抗cd20抗体的结晶的制作方法

专利名称：抗cd20抗体的结晶的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及结晶形式的抗⑶20抗体及涉及结晶的抗⑶20抗体纯化。
背景技术：
CD20 抗体利妥昔单抗(Rituximab) (RITUXAN )是一种针对CD20抗原的遗传工程嵌合鼠 /人单克隆抗体。利妥昔单抗就是1998年4月7日公告的美国专利No. 5，736，137 (Anderson et al.)中称作“C2B8”的抗体。利妥昔单抗指明用于治疗患有复发性或顽固性低级或滤 泡性CD20阳性B细胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。作用机制的体外研究表明利妥昔单抗 结合人补体并通过补体依赖性细胞毒性(⑶C)溶解淋巴样B细胞系(Reff et al.，Blood 83(2) :435-445(1994))。此外，它在抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)测定法中具有显 著活性。最近，利妥昔单抗显示出在氚化胸苷掺入测定法中具有抗增殖效应且直接诱导凋 亡，而其它抗 CD19 和抗 CD20 抗体不行(Maloney et al. , Blood 88(10) :637a(1996))。 在实验中还观察到利妥昔单抗与化疗和毒素之间的协同作用。具体而言，利妥昔单抗使 耐药性人B细胞淋巴瘤细胞系对多柔比星、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒蛋白的细胞毒 性效应敏感(Demidem et al.，CancerChemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3) 177-186(1997))。体内临床前研究显示了利妥昔单抗从猕猴的外周血、淋巴结、和骨髓消减 B细胞，可能是通过补体和细胞介导的过程(Reff et al. , Blood 83(2) =435-445(1994)) 实现的。2H7 (ocrelizumab)是针对人B细胞上⑶20表面抗原的第二代人源化单克隆抗体。 ocrelizumab当前在类风湿性关节炎(RA)治疗的III期临床试验中测试。关注CD20抗体的专利和专利出版物包括美国专利号5，776，456，5，736，137， 6，399，061，和 5，843，439，以及美国专利申请号 US 2002/0197255A1, US 2003/0021781A1, US 2003/0082172A1, US 2003/0095963A1, US2003/0147885A1 (Anderson et al.)；美国 专利号 6，455，043B1 和 W000/09160(Grillo-Lopez，Α.) ； W000/27428 (Gri Ilo-Lopez and White) ；W000/27433(Grillo-Lopez and Leonard) ；W000/44788(Braslawsky et al.)； W001/10462(Rastetter, W. ) ；W001/10461 (Rastetter and White) ；W001/10460(White andGrillo-Lopez)；美国申请号 US2002/0006404 和 W002/04021 (Hanna andHariharan)； 美国申请号 US2002/0012665A1 和 WOO1/74388 (Hanna，N.)；美国申请号 US 2002/0058029A1 (Hanna, N.)；美国申请号 US 2003/0103971A1 (Hariharan and Hanna)； 美国申请号 US2002/0009444A1，和 W001/80884(Grillo-Lopez，Α.) ；W001/97858 (White, C.)；美国申请号 US2002/0128488A1 和 W002/34790 (Reff, M.) ；W)02/060955 (Braslawsky et al. ) ；W02/096948 (Braslawsky et al. ) ；W002/079255 (Reff and Davies)；美国专利号 6，171，586B1，和W098/56418(Lam et al.) ；W098/58964(Raju,S.) ；W099/22764(Raju,S.)； W099/51642，美国专利号 6，194，551B1，美国专利号 6，242，195B1，美国专利号 6，528，624B1 和美国专利号 6，538，124 (Idusogie et al.) ；W000/42072 (Presta, L.) ；W000/67796 (Curd et al.) ；WOO1/03734 (Gri 1 Io-Lopez et al.)；美国申请号 US 2002/0004587A1 和W001/77342 (Miller and Presta)；美国申请号 US2002/0197256 (Grewal，I.)；美国申请 号 US 2003/0157108A1 (Presta, L.)；美国专利号 6，090，365B1，6，287，537B1，6，015，542， 5,843,398，和 5，595，721，(Kaminski et al.)；美国专利号 5，500，362，5，677，180， 5，721，108，和 6，120，767 (Robinson et al.)；美国专利号 6，410，391B1 (Raubitschek et al.)；美国专利号 6，224，866B1 和 W000/20864 (Barbera-Guillem，E.)； W001/13945(Barbera-Guillem, Ε.) ；W000/67795(Goldenberg)；美国 申请号 US2003/01339301A1 和 W000/74718(Goldenberg and Hansen) ；W000/76542(Golay et al.) ；W001/72333(ffolin and Rosenblatt)；美国专利号 6，368，596B1 (Ghetie et al.)； 美国申请号 US2002/0041847A1, (Goldenberg, D.)；美国申请号 US2003/0026801A1 (Weiner and Hartmann) ；W002/102312 (Engleman, E.)；美国专利申请号 2003/0068664 (Albitar et al. ) ；W003/002607 (Leung, S. ) ；W003/049694 禾口 US 2003/0185796A1(Wolin et al.) ；W003/061694(Sing andSiegall) ；US 2003/0219818A1(Bohen et al.)； US 2003/0219433A1 禾口 W003/068821 (Hansen et al. ), US 2006/0246004(Adams et al.)；美国专利号5，849，898和欧洲专利申请号330，191 (Seed et al.)；美国专利号 4，861，579 和 EP332, 865A2(Meyer and Weiss)；美国专利号 4，861，579 (Meyer et al.)和 W095/03770 (Bhat et al.)，通过述及明确将其每一篇收入本文。 关注使用利妥昔单抗的疗法的出版物包括Perotta and Abuel 〃 Responseof chronic relapsing ITP of IOyears duration to Rituximab " Abstract#3360Blood 10(1)(part 1-2) :p.88B(1998) ；Stashi et al. , “ Rituximab chimericanti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathicthrombocytopenic purpura “ Blood 98(4) 952-957 (2001) ；Matthews, R. “ MedicalHeretics “ New Scientist(7Apr. ,2001) ；Leandro et al. , " Clinical outcome in 22patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion " AnnRheum Dis 61 833-888 (2002) ；Leandro et al. , " Lymphocyte depletion inrheumatoid arthritis early evidence for safety, efficacy and dose response. 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Med. 349 (2) 125-138 (July 10,2003)报告了通过 DNA 微阵列序型分析鉴定 的急性肾同种异基因移植物排斥中的分子异质性。哺乳动物细胞培养物中的抗体牛产哺乳动物细胞已经成为生产用于临床应用的哺乳动物蛋白质的主要系统，主要是 由于它们生成正确折叠和装配的异源蛋白质的能力及它们翻译后修饰的能力。中国仓鼠卵 巢(CHO)细胞和自各种其它哺乳动物来源(诸如例如小鼠骨髓瘤(NSO)、幼仓鼠肾(BHK)、 人胚肾(HEK-293)和人肾细胞)获得的细胞系被管理机构批准用于生产生物药学产品，包 括治疗性抗体。在这些中，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是最常用的、常用于生产异源蛋白质的 工业宿主之一。如此，用于在CHO(包括二氢叶酸还原酶阴性(DHFR-) CHO细胞)中大规模 生产抗体的方法是本领域公知的(参见例如Trill et al. , Curr. Opin. Biotechnol. 6 (5) 553-60(1995))通常，为了开始生产周期，容许少量的经转化重组宿主细胞在培养物中生长几天。 一旦细胞进行了几轮复制，就将它们转移至更大的容器，在那里准备用它们进行发酵。用于 培养细胞的培养基及生产周期期间存在的氧、氮和二氧化碳的水平可能对生产过程有显著 影响。为每种细胞系具体确定培养参数，而且频繁地测量这些参数以确保最佳的生长和生 产条件。当细胞生长至足够数目时，将它们转移至大规模生产罐并培养更长的一段时间。 在该过程中的此点，可以收获重组蛋白。典型的是，将细胞改造成分泌多肽入细胞培养液 中，使得纯化过程的第一步是将细胞与培养液分开。收获通常包括离心和过滤以生成已收 获的细胞培养液(HCCF)。然后将培养液进行几个另外的纯化步骤，除去任何细胞碎屑、不想 要的蛋白质、盐、矿物或其它不想要的成分。在纯化过程结束时，重组蛋白是高度纯的，而且 是适合于人治疗性用途的。虽然在过去的几十年里对此过程进行了许多研究和改进，但是重组蛋白(诸如抗 体)的生产仍然是困难重重。纯化步骤常常费时、昂贵、及引入别的问题。当前自制造细胞 培养物提高抗体滴度，抗体的纯化现在需要大小笨重的层析柱和大量的昂贵的层析树脂。 使用蛋白A亲和层析柱自CHO细胞培养物除去CHO宿主细胞蛋白质(CHOP)已知涉及蛋白A 浸出(leach)，而且需要另一个纯化步骤来除去浸出的蛋白A。另外，多肽(诸如抗体)的大 规模生产需要使用和操作大体积，这增加费用，而且常常使之难以实现满意的滴度。如此， 需要用于大规模纯化重组多肽(诸如抗体)的改良方法。鉴于它们已确立的治疗重要性， 会特别想要提供用于纯化CD20抗体的改良工艺，会容许减少纯化工艺步骤的数目，同时维 持与使用多个层析纯化步骤的传统纯化方案相当的收率。关于使用结晶作为异源蛋白质纯化工艺一部分的报告有限。美国申请公开文本 No. 2006/0009387报告了 Apo2L/TRAIL蛋白显示在某些条件下自发结晶的趋势，而且基于 此发现描述了用于纯化Apo2L/TRAIL的方法，包括结晶步骤。发明概述
本发明至少部分基于令人惊讶的发现，即虽然抗体(尤其是全长抗体)传统上难 以结晶，但是CD20抗体能成功地自哺乳动物细胞培养物的已收获的细胞培养液(HCCF)结 晶。具体而言，本发明包括容许自HCCF形成⑶20抗体晶体(包括巨大的、均勻的⑶20抗 体晶体)的条件的鉴定。因而，本发明提供一种用于自哺乳动物细胞培养物纯化CD20抗体 的工艺，包括纯化方案中的结晶步骤。在CD20抗体纯化方案中掺入结晶步骤消除层析步骤 及它们内在的可扩缩性限制(inherent limits of scalability)，同时维持与使用多个层 析纯化步骤、没有结晶的传统纯化方案相当的收率。因而，将结晶引入纯化工艺导致显著地 节约时间和成本，且不损害效率、产物收率或产物质量。一方面，本发明关注一种自混合物纯化⑶20抗体的方法，包括使⑶20抗体结晶并 自混合物回收结晶的⑶20抗体。另一方面，本发明关注一种自混合物纯化⑶20抗体的方法，包括下述步骤(a)使 ⑶20抗体结晶以生成⑶20抗体晶体，(b)溶解⑶20抗体晶体以获得⑶20抗体溶液，(d) 将CD20抗体溶液进行阴离子交换柱纯化，并(e)分离所述CD20抗体。混合物可以是任何包含⑶20抗体的混合物，诸如任何在⑶20抗体重组生成期间 自任何真核或原核宿主细胞获得的组合物。在一个具体的实施方案中，混合物是来自哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞)的已收获的细胞培养液(HCCF)；可以浓缩HCCF使其浓度超出生物反应器时的 初始浓度。在另一个实施方案中，纯化是在没有蛋白A纯化步骤的情况中实施的。在还有一个实施方案中，纯化是在没有阳离子交换层析步骤的情况中实施的。在又一个实施方案中，纯化是在没有蛋白A纯化步骤和阳离子交换层析步骤二者 的情况中实施的。在另一个实施方案中，纯化方案包括病毒过滤步骤和阴离子交换层析步骤，它们 优选在结晶纯化步骤后采用。在另一个实施方案中，本发明的纯化方法由下述步骤组成或基本上由下述步骤组 成(a)自浓缩的HCCF结晶CD20抗体，(b)在缓冲液中溶解CD20晶体，(c)使获得的溶液 通过阴离子交换柱，并(d)浓缩离开所述阴离子交换柱的洗脱液。在所有实施方案中，CD20抗体可以是任何诊断性或治疗性CD20抗体，包括但 不限于利妥昔单抗(RITUXAN )、人源化抗CD20抗体包括人源化2H7和2H7变体、 HuMaX-CD20 (Genmab)、IMMU-106(也称作 veItuzumab 或 hA20 ； Immunomedics)。单克隆抗体 是优选的，其可以是嵌合的、人源化的或人的。在所有方面，术语CD20 “抗体”或“CD20结 合抗体”具体包括全长CD20结合抗体，及其抗原结合片段诸如Fab或F(ab’)2。如此，本文 中具体包括用于使CD20结合抗体及其变体结晶的方法。例如，⑶20抗体可以选自下组表1中列举的2H7⑶20抗体变体A-L·在一个特 别的实施方案中，⑶20抗体选自下组表1中列举的2H7⑶20抗体变体A、C和H，分别具有 VL 禾口 VH 对 SEQ ID NO :1 禾口 2 ；SEQ ID NO 3 禾口 4 ；禾口 SEQ ID NO 3 禾口 5。在一个不同的方面，本发明关注自哺乳动物细胞的浓缩的已收获的细胞培养液 (HCCF)纯化⑶20抗体的方法，包括下述步骤(a)浓缩HCCF，(b)在抑制结晶的pH渗滤具有 高盐浓度的HCCF，(c)通过提高pH使⑶20抗体结晶，(d)溶解⑶20抗体晶体以获得⑶20抗体溶液，(e)将CD20抗体溶液进行阴离子交换柱纯化，并(f)回收所得纯化的CD20抗体。如上所述，例示性的⑶20抗体可以选自下组表1中列举的2H7⑶20抗体变体 A-I。在一个特别的实施方案中，⑶20抗体选自下组表1中列举的2H7⑶20抗体变体A、C 禾口 H，分别具有 VL 禾口 VH 对 SEQ ID NO :1 禾口 2 ；SEQ IDNO 3 禾口 4 ；禾口 SEQ ID NO 3 禾口 5。另一方面，本发明的方法关注包含⑶20结合序列的抗体样分子(诸如包含IgG Fc 区的⑶20结合免疫粘附素)的结晶和纯化。在一个实施方案中，⑶20结合免疫粘附素包 含人源化2H7抗体或其表1所述变体之一的可变区。在所有使用HCCF作为起始混合物的实施方案中，可以浓缩HCCF，使得⑶20抗体浓 度为最少约1. 5mg/ml。约15mg/ml的⑶20抗体浓度提供优良的抗体晶体收率及CHOP (CH0 细胞蛋白质)清除，但是我们已经能够在低至1. 5mg/ml的浓度获得CD20结合抗体的结晶。在所有实施方案中，结晶可以在宽范围的pH中实施，例如约6. 0至约8. 0的或 7. 8+/-0. 2 的 pH。结晶可以在宽的温度范围中实施，诸如例如在约4°C至约40°C的温度，例如在约 37 °C的温度。结晶可以由一种或多种沉淀剂诱导，诸如一种或多种选自下组的沉淀剂PBS、 NaCUNa2SO4, KCUK2SO4, Na2HPO4JP KH2PO4,特别是 ΚΗ2Ρ04。结晶更容易在较高的蛋白质浓度实现，但是出于实践原因，HCCF不浓缩至极大的 程度。另一方面，本发明关注CD20抗体的晶体。晶体可以以不同形状存在，包括但不限 于微针、针、球状或球状花生形晶体，其可以单独存在或在有或无无定形的非结晶沉淀物情 况下以各种混合物的形式存在。另一方面，本发明关注一种组合物，其包含⑶20结合抗体晶体。组合物可以例如 是药物组合物，包含一种或多种药学可接受赋形剂。本发明进一步关注用于治疗B细胞恶性肿瘤或自身免疫病的方法，包括对哺乳 动物受试者施用有效量的通过本发明方法纯化的CD20抗体。在具体的实施方案中，自身 免疫病选自下组类风湿性关节炎和幼年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)包 括狼疮肾炎、韦格纳氏病(Wegener’ s disease)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板 减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬 化、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、ANCA相关血管炎、糖尿病、雷诺氏综合 征(Reynaud，s syndrome)、斯耶格兰氏综合征(Sjogren，s syndrome)、和视神经脊髓炎 (NMO)。根据下文提供的实施例，这些和其它实施方案会是显而易见的。附图简述

