来自藻类的二酰基甘油酰基转移酶2基因及其编码的蛋白质的制作方法

专利名称：来自藻类的二酰基甘油酰基转移酶2基因及其编码的蛋白质的制作方法
技术领域：
本公开内容大体上涉及生物技术领域，更特别地，涉及对植物特性进行基因操纵 的有用的基因。在一些特定的具体实施方式
中，本公开涉及分离和/或纯化的编码二酰基 甘油酰基转移酶2(DGAT2)的多肽和核酸以及其应用方法。
背景技术：
油料种子作物是重要的农业经济作物。植物种子油是从人类饮食中获得必要的多 不饱和脂肪酸的主要来源，并且是化学工业中的可再生原料。在发育的种子的质体中，脂肪 酸合酶的复杂体系中的酶类负责脂肪酸的生物合成，这些脂肪酸被引导入胞浆酰基辅酶A 池内，以维持三酰基甘油的累积。三酰基甘油(TAG)的生物合成位于内质网上，使用3-磷 酸甘油和脂肪酰辅酶A作为基本底物。有三种酰基转移酶参与植物的储存性的脂质的生 物合成，其名称分别为甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT，EC2. 3. 1. 15)，溶血磷脂酸酰基转移 酶(LPAT，EC2. 3. 1. 51)以及二酰基甘油酰基转移酶(DGAT，EC2. 3. 1. 20)。这三种酰基转移 酶催化甘油骨架的分步式的酰基化反应，并且最后一步是通过DGAT将sn-1，2- 二酰甘油 (DAG)酰基化形成TAG，这个生化过程通常被称为Kennedy途径。已经公开了 DGAT介导的 甘油骨架的酰基化反应生产TAG是植物脂质积累过程中的限速步骤。因此，DGAT是植物脂 质生物合成中的遗传修饰的一个靶点。

发明内容
我们在此公开了具有与假微型海链藻(T. pseudonana)中二酰基甘油酰基转移酶 2 (DGAT)至少90%的序列同一性的一系列多肽。这些多肽可以用于改变植物中多不饱和脂 肪酸的水平。同样公开了包含假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)DGAT2的催化性 的二酰甘油转移酶结构域的多肽，以及具有与DGAT2的催化性的二酰甘油转移酶结构域至 少90%的序列同一性的多肽。进一步描述了编码具有与假微型海链藻DGAT2至少90%的 序列同一性的多肽的多聚核苷酸序列，以及编码具有与假微型海链藻DGAT2的催化性的二 酰甘油转移酶结构域至少90%的序列同一性的多肽的多核苷酸。在此我们公开了从假微型海链藻中分离和纯化出的二酰基甘油酰基转移酶 2 (DGAT)基因以及cDNA序列。同样公开了假微型海链藻中的DGAT2的cDNA的全长序列，并 且该cDNA序列具有与DGAT2的cDNA至少80%的序列同一性。在一些具体实施方式
中，这 些cDNA序列可以包含于载体中。这些多核苷酸可用于修饰植物中的三酰基甘油的天然合 成以用于提高商品化植物油的产量，或者用于修饰其组成来获得植物以及植物产品中特定的商品成分的改善。同样公开了从假微型海链藻中分离及纯化的其它的DGAT2家族的基因和cDNA序 列，以及来自其它藻类种属的DGAT2家族的基因和cDNA序列，这些藻类种属包括莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)，參录藻(Ostreococcuslucinarinus), Ostreococcus tauri, 以及三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)。这些多核苷酸也可以用于修饰植物中的三 酰基甘油的天然合成以用于提高商品化植物油的产量，或者用于修饰其组成来获得植物以 及植物产品中特定的商品成分的改善。一种包含核酸构建体的转基因植物同样被公开。描述了转化细胞或植物的方法； 该方法包括将分离的、纯化的或重组的核酸引入到细胞或植物中。生产基因转化植物种子 的过程包括将核酸转入到植物种子中去。在一些具体实施方式
中，这些方法可以用来修饰 植物以改变其种子油含量。更通常地说，一些实施例公开了分离、纯化和鉴定藻类中的DGAT2基因，以及 DGAT2在超长链的多不饱和脂肪酸的生产中的应用。通过下文详细描述的一些实施例，其结 合附图作为参考，上述的内容将更易被理解，


图1描述了推导的氨基酸序列(SEQ ID N0:1)，对应于假微型海链藻的DGAT2 cDNA 全长序歹Ij (SEQ ID NO :2)。图 2 描述了 SEQ ID NO :l(TpDGA2)和 gi :37182187、gi :50541689、gi :74623358、 gi =74623359, gi =86279638以及gi =62825813的序列比对结果，上述均为2型二酰 基甘油酰基转移酶。序列中的4个或更多共有的氨基酸用粗体表示。包括这些2型 二酰基甘油酰基转移酶的催化性的二酰甘油转移酶结构域的氨基酸序列由如下残基 组成236-365(TpDGA2) ；79-208(gi 37182187) ；76-205 (gi 50541689) ；76-205(gi 74623358) ；34-165(gi 74623359) ；33-165(gi 86279638) ；36-165(gi :62825813)。图3A描述了与SEQ ID NO 1同源的多肽序列的一个例子(SEQ ID NO 3)。图3B 描述了与SEQ ID NO :2具有至少90%序列同源性的多核苷酸序列的一部分，和编码SEQ ID NO 3的多肽的一部分；(SEQ ID NO 4)。图4A描述了与SEQ ID NO 1同源的多肽序列的另一个例子；(SEQ IDNO 5)。图 4B描述了与SEQ ID NO 2具有至少90%序列同源性的多核苷酸序列的一部分，和编码SEQ ID NO 5 的多肽的一部分；(SEQ ID NO 6)。图5A描述了与SEQ ID NO 1同源的多肽序列的另一个例子；(SEQ IDNO 7)。图 5B描述了与SEQ ID NO 2具有至少90%序列同源性的多核苷酸序列的一部分，和编码SEQ ID NO 7 的多肽的一部分；(SEQ ID NO 8)。图6A描述了与SEQ ID NO 1同源的多肽序列的另一个例子；(SEQ IDNO :9)。图 6B描述了与SEQ ID NO 2具有至少90%序列同源性的多核苷酸序列的一部分，和编码SEQ ID NO 9 的多肽的一部分；(SEQ ID NO 10)。图7A描述了与SEQ ID NO=I同源的多肽序列的另一个例子；(SEQ IDNO :11)。图 7B描述了与SEQ ID NO 2具有至少90%序列同源性的多核苷酸序列的一部分，和编码SEQ ID NO 11 的多肽的一部分；(SEQ ID NO 12)。
