献未教导体内表达的BMP-7水平是否可以达到治疗上有用的血浆浓度。任何文件在本申请中的引用或鉴定不构成此种文件可用作本发明的现有技术的承认。发明_既述本发明涉及预防和治疗患有骨关节炎(OA)或处于骨关节炎(OA)危险中的哺乳动物受试者的方法，以及用于在此种方法中使用的重组载体和药物组合物。本发明的方法、载体和组合物可以用于减少、预防、抑制、延迟或减轻表征骨关节炎的关节功能的进行性丧失。本发明的方法、重组载体和组合物对于其有用的受试者包括但不限于，已受OA折磨的受试者，以及合理预期患有与OA相关的关节功能进行性丧失的任何受试者。特定受试者是否处于OA危险中和/或受试者是否可能从本发明的方法和/或组合物中获益，是可以通过相关医学或兽医领域普通技术人员照常规进行确定。处于OA危险中的受试者显著地是运动哺乳动物，如参加接触性运动或活动例如过度赛跑的运动员、赛马、赛犬、军犬和/或警犬、肥胖哺乳动物(即人和宠物，例如犬和猫)、具有先天性或获得性肌肉骨骼病症的哺乳动物、老年哺乳动物......。在一个实施方案中，本发明涉及如下载体，其可以包含且在宿主中表达前原(pre-pro)BMP_7基因、前BMP-7基因或成熟BMP-7基因。编码前原BMP-7多肽、前BMP-7多肽或成熟BMP-7多肽的BMP-7基因可以源于哺乳动物。在一个优选实施方案中，表达载体可以包括编码犬前原BMP-7、犬前BMP-7或犬成熟BMP-7多肽的多核苷酸。在另一个优选实施方案中，表达载体可以包括编码猫前原BMP-7、猫前BMP-7或猫成熟BMP-7多肽的多核苷酸。在另一个优选实施方案中，表达载体可以包括编码马前原BMP-7、马前BMP-7或马成熟BMP-7多肽的多核苷酸。在另一个优选实施方案中，表达载体可以包括编码人前原BMP-7、人前BMP-7或人成熟BMP-7多肽的多核苷酸。编码BMP-7多肽的多核苷酸可以与启动子和任选地与增强子可操作地连接。在一个有利的实施方案中，本发明涉及包含且表达犬前BMP-7多肽的载体，其中所述犬前BMP-7多肽缺失在N末端处的“前”肽，并且其中来自不同起源的肽信号序列与犬前BMP-7多肽融合。在另一个有利的实施方案中，本发明涉及包含且表达猫前BMP-7多肽的载体，其中所述猫前BMP-7多肽缺失在N末端处的“前”肽，并且其中来自不同起源的肽信号序列与猫前BMP-7多肽融合。在另一个有利的实施方案中，本发明涉及包含且表达马前BMP-7多肽的载体，其中所述马前BMP-7多肽缺失在N末端处的“前”肽，并且其中来自不同起源的肽信号序列与马前BMP-7多肽融合。在另一个有利的实施方案中，本发明涉及包含且表达人前BMP-7多肽的载体，其中所述人前BMP-7多肽缺失在N末端处的“前”肽，并且其中来自不同起源的肽信号序列与人前BMP-7多肽融合。有利地，肽信号序列可以是胰岛素样生长因子I(IGF-I)或组织型纤溶酶原激活物(tPA)肽信号序列。在另一个实施方案中，表达载体可以包括编码犬成熟BMP-7多肽的多核苷酸，其中所述多肽与来自BMP-7、IGF-I或tPA的肽信号序列融合。在另一个实施方案中，表达载体可以包括编码猫成熟BMP-7多肽的多核苷酸，其中所述多肽与来自BMP-7、IGF-I或tPA的肽信号序列融合。在另一个实施方案中，表达载体可以包括编码马成熟BMP-7多肽的多核苷酸，其中所述多肽与来自BMP-7、IGF-I或tPA的肽信号序列融合。在另一个实施方案中，表达载体可以包括编码人成熟BMP-7多肽的多核苷酸，其中所述多肽与来自BMP-7、IGF-I或tPA的肽信号序列融合。在另一个实施方案中，本发明涉及包括表达前原BMP-7多肽、前BMP-7多肽或成熟BMP-7多肽的载体(vector)和药学上或兽医学上可接受的转运体(carrier)、赋形剂或媒介物(vehicle)的药物组合物。在一个具体实施方案中，药物组合物可以包括改善载体转染或转导到宿主细胞内的功效的物质。在另外一个实施方案中，本发明涉及用于将BMP-7多肽递送给哺乳动物的方法，所述方法可以包括将载体关节内注射到滑液内，所述载体能够在体内表达前原BMP-7多肽、前BMP-7多肽或成熟BMP-7多肽。在一个有利的实施方案中，哺乳动物宿主可以是人、犬科、马科或猫科，显著地是男人、女人、儿童、犬、母犬、幼犬、马、母马、马驹或猫、小猫。本发明涉及此种载体就OA预防和/或治疗哺乳动物的用途。应当指出在本公开内容中且特别地在权利要求和/或段落中，术语例如“包含”、“含有”等可以具有在美国专利法中归于其的含义；例如，它们可以意指“包括”等；并且术语例如“基本上由......组成”具有在美国专利法中归于其的含义，例如，它们允许未明确叙述的元件，但排除在现有技术中发现或影响本发明的基本或新型特征的元件。这些和其他实施方案在下述详述中描述，或由于下述详述而显而易见，且由下述详述包含。附图简述给出作为例子但不意欲使本发明仅限制于所述具体实施方案的下述详述结合附图可以得到最佳理解，其中图1提供了在通过撞击人为制造的骨关节炎后90天尸检时，绵羊的经处理和未经处理膝上显示的肉眼观察损害的肉眼检查数据。图2提供了实施例8中组1动物之一(Y13)的左和右膝的组织学图片。图3提供了对于组1动物的BMP-7处理关节和对侧未经处理关节以及对于组2的未经处理动物，以如通过印度墨汁保留所测量的软骨表面粗化的平方毫米表示的损伤后软骨保护。图4提供了对于组1动物的BMP-7处理关节和对侧未经处理关节以及对于组2的未经处理动物，使用OARSI评分的定量组织学观察，其中对软骨腐蚀深度指定级别和对印度墨汁染色面积指定阶段(以如通过印度墨汁保留测量的软骨表面粗化的平方毫米表不)O还包括作为本申请部分的是序列表，其中SEQIDNO1是犬前原BMP_7多肽的核苷酸序列，SEQIDNO:2是犬前原BMP-7多肽的密码子最佳化核苷酸序列，SEQIDNO3是犬前原BMP-7多肽的氨基酸序列，SEQIDNO4是来自tPA的短信号肽(23个氨基酸)的核苷酸序列，SEQIDNO5是来自tPA的短信号肽(23个氨基酸)的氨基酸序列，SEQIDNO6是来自tPA的长信号肽(28个氨基酸)的核苷酸序列，SEQIDNO7是来自tPA的长信号肽(28个氨基酸)的氨基酸序列，SEQIDNO8是马IGF-I信号肽的核苷酸序列，SEQIDNO:9是马IGF-I信号肽的氨基酸序列，SEQIDNO10是马前原BMP-7多肽的核苷酸序列，SEQIDNO:11是犬IGF-I信号肽的核苷酸序列，SEQIDNO:12是犬IGF-I信号肽的氨基酸序列，SEQIDNO:13是人前原BMP-7多肽的核苷酸序列，SEQIDNO14是人前原BMP-7多肽的密码子最佳化核苷酸序列，SEQIDNO:15是人前原BMP-7多肽的氨基酸序列，SEQIDNO:16是马前原BMP-7多肽的氨基酸序列，SEQIDNO17是猫前原BMP-7多肽的核苷酸序列，SEQIDNO18是猫前原BMP-7多肽的密码子最佳化核苷酸序列，和SEQIDNO:19是猫前原BMP-7多肽的氨基酸序列，SEQIDNO20是PB1053引物的核苷酸序列，SEQIDNO21是PB1063引物的核苷酸序列，SEQIDNO22是PB1060引物的核苷酸序列，SEQIDNO23是PB1062引物的核苷酸序列，SEQIDNO24是PB1088引物的核苷酸序列，SEQIDNO25是PB1089引物的核苷酸序列，SEQIDNO26是PB1090引物的核苷酸序列，SEQIDNO27是鼠前原BMP-7多肽的核苷酸序列，SEQIDNO28是鼠前原BMP-7多肽的氨基酸序列，SEQIDNO29是LF189引物的核苷酸序列，SEQIDNO30是LF190引物的核苷酸序列，SEQIDNO31是LF191引物的核苷酸序列，SEQIDNO:32是LF192引物的核苷酸序列，SEQIDNO33是DNA接头的核苷酸序列，SEQIDNO34是LF327引物的核苷酸序列，SEQIDNO35是LF324引物的核苷酸序列，SEQIDNO:36是LF326引物的核苷酸序列，SEQIDNO:37是LF325引物的核苷酸序列，SEQIDNO38是LF361引物的核苷酸序列，SEQIDNO39是LF334引物的核苷酸序列，SEQIDNO40是LF437引物的核苷酸序列，SEQIDNO41是LF172引物的核苷酸序列，SEQIDNO:42是LF159引物的核苷酸序列，SEQIDNO:43是LF377引物的核苷酸序列，SEQIDNO44是LF378引物的核苷酸序列，SEQIDNO45是SPH6Etrl引物的核苷酸序列，SEQIDNO46是SPH6Etr2引物的核苷酸序列，SEQIDNO:47是SPH6Etr3引物的核苷酸序列，SEQIDNO48是SPH6Etr4引物的核苷酸序列，SEQIDNO49是SPH6Etr5引物的核苷酸序列，SEQIDNO50是SPH6Etr6弓丨物的核苷酸序列，SEQIDNO51是SPH6Etr7弓丨物的核苷酸序列，SEQIDNO:52是SPH6Etr8引物的核苷酸序列，SEQIDNO53是LF394引物的核苷酸序列，SEQIDNO54是LF395引物的核苷酸序列，SEQIDNO55是LF397引物的核苷酸序列，SEQIDNO:56是LF398引物的核苷酸序列，SEQIDNO57是M13R引物的核苷酸序列，SEQIDNO58是LF409引物的核苷酸序列，SEQIDNO59是马ILlO多肽的核苷酸序列，SEQIDNO60是马ILlO多肽的氨基酸序列，SEQIDNO61是犬ILlO多肽的核苷酸序列，SEQIDNO62是犬ILlO多肽的氨基酸序列，SEQIDNO63是猫ILlO多肽的核苷酸序列，SEQIDNO64是猫ILlO多肽的氨基酸序列，SEQIDNO65是人ILlO多肽的核苷酸序列，SEQIDNO:66是人ILlO多肽的氨基酸序列，SEQIDNO67是病毒ILlO多肽的核苷酸序列，和SEQIDNO68是病毒ILlO多肽的氨基酸序列。