图1是如实施例1中所述，在37°C含有150mg/ml 2H7抗体的药物产品透析入装有 20X PBS的烧杯中获得沉淀物的观察结果的显微镜视图。图2是如实施例2中所述，在24°C自含有6mg/ml 2H7和IOX PBS的溶液生长的大 的“干草堆” 2H7抗体晶体的显微镜视图。图3是如实施例2所述，在37°C自含有37. 5mg/ml 2H7和IOX PBS的溶液生长的 针型和球状2H7抗体晶体的显微镜视图。
图4是如实施例2中所述，在4°C自含有5mg/ml 2H7和IPBS的溶液获得的细针 2H7抗体晶体的显微镜视图。图5是如实施例3中所述，在37°C自含有37. 5mg/ml 2H7和IOX PBS的溶液生长 的大的圆球形和针形2H7抗体晶体的显微镜视图。图6是如实施例3中所述，在37°C自含有5mg/ml 2H7和IOX PBS的溶液获得的细 针形2H7抗体晶体的显微镜视图。图7是如实施例3中所述，在37°C自含有75mg/ml 2H7和300mM Na2HPO4的溶液 生长的微针2H7抗体晶体的显微镜视图。图8是如实施例3中所述，在37 °C自含有17. 5mg/ml 2H7和500mM KH2PO4的溶液 获得的大的球状和花生形2H7抗体晶体的显微镜视图。图9是如实施例3中所述，在37 °C自含有37. 5mg/ml 2H7和500mM KH2PO4的溶液 生长的球状花生形2H7抗体晶体的显微镜视图。图10A-H显示了在存在(A、C、E、G)和缺乏(B、D、F、H) Tween/海藻糖的情况中，使 用IOX PBS作为沉淀剂，自含有75mg/ml、37. 5mg/ml、17. 5mg/ml或5mg/ml 2H7的浓缩溶液 沉淀的2H7抗体晶体的显微镜视图，该浓缩溶液是自经Q-S^harose层析步骤运行的条件 化2H7集合获得的(下文称作“Q集合(Q-pool)，，)。图IlA-C显示了在存在(A、B、D)或缺乏(C、E)Tween/海藻糖的情况中，使用IM KH2PO4作为沉淀剂，自含有75mg/ml、37. 5mg/ml、或17. 5mg/ml2H7的Q集合获得的2H7抗体 晶体的显微镜视图。图12A-B以图汇总了海藻糖和Tween对结晶效率的影响。图 13A-H 显示了在分别存在 IOX PBS、15X PBS、500mM KH2PO4、和 750mM KH2PO4W 情况中，自含有15. 5mg/ml 2H7的已收获的细胞培养液(HCCF)获得的2H7抗体晶体的显微 镜视图，使用含有15. 5mg/ml 2H7的Q集合作为对照。图14是HCCF结晶效率的pH依赖性的图示，使用500mM KH2PO4作为沉淀剂。2H7 浓度自3mg/ml至15. 5mg/ml变化。图15显示了 1小时和18小时时37°C的HCCF溶解度曲线。图16显示了 1小时和18小时时24°C的HCCF溶解度曲线。图17显示了 1小时和18小时时4°C的HCCF溶解度曲线。发明详述A.定义术语“抗体”以最广义使用，明确涵盖单克隆抗体(包括全长的或完整的单克隆抗 体)、多克隆抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗 体)、及抗体片段(见下文)，只要它们展现出期望的生物学活性。“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合位点，如此 保留了与抗原结合的能力。此定义所涵盖的抗体片段的例子包括(i)Fab片段，其具有 VL、CL、VH和CHl结构域；(ii)Fab ‘片段，其是在CHl结构域的C-末端具有一个或多个 半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CHl结构域；(iv)Fd'片段，其具有 VH和CHl结构域及CHl结构域C-末端的一个或多个半胱氨酸残基；(v) Fv片段，其具有抗 体单臂的 VL 和 VH 结构域；(vi) dAb 片段(Ward et al.，Nature 341 :544_546 (1989))，其由VH结构域组成；(vii)分离的⑶R区；(viii)F(ab' )2片段，即包含通过铰链区的二硫 桥相连的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv ;SCFv) (Bird et al. ， Science 242 :423_426(1988)和 Huston et al. ， PNAS(USA)85 :5879_5883(1988))； (x) “双抗体”，其具有两个抗原结合位点，包含在同一条多肽链中相连的重链可变域(VH) 和轻链可变域(VL)(参见例如 ΕΡ404, 097 ;W0 93/11161 ；和 Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 =6444-6448(1993)) ； (xi) “线性抗体”，其包含一对串联的 Fd 区段 (VH-CH1-VH-CH1)，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata etal.，Protein Eng. 8(10) 1057-1062 (1995)和美国专利 5，641，870)。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成 群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在的可能突变(例如天然存在突变)夕卜。 如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同抗体混合物的特征。单克隆抗体是针对单一抗原 高度特异性的。在某些实施方案中，单克隆抗体典型地包括包含能结合靶物的多肽序列的 抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在 内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆(诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组 DNA克隆的集合)中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如 为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其 在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本 发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备 物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性之外，单克隆抗体制备 物的优点还在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求 通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来 生成，包括例如杂交瘤法(例如 Kohler and Milstein, Nature 256:495—97(1975) ；Hongo et al. , Hybridoma,14 (3) :253_260 (1995) ；Harlow et al. , Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2nd ed. 1988 ；Hammerling et al., 于Monoclonal Antibodies and T-CelIHybridomas, 563-681, Elsevier, N. Y. ,1981)> 重组DNA法(参见例如美国专利No. 4，816，567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al. , Nature 352:624-628(1991) ；Marks et al. , J. Mol. Biol. 222 581-597 (1991) Sidhu et al. , J. Mol. Biol. 338(2) :299_310 (2004) ；Lee et al. , J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093(2004) ；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34) 12467-12472(2004) 及 Lee et al. , J. Immunol. Methods 284(1-2) :119_132(2004))、及用于在具有部分或 整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体 的技术(参见例如 WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ；WO 1996/33735 ；W01991/10741 ； Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551(1993) ；Jakobovits et al., Nature 362:255-258(1993) ；Bruggemann et al. , Year inlmmuno. 7 :33 (1993)；美国专 利 No. 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，661，016 ；Marks et al.，Bio/Technology 10 :779_783 (1992) ；Lonberget al.，Nature 368 :856_859(1994)； Morrison, Nature 368 812-813(1994) ；Fishwild et al. , Nature Biotechnol. 14 845-851(1996) ；Neuberger, NatureBiotechnol. 14 826(1996)；及 Lonberg and Huszar,Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93(1995))。单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生 自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分 与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类 抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No. 4，816，567和Morrison et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851_6855 (1984))。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白 的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变 区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、家兔 或非人灵长类动物)的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白 的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在 供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言， 人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有 高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的 FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的 恒定区。更多细节参见 Jones et al.，Nature321 :522_525 (1986) ；Riechmann et al.， Nature 332 :323_329 (1988)；及 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992)。还可 参见例如 Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115 (1998)； Harris, Biochem. Soc. Transactions 23 1035-1038(1995) ；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 :428_433 (1994)；及美国专利 No. 6，982，321 和 7，087，409。还可参见 van Dijkand van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol.，5 :368_74 (2001)。人抗体可以如下制备， 即将抗原施用于转基因动物，其经修饰而应答抗原挑战生成此类抗体，但是其内源基因座 已经失去能力，例如经免疫的异种移植小鼠(xenomice)(参见例如美国专利No. 6，075，181 和 6，150，584，关于 XEN0M0USE 技术)。还可参见例如 Li et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 =3557-3562 (2006)，关于经人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体。“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本 文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人 抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个实施方 案中，人抗体是从噬菌体文库选择的，该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan et al.，Nature Biotechnology 14:309-314(1996) ；Sheets et al.，PNAS(USA)95 :6157_6162(1998)； Hoogenboom andffinter, J. Mol. Biol. 227 381 (1991) ；Marks et al. , J. Mol. Biol. 222 581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球蛋白基因已经部分或 完全灭活的转基因动物(例如小鼠)来生成。在受到攻击时，观察到人抗体生成，它在所有 方面与在人体中看到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体全集。这种方法记载于例如美 国专利 No. 5，545,807 ；5，545,806 ；5，569,825 ；5, 625, 126 ；5，633，425 ；5，661，016，及以下 科学出版物Marks et al. ,Bio/Technology 10:779-783(1992) ；Lonberg et al. ,Nature 368 856-859(1994) ；Morrison, Nature 368 812-13(1994) ；Fishwild et al. , Nature BiotechnologyH 845-51 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996)； Lonberg andHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93 (1995)。或者，人抗体可通过生成针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可从个体回收，或者 可在体夕卜免疫)。参见例如 Cole et al. , Monoclonal Antibodies andCancer Therapy, Alan R. Liss，p. 77(1985) ；Boerner et al. ,J. Immunol. 147(1) :86_95(1991)；及美国专利 No. 5，750，373。术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗 体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均勻分布于抗体的整个可变域。 它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中较高度保守的部分称作框 架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过 形成环状连接且在有些情况中形成折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的 高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合 位点的形成(参见 Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版，Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,MD. (1991))。 恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性 细胞的细胞毒性中的参与。术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残 基。例如，术语高变区指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。 通常，抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗 体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异 性中发挥独特作用。参见例如 Xu et al. Immunity 13:37-45(2000) Johnson and Wu 于 Methods in Molecular Biology 248 :l-25(Lo,ed. ,Human Press，Totowa，NJ，2003) 。·实 上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如 Hamers-Casterman et al. Nature 363 446-448(1993) ；Sheriff et al. Nature Struct. Biol. 3 733-736(1996)。本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(OTR)是以序列变异性 为基石出的，而且是最常用的(Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th E d. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改为指结构环的位置(Chothia and LeskJ. Mol. Biol. 196 901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触” HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分 析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。环KabatAbMChothia接触
