专利名称：HIV p17蛋白的一种截短形式的制作方法
HIV p1 7蛋白的一种截短形式本发明总体而言属于免疫学领域，特别涉及HIV pl7蛋白的一种截短形式，其特别 适合用作抗HIV-I病毒的疫苗。开发一种有效的抗HIV-I疫苗是全世界科学界的主要目标之一。所述疫苗必须首 先能够同时引起显著的细胞应答和有力的体液活性发展，后者的特征在于产生能够中和病 毒感染性的抗体。在最近几年中，科学界的注意力已转到源于病毒的多肽用作抗病毒疫苗设计的基 石出。pl7蛋白，其构成HIV-I病毒的基质，从所述观点来看是特别令人感兴趣的一种生 物靶。实际上，尽管已被分类为结构蛋白，现在明确P17在病毒复制周期的多个阶段行使 多种功能，从病毒进入细胞质，到病毒遗传物质整合到细胞遗传物质，再到新病毒颗粒的组 装，因此不仅在病毒结构中而且在HIV-I复制周期中起到了极其重要的作用。近期研究已能指出pl7的结构与人促炎因子Y干扰素非常相似。此外，细胞生物 学研究已能指出P17调控来自天然或适应性区域的多种免疫系统细胞的生物学活性的能 力。具体而言，P17对HIV-I的优先目标CD4+T淋巴细胞亚群的活性已显示所述病毒蛋白能 够通过激活所述淋巴细胞以刺激它们，因而使其更易受病毒感染。另外，P17能够诱导激活 的T淋巴细胞向细胞培养微环境释放促炎细胞因子，例如γ干扰素和肿瘤坏死因子α，因 而产生最适HIV-I复制的有利环境。ρ17作为“病毒因子”的活性取决于所述蛋白与靶细胞表面表达的特异性受体的直 接相互作用。从生物学观点来看，ρ17能够通过影响功能和诱导HIV-I复制活性增加而作用于 HIV-I靶细胞的事实，使得该蛋白被认为是建立抗AIDS疫苗接种策略的优秀靶标。一个重 要的先决条件是P17应从HIV-I感染的细胞释放到细胞微环境。实际上，在体外HIV-I感 染的H9细胞释放大量pl7到细胞培养上清液。另外，最近已证实pl7在HIV-I血清阳性患 者的淋巴结以及抗逆转录病毒疗法(HAART)中以蛋白沉积物存在。令人感兴趣地注意到在 没有病毒颗粒和/或病毒基因组存在下可在淋巴结组织中检测到P17。这表明，如其它HIV 结构蛋白所证实，P17独立于病毒存在而作为外源蛋白作用于某些靶细胞。这解释了某些 研究者获得的数据，所述数据指出了高水平抗P17中和抗体的存在与获得性免疫缺陷综合 征进展的显著延迟之间的联系。由于P17在病毒结构中位于糖蛋白衣壳之内，因而抗体不 能接触，在发现P17由感染细胞释放之前无法解释所述数据。国际专利申请W003/016337描述了从HIV pl7分离的短肽，其代表pl7中和表位 (残基9到22)，其作为疫苗施用时能够产生中和免疫应答。但是，使用仅代表有限表位区域的肽作为疫苗制剂的基础或者作为能够刺激并引 起体液免疫应答的分子显示出某些缺点，主要的一点取决于肽通常表现出与全长蛋白显示 不同的构象的事实。因此，用此类肽免疫生产的抗体导致对天然病毒蛋白识别不佳，并因此 产生低效体液免疫应答。国际专利申请W003/082908描述了使用全长pl7蛋白作为疫苗以引起能够中和人类细胞上P17发挥的免疫刺激活性的免疫应答。但是，使用所述全长蛋白作为疫苗显示出 缺点，即所施用的全长蛋白可具有与天然病毒蛋白相同的有害生物效应。为克服所述缺点，本发明提供了 pl7蛋白的一种截短形式，称为“AT96”，其显示与 全长P17蛋白相同的免疫学特性，但不显示所述全长蛋白的典型有害生物活性。本发明的截短AT96蛋白由pl7蛋白的氨基酸1_96组成。优选地，AT96由序列表 中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列编码。更优选地，AT96具有序列表中SEQ ID N0:2所示 的氨基酸序列。本发明的截短AT96蛋白是一种非常有希望的抗HIV治疗分子，因为如下面实验章 节说明，即使其缺少对天然蛋白生物活性重要的P17羧基末端(即氨基酸97-132)，其仍然 保留免疫原性上重要的表位，即能促进中和细胞介导的和体液的免疫应答的表位。