碰本发明的方法和组合物可以用于OA的治疗性处理。当术语“治疗”或“治疗处理”涉及OA时，并且当它们在本文中以及在兽医学和人类医学领域中使用时，它们涉及治疗已患有OA或从OA恢复的哺乳动物，或旨在减缓和/或逆转诊断为具有OA或处于具有OA的危险中的哺乳动物中的形态学软骨损害的治疗。特定哺乳动物是否患有OA可以通过相关兽医或医学领域普通技术人员容易地确定。如本文所使用的，如果哺乳动物被合理预期患有与相当大量软骨丧失相关的关节功能的进行性丧失、磨损颗粒产生、软骨下骨中的滑膜增厚和囊失调以及在关节边缘处的骨赘生长，那么哺乳动物被认为患有OA。OA在哺乳动物中的主要结果包括但不限于跛行。在人类中，OA的诊断主要基于历史和体格检查，但当诊断不确定时，放射摄像发现包括不对称关节间隙狭窄(JSN)、软骨下硬化、骨赘形成、半脱位和骨关节炎改变的分布类型都是有帮助的。在X射线上的结构形态改变也视为用于评估OA进展的初步结果变量。几种指示目前用于评估OA的放射学进展，包括个体放射学特征(例如边缘骨赘)、复合指示(例如Kellgren和Lawrence评分系统)、和定量测量(例如关节间隙宽度(JSW)测量)(SalaffiF.等人，AgingClin.Exp.Res.，2003，15(5)391-404；Buckland-Wright,OsteoarthritisCartilage，1999，7(4)430-3)。管理机构认可可以授予化合物以DMOAD适应症，条件是它们显示出它们可以减缓骨关节炎疾病进展；进展可以通过关于结构改变的替代物进行校准，通过测量在X射线平片上的关节间隙狭窄(JSN)，警告是这种延迟JSN转化为关于该患者的临床利益。近来，已开发新的磁共振成像(MRI)技术，以检测比常规X射线更早的OA关节结构改变，并且目前用于测量OA患者中的软骨形态和完整性参数(AbadieE.等人，OsteoarthritisCartilage，2004，12(4)263-8)。如果不使用诊断技术的系列评估，OA可能未被诊断直至晚期。这通常是哺乳动物中的情况，如犬科、猫科或马科，对于其OA仅在晚期症状尤其是跛行出现时才得到鉴定。本发明提供了利用包括载体的药物组合物用于OA的疗法，所述载体能够在体内表达BMP-7多肽，以及用于诱导滑液BMP-7浓度中的持续增加的方法和组合物。如本文所使用的，如果施用组合物的量足以引起患有OA的哺乳动物受试者中的疾病临床体征或可测量标志物的显著改善，根据本发明的药物组合物被说成具有“治疗功效”或是“治疗上有效的”。如本文所使用的，如果施用组合物的量足以阻止受试者中的OA发展，根据本发明的药物组合物被说成具有“预防功效”或是“有效的”。术语“治疗上有效的”还可以在本文中以更一般的含义使用，以指如下组合物量，其足以引起患有OA的哺乳动物受试者中的疾病临床体征或可测量标志物的显著改善，或足以阻止受试者中的OA发展。本发明的方法和组合物(例如用于使用BMP-7或BMP-7功能等价物的基因疗法的方法和组合物)的功效的实验证明可以用各种可测量标志物来执行，例如，通过证实当患有OA时，与安慰剂治疗的人相比较，使用本发明的方法和组合物治疗的人显示关节间隙狭窄测量(JSN)减少的显著下降，或通过证实当患有OA时，与安慰剂治疗的哺乳动物受试者相比较，使用本发明的方法和组合物治疗的哺乳动物受试者显示跛行的显著下降和/或X射线上软骨厚度测量减少的显著下降。软骨厚度测量也可以通过对马的回波描记术来完成。在一个方面，本发明涉及能够在宿主内体内表达骨形态生成蛋白_7(BMP-7)多肽、或其变体或片段的载体。如本文所使用的，“BMP-7多肽”可以用于指前原、前或成熟BMP-7多肽，其中所述前和成熟BMP-7多肽可以与BMP_7、IGF-I或tPA信号肽融合。本发明的BMP-7多肽优选是犬、猫、马或人起源的。在一个实施方案中，载体可以包含且在宿主中表达前原BMP-7多肽、前BMP-7多肽或成熟BMP-7多肽核苷酸序列或基因。编码前原BMP-7多肽、前BMP-7多肽或成熟BMP-7多肽的核苷酸序列或基因可以源于哺乳动物，例如人、猫、马或犬。在一个优选实施方案中，BMP-7核苷酸序列或基因可以源于犬。在另一个优选实施方案中，BMP-7核苷酸序列或基因可以源于猫。在另一个优选实施方案中，BMP-7核苷酸序列或基因可以源于马。在另一个优选实施方案中，BMP-7核苷酸序列或基因可以源于人。BMP-7也称为成骨蛋白质-1或“OP-1”，并且是转化生长因子-β或“TGF-β”超家族的成员。它是分泌性蛋白质，由前蛋白质加工以产生羧基末端成熟蛋白质。在成熟蛋白质内，存在保守模式的7个半胱氨酸残基，限定从SEQIDNO:3、SEQIDNO15、SEQIDNO16和SEQIDNO:19的氨基酸330延伸到氨基酸430的结构域。激活型蛋白质是二硫化物键合的同二聚体。以其成熟、天然形式，天然存在的BMP-7是具有约30-36kDa表观分子量的糖基化二聚体，如通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(“SDS-PAGE”)测定的。当还原时，30-36kDa蛋白质产生具有约16kDa和18kDa表观分子量的2种糖基化多肽亚单位。非糖基化BMP-7蛋白质具有约27kDa的表观分子量。当还原时，27kDa非糖基化蛋白质产生具有约14kDa和16kDa分子量的2种非糖基化多肽链。一般地，天然存在的BMP-7蛋白质被翻译成具有N末端信号肽序列、“前”结构域和“成熟”蛋白质结构域的前体。所述信号肽长29个残基，并且在翻译后在切割位点处快速切割掉，所述切割位点可以使用VonHeijne(1986)，NucleicAcidResearch，14;4683-4691的方法进行预测。所述“前”结构域在人、犬、猫、猪和牛BMP-7中具有264个残基，并且在小鼠BMP-7中具有263个残基。切割前BMP-7的N末端部分，以产生139个残基的“成熟”C末端结构域，其包括102个残基的保守七半胱氨酸C末端结构域。如本文提及的，BMP-7多肽的“前形式”指包括一对多肽的蛋白质，所述多肽各自包括与BMP-7多肽的成熟结构域共价或非共价结合的前结构域。前形式看起来是从培养的哺乳动物细胞中分泌的主要形式。“成熟形式”的蛋白质指未与前结构域共价或非共价结合的成熟C末端结构域。如本文所使用的，术语“前原BMP-7”、“前BMP-7”、“成熟BMP-7”和“BMP-7”不仅指说明书和伴随序列表中举例说明的特定多肽和序列，还指这些蛋白质的任何和所有已知的天然存在变体，包括但不限于衍生物、突变体、同系物、直向同源物、等位基因变体、等位基因多态物、多态变体、系统发育配对物，以及这些蛋白质的任何和所有非天然存在的变体，包括但不限于衍生物、突变体、片段、融合蛋白等。如本文所使用的，术语“变体”包括所有此种天然存在和非天然存在的变体。特别地，本发明包括所有此种变体，其保留对于OA的治疗性或预防性处理有用的特征，和/或保留BMP-7活性。这些功能上等价的变体、衍生物和片段等显示保留BMP-7活性的能力。如本文所使用的，功能等价物指任何BMP-7变体、衍生物、片段等，其符合下述2个标准中的任一(a)它们与如本文所描述的BMP-7蛋白质序列具有显著水平的氨基酸序列同源性，或由与本文所描述的BMP-7蛋白质序列具有显著水平的核苷酸序列同源性的核苷酸所编码；或(b)在哺乳动物的骨关节炎实验模型中，如例如先前所述的创伤后骨关节炎模型(PTOA模型)，与安慰剂处理组相比较，它们具有提供在治疗组中的统计学不同应答的能力(参见HurtigMB等人，ProceedingsCombinedOrthopaedicResearchSociety,070，2004年10月；BolamC.J.等人，AJVR，2006，67(3)433-447)。在一般的PTOA模型中，在第0天(DO)时使用3cm最低限度侵入关节切开术，使动物2个(左和右)内侧股骨踝(medialfemoralcondyles)实验上暴露于标准化30MPa撞击伤。在第7天(D7)时，一半动物接受一个剂量(IO9病毒颗粒/mL)根据本发明的ImLBMP-7腺病毒载体(Ad5-BMP-7)进入挫伤膝的后膝关节(stiflejoint)内。施用用注射器和针进入股膝关节(femoropatellarjoint)而关节内完成。在收集滑液(ImL)用于各种分析后完成注射。对侧挫伤膝不用Ad5-BMP_7进行处理。另一半动物不接受任何处理，并且保留作为阴性对照。在DO、D14、D21、D28、D60和D90时收获血清和滑液。在D90时，还收集组织用于肉眼检查和组织学。对于每个动物比较在左和右膝上的结果(即跛行进展、在D90尸检时膝的肉眼检查数据、组织学结果)，并且也与对照动物相比较。动物模型可以是例如绵羊(参见HurtigMB等人，ProceedingsCombinedOrthopaedicResearchSociety,070，2004年10月))或马(参见BolamC.J.等人，AJVR，2006，67(3)433-447)。通过可以由本发明包括的变体、衍生物等的举例说明包括但不限于BMP-7变体、衍生物等，其由与本文公开的核苷酸序列并非确切相同的核苷酸序列编码，但其中核苷酸序列中的改变不改变所编码的氨基酸序列，或导致氨基酸残基的保守置换、一个或数个氨基酸的缺失或添加、氨基酸残基被氨基酸类似物的置换，所述氨基酸类似物不显著影响所编码多肽的性质，等等。保守氨基酸置换的例子包括甘氨酸/丙氨酸置换；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸置换；天冬酰胺/谷氨酰胺置换；天冬氨酸/谷氨酸置换；丝氨酸/苏氨酸/甲硫氨酸置换；赖氨酸/精氨酸置换；和苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸置换。