LlL24-L34L24--L34L26-L32L30-L36
L2L50-L56L50--L56L50-L52L46-L55
L3L89-L97L89--L97L91-L96L89-L96
HlH31-H35BH26--H35BH26-H32H30-H35B (Kabat 编号方式)
HlH31-H35H26--H35H26-H32H30-H35(Chothia编号方式)
H2 H50-H65H50-H58H53-H55H47-H58H3 H95-H102 H95-H102H96-H101H93-H101HVR 可包括如下“延伸的 HVR" :VL 中的 24-36 或 24-34 (Li)、46-56 或 50-56 (L2) 和 89-97 或 89-96 (L3)及 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或 95-102 (H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。“框架区”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基之外的那些残基。术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式” 及其变化形式指Kabat et al.，见上文中的用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号 系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域 FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照 Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和 82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准” Kabat编号序列对 比同源区来确定。贯穿本说明书和权利要求书，Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大 约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat et al.，Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。“EU编号系统”或“EU索引” 一般在提及免疫球蛋白重链 恒定区中的残基时使用(例如 Kabat et al. ,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)中报道的EU索引，明确收入本文作为参考)。除非本文中另有说明，提及抗体可 变域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及 抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式(例如参见美国临时申请 No. 60/640，323，EU编号方式的图)。根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫 球蛋白有五大类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如 IgGJ包括非A和A同种异型)、IgG2, IgG3、IgG4, IgA1和IgA20将与不同类的免疫球蛋白 对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、Y和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维 构造是众所周知的，一般性记载于例如Abbas et al. ,Cellular and Mol. Immunology,4th ed. (W. B. Saunders, Co.，2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共 价结合而形成的更大融合分子的一部分。术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，其可以是通过木瓜蛋白酶消化完 整抗体生成的。Fc区可以是天然序列Fc区或变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边 界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为Fc区自大约Cys226位置或大约Pro230位 置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统) 可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工 程改造。因而，完整抗体的组合物可包括所有K447残基都被消除的抗体群、无一 K447残基 被消除的抗体群或者混合了有和无K447残基的抗体的抗体群。免疫球蛋白的Fc区一般包 含两个恒定域，即CH2结构域和CH3结构域，任选包含CH4结构域。除非本文另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabat et al.，见上文中的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgGlEU抗体的残基编号方式 人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“Cg2”结构域)通常自约第231位氨基酸 残基延伸至约第340位氨基酸残基。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密 配对。而是，有两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构 域之间。推测碳水化合物可能提供结构域_结构域配对的替代且有助于稳定CH2结构域。 Burton, Molec. Immunol. 22 161-206 (1985)。CH2结构域在本文中可以是天然序列CH2结 构域或变异CH2结构域。"CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C端的一段残基(即自IgG的约第341位氨 基酸残基至约第447位氨基酸残基)。CH3区在本文中可以是天然序列CH3结构域或变异 CH3结构域(例如在其一条链中具有引入的“隆起”(protroberance)而在其另一条链中具 有相应引入的“空腔” (cavity)的CH3结构域；参见美国专利No. 5，821，333，明确收入本文 作为参考)。此类变异CH3结构域可用于生成本文所述多特异性(例如双特异性)抗体。“铰链区”通常定义为自人IgGl的约Glu216或约Cys226至约Pro230的区段 (Burton, Molec. Immunol. 22 161-206 (1985))。其它IgG同种型的铰链区可以通过将第一 个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgGl序列对比。铰链 区在本文中可以是天然序列铰链区或变异铰链区。变异铰链区的两条多肽链通常每条多 肽链保留至少一个半胱氨酸残基，使得变异铰链区的两条多肽链可在两条链之间形成二硫 键。本文中优选的铰链区是天然序列人铰链区，例如天然序列人IgGl铰链区。“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的至少一项“效应器功能”。例示性的“效应器 功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细 胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能 一般要求Fc区与结合域(例如抗体可变域)结合，而且可使用本领域已知的用于评估此类 抗体效应器功能的多种测定法来评估。“完整”抗体指包含抗原结合可变区以及轻链恒定域(CJ和重链恒定域Ch1、Ch2和 Ch3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变 体。优选的是，完整抗体具有一项或多项效应器功能。“亲本抗体”或“野生型”抗体指包含如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列与本 文所公开的抗体变体相比缺少一处或多处氨基酸序列改变。如此，亲本抗体一般具有至少 一个如下高变区，所述高变区在氨基酸序列方面与本文所公开的抗体变体的相应高变区的 氨基酸序列不同。亲本多肽可包含天然序列(即天然存在的)抗体(包括天然存在的等位 变体)或具有天然存在序列的预先存在的氨基酸序列修饰(诸如插入、删除和/或其它改 变)的抗体。贯穿本公开内容，“野生型”、“WT”、“wt”、和“亲本”抗体可互换使用。在用于本文时，“抗体变体”或“变体抗体”指具有如下氨基酸序列的抗体，所述氨 基酸序列与亲本抗体的氨基酸序列不同。在某些实施方案中，抗体变体会具有如下的氨基 酸序列，所述氨基酸序列与亲本抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有约75%至少 于100%，更优选约80%至少于100%，更优选约85%至少于100%，更优选约90%至少于 100%，和最优选约95%至少于100%的氨基酸序列同一性或相似性。抗体变体一般是在其 一个或多个高变区中或附近包含一处或多处氨基酸改变的抗体。“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，变异Fc区具有与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比至少 一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨 基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区 中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。典型的是，变异Fc 区在本文中将与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80%序列同一性，或至 少约90%序列同一性，或至少约95%或更多序列同一性。抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体 Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合和补 体依赖性细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作 用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞 (例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型 Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶 细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达Fc y RIII，而单核细胞表达 Fc γ RI、Fc YRII 禾口 Fc YRIII0 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 457-92 (1991) 第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行 体外ADCC测定法，诸如美国专利No. 5，500, 362或5，821，337中所记载的。可用于此类测 定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在 体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS (USA) 95 652-656(1998)中所披露的。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径 的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合抗体(适宜亚类的)起始的，该抗体已结合至 其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202 :163 (1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列(具 有变异Fc区的多肽)及提高或降低的Clq结合能力的多肽变体记载于例如美国专利 No. 6，194，551B1 和 W01999/51642。还可参见例如 Idusogie et al. , J. Immunol. 164 4178-4184(2000)。“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该 抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案， 亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体 可通过本领域已知规程来生成。Markset al. ,Bio/Technology 10 :779_783 (1992)记载了 通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了 CDR和/或框架残基的随机诱 ^ =Barbas et al. ，Proc.Nat. Acad. Sci. USA 91 3809-3813(1994) ；Schier et al. ，Gene 169 147-155(1995) ；Yelton et al.，J. Immunol. 155 1994-2004(1995) Jackson et al.， J. Immunol. 154(7) :3310_9 (1995)；及 Hawkins et al.，J. Mol. Biol. 226 :889_896 (1992)。术语“治疗性抗体”指在疾病治疗中使用的抗体。治疗性抗体可具有各种作用机 制。治疗性抗体可结合并中和与抗原有关的靶物的正常功能。例如，阻断癌细胞存活所需要 的蛋白质的活性的单克隆抗体引起细胞死亡。另一种治疗性单克隆抗体可结合并活化与抗 原有关的靶物的正常功能。例如，单克隆抗体能结合细胞上的蛋白质并触发凋亡信号。又一种单克隆抗体可结合只在患病组织上表达的靶抗原；给单克隆抗体偶联毒性净荷(有效 药剂)(诸如化疗剂或放射性药剂)能创建向患病组织特异性投递毒性净荷的药剂，降低对 健康组织的损害。治疗性抗体的“生物学功能性片段”会展现至少一项(如果不是一些或 所有的话)归于完整抗体的生物学功能，该功能至少包含特异性结合靶抗原。“纯化的”意味着分子以至少80-90% (以包含它的样品的重量计)的浓度存在于 样品中。纯化的蛋白质(包括抗体)优选是基本上纯的且期望是基本上同质的(即不含污 染性蛋白质等)。“基本上纯的”蛋白质意味着基于组合物的总重量，蛋白质组合物包含至少约90% (以重量计)、优选至少约95% (以重量计)的蛋白质。“基本上同质的”蛋白质意味着基于组合物的总重量，蛋白质组合物包含至少约 99% (以重量计)的蛋白质。术语“贮藏稳定的”用于描述具有商业销售过程中产品可接受的保存期的配制剂， 例如给定温度至少12个月，和优选给定温度至少24个月。任选的是，此类贮藏稳定的配 制剂含有不超过5%的聚集物、不超过10%的二聚体、和/或电荷异质性或生物学活性的极 少变化。蛋白质降解途径可涉及化学不稳定性(即任何涉及通过键形成或切割来修饰蛋白 质，从而产生新化学实体的过程)或物理不稳定性(即蛋白质高级结构的变化)。化学不 稳定性可源自例如脱酰胺、外消旋、水解、氧化、β -消除或二硫化物交换。物理不稳定性可 源自例如变性、聚集、沉淀或吸附。三种最常见的蛋白质降解途径是蛋白质聚集、脱酰胺和 氧化。Cleland et al. Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems 10(4) 307-377(1993)。如本文中所使用的，“可溶的”指根据目测检查的评估，多肽在水溶液中时完全溶 解，产生清澈至略微乳色的溶液，没有可见的微粒。溶液浊度(或蛋白质溶解度)的另一项 测定法可以用Icm通路长度的室通过测量340nm至360nm处的UV吸光度来进行，其中20mg/ ml时的浊度小于0. 05个吸光度单位。“防腐剂”能起阻止细菌、病毒、和真菌在配制剂中繁殖的作用，而抗氧化剂或其它 化合物能以各种方式发挥功能来保持配制剂的稳定性。例子包括十八烷基二甲基苯甲基铵 氯化物、氯己双胺、苯扎氯铵(烃基苯甲基二甲基铵氯化物的混合物，其中烃基是长链化合 物)、和苄索氯铵。