图8A描述了与SEQ ID NO=I同源的多肽序列的另一个例子；(SEQ IDNO :13)。图 8B描述了与SEQ ID NO 2具有至少90%序列同源性的多核苷酸序列的一部分，和编码SEQ ID NO 13 的多肽的一部分；(SEQ ID NO 14)。图9描述了薄层层析法(TLC)对在酵母突变体H1246 ΜΑΤ α (DGAT,PDAT\ASAT1\ ASAT2_，其为TAG合成缺陷型)中通过表达TpDGAT2和AtDGATl产生的TAG的分析。泳道1 显示了 AtDGATl的表达，泳道2-6显示了 TpDGAT2的表达。可以在泳道2_6观察到清晰的 TAG(三酰基甘油)条带。泳道8表示空载体(pYES2. 1)对照，并且此泳道没有TAG(三酰基 甘油)条带。泳道8的右侧泳道的上样为TAG标准品，其用作TAG标记物。图10显示了用空载体(pYES2. 1 Con ；空白柱形)，用假微型海链藻的DGAT2 cDNA(pYES =DGAT ；斑点状柱形)，用拟南芥(A. thaliana)DGATlcDNA(纯黑柱形)转化的酵 母突变体H1246 MATa中的DGAT活性。使用不同的14C标记的酰基辅酶A作为酰基供体， 以及未标记的sn-1，2甘油二油酸酯作为受体，来检测通过诱导的酵母细胞裂解物制备得 到的微粒体膜组分以测定DGAT的活性。此处相对DGAT活性用DPM (掺入合成到TAG中的 14C标记的底物的数量)表示。结果显示了底物偏好性以及TpDGAT2和AtDGATl的相对活 性。图11描述了 TpDGAT2 (TpDGAT2_l)与来自假微型海链藻(T. pseudonana)或来自其 它藻类禾中属(Cr—莱茵衣藻(Cr-Chlamydomonasreinhardtii) ；01- MM (Ol-Ostreococcus lucimarinus) ；Ot-Ostreococcus tauri ；Pt-三角 褐指藻(Pt-Phaeodactylum tricornutum))的家族成员的氨基酸序列的同源性比较。TpDGA2 (TpDGAT2_l)与其家族成 员丁 06六12-2、1 06六12-3、1 06六12-4分别拥有24%、25%以及17%的序列同一性。在这些 不同的藻类种属中TpDGAT2(TpDGAT2-l)显示了与PtDGAT2_l的高序列相似性(48%序列 同一性)，以及与CrDGAT2-l、CrDGAT2_2、和CrDGAT2_3的相对高的相似性(分别为20%、 23% 以及 24% )。
具体实施例方式I 一些具体实施方式
的概述此处公开了从假微型海链藻中分离及纯化的2型二酰基甘油酰基转移酶 (DGAT2)。这种多肽令人惊讶的能力为在其它生物以及其它生物细胞中修饰超长链的多不 饱和脂肪酸(VLCPUFA)的合成，这种能力可用来转化植物以及植物种子来产生包含所需的 脂肪酸组成的转基因植物及植物种子。本公开内容中还包括与假微型海链藻的DGAT2的氨 基酸序列具有至少90%序列同一性并且具有DGAT2活性的多肽。在一些特定的具体实施方 式中，这些多肽序列包括，例如，SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、 SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :13。同样公开了与假微型海链藻DGAT2的催化 性二酰基甘油酰基转移酶结构域具有至少90%序列同一性的序列的多肽。在一些特定的具 体实施方式中，这些多肽序列包括，例如，SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:17或SEQ ID N0:19。 在图2中描述了假微型海链藻DGAT2的催化性二酰基甘油酰基转移酶结构域；其由假微型 海链藻DGAT2完整公开的多肽序列中的236-365位氨基酸残基构成。SEQ ID NO 15的多肽包括假微型海链藻DGAT2的催化性二酰基甘油酰基转移酶 结构域。一些具体实施方式
中涉及包括与分离或纯化的如SEQ ID NO :15所示的多肽具有至少约 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, ,99%,99. 5%、99. 6%或 99. 7%
序列同一性的分离或纯化的多肽，例如，SEQID NO :1。在特别的具体实施方式
中，这些多肽 具有二酰基甘油酰基转移酶活性。本领域技术人员可以通过，例如，体外酶活性测定方法， 很容易测定二酰基甘油酰基转移酶的活性。该方法的具体细节在实施例4中进行了详述， 并且该检测的典型的结果如图10所示。本领域技术人员很容易理解，本公开内容同样涉及 从植物及藻类中得到的大幅度地同源的DNA序列，和编码包括与SEQ ID N0:15的推导的氨 基酸序列具有90%氨基酸序列同源性或更高同源性的蛋白质。 其它的从藻类中分离或纯化的DGAT2家族的成员多肽，其包括与，例如SEQ IDNO
25 (TpDGAT2-2)、SEQIDNO:27(TpDGAT2-3)、SEQIDNO:29(TpDGAT2-4)、SEQIDNO31 (CrDGAT2-l)、SEQIDNO:33(CrDGAT2-2)、SEQIDNO:35(CrDGAT2-3)、SEQIDNO37(CrDGAT2-4)、SEQIDNO:39(CrDGAT2-5)、SEQIDNO :41(01DGAT2-1)、SEQIDNO43(01DGAT2-2)、SEQIDNO:45(01DGAT2-3)、SEQIDNO47 (01DGAT2-4)、SEQIDNO49(0tDGAT2-l)、SEQIDNO51 (0tDGAT2-2)、SEQIDNO:53(0tDGAT2-3)、SEQIDNO55(0tDGAT2-4)、SEQIDNO 57(PtDGAT2-l)、SEQIDNO ；:59(PtDGAT2-2)、SEQIDNO
61(PtDGAT2-3)或SEQ ID NO 63 (PtDGAT2-4)的氨基酸序列具有至少90%序列同源性的氨
基酸序列。一些具体实施方式
涉及到编码上述的多肽的分离或纯化的核酸(多核苷酸)。这 些多核苷酸序列可以包括，例如，SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :8、 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO :26 (TpDGAT2_2)、SEQ ID NO :28 (TpDGAT2_3)、SEQ ID NO :30 (TpDGAT2_4)、 SEQ ID NO :32(CrDGAT2-l)、SEQ IDNO :34 (CrDGAT2_2)、SEQ ID NO :36 (CrDGAT2_3)、SEQ ID NO :38(CrDGAT2-4)、SEQ ID NO :40 (CrDGAT2_5)、SEQ ID NO :42 (01DGAT2-1)、SEQ ID NO 44 (01DGAT2-2)、SEQ ID NO :46 (01DGAT2-3)、SEQ ID NO :48 (01DGAT2-4)、SEQ IDNO 50(0tDGAT2-l)、SEQ ID NO :52 (0tDGAT2_2)、SEQ ID NO :54 (0tDGAT2_3)、SEQ ID NO: 56 (0tDGAT2-4)、SEQ ID NO :58 (PtDGAT2_l)、SEQ ID NO :60 (PtDGAT2_2)、SEQ ID NO: 62 (PtDGAT2-3)或SEQ ID NO :64 (PtDGAT2_4)。在一些具体实施方式
中，多核苷酸序列具有 与编码公开的编码多肽的的公开的多核苷酸的碱基具有百分比为至少约80%、81%、82%、 83%,84%,85%,, 86%,,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%、99%、99. 5%、99. 6%或99. 7%的同源性。所述多核苷酸的一些例子为SEQ ID NOS 21-24。作为本领域技术人员容易理解的是，核酸序列上的轻微的改变不一定会改变其编码 多肽的氨基酸序列。本领域技术人员很容易理解特定基因序列的同源性的改变可以改变其 编码的氨基酸序列，可能会导致降低或提高基因的有效性，并且，在一些应用中(即，反义 的引物、协同抑制、或RNAi)，部分序列经常与全长形式一样有效地起作用。如何进行基因序 列改变或缩短的方法是本领域技术人员熟知的，同样熟知的还有那些检测改变的基因的有 效性的方法。在一些特定的具体实施方式