如上所述，导致功能BMP-7衍生物的其他类型的置换、变异、添加、缺失和衍生物也由本发明包括，并且本领域技术人员将容易了解如何制备、鉴定或选择此种变体或衍生物，以及如何测试那些变体或衍生物的BMP-7活性。本领域技术人员可以最佳化本发明的BMP-7多肽的表达，通过去除隐藏剪接位点，通过采用密码子选择，通过在起始密码子前引入Kozak共有序列，通过改变密码子选择或其组合以改善表达。在另一个实施方案中，本发明可以包括与SEQIDNO3的残基1至431具有至少97.5%、至少98%、至少98.5%或至少99%同源性或同一性的犬前原BMP-7多肽的功能等价物。在另一个实施方案中，本发明可以包括与SEQIDNO15的残基1至431具有至少98%、至少98.5%或至少99%同源性或同一性的人前原BMP-7多肽的功能等价物。在另一个实施方案中，本发明可以包括与SEQIDNO19的残基1至431具有至少98.5%或至少99%同源性或同一性的猫前原BMP-7多肽的功能等价物。在另一个实施方案中，本发明可以包括与SEQIDNO16的残基1至431具有至少97.5%、至少98%、至少98.5%或至少99%同源性或同一性的马前原BMP-7多肽的功能等价物。对于本发明的目的，序列同一性或同源性可以通过下述进行测定当这样比对时比较序列，以便使重叠和同一性达到最大，同时使序列缺口降到最低。特别地，序列同一性可以使用许多数学算法中的任何进行测定。用于比较2个序列的数学算法的非限制性例子是Karlin&Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1990,87:2264-2268的算法，如Karlin&Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993,90:5873-5877中修饰的。用于序列比较的数学算法的另一个例子是Myers&Miller，CABIOS1988，4，11-17的算法。此种算法掺入ALIGN程序(版本2.0)内，这是GCG序列比对软件包的部分。当利用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12、和缺口罚分4。用于鉴定局部序列相似性和比对区域的另一种有用算法是如Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988，85，2444-2448中描述的FASTA算法。对于根据本发明的用途有利的是WU-BLAST(WashingtonUniversityBLAST)版本2.0软件。用于数种UNIX平台的WU-BLAST版本2.0可执行程序可以从ftp://blast.wustl.edu/blast/executables下载。这种程序基于WU-BLAST版本1.4，其依次基于公众域NCBI-BLAST版本1.4(Altschul&Gish,1996,Localalignmentstatistics,Doolittleed.,MethodsinEnzymology266,460-480;Altschul等人，JournalofMolecularBiology1990,215，403-410；Gish&States，NatureGenetics,1993，3266-272；Karlin&Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,5873-5877；所有这些通过引用合并入本文)。—般而言，氨基酸序列的比较可以通过使已知结构多肽的氨基酸序列与未知结构多肽的氨基酸序列比对来完成。随后比较序列中的氨基酸，并且使同源的氨基酸组集合在一起。这种方法检测出多肽的保守区，并且说明了氨基酸插入和缺失。氨基酸序列之间的同源性可以通过使用商购可得的算法进行测定(还参见上文同源性的描述)。除本文在其他方面提及的那些外，还提及由美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)提供的程序BLAST、缺口BLAST、BLASTN、BLASTP禾口PSI-BLASTo这些程序在本领域中广泛用于这个目的，并且可以比对2个氨基酸序列的同源区。在套件中的所有搜索程序中，缺口比对例行程序其自身整合至数据库搜索。需要时可以关闭缺口。关于缺口长度1的缺省罚分(Q)对于蛋白质和BLASTP是Q=9，并且对于BLASTN是Q=10，但可以改变成任何整数。关于延伸缺口的缺省每残基罚分(R)对于蛋白质和BLASTP是R=2，并且对于BLASTN是R=10，但可以改变成任何整数。可以使用关于Q和R值的任何组合，以便比对序列，从而使重叠和同一性达到最大，同时使序列缺口降到最低。缺省氨基酸比较矩阵是BLOSUM62，但可以利用其他氨基酸比较矩阵例如PAM。在一个优选实施方案中，本发明提供了如下载体，其包括编码犬前原BMP-7多肽的多核苷酸作为插入片段，并且更优选地包含编码具有SEQIDNO:3氨基酸序列的多肽的多核苷酸。优选地这种载体包含SEQIDNO1的核苷酸1至1296。在另一个优选实施方案中，本发明提供了如下载体，其包括编码人前原BMP-7多肽的多核苷酸作为插入片段，并且更优选地包含编码具有SEQIDNO:15氨基酸序列的多肽的多核苷酸。优选地这种载体包含SEQIDNO13的核苷酸1至1296。在另一个优选实施方案中，本发明提供了如下载体，其包括编码猫前原BMP-7多肽的多核苷酸作为插入片段，并且更优选地包含编码具有SEQIDNO:19氨基酸序列的多肽的多核苷酸。优选地这种载体包含SEQIDNO17的核苷酸1至1296。在另一个优选实施方案中，本发明提供了如下载体，其包括编码马前原BMP-7多肽的多核苷酸作为插入片段，并且更优选地包含编码具有SEQIDNO:16氨基酸序列的多肽的多核苷酸。优选地这种载体包含SEQIDNO10的核苷酸1至1296。在一个实施方案中，肽信号(前肽)序列跨越位置⑴处的Met残基到位置(29)处的Ala残基，其中氨基酸残基编号是鉴定为SEQIDNO3、15、16或19的前原BMP-7多肽序列的那种。信号肽的切割可以在Ala(29)残基后发生。在前BMP-7多肽切割后，前BMP-7多肽在序列Arg-X-X-Arg(292)后进行二次切割，以产生成熟BMP-7多肽。术语“蛋白质”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，以指任何长度的氨基酸残基聚合物。在特定实施方案中，表达载体可以包括编码成熟BMP-7多肽的多核苷酸，其中所述多肽与肽信号序列融合，所述肽信号序列是、或包括或衍生自BMP-7信号肽。在其他实施方案中，信号肽序列可以是、或包括或衍生自其他信号肽。本发明进一步涉及包含且表达编码前BMP-7多肽的多核苷酸的载体，其中所述前BMP-7信号肽缺失，并且其中来自不同起源的肽信号序列与前BMP-7多肽融合。例如，在特定实施方案中，肽信号序列可以是胰岛素样生长因子I(IGF-I)或组织型纤溶酶原激活物(tPA)肽信号序列。在一个优选实施方案中，由多核苷酸编码的前BMP-7是犬前BMP-7多肽。有利地，前BMP-7由如下多核苷酸编码，其是、或包括、或衍生自SEQIDNO1的核苷酸88至1296，并且编码、或包括与SEQIDNO3的氨基酸残基30至431相对应的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，使用与SEQIDNO:2相对应的密码子最佳化犬核苷酸序列。在另一个优选实施方案中，由多核苷酸编码的前BMP-7是人前BMP-7多肽。有利地，前BMP-7由如下多核苷酸编码，其是、或包括、或衍生自SEQIDNO:13的核苷酸88至1296，并且编码、或包括与SEQIDNO:15的氨基酸残基30至431相对应的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，使用与SEQIDNO:14相对应的密码子最佳化人核苷酸序列。在另一个优选实施方案中，由多核苷酸编码的前BMP-7是猫前BMP-7多肽。有利地，前BMP-7由如下多核苷酸编码，其是、或包括、或衍生自SEQIDNO:17的核苷酸88至1296，并且编码、或包括与SEQIDNO:19的氨基酸残基30至431相对应的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，使用与SEQIDNO:18相对应的密码子最佳化猫核苷酸序列。在另一个优选实施方案中，由多核苷酸编码的前BMP-7是马前BMP-7多肽。有利地，前BMP-7由如下多核苷酸编码，其是、或包括、或衍生自SEQIDNO:10的核苷酸88至1296，并且编码、或包括与SEQIDNO16的氨基酸残基30至431相对应的氨基酸序列。在不同物种中的密码子优先性可以显著不同。为了增强异种蛋白质的表达水平，相关的是使异种蛋白质的密码子频率与宿主表达系统的那种相匹配(Kim等人，Gene，1997，199(1-2)293-301)。密码子最佳化还最佳化mRNA的稳定性及其至细胞质的输出过程。对于密码子最佳化，可以考虑除密码子频率外的其他因素，例如DNA基序和重复、二级结构、GC含量、重复密码子、限制性核酸内切酶位点、功能基序如剪接位点或终止子结构。已制备算法以促进最佳核苷酸序列的设计。GeneartGmbH(Regensburg，Germany)已开发有专利权的GeneOptimizer软件(W0-A-04/059556和WO-A-06/013103)，其在一个单次操作中实现多参数最佳化。