其它类型的化合物包括芳香族醇(诸如酚和苯甲醇)、对羟基苯甲酸烃 基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯)、和间甲酚。任选的是，此类化合物是酚或苯甲醇。 防腐剂或其它化合物会任选包括在液体或含水形式的CD20抗体配制剂中，但是通常不包 括在冻干形式的配制剂中。在后一种情况中，防腐剂或其它化合物通常会存在于用于重建 的注射用水(WFI)或注射用抑菌水(BWFI)中。“表面活性剂”能起降低浊度或配制剂中蛋白质变性的作用。表面活性剂的例子包 括非离子型表面活性剂诸如聚山梨酯例如聚山梨酯20、60、或80，泊洛沙姆(poloxamer)例 如泊洛沙姆碘184或188，PlUronic多元醇，乙烯/丙烯嵌段聚合物或本领域知道的任何其 它的。抗体的“生物学功能性片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分保留该部分 存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、多至大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体的生物学功能性片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在 另一个实施方案中，抗体的生物学功能性片段(例如包含Fc区的)保留通常与Fc区存在 于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、 ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体的生物学功能性片段是体内半衰期与完整 抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体的生物学功能性片段可包含抗原结合臂且 其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然 环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和 其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如 Lowry法的测定，抗体重量超过95%，而在有些实施方案中，重量超过99%，(2)足以通过使 用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据 还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体 天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分 离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。术语“蛋白A”和“ProA”在本文中可互换使用，涵盖自其天然来源回收的蛋白A、 合成生成的蛋白A(例如通过肽合成或通过重组技术)、及其保留结合具有Ch2/Ch3区(诸如 Fc区)的蛋白质的能力的变体。蛋白A可购自R印ligen、Pharmacia和Fermatech。蛋白 A 一般固定化在固相支持材料上。术语“蛋白A”还指含有对其共价附着蛋白A的层析固体 支持基质的亲和层析树脂或柱。术语“层析”指根据混合物中的各种溶质在流动相的影响下或在结合和洗脱过程 中穿过静止的介质迁移的速率的差异，将混合物中的感兴趣溶质与混合物中的其它溶质分 开的过程。术语“亲和层析”和“蛋白质层析”在本文中可互换使用，指其中感兴趣蛋白质或感 兴趣抗体可逆地且特异性地结合至生物特异性配体的蛋白质分离技术。优选的是，所述生 物特异性配体共价附着至层析固相材料且在溶液接触层析固相材料时是溶液中的感兴趣 蛋白质可及的。在层析步骤期间，所述感兴趣蛋白质(例如抗体、酶、或受体蛋白质)保留 其对生物特异性配体(例如抗原、底物、辅因子、或激素)的特异性结合亲和力，而混合物中 的其它溶质和/或蛋白质没有可观地或特异性地结合配体。感兴趣蛋白质对固定化配体的 结合容许污染性蛋白质或蛋白质杂质流过层析介质而感兴趣蛋白质保持特异性结合至固 相材料上的固定化配体。然后，特异性结合的感兴趣蛋白质用低pH、高PH、高盐、竞争性配 体、等等以活性形式自固定化配体消除，并随洗脱缓冲液流过层析柱，不含早先容许流过柱 的污染性蛋白质或蛋白质杂质。任何成分都能用作用于纯化其相应特异性结合蛋白质(例 如抗体)的配体。术语“非亲和层析”和“非亲和纯化”指其中不利用亲和层析的纯化过程。非亲和 层析包括依赖感兴趣分子(诸如蛋白质，例如抗体)与固相基质之间的非特异性相互作用 的层析技术。“阳离子交换树脂”指如下的固相，其带负电荷且因此有游离阳离子供与流过该 固相的水溶液中的阳离子交换。附着至固相以形成阳离子交换树脂的、带负电荷的配体可 以是例如羧酸根或磺酸根。商品化的阳离子交换树脂包括羧甲基纤维素、在琼脂糖上固定化的磺丙基(SP)(例如 GE Healthcare 的 SP-SEPHAROSE FAST FLOW 或 SP-SEPHAR0SE HIGHPERFORMANCE )和固定化在琼脂糖上的磺酰基(例如GE Healthcare的S-SEPHAR0SE FAST FLOW )。“混合模式离子交换树脂”指经阳离子、阴离子、和疏性模块共价修饰的固相。 商品化的混合模式离子交换树脂是BAKERBOND ABX (J. Τ. Baker, Phillipsburg, NJ)，其含 有附着至硅胶固相支持介质的弱阳离子交换基团、低浓度阴离子交换基团、和疏水性配体。术语“阴离子交换树脂”在本文中用于指带正电荷的固相，例如具有附着于它的一 个或多个带正电荷的配体，诸如季氨基团。商品化的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、QAE Sephadexb^pq SEPHAR0SEtm FastFloKge Healthcare)。“缓冲液”指通过其酸-碱成对成分的作用来抵抗PH变化的溶液。Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D.，ed. Calbiochem Corporation (1975)中记载了取决于例如期望的缓冲液pH而可采用的 多种缓冲液。在一个实施方案中，所述缓冲液具有约2至约9、或者约3至约8、或者约4至 约7、或者约5至约7范围内的pH。会将pH控制在此范围内的缓冲液的例示性例子包括 MES、M0PS、M0PS0、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、和铵缓冲液，以及这些 缓冲液的组合。“加载缓冲液”指用于将包含感兴趣多肽分子和一种或多种杂质的组合物加载到 离子交换树脂上的缓冲液。加载缓冲液具有如下的电导率和/或PH，其使得感兴趣多肽分 子(和一般一种或多种杂质)结合至离子交换树脂或使得感兴趣蛋白质流过柱而杂质结合 至树脂。“中间缓冲液”指用于在洗脱感兴趣多肽分子之前自离子交换树脂洗脱一种或多 种杂质的缓冲液。中间缓冲液的电导率和/或PH使得一种或多种杂质自离子交换树脂洗 脱，但不洗脱显著量的感兴趣多肽。术语“清洗缓冲液”在本文中使用时指用于在洗脱感兴趣多肽分子之前清洗或再 平衡离子交换树脂的缓冲液。方便的是，清洗缓冲液和加载缓冲液可以是相同的，但这不是 必须的。“洗脱缓冲液”用于自固相洗脱感兴趣多肽。洗脱缓冲液的电导率和/或pH使得 感兴趣多肽自离子交换树脂洗脱。“再生缓冲液”可用于再生离子交换树脂，使得它能再使用。再生缓冲液具有自离 子交换树脂清除基本上所有杂质和感兴趣多肽所要求的电导率和/或PH。短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值(例如，一个涉 及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的相似程度，以致本领域技术 人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异 具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值 之间的差异例如小于约50%，小于约40%，小于约30%，小于约20%，和/或小于约10%。术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类 载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA。另一类载体是噬菌体载体。 另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在 其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物 载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因 表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA 技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因 为质粒是载体的最常用形式。关于参照多肽序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必 要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一 部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定 百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用 公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领 域技术人员可决定用于对比序列的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的 任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序 ALIGN-2生成的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，而且源代码已经连 同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office, Washington D. C.，20559)，并 以美国版权注册号TXU510087注册。公众可以自Genentech公司(South San Francisco, California)获取ALIGN-2程序，或者可以自源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX 操作系统(优选数码UNIX V4. 0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、 与(with)或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具 有或包含相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序 列A)如下计算分数X/Y 乘 100其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨 基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基 酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨 基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依 照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。“治疗”或“处理”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者 包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。“治疗”或“处理”在本文中涵盖缓 解疾病和缓解特定疾病的征候和症状。为了治疗目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，非人高等灵长类， 其它脊椎动物，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。优选的是，哺 乳动物指人。B.用于实施本发明的例示性方法和材料本发明提供CD20抗体晶体及用于回收和纯化CD20抗体的方法。具体而言，本发 明提供涉及结晶的，自伴有其它污染物(诸如污染性蛋白质和/或其它杂质)的混合物回 收和纯化CD20抗体的方法。在一个具体的实施方案中，本发明提供自重组宿主培养物或细 胞溶胞物(诸如哺乳动物细胞培养物或生成CD20抗体的大肠杆菌重组宿主细胞的细胞溶 胞物)回收和纯化⑶20抗体的方法。这些纯化方法的基础是CD20抗体(包括抗体片段)易于以高纯度及以容许在整个纯化工艺中最佳操作的尺寸和形态结晶的条件的鉴定。进一步发现了包括结晶步骤的纯 化方案易于扩缩，且因此可用于大规模纯化CD20抗体。在纯化方案中掺入结晶步骤容许减少纯化工艺步骤，同时维持与使用多个层析纯 化步骤、没有结晶的传统纯化方案相当的收率。因而，将结晶引入纯化工艺导致显著的节 约，且不损害效率、收率或产物品质。除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学等等的常规技术，这些都在本 领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释。参见例如Molecular Cloning =A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989) Current Protocols inMolecular BioIory(F. Ausubel et al.， eds. ,1987updated) :Essential MolecularBioloRY(T. Brown ed. ,IRL Press 1991) :Gene Expression TechnoloRY(Goeddeled. ， Academic Press 1991) :Methods for CloninR and Analysis of EukaryoticGenes(A. Bothwell et al. , eds. , Bartlett Publ.1990)； Gene Transfer andExpression (M.Kriegler, Stockton Press 1990) (Recombinant DNA MethodologyII(R. ffu et al. , eds. , Academic Press 1995) ；PCR :A Practical Approach(M.McPherson et al. , IRL Press at Oxford University Press 1991)； 01iRonucIeotideSynthesis(M. Gait ed.，1984) :Cell Culture for Biochemists(R. Adams ed. , Elsevier Science Publishers 1990) ;Gene Transfer Vectors for Mammalian CeUs (J. Miller & Μ· Calos eds. , 1987) MammaIian Cell Biotechnology (M. Butler ed.,1991) Animal Cell Culture(J. Pollard et al. , eds. , Humana Press 1990)； Cultureof Animal Cells, 2nd Ed. (R. Freshney et al.，eds.，Alan R. Liss 1987)； FlowCytometry and SortinR(Μ. Melamed et al.，eds.，Wiley-Liss 1990)丛书 Methods in EnzymoloRy(Academic Press,Inc.) ；Wirth Μ. and Hauser H. (1993) ；Immunochemistry in Practice，3rd edition,A. Johnstone & R. Thorpe, BlackwelIScience,Cambridge, MA, 1996 ；Techniques in Immunocytochemistry，(G.Bullock & P.Petrusz eds.，Academic Press 1982,1983,1985,1989) ；Handbookof Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, eds.) ；Current Protocolsin Immunology(J. Coligan et al.，eds. 1991)； Immunoassay(Ε. P. Diamandis &T. K. Christopoulos, eds.，Academic Press，Inc.，1996)； Goding (1986)Monoclonal Antibodies -Principles and Practice (2d ed)Academic Press，NewYork ；Ed Harlow and David Lane，Antibodies A laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York，1988 ；Antibody Engineering， 2nd edition (C. Borrebaeck, ed. , Oxford University Press，1995)禾口丛书 AnnualReview of Immunology ；丛书 Advances in Immunology。B. 1⑶20抗体的牛成(i)CD20 抗体在各种实施方案中，本发明提供结晶形式的2H7CD20抗体及掺入至少一个结晶步 骤，用于纯化此类抗体的方法。在具体的实施方案中，人源化2H7抗体是表1中列举的抗体。表1 人源化2H7抗⑶20抗体及其变体2H7 VlVh完整L链完整H链变体0139]SEQ ID NO.SEQ ID NO.SEQ ID NO.SEQ ID NO.0140]A12670141]B12680142]C349100143]D349110144]F349120145]G349130146]H359140147]I126150148]表1抗体变体A、B和:每一项包含轻链可变区序列0149]DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTD
FTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO 1)；禾口
重链可变区序列(Vh) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFT ISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 2)。表1抗体变体C、D、F和G每一项包含轻链可变区序列(\)DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID N0:3)，和重链可变区序列(Vh)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFT ISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :4)。表1抗体变体H包含轻链可变区序列SEQ ID NO 3(见上文)和重链可变区 序列(Vh)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFT ISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 5)表1抗体变体A、B和I每一项包含全长轻链序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 6)。表1变体A包含全长重链序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRF
TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK(SEQ ID NO :7)。 表1变体B包含全长重链序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO :8)。表1变体I包含全长重链序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO :15)。表1抗体变体C、D、F、G和H每一项包含全长轻链序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 9)。表1变体C包含全长重链序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO 10)。表1变体D包含全长重链序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO :11)。表1变体F包含全长重链序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO :12)。表1变体G包含全长重链序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO :13)。表1变体H包含全长重链序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO 14)。在某些实施方案中，人源化2H7抗体进一步包含IgG Fc中的氨基酸改变，且展现 出比具有野生型IgG Fc的抗体升高至少60倍、至少70倍、至少80倍、更优选至少100倍、 优选至少125倍、甚至更优选至少150倍至约170倍的对人FcRn的结合亲和力。IgG中的N-糖基化位点位于(^2域中的Asn297。本发明的人源化2H7抗体组合 物包括任何前述具有Fc区的人源化2H7抗体的组合物，其中组合物中约80-100% (优选约 90-99%)的抗体包含缺少附着至糖蛋白Fc区的岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构。此类 组合物在本文中证明展示出乎意料的对Fc γ RIIIA(F158)的结合的改善，在与人IgG相互 作用方面Fc γ RIIIA(F158)不如Fc γ RIIIA(V158)有效。在正常的、健康的非洲裔美国人和 高加索人种中，Fc y RIIIA(F158)比 Fc γ RIIIA(V158)更常见。参见 Lehmbecher et al.， Blood94:4220(1999)o历史上，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(最常用的工业宿主之一)中生 成的抗体中，群体中约2-6%是未岩藻糖基化的。然而，YB2/0和Lecl3能生成78-98%未 岩藻糖基化的抗体。Shinkawa et al.，J Bio. Chem. 278 (5)，3466-347 (2003)报告了在具 有较低FUT8活性的YB2/0和Lecl3细胞中生成的抗体在体外显示显著升高的ADCC活性。 具有降低的岩藻糖含量的抗体的生成也记载于例如Li et al. , (GlycoFi) "Optimization of humanized IgGs inglycoengineered Pichia pastoris" in Nature Biology online publication 22Jan.2006 ；Niwa R. et al. , Cancer Res. 64(6) 2127-2133(2004) ；US 2003/0157108 (Presta) ；US 6,602, 684 和 US 2003/0175884 (Glycart Biotechnology)； US2004/0093621, US 2004/0110704，US 2004/0132140 (都是 Kyowa Hakko Kogyo 的)。
双特异性人源化2H7抗体涵盖如下的抗体，其中抗体的一条臂至少具有本发明人 源化2H7抗体H和/或L链的抗原结合区，且另一条臂具有针对第二抗原的V区结合特异 性。在具体的实施方案中，所述第二抗原选自下组⑶3、⑶64、⑶32A、⑶16、NKG2D或其它 NK活化性配体。本发明还包括其它⑶20抗体的纯化，包括但不限于治疗性抗体RITUXAN (利妥昔单抗)，其在临床实践中用于复发性或顽固性、低级或滤泡性、CD20阳性B细胞非 何杰金氏淋巴瘤(NHL)的治疗；与CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)或其 它基于蒽环类抗生素的化疗方案组合用于弥漫性大B细胞CD20阳性非何杰金氏淋巴瘤 (DLBCL-—类NHL)的一线治疗；与CVP (环磷酰胺、长春新碱和泼尼松龙)化疗组合用于滤 泡性、CD20阳性B细胞非何杰金氏淋巴瘤的一线治疗；及用于病情稳定的或在使用CVP化 疗的一线治疗后实现部分或完全响应的患者中低级、CD20阳性、B细胞非何杰金氏淋巴瘤 的治疗。(ii)抗体牛成单克隆抗体(包括本文中的⑶20抗体)可以使用最初由Kohler等，Nature, 256 =495(1975)记载的杂交瘤方法来生成，或者可以通过重组DNA方法(美国专利 No. 4,816, 567)来生成。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸 如仓鼠或猕猴，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于 免疫的所述蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂诸如聚乙二 醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press,1986)。将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑 制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺少 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有 次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选择的抗体生产细胞稳定且高水平 的生成抗体、且对培养基诸如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞 系是鼠骨髓瘤系，诸如那些自可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA)获得的 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠肿瘤和可 从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection, Rockville, Md. USA)获 得的SP-2或X63-Ag8-653衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也有用于生 成人单克隆抗体的记载(Kozbor, J. Immunol.，133 3001(1984) ；Brodeur 等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications, pp. 51—63, Marcel Dekker, Inc., NewYork,1987)。可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选 的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸 附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。在鉴定出生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述 克隆就可通过有限稀释规程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies :Principles and Practice, pp. 59-103, AcademicPress, 1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水 瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-S印harose、羟磷灰石层析、凝 胶电泳、透析、或亲和层析，将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够特异性 结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是此类DNA的优选 来源。一旦分离，就可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外生成免疫球 蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或 骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组生产在下文中有更 详细描述。在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature，348 :552_554 (1990)中记 载的技术构建的噬菌体抗体库中分离抗体或抗体片段。Clackson 等，Nature，352 :624_628 (1991)及 Marks 等，J. Mol. Biol.，222 581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库进行的鼠和人抗体的分离。后续出版物记 载了通过链改组生成高亲和力(nM范围)的人抗体(Marks等，Bio/Technology 10: 779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略 (Waterhouse 等，Nuc. Acids Res. 21 :2265_2266 (1993))。如此，这些技术是用于分离单克 隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。也可以修饰DNA，例如通过用人重链和轻链恒定域的编码序列替代同源鼠序列 (美国专利 No. 4，816，567 ；Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 6851 (1984))，或通 过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列共价连接。典型地，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一 个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗 原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。(iii)人源化和人抗体人源化抗体具有一个或多个导入其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨 基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter 及其同事的方法进行(Jones 等，Nature，321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等，Nature，332 323-327(1988) ；Verhoeyen 等，Science，239 :1534_1536 (1988))，即用啮齿类 CDR 或 CDR 序 列替代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4，816，567)， 其中本质上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通 常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的 人抗体。用于制备人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链的人可变域的选择，对 于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)法，用啮齿类抗体的可变域序列对 已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类序列最接近的人序列作为人 源化抗体的人框架(FR) (Sims 等，J. Immunol.，151 2296(1993) ；Chothia 等，J. Mol. Biol.， 196 901 (1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的 特定框架。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89 4285 (1992) ；Presta 等，J. Immunol.，151 2623 (1993))。更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特 性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析 亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是 可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的 可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列 行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从 受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和 力提高。通常，CDR残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。或者，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人 抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重 链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转 移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如Jakobovits等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature，362 :255_258 (1993)； Bruggermann 等，Yearin Immuno. ,7 33 (1993)；及 Duchosal 等，Nature, 355 258 (1992)。 还可从噬菌体展示库衍生人抗体(Hoogenboom等，J. Mol. Biol.，227 =381 (1991) ；Marks等， J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991) ；Vaughan 等，Nature Biotech.，14 309 (1996))。下文进 一步描述了自抗体噬菌体展示文库生成人抗体。(iv)抗体片段已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗 体来衍生这些片段(参见例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107—117(1992)；及 Brennan 等，Science，229 :81 (1985))。