中，有效性可能很容易地检测，通过，例如，常规的 气象色谱法检测。在此将所有这样的基因的变体都引入作为本发明的一部分。一些具体实施方式
涉及一种载体，其包含分离或纯化的多核苷酸，所述多核苷酸 与 SEQ ID NO 2 具有至少 80%的同源性，例如，SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO 16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID NO 20、SEQ IDNO 21-24。因此，提供了一种制备一种载体的方法，所述载体包括选自，例如SEQ IDNO :2，例如，SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID NO : 20、SEQ ID NO : 21-24 或其 片段的序列，将这些序列或其反向的部分序列，或其互补序列导入到植物细胞中。特定的具体实施方式
涉及包括与藻类中DGAT2家族成员具有至少80%同源性的 序列的载体。这些载体可包括多核苷酸序列，例如，SEQ ID N0:26、SEQ IDNO 28、SEQ ID NO 30,SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 36、SEQID NO 38、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42,SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46、SEQED NO 48、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 52、SEQ ID NO 54,SEQ ID NO 56,SEQID NO 58、SEQ ID NO60,SEQ ID NO :62、或 SEQ ID NO 64.在一些具体实施方式
中，分离和纯化的多核苷酸，以及包含这些分离和纯化的多 核苷酸的载体，可以用于构建产生具有DGAT2活性的多肽的转基因植物。因此，一种具体实 施方式涉及包括分离或纯化的多核苷酸的转基因植物以及植物种子，所述多核苷酸与SEQ ID NO :2具有至少80%同源性；例如，脱氧核糖核酸分子具有SEQEE NO :2、SEQ ID NO :15、 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :20、或 SEQ ID NO 21~24 的序 列。其它的具体实施方式
涉及包括分离或纯化的多核苷酸序列的转基因植物和植物种子， 所述多核苷酸序列具有与藻类DGAT2家族的另一成员至少80%的同源性；例如，脱氧核糖 核酸分子具有SEQ IDNO 26,SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO :34、 SEQID NO 36,SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO :44、SEQID NO :46、 SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :54、SEQID NO :56、SEQ ID NO 58、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :62、或SEQ ID NO 64的序列。与缺乏这种核酸构建体的植 物相比，这些具体实施方式
中的植物可以在种子中具有改变了的多不饱和脂肪酸的水平。 这些植物中的脂肪酸可约有超过70%为多不饱和脂肪酸。一种具体实施方式
中包括生产所述植物和植物种子的方法。该方法包括构建一 种具有编码多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多肽与选自SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、 15、17和19的多肽具有至少90%的序列同一性，或者所述多肽与藻类DGAT2家族的多肽 具有至少 90%的序列同一性；例如，SEQ ID NO :25、SEQID NO :27、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :35、SEQID NO :37、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :45、SEQID NO :47、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :53、 SEQ ID NO :55、SEQID NO :57、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO 61 或 SEQ ID NO 63 ；以及将该 构建体导入植物中。该具体实施方式
的方法可使用本领域普通技术人员熟知的任意方法完 成，非限制性的例子为，农杆菌介导的转化。在具体的实施方式中，该方法还包括将编码具 有Brusica丙酮酸脱氢酶激酶活性多肽的多核苷酸，编码具有二酰甘油乙酰转移酶活性多 肽的多核苷酸，和/或具有编码3-磷酸-甘油脱氢酶活性多肽的多核苷酸，导入到植物中。 该方法可能在选自如下的植物中实施，所述植物选自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、琉 璃宦(Borago spp.)、力口拿大油料(Canola)、菌麻(Ricinusspp.)、可可(Theobroma spp.)、 玉蜀黍(Zea spp·)、棉(Gossypium spp)、海甘蓝(Crambe spp·)、萼距花(Cuphea spp·)、 亚麻(Linum spp.)、雷斯克勒(Lesquerellaspp.)、鲸油草(Limnanthes spp.)、亚麻的突变 株(Linola)、旱金莲(Tropaeolumspp.)、月见草(Oenothera spp.)、洋撤揽(Olea spp·)、 油掠(Elaeis spp.)、花生(Arachis spp.)、油菜轩(rapeseed)、红花(Carthamus spp·)、大 M (Glycine spp. )>If^icM (Soja spp.(Helianthus spp.)(Nicotianaspp.)、斑鸡菊(Vernonia spp·)、小麦(Triticum spp·)、大麦(Hordeum spp.)、稻 (Oryza spp.)、燕麦(Avena spp.)、高粱(Sorghum spp.)，、黑麦(Secale spp.)、十字花科植物 (Brassicaceae)，以及其它禾本科(Gramineae)植物。在一些具体实施方式
中，该方法还包括从包含引入的核酸构建体的植物中收获种 子，以及从收获的种子中提取油。因此，其它的一些具体实施方式