平行考虑最重要的参数，该软件在进化方法中产生总共高达500,000个靶序列的最佳化变体，并且选择最合适的那种。已报告与原始基因序列相比较，此种最佳化基因具有表达得率中高达100倍的增加(Bradel-Tretheway等人，J.Virol.Methods，2003，111(2)145-56；Disbrow等人，Virology,2003，311(1)105-14)。在其中核苷酸序列是密码子最佳化的实施方案中，密码子最佳化可以通过GeneartGmbH(Regensburg，Germany)使用GeneOptimizer软件来完成。密码子最佳化仅改变核酸序列并且不改变所编码的氨基酸序列。在其中信号肽衍生自IGF-I信号肽的实施方案中，优选肽信号可以是、或可以包括、或可以衍生自马IGF-I肽信号，并且优选由SEQIDNO:9的氨基酸残基1至25限定，并且由SEQIDNO8的核苷酸1至75编码的那种。在备选实施方案中，IGF-I肽信号可以是、或可以包括、或可以衍生自犬IGF-I肽信号，并且优选地是、或包括、或衍生自如下犬IGF-I肽信号，其由SEQIDNO:12的氨基酸残基1至25限定，并且由SEQIDNO11的核苷酸1至75编码。在其他实施方案中，肽信号可以是、或可以包括、或可以衍生自tPA肽信号，例如人tPA信号肽。在一个优选实施方案中，所使用的tPA信号肽是、或包括或衍生自SEQIDNO5的人tPA信号肽序列的氨基酸残基1至23，并且由SEQIDNO4的核苷酸1至69编码。在一个备选实施方案中，人tPA信号肽可以是、或可以包括、或可以衍生自SEQIDNO7的氨基酸残基1至28，并且由SEQIDNO6的核苷酸1至84编码。根据本发明的一个有利实施方案，表达载体可以包括如下多核苷酸，其编码与缺失信号肽的前原BMP-7多肽(与残基30至残基431相对应)融合的，根据SEQIDNO5、7、9或12的IGFl或tPA信号肽。根据本发明的另一个实施方案，表达载体包括如下多核苷酸，其编码与成熟BMP-7(与残基293至残基431相对应)融合的IGFl或tPA信号肽。在某些实施方案中，本发明包括如下载体，其能够表达犬前原BMP-7、犬前BMP-7、犬成熟BMP-7、人前原BMP-7、人前BMP-7、人成熟BMP-7、马前原BMP-7、马前BMP-7、马成熟BMP-7、猫前原BMP-7、猫前BMP-7、猫成熟BMP-7、或其变体或片段。对于成熟BMP-7或前BMP-7，优选编码肽的核苷酸序列紧在框内编码肽信号的核苷酸序列后，以便促进BMP-7分泌到细胞外介质内。信号序列可以是来自前原BMP-7的天然序列，或来自分泌性蛋白质的肽信号，例如来自组织型纤溶酶原激活物蛋白(tPA)特别是人tPA的信号肽(S.FrieznerDegen等人J.Biol.Chem.1996，261，6972-6985；R.Rickles等人J.Biol.Chem.1988，263，1563-1569；D.Berg.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.1991，179，1289-1296)，或来自胰岛素样生长因子1(IGFl)的信号肽，特别是马IGFl(K.Otte等人Gen.Comp.Endocrinol.1996，102(1)，11-15)、犬IGFl(P.Delafontaine等人Gene1993，130，305-306)、猫IGFl(WO-A-03/022886)、牛IGFl(S.Lien等人Mamm.Genome2000，11(10)，877-882)、猪IGFl(M.Muller等人NucleicAcidsRes.1990,18(2)，364)、鸡IGFl(Y.Kajimoto等人Mol.Endocrinol.1989，3(12)，1907-1913)、火鸡IGFl(GenBank登记号AF074980)。来自IGFl的信号肽可以是天然的或最佳化的，特别是通过去除隐藏剪接位点和/或通过采用密码子选择而最佳化的。如本文所使用的，术语“多核苷酸”用于指任何长度的核苷酸聚合形式，其包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。本发明进一步包括包含且表达编码BMP-7多肽的多核苷酸的载体，所述BMP-7多肽与启动子元件可操作地连接且任选地还与增强子连接。在一个有利的实施方案中，启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期基因的启动子，优选来自人或鼠类衍生的CMV。在其他实施方案中，增强子和/或启动子可以选自本领域已知且适合于在本发明的载体中表达BMP-7的那些启动子。许多此种启动子是本领域已知的，并且合适启动子可以由本领域技术人员容易地选择。例如，存在各种细胞和/或组织特异性启动子(例如，肌肉、内皮细胞、肝、体细胞和干细胞特异性启动子)，以及各种病毒启动子和增强子，和BMP-7启动子，例如对于每个动物物种同基因特异性的那些。例如，在一个实施方案中，如果犬BMP-7待在犬滑膜细胞中表达，那么可以使用对于犬滑膜细胞特异的增强子和/或启动子，以便使犬BMP-7的表达对于所需应用进行最佳化。可以在本发明中采用的启动子和增强子包括但不限于，劳斯肉瘤病毒LTR、HSV-I的TK基因、SV40的早期或晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子(MLP)、磷酸甘油酸酯激酶基因、金属硫蛋白基因、α-1抗胰蛋白酶基因、白蛋白基因、胶原酶基因、弹性蛋白酶I基因、β-肌动蛋白基因、β-珠蛋白基因、Y-珠蛋白基因、α-甲胎蛋白基因、和肌肉肌酸激酶基因的启动子和增强子。一般而言，采用在真核细胞中有功能的强启动子是有利的。优选的强启动子是人或鼠类起源，或任选具有另一个起源例如大鼠或豚鼠的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)。CMV-IE启动子可以包括实际启动子部分，这可以与增强子部分结合或不结合。可以参考ΕΡ-Α-260148、ΕΡ-Α-323597,美国专利号5,168,062、5,385,839和4,968,615，以及PCT申请号W087/03905。CMV-IE启动子有利地是人CMV_IE(BoshartΜ.等人，Cell.，1985，41，521-530)或鼠类CMV-IE。在更一般的术语中，启动子具有病毒或细胞起源。可以在本发明的实践中有利地采用的除CMV-IE外的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可以在本发明的实践中有利地采用的强细胞启动子是对于滑膜细胞特异的基因的启动子。这些启动子的功能亚片段，即这些启动子维持足够的启动活性的部分，包括在本发明内，例如根据PCT申请号W098/00166或美国专利号6,156,567的截短CMV-IE启动子可以用于本发明的实践中。在本发明的实践中的启动子因此包括全长启动子的衍生物和亚片段，其维持足够的启动活性并且因此充当启动子，优选是与衍生物或亚片段由其衍生的实际或全长启动子的那种基本上相似的启动活性，例如美国专利号6,156,567的截短CMV-IE启动子的活性类似于全长CMV-IE启动子的活性。因此，在本发明的实践中的CMV-IE启动子可以包括下述或基本上由下述组成或由下述组成全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分，以及衍生物和亚片段。优选地，载体包括其他表达控制元件。特别有利的是掺入一个或多个稳定序列，例如一个或多个内含子序列，优选hCMV-IE的第一个内含子(PCT申请号W089/01036)、兔β-珠蛋白基因的内含子II(vanOoyen等人，Science，1979，206，337-344)。关于用于除痘病毒外的病毒载体的多腺苷酸化信号(多聚A)，可以使用牛生长激素(bGH)基因的多聚(A)信号(参见美国专利号5,122,458)、或兔β-珠蛋白基因的多聚(A)信号或SV40病毒的多聚(A)信号。如本文所使用的，术语“载体”指包括例如在体内待递送到靶细胞内的异源多核苷酸的重组腺病毒。异源多核苷酸可以包括用于治疗用途的目的序列，并且可以任选以表达盒的形式。异源多核苷酸可以包括另外的序列，例如在相同转录单位内的另外编码序列，控制元件例如启动子，核糖体结合位点，转录终止子，多腺苷酸化位点，在相同或不同启动子控制下的另外转录单位，允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞转化的序列，以及如提供本发明的实施方案可能需要的任何此种构建体。如本文所使用的，术语“重组体”意指半合成或合成起源的多核苷酸，其在自然界中不存在，或以在自然界中未发现的排列与另一种多核苷酸连接。如本文所使用的，术语“异源的”衍生自与它与之相比较的实体其余部分在遗传上不同的实体。例如，多核苷酸可以通过基因工程技术放置到衍生自不同来源的质粒或载体内，并且因此是异源多核苷酸。从其天然编码序列中取出且与除天然序列外的编码序列可操作地连接的启动子因此是异源启动子。用于表达犬ΒΜΡ-7或猫ΒΜΡ-7或人ΒΜΡ-7或马ΒΜΡ-7的元件有利地存在于本发明载体中。以最低限度方式，这可以包括下述、可以基本上由下述组成、或可以由下述组成起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子，以及任选地用于特定载体例如除痘病毒外的病毒载体的多腺苷酸化序列。当有利地在载体中的多核苷酸编码多肽片段，例如犬ΒΜΡ-7时，ATG可以置于读码框的5'处，并且终止密码子可以置于3'处。