然而，现在可直接 由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可以从上文讨论的噬菌体抗体库分离抗体片段。或 者，可直接从大肠杆菌回收Fab' -SH片段并化学偶联以形成F(ab' )2片段(Carter等， Bio/Technology 10 163-167 (1992))。在另一个实施方案中，如下文实施例所述，使用亮氨 酸拉链GCN4促进F(ab' )2分子的装配来形成F(ab‘ )2。依照另一种方法，可直接从重组 宿主细胞培养物分离F(ab' )2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员将是 显而易见的。在其它实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185。(ν)抗体的重组生产为了重组生产抗体，分离编码抗体的核酸，并插入可复制载体中，用于进一步克隆 (DNA扩增)或表达。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用 能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载 体构件通常包括但不限于下列一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增 强子元件、启动子、和转录终止序列(例如如美国专利No. 5，534，615中所记载的，明确收入 本文作为参考)。适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母 或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰 氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或 大肠杆菌(E. col i)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏 菌(Salmonella typhinurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆 菌(B. subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)(例如1989年4月12日公布的 DD 266，710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa)、和链霉菌属(Str印tomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌 294仏了031，446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌8、大肠杆菌乂1776仏10 31,537)和大肠杆 菌W3110(ATCC 27，325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合 适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用 的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌 株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵 母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K. Iactis)、脆壁克鲁维酵母 (K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亚克鲁维酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、威克 克鲁维酵母(K. wickeramii) (ATCC 24，178)、K. waltii (ATCC 56，500)、果蝇克鲁维酵母 (K. drosophilarum) (ATCC 36，906)、耐热克鲁维酵母(K. thermotolerans)和马克思克鲁 维酵母(K. marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia) (EP 402, 226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) (EP 183, 070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia) (EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如西方许 旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；禾口丝状真菌，诸如例如脉抱菌属(Neurospora)、 青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构 巢曲霉(A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)。适于表达糖基化抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包 括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们 来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、 白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和 家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-I变体和家蚕(Bombyx mori) NPV的Bm_5株，而且此类病毒可依照本 发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、 矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的 繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CVl系 (COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞， Graham 等，J. Gen Virol. ,36 59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK, ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵 巢细胞/-DHFR (CHO，Urlaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4216 (1980))；小鼠塞托利 (sertoli)细胞(TM4，Mather, Biol. Reprod. ,23 :243_251 (1980))；猴肾细胞(CVl, ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL 2)； 犬肾细胞(MDCK, ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)； 人肺细胞(Wl38, ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCCCCL 51) ；TRI 细胞(Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci.，383 44-68 (1982) ；MRC5 细胞；FS4 细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。在一个实施方案中，本文中的⑶20抗体是在dpl2. CHO细胞中生产的，dp 12. CHO 细胞是如EP307247所述自CH0-K1DUX-B11细胞生成的。CH0-K1DUX-B11细胞继而是遵循 Simonsen, C. C. ，and Levinson, A. D. ， (1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 :2495-2499and Urlaub G.，and Chasin，L.，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci USA 77 :4216_4220 中记载的方法 自CHO-Kl (ATCC No. CCL61 CHO-K1)细胞获得的。另外，知道其它CHO-Kl (dhfrO细胞系， 而且能在本发明的方法中使用。可以在多种培养基中培养用于生产肽、多肽和蛋白质的哺乳动物宿主细胞。商 品化培养基诸如Ham氏FlO(Sigma)、极限必需培养基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、 和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以 使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基Ham and Wallace (1979), Meth. in Enz. 58 44 ；Barnes and Sato (1980)， Anal. Biochem. 102 255 ； _ 国 禾U # 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；或 4，560，655 ；WO 90/03430 ；WO 87/00195 ；美国专利 号Re. 30，985 ；或美国专利号5，122，469，通过述及将所有的公开内容收入本文。任何这些 培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因 子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷(诸如腺苷和胸苷)、 抗生素(诸如Gentamycin 药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的 无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以本领域技术人员知道的适宜浓度包含任何其 它必需补充物。培养条件，诸如温度、PH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对 于普通技术人员而言是显而易见的。B. 2⑶20抗体的结晶结晶广泛用于纯化小分子。然而，一般而言，为蛋白质(尤其是全长抗体)找到 结晶条件是非常困难和繁重的，其中三维抗体结构的正确装配提出特殊的问题。影响结晶 的参数包括例如溶解度、成核和生长速率、及晶体尺寸分布，每一项都是其它参数(诸如温 度、PH、缓冲液、杂质、等等)的函数。因为抗体进行结晶比小分子或小蛋白质或结构较简单 的蛋白质困难得多，所以治疗性抗体的回收和纯化极少涉及结晶步骤。 B. 3在CD20抗体的回收和纯化中使用结晶在本发明的方法中，结晶是用于回收和纯化CD20抗体的单柱或双柱方案中的一 个关键步骤。用于在哺乳动物(诸如CH0)细胞中生产、回收和纯化重组抗体的方案可以包括下 述步骤可以在搅拌罐生物反应器系统中培养细胞，而且采用补料分批培养规程。在一种 优选的补料分批培养中，首先向培养容器供应哺乳动物宿主细胞和培养基，而且培养期间 连续地或以离散增量向培养物补加另外的培养养分，在终止培养之前定期收获细胞和/或 产物或不进行收获。补料分批培养可以包括例如半连续补料分批培养，其中定期地取出整 个培养物(包括细胞和培养基)并用新鲜培养基更换。补料分批培养与单个分批培养的区 别在于在培养工艺开始时向培养容器供应细胞培养的所有成分(包括细胞和所有培养养 分)。另外，补料分批培养与灌注培养的区别在于工艺期间不自培养容器取出上清液(在灌注培养中，通过例如过滤、包囊(encapsulation)、锚定至微载体等将细胞局限在培养物中， 而且连续地或间歇地引入培养基并自培养容器取出培养基)。另外，可以依照任何对所设想的特定宿主细胞和特定生产计划合适的方案或例程 来繁殖培养的细胞。因此，可以采用一步或多步培养规程。在一步培养中，将宿主细胞接种 入培养环境，并在细胞培养的单一生产阶段期间采用所述工艺。或者，可以使用多阶段培 养。在多阶段培养中，可以在多个步骤或阶段中培养细胞。例如，可以在第一步或生长阶段 培养中培养细胞，其中将细胞(可能是自贮藏中取出的)接种入适合于促进生长和高存活 力的培养基。通过向宿主细胞培养物添加新鲜培养基，可以将细胞在生长阶段维持合适的 一段时间。在某些实施方案中，补料分批或连续细胞培养条件可以设计成增强哺乳动物细胞 在细胞培养的生长阶段中的生长。在生长阶段中，培养细胞的条件和时间使生长最大化。培 养条件(诸如温度、PH、溶解氧(d02)等等)就是那些用于特定宿主的，而且对于普通技术 人员会是显而易见的。通常，使用酸(例如CO2)或碱(例如Na2CO3或NaOH)将pH调节至 介于约6. 5和7. 5之间的水平。用于培养哺乳动物细胞(诸如CHO细胞)的合适温度范围 介于约30°C至38°C之间，而合适的d02介于5-90%空气饱和之间。在一个特定的阶段，可以使用细胞来接种细胞培养的生产阶段或步骤。或者，如上 所述，生产阶段或步骤与接种或生长阶段或步骤可以是连续的。细胞培养的生产阶段期间的培养条件通常是受到控制的。如此，如果生产糖蛋 白，那么可以操控影响哺乳动物宿主细胞的细胞单位生产率(specif icproductivity)的 因素，使得在所得糖蛋白中实现期望的唾液酸含量。在一个优选的方面，细胞培养工艺的 生产阶段前面有细胞培养的转换阶段，其中启用细胞培养的生产阶段的参数。此工艺的进 一步详情可见于美国专利 No. 5，721，121 及 Chaderjian et al.，Biotechnol. Prog. 21(2) 550-3(2005)，通过述及将它们的完整公开内容明确收入本文。发酵后，纯化蛋白质。用于自细胞残骸纯化蛋白质的规程首先取决于蛋白质表达 的部位。一些蛋白质可直接自细胞分泌入周围培养基中；其它一些在细胞内生成。对于后一 种蛋白质，纯化工艺的第一步牵涉溶解细胞，这可以通过多种方法来进行，包括机械剪切、 渗压振扰、或酶促处理。此类破坏将细胞的整个内容物释放入勻浆，而且另外产生因为它们 的尺寸小所以难以除去的亚细胞碎片。这些一般通过差速离心或通过过滤来除去。由于蛋 白质生产运行的过程中细胞的自然死亡和细胞内宿主细胞蛋白质和成分的释放，直接分泌 的蛋白质产生同样的问题，只是程度较轻。一旦获得含有感兴趣蛋白质的澄清溶液，通常使用不同层析技术的组合来尝试将 它与细胞生成的其它蛋白质分开。这些技术根据蛋白质的电荷、疏水性程度、或尺寸将这些 蛋白质的混合物分开。数种不同的层析树脂可用于这些技术每一种，容许精确调整纯化方 案适应所涉及的特定蛋白质。这些分离方法每一种的本质在于能使蛋白质以不同速率沿长 柱向下移动，实现物理分离，随着蛋白质沿着柱进一步向下而所述物理分离增大，或者选择 性粘附至分离介质，然后用不同溶剂差异洗脱。在一些情况中，当杂质特异性粘附至柱而感 兴趣蛋白质不这样时，也就是感兴趣蛋白质存在于“流出液”中，想要的蛋白质与杂质分开。 如此，自哺乳动物宿主细胞的细胞培养物纯化重组蛋白可包括一个或多个亲和(例如蛋白 A)和/或离子交换层析步骤。
离子交换层析是一种常用于纯化蛋白质的层析技术。在离子交换层析中，溶质表 面上的带电荷的部位受到附着至层析基质的相反电荷的吸引，前提是周围缓冲液的离子强 度低。洗脱一般通过提高缓冲液的离子强度(即电导率)以与溶质竞争离子交换基质的带 电荷位点来实现。改变PH及由此改变溶质的电荷是实现溶质洗脱的另一种方式。电导率 或PH的变化可以是逐渐的(梯度洗脱)或分步的(分步洗脱)。在过去，这些变化是渐进 的；即PH或电导率以一个方向升高或降低。关于治疗性抗体的工业纯化的进一步详情参见例如Fahrner et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18 301-27 (2001)，通过述及将其整个公开内容明确收入本文。一种用于自CHO细胞培养物纯化重组蛋白(诸如抗体)的典型方案包括下述步 骤(1)蛋白A层析，(2)阳离子交换层析，(3)病毒过滤，(4)阴离子交换层析和(5)超 滤_渗滤(UFDF)。蛋白A层析除去CHO细胞蛋白质(CHOP) XHO细胞DNA、庆大霉素、胰岛素、和无活 性的病毒污染。通过树脂表面上本质上酸性的带电荷基团与组氨酸、赖氨酸和精氨酸的相互 作用，阳离子交换层析保留生物分子。阳离子交换树脂可以自多家制造商(诸如例如 Sigma Aldrich)的产品系列购得。阳离子交换剂包括携带例如羧甲基官能基(弱阳 离子交换剂，诸如CM纤维素/SEPHADEX )或磺酸官能基(强阳离子交换剂，诸如 SPSEPHADEX )的树脂。在本发明方法的第二个层析纯化步骤中，优选强阳离子交换 柱，例如SP- SEPHADEX , SPECTRA/ GEL 强阳离子交换剂、等，TSKgel强阳离子交换 齐 、等。在SP-SEPHAROSE 柱的情况中，具有带负电荷的官能基的交联琼脂糖基质结 合CD20抗体，同时容许大部分杂质穿过柱。可以使用盐梯度洗脱或分步洗脱来实施洗脱， 分步洗脱是优选的，因为它为后续结晶步骤提供更好的条件，不损害收率。洗脱缓冲液通常 含有氯化钠或硫酸钠，而且盐浓度选择成达到阳离子交换柱的要求。SP-SEPHAROSE 柱需要相当高的盐浓度来除去结合的CD20蛋白，而为了降低蛋白质溶解度，后续结晶步骤 优选相对较低的盐浓度。通常，使用约100-150mM Na2SO4或100_200mM NaCl浓度。一种典 型的缓冲液组成如下200mM NaCl, 50mM HEPES，0. 05% Triton X-100，ImMDTT，pH 7.5。阳 离子层析步骤用于除去剩余的CHOP、浸出的蛋白A、剩余的CHO DNA、庆大霉素、胰岛素和抗 体聚集体。病毒过滤步骤提供高水平逆转录病毒清除。阴离子交换层析采用带正电荷的树脂，例如具有一个或多个附着于它的带正电荷 的配体，诸如季氨基团。商品化阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、QAE SEPHADEX 和Q SEPHAROSE Fast Flow (GE Healthcare)。