包括通过该方法产生的植 物，以及从该方法产生的植物中提取的油。一些可能使用DGAT2基因或其部分进行的操纵和传递，包括，但不限于，如下提 高或降低油含量的种子；具有提高的超长链的多不饱和脂肪酸含量的种子，以及显示了提 高的或改变的富集超长链的多不饱和脂肪酸能力的植物。II缩写词CaMV花椰菜花叶病毒cDNA 互补 DNACERV香石竹蚀环病毒CrDGAT2莱茵衣藻2型二酰甘油转移酶DAG sn-l，2_ 甘油二酯DGAT 二酰基甘油酰基转移酶DGAT2 2型二酰甘油转移酶DHA 二十二碳六烯酸DNA脱氧核糖核酸EPA 二十碳五烯酸GPAT甘油-3-磷酸酰基转移酶LPAT溶血磷脂酸酰基转移酶01DGAT2 绿藻(Ostreococcus lucimarinus) 2 型二酰甘油转移酶0tDGAT2 Ostreococcus tauri 2 型二酰甘油转移酶PCR聚合酶链式反应PtDGAT2 三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum) 2 型二酰甘油转移酶RNA核糖核酸RNAi RNA 干扰RT-PCR 逆转录 PCRT35S CaMV 35S 终止子TAG三酰基甘油TLC薄层层析法Tmas甘露碱合酶终止子Tnos胭脂碱合酶终止子TpDGAT2假微型海链藻(T. pseudonana) 2型二酰甘油转移酶TrbcS 二磷酸核酮糖盐羟化酶小亚基终止子区域VLCPUFA超长链多不饱和脂肪酸III 术语为了更容易阅读本公开内容中的各种不同的实施例，下文提供了各种专用名词的解释互补核酸序列一条序列的“互补核酸序列”的含义为任意的DNA，其核酸序列互 补于本公开内容中的序列，并且其方向为相反的(反向平行序列)。序列同源性的程度或百分比术语“序列同源性的程度或百分比”指的是两条序 列最适的比对之后其序列同一性的程度或百分比。序列同一性百分比(或程度或同一性) 定义为在比较窗口中最适排布下比较两条序列，在比较窗口中的两条序列最适排布下肽或 多核苷酸序列的部分序列与参考序列(其不包括添加或缺失)相比可能包括添加或缺失 (即，缺口)。所述百分比通过确定两条序列中存在的相同的氨基酸残基或核苷酸碱基产生 的配对位置的数量来计算，将配对位置的数量除以比较窗口中总的位置总数，然后将结果 乘以100即可获得序列同一性的百分比。同源的分离和/或纯化序列“同源的分离和/或纯化序列”是指分离和/或纯 化的序列，其与核酸序列的碱基，或多肽序列的氨基酸，具有至少约80%、81%、82%、83%、 84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99%、99. 5%、99. 6%或99. 7%的同一性百分比。该百分比为纯统计学的，并且可能根据两 条核酸序列在随机或全长上的不同进行归类。序列同一性可以通过，例如，设计的执行单个 和多重序列比对的计算机程序进行确定。可以知道本领域任意普通技术人员都可以理解本 发明包含密码子使用的简并性。此外，本领域技术人员可以理解在多肽氨基酸序列上可进 行不破坏该多肽结构或功能的保守替代。本领域技术人员可以通过引入相似疏水性、极性、 以及R-链长度的氨基酸替换另一个氨基酸来完成保守替代。另外，通过不同种属的同源蛋 白质的序列间的比对，保守替代可能通过定位在种属间发生突变的氨基酸残基来确定，所 述突变的氨基酸残基没有改变编码蛋白的基本功能。分离本领域技术人员容易理解地，“分离”指的是从其天然环境中“分离”获得的多肽。核苷酸、多核苷酸、或核酸序列“核苷酸，多核苷酸，或核酸序列”指的是单体和二 聚的(所谓的串联)形式的双链或单链DNA以及所述DNA的转录产物。序列同一性当两条序列中的氨基酸序列或核苷酸残基如下文所述进行最大匹配 度比对时两者相同，两条氨基酸或核酸序列被称为“同一的”。两条(或多条)多肽或多核 苷酸序列比对一般通过比较两条最佳比对的序列过分割或“比较窗口 ”中确定并比较局部 位置的序列相似性。序列最适比对的比较可以通过Smith和Waterman，Ad. App. Math 2 482(1981)的局部同源性算法，或者 Neddlemanhe 和 Wunsch，J. Mol. Biol. 48 443 (1970)的 同源性算法，或者 Pearson 和 Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85 2444(1988)的相似性 检索，或者这些算法的计算机化的工具(WisconsinGenetics Software Package中的GAP、 BESTFIT、FASTA、禾口 TFASTA, GeneticsComputer Group (GCG),575 Science Dr. , Madison, Wis.)，或者直接观察来进行。上述给出的序列同一性的定义为本领域技术人员均可使用的定义。定义自身不需 要任何算法的帮助，所述算法只有在获得序列的最适比对时，而非在计算序列同源性时使用。从上述给出的定义，对应于最佳或最适比对的序列的获得的值，两条比较序列间 有一个清晰可辨的并且唯一的序列同一性值。
在BLAST N 或 BLAST P "BLAST 2 序列”中，软件可从网页 http //worldwiseweb. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/bl2. html上获得，发明人习惯性使用并且通常本领域技术人员用 这些来比较和确定两条序列的同一性，依赖于比较的序列长度的断裂值可以直接在软件上 选择(即，取代矩阵BL0SUM-62，长度> 85，值为11.2)。严格(条件下的)杂交核酸序列的严格条件下的杂交的含义为在选择的温度和 离子强度的条件下的杂交，所述条件使得两个互补DNA片段维持杂交。此处描述的从其他 生物获得的DGAT2基因的同源性，例如，从植物中，可能通过扫描合适的同系物群来获得， 其中扫描使用此处公开的特异的DGAT2基因的核酸序列，或其片段或探针来实行，或使用 序列比对检索程序如BLAST、FASTA来进行序列同源性比对检索。III.从藻类获得的DGAT2修饰脂肪酸水平A.概述最近关于桐树以及蓖麻子中获得的DGAT2的研究显示了植物含有罕见的脂肪酸， DGAT2可以在罕见的脂肪酸到种子储存油的通路上有重要的作用。而DGAT2可以是植物 油料种子中油脂生物合成基因修饰的潜在靶点，最近鉴定出的酶类分别利用共轭的脂肪酸 桐油酸(桐树DGAT2)和蓖麻油酸(蓖麻子DGAT2)。任何一种酶(桐树DGAT2或蓖麻子 DGAT2)都不参与三酰基甘油(TAG)中的商业上想要的长链ω-3多不饱和脂肪酸二十碳五 烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。海洋环纹硅藻(marine centric diatom algae)假微型海链藻可以生产和累积 TAG中的长链ω-3多不饱和脂肪酸EPA和DHA，并且是高水平的超长链多不饱和脂肪酸 (VLCPUFA)累积油类的来源。由于此原因，研究并鉴定了假微型海链藻中的二酰基甘油酰基 转移酶(TpDGAT2)基因。令人惊奇的是，发现了 TpDGAT2，其不像从桐树或蓖麻子中获得的 DGAT2，可以有效地参与超长链多不饱和脂肪酸合成TAG。使用TpDGAT2基因来从假微型海 链藻及相关藻类种属中检索多核苷酸序列，藻类中的其他DGAT2家族成员被确定。因此，确 定藻类DGAT2基因在应用转基因工具中对于种子中的TAG组成和累积是有效的。B.与具有2型二酰甘油转移酶活性的假微型海链藻DGAT2同源的多肽使用搜索引擎，如BLAST，能够通过检索蛋白数据库(如NCBI蛋白质数据库)找到 与全长的假微型海链藻DGAT2同源的蛋白质。其同样可以通过合理设计获得。合理设计的 过程可以包括在所需获得的多肽长度中鉴别保守的氨基酸取代，并且在编码蛋白中制造这 些取代。使用假微型海链藻的DGAT2的全长氨基酸序列在NCBI蛋白质数据库(BLASTP)中 检索时显示出了与TpDGAT2显著的序列同源性的多肽，其中在图2中示出了一些与TpDGAT2 的比对结果。保守的2型二酰甘油转移酶结构域的比对如图2所示，由TpDGAT2的236-365 位氨基酸残基以及与其他的DGAT2多肽相应的残基组成。