可以存在用于控制表达的其他元件，例如增强子序列、稳定序列例如内含子和允许蛋白质分泌的信号序列。用于制备和/或施用在体内表达本发明基因的基因产物的载体或重组体的方法可以是任何所需方法，例如由下述参考文献中公开或下述参考文献中引用的文件中公开或类似的方法ChroboczekJ等人，Virol.1992，186280-285；Yarosh等人，Vaccine,1996，14(13)1257-64;Lutze-Wallace等人，Biologicals，1995，23(4)271-7；FallouxF.等人，HumanGeneTherapy，1998，91909-1917;ShriverJ.等人，Nature,2002，415331-335;GrahamF.等人，MethodsinMolecularBiology，第7卷GeneTransferandExpressionProtocolsEditedbyE.Murray,TheHumanPressInc,1991,ρ109-128；IlanY.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1997，94:2587-2592；TripathyS.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,1994，91:11557-11561;TapnellB.，Adv.DragDeliv.Rev.，1993，12:185-199；DanthinneX.等人，GeneTherapy,2000，71707-1714;BerknerK.,BioTechniques,1988，6616-629;BerknerK.等人，Nucl.AcidRes.，1983，11:6003-6020；ChavierC.等人，J.Virol.，1996，70:4805-4810。根据本发明的一个实施方案中，表达载体可以是病毒载体，特别是体内表达载体。在一个有利的实施方案中，表达载体可以是腺病毒载体。有利地，腺病毒可以是人腺病毒5型(hAd5)载体、El缺失和/或E3缺失型hAd5。有利地，腺病毒可以是犬腺病毒2型(CAV-2)载体、E3缺失型CAV-2和/或位于E4区和右ITR区之间的区域中的插入型CAV-2。在一个实施方案中，病毒载体可以是通过病毒基因组El区中的缺失使得无法复制的人腺病毒，特别是血清型5腺病毒，所述缺失特别是约核苷酸459至约核苷酸3510，通过参考在登记号M73260下在Genbank中以及在参考的出版物J.Chroboczek等人Virol.1992，186，280-285中公开的hAd5序列。缺失型腺病毒可以在表达El的HEK293(F.Graham等人J.Gen.Virol.1977，36，59-72)或PER细胞中繁殖，特别是PER.C6细胞系(F.Falloux等人HumanGeneTherapy1998,9,1909-1917)。有利地，Ad5载体可以在提供病毒缺失的El基因组区域的反式互补的任何细胞系中繁殖。人腺病毒还可以在E3区中缺失，特别是约核苷酸28592至约核苷酸30470。进一步地，El区中的缺失可以与E3区中的缺失组合完成(参见例如，J.Shriver等人Nature，2002，415,331-335,F.Graham等人MethodsinMolecularBiology第7卷GeneTransferandExpressionProtocolsEditedbyE.Murray,TheHumanPressInc，1991,pl09_128;Y.Ilan等人Proc.Natl.Acad.Sci.1997，94，2587-2592；US6,133,028；US6,692,956；S.Tripathy等人Proc.Natl.Acad.Sci.1994，91，11557-11561；B.TapnellAdv.DragDeliv.Rev.1993，12，185-199；X.Danthinne等人GeneThrapy2000，7，1707-1714;K.BerknerBioTechniques1988，6，616-629；K.Berkner等人Nucl.AcidRes.1983，11，6003-6020;C.Chavier等人J.Virol.1996，70，4805-4810)。插入位点可以是最终在El和/或E3区的部分或完全缺失后的El和/或E3基因座(区)。有利地，将待表达的多核苷酸插入在真核细胞中有用的启动子控制下，例如强启动子，优选巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV-IE启动子)，特别是在M.Boshart等人Cell1985，41，521-530中的约核苷酸-734至约核苷酸+7的增强子/启动子区，或来自PROMEGACorp的pCI载体的增强子/启动子区。CMV-IE启动子有利地是鼠或人起源。还可以使用延伸因子Ia的启动子。强启动子也在本文中就质粒载体而言讨论。在一个实施方案中，剪接序列可以位于增强子/启动子区的下游。例如，从CMV-IE基因中分离的内含子l(R.Stenberg等人J.Virol.1984，49，190)、从兔或人珠蛋白基因中分离的内含子、特别是来自珠蛋白基因的内含子2、从免疫球蛋白基因中分离的内含子、来自SV40早期基因的剪接序列或从来自PromegaCorp.的pCI载体中分离的嵌合内含子序列，包括与小鼠免疫球蛋白受体序列(在登记号CVU47120下在Genbank中的约核苷酸890至约核苷酸1022)融合的人β-珠蛋白供体序列。多聚(A)序列和终止序列可以插入待表达的多核苷酸下游，所述多核苷酸例如牛生长激素基因，特别是在登记号BOVBMP-7下在Genbank中的约核苷酸2339至约核苷酸2550，兔β-珠蛋白基因或SV40晚期基因多腺苷酸化信号。在另一个实施方案中，病毒载体可以是犬腺病毒(CAV)，特别是CAV_2(参见例如L.Fischer等人Vaccine，2002，20，3485-3497；美国专利号5,529,780；美国专利号5,688,920；PCT公开号W095/14102)。对于CAV，插入位点可以在E3区中和/或在位于E4区和右ITR区之间的区域中(参见美国专利号6,090,393；美国专利号6,156,567)。在一个实施方案中，载体可以是CAV-2，并且插入片段可以是编码犬前原BMP-7、犬前BMP-7或犬成熟BMP-7多肽的核酸序列，在启动子控制下，例如巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV-IE启动子)或已描述用于人腺病毒载体的启动子。多聚(A)序列和终止序列可以插入待表达的多核苷酸下游，所述多核苷酸例如牛生长激素基因或兔珠蛋白基因多腺苷酸化信号。除编码前原ΒΜΡ-7多肽、前ΒΜΡ-7多肽或成熟ΒΜΡ-7多肽的多核苷酸外，每种人腺病毒载体可以包括下述或可以包含下述或可以基本上由下述组成与启动子可操作地连接或在启动子控制下或依赖于启动子的，优选来自犬起源、马起源、猫起源、人起源的BMP-7多肽，变体、类似物或片段。本发明还涉及包括载体的药物组合物，所述载体在体内在合适或适当的条件下或在合适的宿主细胞中表达。药物组合物可以包括下述、可以基本上由下述组成、或可以由下述组成一种或多种载体，例如表达载体，例如体内表达载体，其包括下述、基本上由下述组成或由下述组成且表达下述在药学上或兽医学上可接受的转运体、赋形剂或媒介物中，任选与BMP-7、IGF-I或tPA信号肽融合，编码BMP-7多肽的一种或多种多核苷酸。有利地，载体可以是人腺病毒，并且可以包括下述、可以基本上由下述组成、或可以由下述组成并且表达在药学上或兽医学上可接受的转运体、赋形剂或媒介物中，任选与BMP-7、IGF-I或tPA信号肽融合，编码犬BMP-7多肽或马BMP-7多肽或猫BMP-7多肽或人BMP-7多肽的至少一种多核苷酸。因此，根据本发明的一个实施方案，组合物中的其他一种或多种载体可以包括如下多核苷酸，其编码并且在合适环境下表达除犬BMP-7多肽或马BMP-7多肽或猫BMP-7多肽或人BMP-7多肽外的一种或多种其他蛋白质、多肽或肽。包含一种或多种载体的组合物可以包括多核苷酸、可以基本上由多核苷酸组成、或可以由多核苷酸组成，所述多核苷酸编码且有利地在体内表达犬BMP-7多肽或马BMP-7多肽或猫BMP-7多肽或人BMP-7多肽或其融合蛋白。在一个有利的实施方案中，本发明可以提供治疗有效量的制剂的施用，用于在靶细胞中递送且表达BMP-7多肽。在一个实施方案中，制剂包括包含多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸表达BMP-7多肽和药学上或兽医学上可接受的转运体、媒介物或赋形剂。在一个有利的实施方案中，药学上或兽医学上可接受的转运体、媒介物或赋形剂可以促进载体的转染和/或可以改善载体的保存。例如，药学上或兽医学上可接受的转运体或媒介物或赋形剂可以是水或0.9%NaCl(例如盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可以用于本发明的方法的其他药学上或兽医学上可接受的转运体或媒介物或赋形剂包括但不限于，多聚(L-谷氨酸盐)或聚乙烯吡咯烷酮。对于Ad5载体，药学上或兽医学上可接受的转运体或媒介物或赋形剂是TrisHCllOmM>MgCl2ImM>NaCl150mM、Tween_8054mg/L、蔗糖1M，pH8.5。药学上或兽医学上可接受的转运体或媒介物或赋形剂可以是如下任何化合物或化合物的组合，其促进载体的施用、增加表达水平或增加表达持续时间。剂量和剂量体积在本文一般描述中讨论，并且还可以通过技术人员根据结合本领域知识阅读的本公开内容进行确定，无需任何过度实验。