阴离子交换步骤除去最终的 CHOP 和 CHO DNA 残留及病毒杂质，而UFDF步骤浓缩和配制Q集合(pool)。本发明提供一种纯化方案，其中用结晶步骤代替传统纯化工艺的一个或多个步 骤。如此，例如，蛋白A和后续阳离子交换纯化步骤可以用浓缩HCCF接着使CD20抗体结晶 的步骤代替。结晶步骤有效除去CH0P、CH0 DNA、庆大霉素和胰岛素。在包括结晶步骤的工 艺中，CHOP和CHO DNA水平比两个层析纯化步骤后的相应水平要低。另外，因为不包括蛋白A层析步骤，所以不需要除去浸出的蛋白A，这导致显著的节约。如此，本文中所描述的用 于自重组细胞培养物纯化CD20抗体的新方法实现了原材料和工艺步骤减少，而且产生了 高度有效且可扩缩的纯化方案，适合于大规模⑶20抗体生产。虽然实施例例示自哺乳动物(CHO)细胞培养物纯化，但是可以应用相似的办法自 细菌例如大肠杆菌细胞纯化CD20抗体。如果在大肠杆菌中生产CD20抗体，那么通常收获 整个细胞培养物并勻浆以破碎大肠杆菌细胞并释放胞质内的抗体。除去固体残骸后(例如 通过离心)，将混合物加载到阳离子交换层析柱上，诸如例如SP-S印harose Fast Flow柱 (Amersham Pharmacia, Sweden)。在一种典型的方案中，将通过大肠杆菌细胞发酵获得的整个细胞培养物的pH调 节至约7. 5，例如通过添加HEPES钠或任何其它适宜的缓冲液。通过一次或多次经过商品化 勻浆器破碎细胞，除去细胞残骸，并将溶胞物澄清。特定的处理参数(诸如试剂的选择和浓 度)取决于起始的整个细胞培养物的组成(诸如例如细胞密度)。在此情况中，结晶步骤可 以在阳离子交换(例如SP-SEPHAROSE )纯化之后。浓度必须高到足够使不同温度 时的溶解度差异最大化，但又不能太高以至于在室温或室温上下触发自发结晶。当结晶完成时，取出⑶20抗体晶体，例如通过过滤。晶体可以使用嵌入式搅动器 在整个过滤中保持悬浮，或者可以在填充床中沉积。重要的是要避免压缩晶体饼的形成，这 会使之不可能实现期望的流速。流速可以有所变化，而且通常介于约200cm/hr和约IOOcm/ hr之间。流速可取决于所使用的设备和过滤期间要应用的压力。过滤可以分批或连续实 施。结晶和分离后，可以将抗CD20抗体再溶解并贮存或转换成适合于预定用途的配 制剂。或者，可以增加另一个层析纯化步骤，通过除去抗-溶剂(PEG)残留和缓冲液成分 并降低残余细胞外蛋白质、内毒素、二聚体、和聚集体，进一步提高纯度。总之，用于纯化本发明的⑶20结合抗体的方法牵涉下述步骤浓缩HCCF，在适宜 条件下使抗体结晶，取出和清洗所得抗体晶体，再溶解抗体晶体，将抗体溶液提交层析纯化 步骤(例如Q-S^harose层析)，并使用例如超滤/渗滤将纯化的抗体交换入期望的配制 剂。B. 4在治疗方法中使用纯化的抗体通过本发明的方法纯化的CD20结合抗体对于治疗或缓解自身免疫病或B细胞恶 性肿瘤是有用的，或是作为前线疗法或在其它治疗之后，或是与第二治疗剂联合，或是同时 的、序贯的或是交替的方案。在优选的实施方案中，静脉内或皮下施用所述抗体。治疗CD20阳性B细胞恶性肿瘤的方法包括对具有恶性肿瘤的患者施用治疗有效 量的通过使用结晶的本发明方法纯化的CD20抗体。在具体的实施方案中，CD20抗体是表1 所述人源化2H7抗体。在具体的实施方案中，B细胞恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤或白血病，包 括非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、以淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD)、小淋巴细胞性淋巴 瘤(SLL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在B细胞淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的情 况中，NHL包括但不限于滤泡性淋巴瘤、复发性滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞 性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、蕈样肉芽肿病/塞扎里综合征、脾边缘区 淋巴瘤、和弥漫性大B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，B细胞淋巴瘤选自下组无痛性淋巴瘤、攻击性淋巴瘤、和高度攻击性淋巴瘤。在具体的实施方案中，使用人源化CD20结合抗体或其功能性片段来治疗无痛性 NHL,包括复发性无痛性NHL和利妥昔单抗不应性无痛性NHL。“自身免疫病”在本文中指源于且针对个体自身组织或器官的疾病或紊乱或其共 分离(co-segregate)或表现或由其导致的状况。在这些自身免疫病和炎症紊乱的许多中， 可以存在许多临床和实验室标志，包括但不限于高丙种球蛋白血症、高水平自身抗体、组 织中抗原-抗体复合物沉积、得益于皮质类固醇或免疫抑制治疗、及受侵害组织中的淋巴 样细胞集合体。不限于任意一种有关B细胞介导的自身免疫病的理论，认为B细胞通过众 多机械途径在人自身免疫病中表现出致病作用，包括自身抗体产生、免疫复合物形成、树突 细胞和T细胞活化、细胞因子合成、直接趋化因子释放和提供用于异位新淋巴生成的巢。这 些途径中的每一种可以以不同程度参与自身免疫病的病理学。“自身免疫病”可以为器官特异性疾病(即免疫应答特异性针对一种器官系统，诸 如内分泌系统、造血系统、皮肤、心肺系统、胃肠和肝系统、肾系统、甲状腺、耳、神经肌肉系 统、中枢神经系统等)或可以影响多器官系统的系统性疾病(例如系统性红斑狼疮(SLE)、 类风湿性关节炎、多肌炎等)。优选的此类疾病包括自身免疫性风湿病学病症(诸如例如类 风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征(Sj0gren’sSyndrome)、硬皮病、狼疮(诸如SLE和狼疮肾 炎)、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征、和银屑病关节炎)、自身免疫性胃 肠和肝病症(诸如例如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn' s disease)), 自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管 炎、和乳糜泻)、血管炎(诸如例如ANCA阴性血管炎和ANCA相关血管炎，包括丘施二氏血 管炎(Churg-Straussvasculitis)、韦格纳氏肉芽月中病(Wegener' s granulomatosis)、禾口 微观多脉管炎)、自身免疫性神经病学病症(诸如例如多发性氧化、视性眼阵挛肌阵挛综 合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏病(Parkinson’ s disease)、阿耳茨海默氏病 (Alzheimer's disease)、和自身免疫性多神经病)、肾病症(诸如例如肾小球肾炎、古德帕 斯丘氏综合征(Goodpasture's syndrome)、和贝格尔氏病(Berger，s disease))、自身免疫 性皮肤病学病症(诸如例如银屑病、荨麻疹、hives、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、、和皮 肤红斑狼疮)、血液学病症(诸如例如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血 后紫癜、和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听觉疾病(诸如 例如内耳病和听力损失)、贝切特氏病(Behcet' s disease)、雷诺氏综合征(Raynaud' s syndrome)、器官移植、和自身免疫性内分泌病症(诸如例如糖尿病相关自身免疫病诸如胰 岛素依赖性糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病(Addison’ sdisease)、和自身免疫性甲状腺病(例 如格雷夫斯氏病(Graves'disease)和甲状腺炎))。更优选的此类疾病包括例如类风湿性 关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关血管炎、狼疮、多发性硬化、斯耶格伦氏综合征、格雷夫斯 氏病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎、和肾小球肾炎。本文中所定义的其它自身免疫性疾病的具体例子(在有些情况中涵盖上文所列 举的那些)包括但不限于关节炎(急性的和慢性的，类风湿性关节炎，包括幼发型类风湿性 关节炎和关节炎的各个阶段诸如类风湿性滑膜炎、痛风或痛风性关节炎、急性免疫性关节 炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱发的关节炎、感染性关节炎、莱姆(Lyme) 关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、斯提耳氏(Still)病、脊椎关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎、绝经期关节炎、雌激 素消减性关节炎、和强直性脊柱炎/类风湿性脊椎炎)，自身免疫性淋巴细胞增生性疾病， 炎性过度增殖性皮肤病，银屑病诸如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑 病，特应性包括特应性疾病诸如干草热和乔布氏(Job)综合征，皮炎包括接触性皮炎、慢性 接触性皮炎、剥脱性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、荨麻疹、疱疹样皮炎、钱币状皮 炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎和特应性皮炎，χ连锁的高IgM 综合征，变应性眼内炎性疾病，荨麻疹诸如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹(包括 慢性自身免疫性荨麻疹)，肌炎，多肌炎/皮肌炎，青少年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解 症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化诸如系统性硬化、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼 (spino-optical)MS、原发性进行性 MS(PPMS)和复发性消退性(relapsing remitting) MS(RRMS)、进行性系统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化、共济失调性(ataxic) 硬化，视神经脊髓炎(NMO)，炎症性肠病(IBD)(例如克罗恩氏(Crohn)病、自身免疫介导 的胃肠病、胃肠炎症、结肠炎诸如溃疡性结肠炎(colitisulcerosa)、微观结肠炎、胶原性 结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎、和自身免疫性炎症性肠病)， 肠炎，坏疽性脓皮症，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，呼吸窘迫综合征包括成人型或急 性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，整个或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免 疫性血液学病症，移植物抗宿主疾病，血管性水肿诸如遗传性血管性水肿，脑神经损伤像 脑膜炎中的，妊娠疱疹，妊娠性类天疱疮，阴囊瘙癣(pruritis scroti),自身免疫性早熟 性卵巢衰竭，因自身免疫性疾患引起的突发性听觉丧失，IgE介导的疾病诸如过敏反应和 变应性和特应性鼻炎，脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen)脑炎和边缘系和/或脑干脑炎， 葡萄膜炎(诸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、 晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和没有肾病综合征的肾 小球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性 肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜增殖性或膜性增殖性GN(MPGN)(包括I型和 II型)、和急进性GN(RPGN)，增殖性肾炎，自身免疫性多腺体内分泌衰竭，龟头炎包括浆细 胞性局限性龟头炎，龟头包皮炎，离心性环状红斑，持久性色素异常性红斑，多形性红斑， 环状肉芽肿，光泽苔藓，硬化萎缩性苔藓，慢性单纯苔藓，小棘苔藓，扁平苔藓，片层状鱼鳞 癣，表皮松解性角化过度，恶变前角化，坏疽性脓皮症，变应性疾患和应答，食物过敏，药物 过敏，昆虫过敏，罕见的过敏性病症诸如肥大细胞增生病，过敏反应，湿疹包括变应性或特 应性湿疹、干性湿疹、汗疱和水泡性掌跖湿疹(vesicular palmoplantar eczema)，哮喘诸 如支气管哮喘(asthma bronchiale, bronchial asthma)和自身免疫性哮喘，涉及T细胞 浸润和慢性炎性应答的疾患，针对外来抗原诸如妊娠期间胎儿A-B-O血型的免疫反应，慢 性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，狼疮包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科 狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、狼疮脱发、SLE(诸如皮肤SLE或亚 急性皮肤SLE)、新生儿狼疮综合征(NLE)、和播散性红斑狼疮，幼发型(I型)糖尿病包括 儿科IDDM，成人期发作的糖尿病(II型糖尿病)，自身免疫性糖尿病，特发性尿崩症，糖尿 病视网膜病变，糖尿病肾病，糖尿病结肠炎，糖尿病大动脉病症，与细胞因子和T-淋巴细胞 介导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤样 肉芽肿病、粒细胞缺乏，血管炎病(包括大血管血管炎(诸如风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu))动脉炎)、中血管血管炎(诸如川崎氏(Kawasaki)病和结节性多动脉 炎/结节性动脉周围炎)、免疫血管炎、CNS血管炎、皮肤性血管炎、超敏感性血管炎、坏死 性血管炎(诸如类纤维蛋白坏死性血管炎和系统性坏死性血管炎)、ANCA阴性血管炎、和 ANCA相关血管炎诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)综合征(CSS)，韦格纳氏(Wegener)肉 芽肿病、和微观多脉管炎)，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，库 姆斯(Coombs)阳性贫血，戴-布二氏(Diamond Blackfan)贫血，溶血性贫血或免疫性溶 血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血(anemia pemiciosa)，阿狄森氏 (Addison)病，单纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫 性嗜中性粒细胞减少症，细胞减少症诸如全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞渗出 的疾病，CNS炎性病症，阿耳茨海默氏(Alzheimer)病，帕金森氏(Parkinson)病，多器官损 伤综合征诸如那些脓毒症、外伤或出血继发的，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基 底膜病，抗磷脂抗体综合征，运动神经炎，变应性神经炎，贝切特氏(Behcet)病/综合征， 卡斯尔曼氏(Castleman)综合征，古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征，雷诺氏(Reynaud) 综合征，斯耶格伦氏(SjSgren)综合征，史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征，类天疱疮 或天疱疮诸如大疱性类天疱疮、瘢痕性(粘膜)类天疱疮、皮肤类天疱疮、寻常型天疱疮、 副肿瘤性天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮和红斑性天疱疮，获得性大疱性表 皮松解症，眼部炎症(优选变应性眼部炎症，诸如变应性结膜炎、线性IgA大疱性疾病、自 身免疫诱发的结膜炎症)，自身免疫性多内分泌病，莱特氏(Reiter)病或综合征，由自身免 疫性疾患引起的热伤，先兆子痫，免疫复合物病症诸如免疫复合物肾炎，抗体介导的肾炎， 神经炎性病症，多神经病，慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经病，血小板减少 症(例如心肌梗死患者发生的)包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、 肝素诱发的血小板减少症、和自身免疫或免疫介导的血小板减少症(包括例如特发性血小 板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP)，巩膜炎诸如特发性角膜-巩膜炎、巩膜外层炎， 睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退症，甲 状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎(诸如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏 (Hashimoto)病、慢性甲状腺炎(桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎)、自 