保守的2型二酰甘油转移酶 结构域在NCBI保守结构域数据库中有描述(http://worldwideweb. ncbi. nlm. nih. gov/ Structure/cdd/cdd. shtml)。与该保守结构域同源的多肽序列赋予了包含该片段的蛋白质 TpDGAT2的2型二酰甘油活性。本领域普通技术人员可以理解，具有同源序列的多肽因其具有同源性可以设计为 显示具有相同的结构和功能。本领域技术人员能够设计与那些在本公开内容图2序列比对 中列出的具体的例子同源的多肽。这些同源多肽可以是那些本发明公开的多肽的保守取代的多肽，例如，SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO 7, SEQID N0:9、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID N0:17、或 SEQ ID NO :19 的多肽。可以确定这些同源的 多肽是否具有与TpDGAT2实质上相似的2型二酰甘油转移酶活性的简单的实验分析方法是 本领域技术人员已知的。这些分析不需要过度费时，也不昂贵，也没有技术困难。例如，常 规的气相色谱法可以用来检测由TpDGAT2产生的TAG。在下文详述的实施例中对这些分析 试验进行了描述。C.核酸分子应用于转化具有DGAT2活性必须要理解公开的具体实施方式
不包括在它们天然环境中的基因组核 酸序列，也就是说，在假微型海链藻(T. pseudonana)、莱茵衣藻(hlamydomonas reinhardtii)，參录藻(Ostreococcus ludmarinus) > Ostreococcus tauri、或三角揭指藻 (Phaeodactylumtricornutum)的天然基因组中。一些具体实施方式
涉及到已经能够从分离 方法开始，如，离子交换色谱法，通过基于分子大小的排斥选择，或通过亲和性，或可替代地 基于不同溶剂中的溶解度的分级分离技术进行分离、纯化或部分纯化的序列，或者从基因 工程方法开始，如扩增，克隆，及亚克隆进行分离、纯化或部分纯化的序列，其可能是由载体 携带序列。进一步包括核酸分子，其可以杂交到上述公开的序列上。杂交条件可以是严格的， 因此当其与编码公开的DGAT2分子的核酸分子具有至少90%，95%或97%序列同一性时才 会发生杂交。严格条件可以包括那些用于已知的Southern杂交的条件，例如，在具有50% 甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM 枸橼酸钠)、50mM 磷酸钠(ρΗ7· 6)、5 XDenhardt，s 溶液、 10%硫酸葡聚糖、以及20微克/毫升的变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中42°C孵育过夜， 随后用0. IXSSC在约65°C下清洗杂交支持物。其他广泛已知的杂交条件参见Sambrook 等 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001).已经很好地建立了 DNA的分离和克隆。相似的，编码分离酶类的DNA可以被插入 到载体中，用常规的方法转入到酵母细胞。然而，因为没有可有效利用VLCPUFA的DGAT2基 因已经被克隆过，所以还不可能通过调整DGAT2的活性来进行定位遗传修饰。我们确定了 DGAT2参与TAG合成并且比DGAT更有效地利用VLCPUFA。编码DGAT2 的核酸分子，例如与 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :16、SEQ IDNO :25、SEQ ID NO 27,SEQ ID NO 29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO 33、SEQID NO 35、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 39,SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :43、SEQID NO 45、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 49、SEQ ID N0:51、SEQ ID NO :53、SEQID NO :55、SEQ ED NO :57、SEQ ID N0:59 或SEQ ID NO :61具 有至少80%同一性的序列可以转入一种生物体中，例如一种植物。这些同源序列为例如SEQ IDN0:21-24。本领域已知的，有许多方法将基因和基因构建体导入生物体，如植物中，并 且转化和组织培养技术的结合已经成功地整合以实现创造转基因生物体的有效的策略，例 如作物植物。这些方法已经在大量文献中被描述过(Potrykus，1991 ；Vasil, 1994 ；Walden 和Wingender，1995 ；Songstad等，1995)，其为本领域技术人员所熟知。例如，本领域技术 人员可以确定地知道，农杆菌介导的拟南芥转化可以通过真空浸染(Bechtold等，1993)或 有伤接种(Katavic等，1994)，同样，使用农杆菌Ti质粒介导的转化(如，下胚轴(DeBlock 等，1989)或子叶叶柄(Moloney等，1989)伤口侵染)，粒子轰击/基因枪法(Sanford等，1987 ；Nehra等，1994 ；Becker等，1994)或聚乙二醇辅助的原生质体转化(Rhodes等，1988 ； Shimamoto等，1989)方法，能够转化其他植物或作物种属。在植物中通过遗传工程转化新的基因或改变已有基因的表达修饰植物的代谢有 许多成功的例子。目前通常将基因导入到许多农学上重要的植物种属中来改善作物生 长状况(如，植物油或块茎淀粉量/组成；膳食改善；除草剂、疾病或害虫抗性；重金属耐 受等)(MacKenzie 和 Jain,1997 ；Budziszewski 等，1996 ；Somerville, 1993 ；Kishore 和 Somerville,1993)。对本领域技术人员来说同样明显的是，和其他地方的说明(Meyer，1995 ；Dada等， 1997)，其可能利用植物启动子直接预期上调或下调转基因的表达(如，基于CaMV35S)，或 通过使用启动子其可使基因在特定的细胞、组织中(如，napin启动子在发育的种子子叶中 的转基因表达)、器官(如，根)中，或者在一个特定的发育的阶段，或特定的外界刺激(如， 热激)下表达。此处使用的启动子可以是可诱导型的、组成型的、或组织特异型的、或具有这些 特征的不同的组合。有效的启动子包括，但不限于，组成型启动子，如，香石竹蚀环病毒 (CERV)，花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子，或更特别的双倍增强花椰菜花叶病毒启动子， 其包括串联的两个CaMV 35S启动子(被称为“双35S”启动子)。在特定情况中可能希望使用组织特异型或生长发育调节启动子代替组成型启动 子。组织特异性启动子允许在特定的组织中过表达而不影响其他的组织中的表达。举例来 说，在种子组织中过表达酶的启动子为ACP启动子，在PCT国际公布文本W092/18634，公开 日为1992年10月29日的文件中有描述。启动子和终止调节区可以在宿主细胞中具有功能，并且可以与植物细胞和基因是 异源的(是指，非自然发生)或同源的(从植物宿主物种中获得)。可能用到的合适的启动 子如上文所述。终止调节区域可以从获得启动子的基因的3'区获得，或来自其他基因。