与其他复制缺陷型重组腺病毒载体一样，Ad5病毒载体受其引发强先天性和适应性免疫应答的倾向限制。事实上，由宿主发展的针对载体的体液免疫应答导致中和抗体，并且已显示阻碍反复施用的功效。聚乙二醇聚合物(PEG)与Ad5病毒表面的共价附着是通过掩蔽载体表面而避开中和抗体的策略。因为Ad5的PEG化与病毒感染力相容，并且使病毒与中和抗体掩蔽，所以PEG化改善在反复基础上施用Ad5载体的能力。在本发明的一个具体实施方案中，Ad5病毒载体可以是PEG化的，即PEG聚合物与Ad5病毒表面共价附着。此种PEG化可以通过包括下述步骤的方法来完成-(I)PEG与Ad5表面的共价附着可以使用激活型PEGtresyl单甲氧基聚乙二醇(TMPEG)来实现，所述TMPEG优先与病毒六邻体、纤维和五邻体碱基的赖氨酸残基的ε-氨基末端反应，同时使颗粒保留低于100的感染单位定量。根据DelgadoC.等人，BiotechnoLAppLBiochem.,1990,12(2)II9-28的操作制造的TMPEG可以从ShearwaterPolymers(Hultsville,AL)商购获得。TMPEG的优点与下述事实相关它可以在弱生理条件下驱动偶联，导致较大的生物学活性。-(2)在用TMPEG进行PEG化前，病毒制备物(在PBS5%蔗糖中)用包含5%蔗糖的130mM磷酸钠，pH7稀释2倍，至约IxlO12颗粒/ml的最终病毒颗粒浓度。-(3)为了维持病毒的最高感染力，使用51(摩尔摩尔)的PEG与病毒比以及使用以5%(w/v)的TMPEG来执行PEG化。在旋转式混合器上在室温下(通常23-24°C)在30分钟过程中执行PEG偶联反应。随后通过使反应温度降低至4°C来终止反应。-⑷为了增加用TMPEG的PEG化水平，起始TMPEG可以在30分钟过程中增至10%(w/V)。然而，这个操作与pH中的减少相关，这对病毒和反应都不利。因为控制pH是关键，所以反应可以在130mM磷酸盐，pH7中执行，这提供超过2小时的pH稳定性，并且因此允许使用10%TMPEG的PEG化。-(5)随后通过CsCl梯度离心或通过针对PBS-蔗糖(5%)透析，使PEG化的载体与未反应的PEG分离。在一个具体实施方案中，药物组合物可以在体内直接施用到待治疗的关节内，并且所编码的产物由在宿主关节中载体的表达。可以修改在体内关节内递送载体的方法，所述载体编码BMP-7多肽，有利地犬BMP-7多肽或马BMP-7多肽或猫BMP-7多肽或人BMP-7多肽，以将本发明的BMP-7多肽递送给人、犬科、马科或猫科，尤其是男人、女人、儿童、犬、母犬、幼犬、马、母马、马驹、猫或小猫。编码且表达本文所述BMP-7的载体的关节内体内递送可以通过人类或兽医学普通技术人员来完成。有利地，根据本发明的药物组合物和/或制剂包括有效量的一种或多种表达载体，或基本上由有效量的一种或多种表达载体组成，或由有效量的一种或多种表达载体组成，以引发如本文讨论的治疗性应答；并且有效量可以根据本公开内容包括本文合并的文件和本领域知识进行确定，无需过度实验。治疗和/或药物组合物每剂量包含表达BMP-7多肽的重组人腺病毒的约IO7至约1011、有利地约IO8至约IOw且更有利地约IO9至约IOw病毒颗粒(VP)。如果治疗和/或药物组合物基于PEG化的人腺病毒载体，尤其是基于PEG化的hAd5载体，上述剂量范围仍是可用的。在基于犬腺病毒载体尤其是CAV-2载体的治疗和/或药物组合物的情况下，剂量可以是表达犬BMP-7多肽的重组犬腺病毒的约IO5VP至约109VP、有利地约IO6至约108、更有利地约IO6至约10VP。在病毒颗粒(VP)中表达的腺病毒滴度可以通过如RoitschC.等人，JChromatography，2001，752263-280的段落2.3中描述的HPLC和色谱法进行测定。基于腺病毒载体用于哺乳动物的组合物的剂量体积，例如犬组合物的剂量体积，一般可以是约0.1至约2.0ml，优选约0.1至约1.0ml，且更优选约0.5ml至约1.0ml。本发明可以考虑给哺乳动物至少施用一次有效量的根据本发明制备的治疗组合物。哺乳动物可以是雄性、雌性、妊娠雌性。在一个有利的实施方案中，哺乳动物可以是人、犬科或马科或猫科，尤其是男人、女人、儿童、犬、母犬、幼犬、马、母马、马驹、猫、雌猫或小猫。根据本发明的治疗组合物可以通过注射器和针进行关节内施用。施用可以通过经过待治疗关节的滑液衬里并且通过将根据本发明的治疗组合物注射到滑液内来完成。本领域技术人员应当理解，以实例的方式提供本文关于本发明的组合物施用的公开内容，并且本发明并不限于所述的具体实例。根据本文的公开内容，并且根据本领域的知识，技术人员可以确定施用次数、施用途径、和对于本发明组合物的每次施用的待使用剂量，无需任何过度实验。在一个优选实施方案中，本发明涉及通过关节内注射用于治疗和/或预防OA的病毒载体的用途，以及包括病毒载体的组合物，所述病毒载体编码且能够表达犬前原BMP-7、犬前BMP-7、犬BMP-7成熟多肽、人前原BMP-7、人前BMP-7、人成熟BMP-7、马前原BMP-7、马前BMP-7、马BMP-7成熟多肽、猫前原BMP-7、猫前BMP-7、猫成熟BMP-7，或其变体、衍生物或片段。根据本发明的药物组合物包括能够在体内表达BMP-7多肽的载体，并且提供用于OA的疗法，也可以施用于哺乳动物受试者，其同时用至少一种活性非类固醇抗炎药(NSAID'S)成分进行治疗。本发明还提供了治疗患有骨关节炎的哺乳动物受试者的方法，其包括给所述哺乳动物受试者关节内施用治疗有效量的组合物，所述组合物包括至少一种药学上或兽医学上可接受的转运体、赋形剂或媒介物，包含编码与启动子可操作地连接的BMP-7多肽的核酸序列的重组腺病毒载体，其中所述哺乳动物受试者同时用至少一种活性NSAID’S成分进行治疗，并且所述BMP-7多肽在哺乳动物受试者内体内表达。在一个具体实施方案中，在包括能够在体内表达BMP-7多肽的载体的药物组合物的施用前约10天和后约10天之间，将活性NSAID’S成分提供给被治疗的哺乳动物受试者。优选地，在包括能够在体内表达BMP-7多肽的载体的药物组合物的施用前约5天和后约5天之间，提供活性NSAID’S成分。最优选地，在包括能够在体内表达BMP-7多肽的载体的药物组合物的施用前约2天和后约2天之间，提供活性NSAID’S成分。NSAID，S的施用可以在剂量单位制剂中经口、局部、肠胃外、通过吸入喷雾或经直肠完成，所述剂量单位制剂包含常规无毒的药学上可接受的转运体、佐剂和媒介物。如本文所使用的，术语肠胃外的包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术。包含活性NSAID’S成分的药物组合物可以以适合于经口使用的形式，例如作为片剂、糖锭、锭剂、水或油悬浮液、可分散粉剂或颗粒、乳状液、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。预期用于经口使用的组合物可以根据本领域已知用于制造药物组合物的任何方法进行制备，并且此种组合物可以包含选自下述的一种或多种试剂甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以便提供药学上精致和可口的制剂。片剂包含与适合于制造片剂的无毒药学上可接受的赋形剂相混合的活性NSAID’S成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶，和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未经包被的，或它们可以通过已知技术进行包被，以延长在胃肠道中的崩解和吸收并且因此提供经过较长时期的持续作用。例如，可以采用时间延迟材料，例如单硬脂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯。它们还可以通过美国专利号4,256,108;4,166,452；和4,265,874中描述的技术进行包被，以形成用于控制释放的渗透治疗片剂。用于经口使用的制剂还可以呈现为其中活性成分与惰性固体稀释剂相混合的硬明胶胶囊，所述惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或呈现为其中活性成分与水或可混溶剂或油介质相混合的软明胶胶囊，所述可混溶剂例如丙二醇、PEGs和乙醇，所述油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油。水悬浮液包含与适合于制造水悬浮液的赋形剂相混合的活性NSAID’S材料。此种赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；崩解剂或湿润剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或烯基氧化物与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七乙烯氧鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。水悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂，例如蔗糖、糖精或阿斯巴甜。油悬浮液可以通过将活性NSAID’S成分悬浮于植物油或矿物油例如液体石蜡中进行制备，所述植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油。油悬浮液可以包含增稠剂例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂例如上文所述那些以及调味剂，以提供可口的经口制备物。