身免疫性甲状腺病、特发性甲状腺功能减退症、格雷夫斯氏(Graves)病，格雷夫斯氏眼病 (Grave' s eye disease)(眼部或甲状腺相关眼部)，多腺性综合征诸如自身免疫性多腺 体综合征例如I型(或多腺性内分泌病综合征)，瘤外综合征包括神经学瘤外综合征诸如 兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特(Lambert-Eaton)综合征， 僵体或僵人综合征，脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和实 验性变应性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力诸如胸腺瘤相关重症肌无力，小脑变性，神经性肌 强直，视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，和感觉神经病，多病灶运动神经病， 席汉氏(Sheehan)综合征，自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活 动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，肺炎诸如淋巴样间质性肺炎(LIP)，梗阻性细支 气管炎(非移植物)对NSIP，格-巴二氏(Guillain-Barre)综合征，贝格尔氏(Berger) 病(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，急性热性嗜中性白细胞皮肤病，角质层 下脓疱皮肤病，一过性棘层松解性皮肤病，硬化诸如原发性胆汁性肝硬化和肺硬变，自身免 疫性肠病综合征，乳糜泻，腹腔或腹部疾病，口炎性腹泻(麸质肠病)，顽固性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白血症诸如混合型冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS)(卢格 里克氏(Lou Gehrig)病)，冠状动脉病，自身免疫性耳病诸如自身免疫性内耳病(AIED)、 自身免疫性听觉丧失，多软骨炎诸如顽固性或复发的或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症， 角膜炎诸如寇甘氏(Cogan)综合征/非梅毒性间质性角膜炎，贝耳氏(Bell)麻痹，斯威特 氏(Sweet)病/综合征，自身免疫性酒糟鼻，带状疱疹相关疼痛，淀粉样变，非癌性淋巴细 胞增多，原发性淋巴细胞增多包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋 白病和性质未确定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS))，周围神经病，瘤外综合征，通道病诸如 癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病，孤独症，炎性 肌病，局灶性或节段性或局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜 炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝脏病学病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特氏 (Schmidt)综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病和慢 性炎性脱髓鞘性多神经病，德雷斯勒氏(Dressier)综合征，斑秃，全秃，CREST综合征(钙质 沉着症、雷诺氏(Raynaud)现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细管扩张)，男性和女性 自身免疫性不孕不育例如由于抗精虫抗体的，混合性结缔组织病，恰加斯氏(Chagas)病， 风湿热，习惯性流产，农民肺，多形红斑，心脏切开术后综合征，柯兴氏(Cushing)综合征， 养鸟者肺，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞性血管炎，阿尔波特氏(Alport)综合征， 肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风，疟疾，寄生虫病 诸如利什曼病、锥虫病、血吸虫病、蛔虫病，曲霉病，Sampter氏综合征，卡普兰氏(Caplan) 综合征，登革，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺纤维化，纤维 性纵隔炎，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑，胎儿成红细 胞增多症，嗜曙红细胞性筋膜炎、舒尔曼氏(Shulman)综合征，费尔提氏(Felty)综合征， flariasis,睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)、 或Fuch氏睫状体炎，亨诺-许兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV) 感染，SCID，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，艾柯病毒感染，脓毒症(系统性炎性应答综合 征(SIRS))，内毒素血症，胰腺炎，甲状腺毒症(thyroxicosis)，细小病毒感染，风疹病毒感 染，种痘后综合征，先天性风疹感染，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染，腮腺炎， 埃文斯(Evans)综合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病，链球菌后 肾炎，闭塞性血栓血管炎(thromboangitisobiterans)，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨 细胞性多肌痛，慢性超敏感性肺炎，结膜炎，诸如春季卡他、干燥性角膜结膜炎、和流行性 角膜结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血-再灌注损伤，移植器 官再灌注，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道/肺部疾病，硅沉着病， 口疮，口疮性口炎，动脉硬化性病症(大脑血管功能不全)诸如动脉硬化性脑病和动脉硬 化性视网膜病，无精子发生，自身免疫性溶血，伯克氏(Boeck)病，冷球蛋白血症，杜普伊 ft (Dupuytren)晶生目艮内 | (endophthalmia phacoanaphylactica),
变应性小肠炎(enteritisallergica)，麻风节结性红斑，特发性面瘫，慢性疲乏综合征， 风湿热(febrisrheumatica)，哈-里二氏(Hamman-Rich)病，感觉神经性听觉丧失，阵 发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)，性腺功能减退，局限性回肠炎 (ileitis regionalis)，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯性(traverse)脊髓 炎，原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmia symphatica) (sympatheticophthalmitis)，新生儿眼炎，视神经炎，肉芽肿性睾丸炎(orchitisgranulomatosa)，胰腺 炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮症，奎尔万氏(Quervain)甲状腺炎，获得性脾萎缩，非恶 性胸腺瘤，淋巴滤泡性胸腺炎，白癜风，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的疾 患，白细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫 应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原_抗体复合物介导的疾病，抗肾小 球基底膜病，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性粘液水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，风 湿病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，自身免疫性多腺性综合征， 包括多腺性综合征I型，成人期发作的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)，心肌病诸如扩张 型心肌病，获得性大疱性表皮松解(印idermolisis bullosa acquisita，EBA)，血色素沉 着，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦 炎，筛窦炎，额窦炎，上颂窦炎或蝶窦炎，变应性鼻窦炎，嗜曙红细胞相关病症诸如嗜曙红细 胞增多症、肺嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏(Loffler) 综合征、慢性嗜曙红细胞性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含 有嗜曙红细胞的肉芽肿，过敏反应，脊椎关节病，血清阴性脊椎关节炎病，多内分泌自身免 疫病，硬化性胆管炎，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝酵母病，布鲁顿氏(Bruton)综合 征，婴儿期一过性低丙种球蛋白血症，威斯科特-奥尔德里齐(Wiskott-Aldrich)综合征， 共济失调性毛细管扩张综合征，血管扩张，与以下各项有关的自身免疫性病症胶原病、 风湿病诸如慢性关节风湿病、淋巴结炎、血压应答降低(reduction in blood pressure response)、血管功能障碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、肾缺血、脑缺血和伴随血管化 的疾病，变应性超敏感性病症，肾小球肾炎病，再灌注损伤，缺血再灌注病症，心肌或其它组 织的再灌注损伤，淋巴瘤气管支气管炎，炎性皮肤病，具有急性炎性成分的皮肤病，多器官 衰竭，大疱病，肾皮质坏死，急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症，眼和眶炎性 病症，粒细胞输血相关综合征，细胞因子诱发的中毒，发作性睡病，急性重度炎症，慢性顽固 性炎症，肾盂炎，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎，和子宫内膜异位症。B. 5配制剂为了在疾病治疗中使用，可以将通过本发明的结晶方法纯化的2H7抗体制备成液 体配制剂，其在20mM乙酸钠，4%二水合海藻糖，0.02%聚山梨醇酯20，pH 5. 5中包含约 20mg/ml抗体，供静脉内施用。还提供了如下的液体配制剂，其在20mM乙酸钠，240mM(8% ) 二水合海藻糖，0. 02%聚山梨醇酯20，pH 5. 3中包含约20mg/ml人源化2H7抗体。还可以 为了皮下施用将2H7抗体配制成如下的配制剂，其在30mM乙酸钠pH 5. 3，7%二水合海藻 糖，0.02%聚山梨醇酯20 (Tween 20 )中包含约150mg/ml抗体。下面的非限制性实施例中提供本发明的进一步详情。引用此申请全文中的所有专利、专利申请、出版物、产品说明、和方案，通过述及将 它们的公开内容完整收入本文。
实施例下面的实施例是仅仅出于例示目的而提供的，并非意图以任何方式限制本发明 的范围。除非另有说明，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。下文实 施例和整篇说明书中以ATCC编号所鉴别的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia)。在下文实施例中，除非另有 说明，2H7指人源化2H7抗体变体A。实施例1 透析结晶研究1. PBS浓度对2H7诱析结晶的影响用于诱析研究的材料和方法1. 150mg/ml 2H7 药物物质2. Pierce Slide-Alyzer 透析盒，30kDa 截留3. PBS 20X 和 IX4. IL玻璃烧杯将IL PBS装入带搅动棒的玻璃烧杯。遵照销售商的指令，将盒用PBS预浸泡30 秒钟，然后用181/2号针装入3ml 2H7。将盒漂浮在烧杯中，并用铝箔覆盖顶部。实验结束 时，取出盒，并用181/2号注射器取出任何上清液。然后沿着膜的边缘切开盒，并用刮刀从 膜层上刮下剩余材料。用20X 和 IX PBS 制备 0. IX、IX、IOX 和 20X 溶液。将 150mg/ml 散装(bulk)抗体 (2H7药物物质)透析入装有每种PBS浓度的烧杯。所有实验于37°C实施。2H7药物物质的组成(也称作配制散剂(formulated bulk))150mg/ml 2H730mM 乙酸钠，pH 5. 37%海藻糖脱水物0.02%聚山梨酯 20MM表2显示了 20小时后对每个盒的目视观察。图1显示了来自20X情况的沉淀物。 在显微镜下观察时，为了观察而放置在显微镜载玻片上的材料产生干燥且破裂的薄膜(图 2)。表2 :t = 20h时，PBS浓度对2H7散剂的透析结晶的影响
PBS浓度观察结果0.1X没有变化，没有结晶IX10%的盒具有小的、白色的沉淀物。以及浑浊和半透明沉淀物的 长条IOX泡沫，完全白色和不透明20X比IOX盒中的混合物中的蛋白质要拥。空气界面处是白色的，其 余部分是乳白色的和半透明的2.温度对2H7诱析结晶的影响基于先前的实验，为此研究选择IX PBS0分别使用2_8°C冷藏室、室温、和温箱环 境于4°C、24°C和37°C实施实验。正如先前的实验，使用150mg/ml2H7散剂(bulk)实施结
MS表3突显了 24小时结束时的显微镜观察结果。表3 显微镜观察结果温度对透析结晶的影响
权利要求
一种自混合物纯化CD20抗体的方法，包括使该CD20抗体结晶并自所述混合物回收该CD20抗体。
2.权利要求1的方法，其中所述混合物未曾进行在先冻干。
3.权利要求1的方法，其中所述混合物是生成该CD20抗体的重组细胞培养物的浓缩的 已收获的细胞培养液(HCCF)。
4.权利要求3的方法，其中该细胞培养物是哺乳动物细胞培养物。
5.权利要求4的方法，其中该哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
6.权利要求4的方法，其中该纯化是在没有蛋白A纯化步骤的情况中实施的。
7.权利要求6的方法，其中该纯化是在没有阳离子交换层析步骤的情况中实施的。
8.权利要求4的方法，其中该纯化另外包括病毒过滤步骤和阴离子交换层析步骤。
9.权利要求8的方法，包括下述步骤(a)使该CD20抗体结晶，(b)在缓冲液中溶解该 CD20抗体晶体，(c)将自步骤(b)获得的溶液进行阴离子交换层析，并(d)浓缩自该阴离子 交换层析获得的洗脱液。
10.一种自哺乳动物细胞的浓缩的已收获的细胞培养液(HCCF)纯化CD20抗体的方法， 包括下述步骤(a)浓缩该HCCF，(b)使该CD20抗体结晶，(c)溶解该CD20抗体晶体以获 得CD20抗体溶液，(d)将该CD20抗体溶液进行阴离子交换层析，并(e)分离该CD20抗体。
11.权利要求10的方法，其中该⑶20抗体是2H7抗体。
12.权利要求11的方法，其中该⑶20抗体选自下组表1中列举的2H7⑶20抗体变体A-I。
13.权利要求12的方法，其中该⑶20抗体选自下组表1中列举的2H7⑶20抗体变体 A、C 和 H，分别具有如 SEQ ID NO :1 禾口 2、SEQ ID NO :3 禾口 4 禾口 SEQ ID NO :3 禾口 5 所示的 VL 和VH对。
14.权利要求11的方法，其中该HCCF浓缩至⑶20抗体浓度为约1.5mg/ml或更大。
15.权利要求10的方法，其中结晶是在约6.0至约8. 0的pH实施的。
16.权利要求15的方法，其中结晶是在7.8+/-0. 2的pH实施的。
17.权利要求10的方法，其中结晶是在约4°C至约40°C的温度实施的。
18.权利要求17的方法，其中结晶是在约37°C的温度实施的。
19.权利要求10的方法，其中结晶是由一种或多种选自下组的沉淀剂诱导的PBS、 NaCl、Na2SO4, KCl、K2SO4, Na2HPO4 和 ΚΗ2Ρ04。
20.权利要求19的方法，其中该沉淀剂是ΚΗ2Ρ04。
21.一种自哺乳动物细胞的浓缩的已收获的细胞培养液(HCCF)纯化CD20抗体的方法， 包括下述步骤(a)浓缩该HCCF，(b)在抑制结晶的pH渗滤具有高盐浓度的该HCCF，(c)通 过提高PH使该CD20抗体结晶，(d)溶解该CD20抗体晶体以获得CD20抗体溶液，(e)将该 CD20抗体溶液进行阴离子交换柱纯化，并(f)分离所得纯化的CD20抗体。
22.权利要求21的方法，其中该⑶20抗体选自下组表1中列举的2H7⑶20抗体变体A-I。
23.权利要求22的方法，其中该⑶20抗体选自下组表1中列举的2H7⑶20抗体变体 A、C禾口 H，其分别具有如SEQ ID NO 1禾口 2、SEQ ID NO 3禾口 4禾口 SEQ ID NO 3禾口 5所示的 VL禾口 VH对。
24.⑶20抗体的晶体。
25.权利要求24的晶体，其具有微针、针、球状或球状花生形态。
26.一种组合物，其包含权利要求24的晶体。
27.权利要求26的组合物，其是药物组合物，包含一种或多种药学可接受赋形剂。
28.一种用于治疗CD20相关状况或疾病的方法，包括对哺乳动物受试者施用有效量的 通过权利要求1或权利要求21纯化的CD20抗体。
全文摘要
本发明总体上涉及结晶形式的抗CD20抗体及涉及结晶的抗CD20抗体纯化。
文档编号C07K16/06GK101945890SQ200880127230
公开日2011年1月12日 申请日期2008年12月16日 优先权日2007年12月21日
发明者布赖恩·洛博, 沙迪亚·A·奥肖迪, 蒂莫西·N·布里斯, 詹姆斯·A·威尔金斯 申请人:健泰科生物技术公司