可用的 合适的终止区是本领域熟知的，包括根癌农杆菌胭脂碱合酶终止子(Tnos)，根癌农杆菌甘 露碱合酶终止子(Tmas)和CaMV 35S终止子(T35S)，豌豆二磷酸核酮糖盐小亚基终止子区 (TrbcS)，或Tnos终止子区。这些基因构建体可以适于筛选通过农杆菌转化宿主细胞的活 性和筛选提高的类异戊二烯水平。合适的，基因的核苷酸序列可以从GenBank (美国卫生与公众服务部的注册商 标)核苷酸数据库中获得，并且可以搜索不会酶切该核苷酸的限制性内切酶。这些限制性 酶切位点可以通过常规方法，如在PCR引物中加入酶切位点或通过亚克隆添加到基因上。优选的，此处使用的DNA构建体包含在一个载体中，最合适的是一个适于在合适 宿主(植物)细胞中表达的表达载体。可以理解的是可以产生包括导入DNA序列的植物的 任何载体都可以。合适的载体对于本领域技术人员来说是众所周知的，并且在一般技术参考文献如 Pouwels 等，Cloning Vectors。A Laboratory Manual，Elsevier, Amsterdam(1986)中进 行了描述。特别适合的载体包括Ti质粒载体。将DNA构建体导入宿主细胞的转化技术是本领域已知的，其包括如下方法，如微 量注射、使用聚乙二醇、电穿孔、高速率冲击穿透、或农杆菌介导的转化。在转化植物细胞或植物之后，那些插入了所需的DNA的植物细胞或植物可以通过如抗生素抗药性、除草剂抗 性、氨基酸类似物耐受性、或使用表现型标记来筛选。可以用各种试验分析来确定植物细胞是否显示了增加的基因表达，例如， Northern杂交或定量反转录PCR(RT-PCR)。通过常规的方法，整个转基因植物可从转化细 胞再生成植株。所述转基因植物具有提高的类异戊二烯水平，可以继续繁殖和自花授粉来 产生纯合子系。所述植物生产的种子包括引入的特定的基因，并且可以生长至生成植物，该 植物产生选择的表型。根据本发明公开内容特别优选的用于修饰的植物选自拟南芥 (Arabidopsisthaliana)、琉璃宦(Borago spp.)、加拿大油料(Canola)、菌麻 (Ricinuscommunis) (Ricinus spp.)、可可豆(Theobroma cacao) (Theobroma spp·)、玉蜀 黍(Zeamays) (Zea spp·)、棉(Gossypium spp)、海甘蓝(Crambe spp·)、萼距花(Cuphea spp·)、亚麻(Linum spp·)、雷斯克勒(Lesquerella spp·)、沼花(Limnanthes spp·)、亚麻 的突变株(Linola)、旱金莲(Tropaeolum spp.)、月见草(Oenothera spp.)、洋橄榄(Olea spp·)、油掠(Elaeis spp·)、花生(Arachis spp·)、油菜轩(rapeseed)、红花(Carthamus spp.)、大豆(Glycine spp.和 Soja spp.)、向曰葵(Helianthus spp.)、烟草(Nicotiana spp.)、斑鸡菊(Vernonia spp·)、小麦(Triticum spp·)、大麦(Hordeum spp.)、和 (Oryza spp.)、燕麦(Avena spp.)、高粱(Sorghum spp.)、黑麦(Secale spp.)以及其它禾本科 (Gramineae)植物。—些具体实施方式
用来改变油料种子作物产生的油料种子的产量或组成。油料种 子作物为那些具有产生在商业上重要收益的可食用的或工业用油的植物品种，并且包括许 多上述所列的植物品种。这些油料作物对于本领域技术人员来说是已知的。在一个实施例中，培养用编码DGAT2的核苷酸序列转化的植物。收获转基因植物 的种子，提取种子中的脂肪酸。提取的脂肪酸用于随后添加到组合物中，例如药物组合物， 营养食品组合物，或食品组合物。在特定的具体实施方式
中，提高或改变油类产品的其他方法还可能以用于待转化 的植物(如，为了在植物中表达，包含一核酸序列，该核酸序列选自包括以下核酸的组编 码例如，具有甘蓝型油菜丙酮酸脱氢酶激酶活性的多肽的核酸(参见，如，Manila等的美国 专利7，214，859 (2007年5月8日)，Zou等的美国专利6，500，670 (2002年12月)，以及 Randall等的美国专利6，256，636(2001年7月))，编码具有二酰基甘油酰基转移酶活性 的多肽的核酸(参见，如，Zou等的美国专利7，015，373和美国专利6，500，670 (2002年12 月))，以及编码具有3-磷酸-甘油脱氢酶活性多肽的核酸(参见，如，美国专利7，112，724 以及其组合)。除了那些此处详细描述的具体实施例外，具体实施方式
易受到各种修饰和改变形 式的影响。因此，具体实施方式
不限于所公开的特定的形式。一般来讲，公开内容包含的所 有的改变，等同体或替代均落入随后附上的权利要求中。实施例实施例1:DNA操作DNA制备、质粒扩增及分离使用标准的方法和步骤(Sambrook等，1999)。测序在 使用 Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing i式齐[J盒(Applied Biosystems, Inc.)的Applied Biosystems Model 373A DNA测序系统上进行。核苷酸与推导的氨基酸序列使 用BLAST程序(ALtschulet等，1990)在数据库中进行比较。在NCBI核苷酸与蛋白质数据 库中基于和其它脂肪酸二酰基甘油酰基转移酶基因的同源性鉴定DGAT2基因，这是本领域 已知的。实施例2 在酵母转化体体内表达TpDGAT2来形成三酰基甘油(TAG)将DGAT2基因插入到pYES2. 1中(Invitrogen)。构建体通过测序确认，并且 将pYES2. l/TpDGAT2用于转化酿酒酵母菌株H1246 ΜΑΤ-α。该突变株为四倍体突变株 (DGAT-、PDAT-、ASAT-、ASAT2_)。从推定的转化体内分离质粒DNA，并通过Southern分析来 确定PYES2. l/TpDGAT2的存在。只包括载体(pYES2. 1)的Η1246ΜΑΤ_α转化体作为对照。 包括拟南芥DGATl的Η1246 ΜΑΤ-α转化体作为阳性对照。在20mL的SD培养基(合成葡萄糖培养基，含有葡萄糖，不含尿嘧啶，Ausubel等， 1995，Vol. 2，p. 13. 1. 3中描述)中过夜培养单个克隆，28°C摇床培养(270rpm)。从过夜培 养物中收集细胞团，重悬于50mL培养基中用于诱导表达(含有半乳糖但不含尿嘧啶的SD 培养基)。细胞于28°C，转速270rpm下重新孵育，4到6小时后收获。GAL诱导的酵母转化 体5000rpm，5分钟离心收获，重悬于IOOmM Hepes NaOH溶液中，pH7. 4，含有ImM的EDTA和 ImM 的 DTT。参考图9，空载体转化体和阴性对照(泳道8)中没有显示TAG条带，而阳性对照 (泳道1)中有TAG条带。含有载体的每个DGAT2(泳道2-6)都显示了 TAG条带，其证实了 DGAT2具有合成TAG的能力。泳道8右侧的泳道的条带为TAG标准品，其用作TAG标记物。实施例3 :TpDGAT2的底物偏好性使用酸洗玻璃珠制备细胞裂解液，如Ausubel等(1995)描述的那样。酵母裂解物 中的蛋白质使用Brdf0rd(1976)分析方法测定，每个裂解物中的蛋白质水平均为标准化且 等分的(250 μ g蛋白质)，用于DGAT2的活性分析。DGAT分析在pH7. 4，100转/分的水浴中30°C下进行10分钟。测定混合物(终 体积0. 5mL)包括100μ g裂解物蛋白质，90mM HEPES-NaOH, 20 μ M sn_l，2甘油二油酸酯， 以及18μΜ 14C酰基辅酶A (放射性比度2nCi/nm0l)作为酰基供体。14C标记的TAG通过硅 胶G盘上的己烷二乙基乙醚乙酸(70 30 1 ν/ν/ν)的TLC进行分离，放射标记的 TAG条带通过在Bioscan AR-2000 radio-TLC扫描仪上使用Win-Scan 2D 软件进行观测 (Bioscan Inc.，Washington DC, USA)，并且按照Taylor等(1991)所述进行条带刮下与条