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸进行保存。适合于通过添加水制备水悬浮液的可分散粉剂和颗粒提供与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂相混合的活性NSAID’S成分。合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂由上文已提及的那些进行例示。还可以存在另外的赋形剂例如甜味剂、调味剂和着色剂。NSAID’S还可以是水包油乳状液的形式。油相可以是植物油例如橄榄油或花生油，或矿物油例如液体石蜡或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂、和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如去水山梨糖醇单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。乳状液还可以包含甜味剂和调味剂。糖浆剂和酏剂可以用甜味剂进行配制，所述甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。此种制剂还可以包含缓和剂、防腐剂以及甜味剂和着色剂。NSAID’S的组合物可以以无菌可注射水或油悬浮液的形式。这种悬浮液可以根据已知技术进行配制，使用上文已提及的那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂。无菌可注射制备物还可以是在无毒肠胃外可接受的悬浮剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。在可以采用的可接受媒介物和溶剂中有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。还可以使用共溶剂例如乙醇、丙二醇或聚乙二醇。此外，无菌、不挥发性油照常规用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以采用任何品牌的不挥发性油，包括合成的甘油单或二酯。此外，脂肪酸例如油酸在注射剂的制备中有用。NSAID'S化合物还可以以栓剂形式进行施用，用于药物的直肠施用。这些组合物可以通过使药物与合适的非刺激性赋形剂相混合进行制备，所述非刺激性赋形剂在常温下是固体，但在直肠温度下是液体，并且因此在直肠中将融化以释放药物。此种材料是可可脂和聚乙二醇。对于局部使用，采用包含NSAID’S化合物的乳膏剂、软膏、凝胶剂、溶液或悬浮液等。局部制剂一般可以包括药学转运体、共溶剂、乳化剂、渗透促进剂、防腐系统和软化剂。约O.Olmg至约140mg/kg体重/天、或备选地约0.5mg至约7g/患者/天级别的剂量水平在治疗上述病状中是有用的。例如，通过施用约0.01至50mg化合物/千克体重/天、或备选地约0.5mg至约3.5g/患者/天可以有效治疗炎症。可以与转运体材料相组合以产生单个剂型的活性NSAID’S成分量将依赖于待治疗的宿主和具体施用方式而改变。例如，预期用于人的经口使用的制剂可以包含与合适和方便量的转运体材料化合的0.5mg至5g活性试剂，其可以是约5至约95%总组合物。剂量单位形式一般将包含约Img至约500mg活性成分，一般是25mg、50mg、lOOmg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg或1OOOmg。然而，应当理解对于任何具体患者的特定剂量水平将依赖于各种因素，包括年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄率、药物组合和骨关节炎的严重度。在一个具体实施方案中，NSAID，S可以是COX_2(环氧化酶-2)抑制剂。COX-2抑制剂可以如先前所述共施用于哺乳动物受试者用于治疗和/或预防OA，所述哺乳动物受试者通过根据本发明的治疗组合物的关节内注射进行治疗。与其他NSAID一样，COX-2抑制剂在治疗环氧化酶介导的疾病中有效，所述疾病例如炎症、痛觉缺失和发热。这些化合物在治疗癌症、类风湿性关节炎和骨关节炎中特别有效。这些化合物具有不影响胃肠道的完整性和肾血流量的优点。这些化合物的例子包括(甲磺酰)苯基-2-5(H)-呋喃酮衍生物。这些衍生物例如在US-B1_5.981.576中描述。优选地，COX-2抑制剂选自如授权专利US-B1_6.169.188中描述的式I的化合物。特别优选的COX-2抑制剂包括3-(环丙基甲氧基)-5，5-二甲基-4-(4-甲磺酰)苯基)_5H_呋喃-2-酮、或3-(环丙基乙氧基)-5，5-二甲基-4-(4-甲磺酰)苯基)-5H_呋喃-2-酮、或这些化合物的药学上可接受的盐或水合物。特别优选的COX-2抑制剂是3-(环丙基甲氧基)-4_[4(甲磺酰)苯基|-5，5-二甲基-5H-呋喃-2-酮的多态形式B。对于马，作为经口或肠胃外施用(尤其是静脉内、皮下或肌内施用)，COX-2抑制剂的剂量可以是约0.05至约0.5mg/kg/12-24小时，并且更优选约0.1mg/kg/24小时。优选地，COX-2抑制剂是经口液体悬浮液或溶液、粘稠液、凝胶剂、糊剂或静脉内/皮下/肌内制剂。对于犬，COX-2抑制剂的剂量可以是约2至约10mg/kg/12-24小时，优选约5至约10mg/kg/24小时，并且更优选约5mg/kg/24小时。优选地，COX-2抑制剂是经口片剂(常规硬咀嚼片或软咀嚼片)、经口液体悬浮液或溶液、或静脉内/皮下/肌内制剂。包含COX-2抑制剂的糊剂的某些例子在专利申请EP-A1-1.688.149中，尤其是在表10-12中描述。本发明提供了用于OA的进一步疗法，其利用包括能够在体内表达BMP-7多肽和至少一种IL-IO(ILlO)的载体的药物组合物，并且从而提供用于诱导滑液BMP-7浓度和ILlO浓度中的持续增加的方法和组合物。本发明提供了治疗患有骨关节炎的哺乳动物受试者的进一步方法，其包括给所述哺乳动物受试者关节内施用治疗有效量的组合物，所述组合物包括至少一种药学上或兽医学上可接受的转运体、赋形剂或媒介物，包含编码与启动子可操作地连接的BMP-7多肽的核酸序列的重组腺病毒载体，和包含编码与启动子可操作地连接的ILlO多肽的核酸序列的重组病毒载体，其中所述BMP-7多肽和ILlO多肽在哺乳动物受试者体内表达。在另一个具体实施方案中，本发明涉及通过关节内注射用于治疗和/或预防OA的病毒载体的用途，以及包括病毒载体和另一种病毒载体的组合物，所述病毒载体编码且能够表达犬前原BMP-7、犬前BMP-7、犬BMP-7成熟多肽、人前原BMP-7、人前BMP-7、人成熟BMP-7、马前原BMP-7、马前BMP-7、马BMP-7成熟多肽、猫前原BMP-7、猫前BMP-7、猫成熟BMP-7，或其变体、衍生物或片段，所述另一种病毒载体编码且能够表达白介素-IO(ILlO)，尤其是马IL10、犬IL10、猫IL10、人IL10、病毒IL10。在一个优选实施方案中，本发明涉及通过关节内注射用于治疗和/或预防OA的病毒载体的用途，以及包括病毒载体和另一种病毒载体的组合物，所述病毒载体编码且能够表达犬前原BMP-7、犬前BMP-7、犬BMP-7成熟多肽，或其变体、衍生物或片段，所述另一种病毒载体编码且能够表达犬IL10。在另一个优选实施方案中，本发明涉及通过关节内注射用于治疗和/或预防OA的病毒载体的用途，以及包括病毒载体和另一种病毒载体的组合物，所述病毒载体编码且能够表达马前原BMP-7、马前BMP-7、马BMP-7成熟多肽，或其变体、衍生物或片段，所述另一种病毒载体编码且能够表达马IL10。在另一个优选实施方案中，本发明涉及通过关节内注射用于治疗和/或预防OA的病毒载体的用途，以及包括病毒载体和另一种病毒载体的组合物，所述病毒载体编码且能够表达猫前原BMP-7、猫前BMP-7、猫BMP-7成熟多肽，或其变体、衍生物或片段，所述另一种病毒载体编码且能够表达猫IL10。在另一个优选实施方案中，本发明涉及通过关节内注射用于治疗和/或预防OA的病毒载体的用途，以及包括病毒载体和另一种病毒载体的组合物，所述病毒载体编码且能够表达人前原BMP-7、人前BMP-7、人BMP-7成熟多肽，或其变体、衍生物或片段，所述另一种病毒载体编码且能够表达人IL10。优选地，“另一种病毒载体”是腺病毒载体，尤其是人腺病毒或犬腺病毒，特别是hAd5载体或CAV2载体。当使用此种载体组合时，施用如先前对于仅包括表达BMP-7多肽的腺病毒载体的组合物所描述的来完成，除治疗和/或药物组合物每剂量包含约IO7至约IO11VP的表达BMP-7多肽的腺病毒载体，和约IO7至约IO11VP的表达ILlO多肽的腺病毒载体外；有利地约IO8至约IOiciVP的表达BMP-7多肽的腺病毒载体，和约IO8至约IOiciVP的表达ILlO多肽的腺病毒载体；和更有利地约IO9至约IOltlVP的表达BMP-7多肽的腺病毒载体，和约IO9至约IOiciVP的表达ILlO多肽的腺病毒载体。在基于犬腺病毒载体，尤其是基于CAV-2载体的治疗和/或药物组合物的情况下，剂量可以是约IO5VP至约109VP、有利地约IO6至约108、更有利地约IO6至约IO7VP的重组犬腺病毒。本发明提供了治疗患有骨关节炎的哺乳动物受试者的进一步方法，其包括给所述哺乳动物受试者关节内施用治疗有效量的组合物，所述组合物包括至少一种药学上或兽医学上可接受的转运体、赋形剂或媒介物，包含编码与启动子可操作地连接的BMP-7多肽的核酸序列、和编码与第二启动子可操作地连接的ILlO多肽的核酸序列的重组腺病毒载体，其中所述BMP-7多肽和ILlO多肽在哺乳动物受试者内体内表达。