W足里。实施例4 :TpDAGT2转化体中的脂肪酸组成酿酒酵母菌株Hl246 ΜΑΤ- α用拟南芥/pYES 2. 1或假微型海链藻/pYES 2. 1进 行转化。转化体在28°C生长3天并使用半乳糖诱导。转化体不用任何东西处理(对照)， 用50 μ MDHA处理或用150 μ MDHA处理。三种包含AtDGATl/pYES2. 1的转化体以及三种包 含TpDGAT2/pYES2. 1的转化体的基于常规气相色谱法的脂肪酸分布如表1所示。脂肪酸被确定为16:0、16:1、18:0、18:1(油酸)，以及22:6(0拟)；以及每种的组成 以总脂肪酸的百分比表示。DHA的表达从对照菌株中的0提高到150 μ MTpDGAT2/pYES2. 1 中的6. 01%，并且是150 μ M AtDGAT/pYES2. 1的两倍多。(表1)这些结果进一步证实了 TpDGAT2利用DHA脂肪酸的效率高于DGATl。
脂肪酸组成的方式中，包含DGAT2 cDNA的突变系显示了总的饱和脂肪酸的下降， 以及不饱和脂肪酸的升高，如表1所示。这些变化指向了 “更健康的”油类，并且可以直接 应用到加拿大油料，其他十字花科的油料种子以及其他的食用油作物来生产相似的结构组 成的改良型油类。表1.在酵母突变菌株H1246 ΜΑΤ- α中由DGAT2和DGATl表达的TAG的脂肪酸组 成
脂肪酸组成%%%%%
处理16:016:118:018:122:6
AtDGAT/pYES2.1_ 不补给13.9335.7117.8432.510.0031.7868.22
AtDGAT/pYES2.1-50 μ M DHA19.6827..5416. 5134.821.4636.1862.36
AtDGAT/pYES2.1-150 μ M DHA19.2427..8315. 2135.082. 6334.4562.91
TpDGAT2/pYES2.1_ 不补给10.0330.2313.8345.900.0023.8776.13
TpDGAT2/pYES2.1-50 μ M DHA6.4335..398.4945. 074.6214.9280.47
TpDGAT2/pYES2.1-150 μ M DHA5. 7731..7311. 5744.936.0117.3476.66实施例5 野生型拟南芥中DGAT2 cDNA的过表达将全长的DGAT2 cDNA用作PCR扩增的模板。片段通过限制性内切酶消化切割，然 后连入到载体的相应位点。通过测序来确定构建体的完整性。载体转入到农杆菌中，用于转化野生型拟南芥，并且进行结果分析。实施例6 用于种子特异性表达的DGAT2 cDNA植物转化载体的构建将全长的DGAT2 cDNA用作PCR扩增模板，使用在序列各个末端提供了新的酶切位 点的引物。PCR程序如下-MV 1分钟；940C 30秒，55°C 30秒，72°C 1分钟，30个循环；和 720C 5分钟。然后将PCR产物连接入PCR2. 1载体(Invitrogen)。片段被切割然后连接到 载体的对应位点。通过测序来确定构建体的完整性。实施例7 用植物DGAT2载体构建体转化农杆菌电转化农杆菌细胞，GV3101 (pMP90)菌株，按照如下方法制备农杆菌培养物在 2YT中生长24到48小时，当600nm处吸光度达到0. 5到0. 7时，细胞置于冰上冷却通过离 心(5, 000 Xg, GSA转子，4°C，10分钟)收集。收集物用1、0. 5、0. 02体积的冷的10%的无 菌甘油清洗，重悬于0.01体积的冷的10%甘油。电转化细胞随后在液氮中速冻然后储存 于-70°C。用20-50ng转化DNA通过电穿孔转入农杆菌细胞，按照制造商的说明书执行，然 后将农杆菌细胞置于选择培养基(加入50 μ g的卡那霉素的LB)中，28°C培养过夜。单独 的转化细胞在5mL添加50 μ g/mL卡那霉素以及25 μ g/mL庆大霉素的LB培养基中生长过 夜(28°C，225r.p.m)。进行DNA提取和纯化。构建体的保真度在转化植物前通过DNA测序 再次检查。实施例8:转化拟南芥拟南芥的种子在荧光灯照明条件下(120 μ E · m^S"1)，16小时有光/8小时黑暗的 条件下，22°C生长。4到6株植物于潮湿的TERRA-LITE RED I-EATRH的IOcm2的盆中培养 (W. R. Grace & Co. Canada Ltd. Ajax，ON，Canada)。为了防止盆中的土壤混合物落入接种培
16养基，土壤成耸起的平面，种子播种于顶部，整个盆用尼龙纱窗纱覆盖，并用橡皮筋固定。在 开始开花时用农杆菌浸润植物真空转化。为了培养农杆菌，5mL悬液在含有50 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的庆大霉素的 LB培养基中28°C培养过夜。在浸染前一天，将“种子培养物”分为4瓶，每瓶包括250mL补 充了 50 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的庆大霉素的LB培养基。这些培养物在28°C下培养 过夜。在检测600nm处吸光度(大约=1.0)的第二天早晨，通过离心收集细胞(5，000X g， GSA转子，室温，10分钟)，并且重悬于浸染培养基(蔗糖5%;Silwet-77 0.005%水溶液) 中以获得600nm处0. 8的光密度。将农杆菌悬液倒入烧杯中，并且将盆栽植物插入烧杯中使花和实(bolt)完全浸 润。将烧杯放置于大的玻璃钟罩中，并使用真空泵抽真空，直到茎表面的气泡形成以及溶液 开始轻微地产生气泡，然后迅速地释放真空。必要的时间和压力每个实验室间都有差异，但 是好的浸染是可以根据均勻的黑暗水浸组织很明显地判断出来。将盆从烧杯中移出，侧面 放置于塑料浅箱上，并且使用塑料圆顶覆盖，以保持湿度。第二天，不覆盖植物，直立放置， 在生长箱内使其生长大约四周，条件为连续光照，如Katavic等(1995)所描述。当果实成 熟并干燥后，收集种子并选择阳性转化子。实施例9 转化甘蓝型油菜转化基本上按照Moleney 等，1989，Plant Cell Reports 8 :238_242 描述的方法 执行。农杆菌菌株GV301/pMP90 (Koncz C. & Schell，J.，1986，Mol. Gen. Genet. 204 383-396)用于转化研究。从LB肉汤培养基(Difco，USA) (IOOmL)中收获稳定期细菌培养 物，重悬于IOmL新鲜的添加DMSO (二甲基亚砜)作为冷冻保护剂的LB肉汤培养基中。 每等分200 μ 1储存于-20°C，直到用于转化，将每等分加入到2mL包含2%蔗糖，50 μ M乙酰 丁香酮的脑、心脏浸剂肉汤(Difco，USA)中，pH5.6，并且在28°C培养过夜。细菌细胞密度 大约为每毫升IX IO9个细胞。子叶外植体暴露于包含植物转化载体的农杆菌中，按照Moloney等(1989) ,Plant Cell Rep.8 :238-242的方法进行。外植体的叶柄切面短暂地浸没在细菌培养物中。将外 植体插入到共培养基中使得切面与培养基接触。每张100X 15mm的培养皿上放置10个外 植体。共培养平板用STRTCHT’ N SEAL 塑料膜封口。平板在如上述的温度和光周期条件 下的培养箱中培养3天，使得种子萌发。随后将外植体转移到选择培养基上。在选择培养基上培养3到4周后，剪下再生的绿色芽(推定的转化体)，转移至新 鲜的选择培养基上继续培养。当芽达到1.5-2. Ocm长时，将其转移至生根培养基。推定的 转基因芽基本上按照Jefferson，R. A(1997)描述的方法进行gus基因扫描。有蓝色的染色 存在被认为是转化的证据。通过在卡那霉素上筛选、Southern杂交、PCR (聚合酶链式反应)以及后代分析来 确认转化体。实施例10 推定的转化体(转基因植物)的筛选以及转基因植物分析大量收获每个构建体的种子。种子用含有20%漂白剂以及0.01% Trion X-100 的溶液浸泡来进行表面消毒20分钟，随后用无菌水漂洗3次。室温条件下，无菌的种子重 新置于悬于灭菌的0. 植物琼脂中倒的平板(每500-1000种子约ImL植物琼脂)上，室温条件下，将包含2，000-4，000种子的体积置于150 X 15mm的卡那霉素选择平板上。平板 在冷的无光条件下培养两天，然后在可控环境下(22°C日光灯荧光灯(120 μ E ^nT2s-1)照射 16小时光照/8小时黑暗周期)生长7到10天。选择培养基包括1/2MSG培养基、0. 8%植 物琼脂、3%蔗糖，、50 μ g/mL卡那霉素和50 μ g/mL特美汀。培养皿和盖子用MicroporeTM 外科带(3M Canada, London, ON, Canada)封口。在7到10天后，对长出绿色叶子和在培养 基中有稳定根的药物抗性植株进行转化体鉴定，在3-5叶片阶段，筛选的转化体移栽到充 分湿润的土壤混合物的平面。转化体生长至成熟并从个体植株中收获产生的种子(T2代， 如Katavic等(1994)所定义)，进一步进行分析。从个体T1植物中分离基因组DNA。分别在T1转化体中使用PCR扩增来确认cDNA 或基因的存在。用Southern分析来选择包含单个拷贝片段插入的转化体。用限制性酶 酶切DNA样品，在的琼脂糖凝胶电泳上分离，用尼龙膜((Hybond-N+，Amersham)进行 Southern杂交。DGAT2 cDNA片段，用α -[32P] dCTP (NEN/DuPont)标记后用作探针。杂交在 60°C进行。杂交膜随后曝光于Kodak X-OMAT-AR胶片。参考文献Ausubel F. M. , R. Brent, R. Ε. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, and K. Stuhl,eds (1995). 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权利要求
一种分离或纯化的多肽，其包含与SEQ ID NO15具有至少90％的序列同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的分离或纯化的多肽，其特征在于，所述多肽与SEQID N0:1具 有至少90%的序列同一性。
3.根据权利要求1所述的分离或纯化的多肽，其特征在于，所述多肽具有二酰基甘油 酰基转移酶活性。
4.编码权利要求1中的分离或纯化的多肽的核酸序列。
5.根据权利要求4所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列位于载体上。
6.一种包含权利要求4中所述的核酸序列的转基因植物。
7.一种包含权利要求4中所述的核酸序列的转基因植物，其特征在于，所述植物种子 中与缺少该核酸序列的植物相比其多不饱和脂肪酸的水平发生了改变。
8.一种包含权利要求4中所述的核酸序列的转基因植物，其特征在于，所述植物中的 脂肪酸约超过70%为多不饱和脂肪酸。
9.一种用权利要求4中的核酸序列转化的酵母细胞。
10.一种改变植物中超长链多不饱和脂肪酸水平的方法，所述方法包括向植物中导入包括编码多肽的多核苷酸的核酸分子，所述多肽与选自SEQ ID NO=U 15、25、27、28、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59 和 61 中的多肽具有至少 90%的序列同一性。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述核酸构建体是通过农杆菌介导的 转化方法导入所述植物的。
12.根据权利要求10所述的方法，所述方法进一步包括向所述植物中导入编码具有 Brusica丙酮酸脱氢酶激酶活性多肽的多核苷酸。
13.根据权利要求10所述的方法，所述方法进一步包括导入编码具有二酰甘油乙酰 基转移酶活性多肽的多核苷酸。
14.根据权利要求10所述的方法，所述方法进一步包括导入编码具有3-磷酸-甘油 脱氢酶活性多肽的多核苷酸。
15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述植物选自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、 琉璃苣(Borago spp.)、加拿大油料(Canola)、蓖麻(Ricinus spp.)、可可 (Theobroma spp.)、玉蜀黍(Zea spp.)、禾帛(Gossypiumspp)、海甘蓝(Crambe spp.)、萼 巨花 (Cuphea spp.)、亚麻(Linum spp.)、雷斯克勒(Lesquerella spp.)、嫁油草(Limnanthes spp.)、亚麻突变株(Linola)、旱金莲(Tropaeolum spp.)、月见草(Oenothera spp.)、洋 橄榄(Olea spp.)、油棕(Elaeis spp.)、花生(Arachis spp.)、油菜籽(rapeseed)、红花 (Carthamus spp·)、大豆(Glycine spp·)、野生大豆(SoJa spp.)、向日葵(Helianthus spp·)、烟草(Nicotiana spp·)、斑鸡菊(Vernonia spp·)、小麦(Triticum spp·)、大麦 (Hordeum spp.)、禾@ (Oryza spp.)、燕麦(Avenaspp.)、高粱(Sorghum spp.)、黑麦(Secale spp.)、十字花科植物(Brassicaceae)，以及其它禾本科(Gramineae)植物。
16.一种根据权利要求10的方法生产的植物。
17.—种从根据权利要求10生产的植物中收获的种子。
18.从根据权利要求10生产的植物中提取的油。
19.根据权利要求10所述的方法，进一步包括从包括核酸构建体的植物收获种子；以 及从收获的种子中提取油类。
全文摘要
本发明公开内容涉及从藻类中分离、纯化以及鉴定一种二酰基甘油酰基转移酶2(DGAT2)，以及编码DGAT2的基因。DGAT2可以参与超长链的多不饱和脂肪酸向三酰基甘油转化的过程，且效率远高于DGAT1。本发明公开内容涉及使用DGAT2基因调节种子油含量，脂肪酸合成，以及脂肪酸组成的方法，还涉及了使用该基因转化的组织和植物。本发明公开内容还涉及了具有包含导入的本公开内容中的DNA序列的转基因植物，植物组织以及植物种子，以及生产所述植物及植物种子的方法。
文档编号C07K14/405GK101951755SQ200880121839
公开日2011年1月19日 申请日期2008年12月16日 优先权日2007年12月21日
发明者徐靖宇, 邹继涛, 郑志富 申请人:加拿大国家研究委员会;陶氏益农公司