在另一个具体实施方案中，本发明涉及通过关节内注射用于治疗和/或预防OA的病毒载体的用途，以及包括病毒载体的组合物，所述病毒载体编码且能够表达两者——犬前原BMP-7、犬前BMP-7、犬BMP-7成熟多肽、人前原BMP-7、人前BMP-7、人成熟BMP-7、马前原BMP-7、马前BMP-7、马BMP-7成熟多肽、猫前原BMP-7、猫前BMP-7、猫成熟BMP-7，或其变体、衍生物或片段，并且编码白介素-10(ILlO)，尤其是马IL10、犬IL10、猫IL10、人IL10。在一个优选实施方案中，本发明涉及通过关节内注射用于治疗和/或预防OA的病毒载体的用途，以及包括病毒载体的组合物，所述病毒载体编码且能够表达两者——犬前原BMP-7、犬前BMP-7、犬BMP-7成熟多肽，或其变体、衍生物或片段，和犬IL10。在另一个优选实施方案中，本发明涉及通过关节内注射用于治疗和/或预防OA的病毒载体的用途，以及包括病毒载体的组合物，所述病毒载体编码且能够表达两者——马前原BMP-7、马前BMP-7、马BMP-7成熟多肽，或其变体、衍生物或片段，和马IL10。在另一个优选实施方案中，本发明涉及通过关节内注射用于治疗和/或预防OA的病毒载体的用途，以及包括病毒载体的组合物，所述病毒载体编码且能够表达两者——猫前原BMP-7、猫前BMP-7、猫BMP-7成熟多肽，或其变体、衍生物或片段，和猫IL10。在另一个优选实施方案中，本发明涉及通过关节内注射用于治疗和/或预防OA的病毒载体的用途，以及包括病毒载体的组合物，所述病毒载体编码且能够表达两者——人前原BMP-7、人前BMP-7、人BMP-7成熟多肽，或其变体、衍生物或片段，和人IL10。当使用此种2种插入载体时，施用如先前对于仅包括表达BMP-7多肽的腺病毒载体的组合物所描述的来完成。编码ILlO的核酸序列可以在互联网数据库中发现，尤其是对于马ILlO在Genbank数据库中在登记号U38200和区域[1-537]下，对于犬ILlO在XM_850467.1和区域[2-541]下，对于猫ILlO在NM_001009209.1和区域[1-537]下，对于人ILlO在NM_000572.2和区域[60-596]下，并且对于病毒ILlO在AF182315下。如对于BMP-7限定的，ILlO功能等价物、ILlO变体、ILlO衍生物等由本发明所包括。ILlO的功能等价物由ILlO的生物学活性和性质限定，其活性和性质尤其在SchlaakJF等人，JImmunolMethods，1994，168(1)49-54中描述。在一个具体实施方案中，本发明可以包括与SEQIDNO:60具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的马ILlO多肽的功能等价物。在另一个具体实施方案中，本发明可以包括与SEQIDNO62具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的犬ILlO多肽的功能等价物。在另一个具体实施方案中，本发明可以包括与SEQIDNO64具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的猫ILlO多肽的功能等价物。在另一个具体实施方案中，本发明可以包括与SEQIDNO66具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的人ILlO多肽的功能等价物。在另一个具体实施方案中，本发明可以包括与SEQIDNO68具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的病毒ILlO多肽的功能等价物。用于表达ILlO的启动子与先前对于BMP-7表达描述的那些不同。本发明现在将通过下述非限制性实施例进行进一步描述。实施例实施例1猫BMP-7基因的产牛。使用从猫肾细胞中纯化的RNA通过RT-PCR获得BMP-7的cDNA。使用RNeasyMiniKit(Qiagen，Courtaboeuf,France)根据制造商的方案，由得自猫仔(foal)肾的猫肾细胞制备总RNA。使用OneStepSuperscriptIIIKit(Invitrogen，NewJersey,USA,Ref12574.035)根据制造商的方案执行逆转录酶(RT)步骤。随后根据GenBank可获得序列(人BMP-7在登记号AL122058下，鼠类在登记号NM_007557下，并且犬在登记号XM_862341下)，使用2对引物PB1053-PB1063和PB1060-PB1062，通过聚合酶链反应(PCR)扩增与猫BMP-7基因相对应的cDNA片段。PB1053(SEQIDNO20)(31聚体)5，GGATCCCTAGTGGCAGCCACAGGCTCGGACG3，PB1063(SEQIDNO21)(24聚体)5，GCCACCAGCAACCACTGGGTGGTC3，PB1060(SEQIDNO22)(24聚体)5，TTCAGCCTGGACAACGAGGTGCAC3，PB1062(SEQIDNO23)(20聚体)5’TGGTTGGTGGCGTTCATGTA3’RT-PCR条件是权利要求1.治疗患有骨关节炎的哺乳动物受试者的方法，其包括给所述哺乳动物受试者关节内施用治疗有效量的组合物，所述组合物包括至少一种药学上或兽医学上可接受的转运体、赋形剂或媒介物，和包含编码与启动子可操作地连接的BMP-7多肽的核酸序列的重组腺病毒载体，其中所述BMP-7多肽在所述哺乳动物受试者体内表达。2.根据权利要求1的方法，其中所述重组腺病毒载体是人腺病毒。3.根据权利要求2的方法，其中所述人腺病毒是人腺病毒5型(hAd5)。4.根据权利要求3的方法，其中所述人腺病毒5型(hAd5)是PEG化的。5.根据权利要求1的方法，其中所述重组腺病毒载体是犬腺病毒。6.根据权利要求5的方法，其中所述犬腺病毒是犬腺病毒2型(CAV2)。7.根据权利要求1的方法，其中所述哺乳动物受试者选自人、犬科、马科和猫科。8.根据权利要求1的方法，其中所述哺乳动物受试者是犬、母犬或幼犬。9.根据权利要求1的方法，其中所述哺乳动物受试者是猫或小猫。10.根据权利要求1的方法，其中所述哺乳动物受试者是马、母马或马驹。11.根据权利要求1的方法，其中所述BMP-7多肽选自前原BMP-7多肽、前BMP-7多肽和成熟BMP-7多肽。12.根据权利要求1的方法，其中所述BMP-7多肽选自犬前原BMP-7多肽、犬前BMP-7多肽、犬成熟BMP-7多肽、猫前原BMP-7多肽、猫前BMP-7多肽、猫成熟BMP-7多肽、马前原BMP-7多肽、马前BMP-7多肽、马成熟BMP-7多肽、人前原BMP-7多肽、人前BMP-7多肽和人成熟BMP-7多肽。13.根据权利要求1的方法，其中编码所述BMP-7多肽的核酸序列选自SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO10、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO17、SEQIDNO18，及其编码具有BMP-7活性的多肽的片段、变体、衍生物和同系物。14.根据权利要求1的方法，其中所述BMP-7多肽具有选自SEQIDNO3、SEQIDNO:15、SEQIDNO16、SEQIDNO19的氨基酸序列，及其具有BMP-7活性的片段、变体、衍生物和同系物。15.根据权利要求1的方法，其中所述BMP-7多肽包括信号肽。16.根据权利要求15的方法，其中所述信号肽选自BMP-7信号序列、IGF-I信号序列和tPA信号序列。17.根据权利要求15的方法，其中所述信号肽由选自SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO11的核苷酸序列，及其编码具有信号肽活性的肽的片段、变体、衍生物和同系物编码。18.根据权利要求15的方法，其中所述信号肽具有选自SEQIDNO:5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO12的氨基酸序列，及其具有信号肽活性的片段、变体、衍生物和同系物。19.根据权利要求1的方法，其中所述启动子选自CMVIE启动子、RSV启动子、HSV-ITK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油酸酯激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-1抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、Y-珠蛋白基因启动子、α-甲胎蛋白基因启动子、和肌肉肌酸激酶基因启动子。20.根据权利要求1的方法，其中所述ΒΜΡ-7多肽选自犬前原ΒΜΡ-7多肽、犬前ΒΜΡ-7多肽、犬成熟ΒΜΡ-7多肽，并且所述启动子是犬滑膜细胞特异性启动子或其中编码所述ΒΜΡ-7多肽的核酸序列选自SEQIDNO:1、SEQIDNO2，及其编码具有ΒΜΡ-7活性的多肽的片段、变体、衍生物和同系物，并且所述启动子是犬滑膜细胞特异性启动子。全文摘要本发明涉及在宿主细胞中表达BMP-7多肽的重组载体和包括此种重组载体的药物组合物。本发明还包括通过关节内施用本发明的重组载体和药物组合物用于预防和/或治疗哺乳动物中的骨关节炎的方法，所述哺乳动物有利地是人、犬、马和猫。文档编号C07K14/51GK102027114SQ200880115829公开日2011年4月20日申请日期2008年10月7日优先权日2007年10月5日发明者L·B·菲舍申请人:梅里亚有限公司