本发明的截短AT96蛋白已使用本身已知的重组DNA方法生产。简单来说，所述AT96蛋白通过扩增编码pl7的氨基酸1_96的核苷酸序列并将其 克隆到原核PGEX-4T表达载体(GE Healthcare)中生产。该核苷酸序列通过从源自BHlO 病毒株(NCBI登录号M15654)的全长pl7的编码序列开始的突变PCR而获得。使用的全长 P17的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :3所示，对应的所编码氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。通过使用特别设计的诱变AT96BamHI和AT96EC0RI引物，建立如下a) AT96编码序列上游的BamHI限制性位点，其对于随后克隆到原核pGEX_4T表达 载体是必须的，并设计产生能够与所述载体编码的谷胱甘肽转移酶(GST)以融合蛋白形式 表达AT96的限制性克隆；以及b)编码pl7的氨基酸96的GAC三联体下游的终止密码子和EcoRI限制性位点，其 对于随后克隆到PGEX-4T是必须的。AT96BamHI和AT96EC0RI引物的序列分别如序列表中SEQ ID NO :5禾口 SEQ ID NO 6所示。所述扩增反应(终体积200 μ 1)使用20ng包含全长pl7核苷酸序列的质粒作为 模板进行。所述PCR反应使用的条件如下94°C，30秒；50°C，30秒；72°C，60秒；共30个循 环。扩增产物使用标准程序纯化(Qiaquick PCR Purification Kit，Qiagen)，然后使用限 制性内切酶BamHI和EcoRI消化，最后克隆到使用相同限制性内切酶预先消化的pGEX_4T 质粒的多克隆位点。所得构建体(PGEX-AT96)使用Big Dye Terminator labeling (Applied Biosystems)测序，结合测序仪和毛细管色谱(ABI PRISM 7700)根据标准程序分析。重组DNA技术也用于根据本身已知方法生产所述AT96蛋白。所述pGEX-AT96构建体(20ng)通过电穿孔引入E. coli (BL21)，所述转化细菌在 包含氨苄青霉素的平板上选择。所选菌落中AT96插入片段的存在通过质粒DNA的提取、纯 化、和限制性酶切检查。阳性菌落用于在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中建立高容量(2-4升)生产培 养物。所述细菌在37°C孵育直至达到对应于平台期开始的光密度值(0.8AU)，然后在30°C 温度通过加入IPTG (异丙基-β-硫代半乳糖苷，Sigma Aldrich)至终浓度IOOmM诱导生 产蛋白。所述IPTG通过去除IacZ操纵子上的阻断，允许所述重组蛋白大量表达。所述ΑΤ96蛋白，以与GST酶(谷胱甘肽_S_转移酶，其序列已插入pGEX系列载体)的融合体生产，通过超声波破碎细菌细胞提取并使用谷胱甘肽琼脂糖4B珠子填充的亲 和柱(GE Healthcare)纯化，所述谷胱甘肽琼脂糖4B珠子由于与GST酶极其相关，以选择 性方式捕获所述融合蛋白。然后AT96使用凝血蛋白酶(GE Healthcare)通过蛋白水解切除从GST分离。备 选地，其可使用包含还原谷胱甘肽的缓冲液从所述谷胱甘肽琼脂糖基质洗脱，并借助于离 液序列高的物质保存在溶液中。最后所述蛋白进行缓冲液交换，使用3500kDa截断的纤维 素膜(Pierce)对氯化钠溶液透析，并使用离子交换柱通过HPLC(GE Healthcare)进一步纯 化。所述截短蛋白的免疫特性如下面实验章节所述通过实验检查，参考附图，其中
图1表示本发明的截短AT96蛋白的三维结构和氨基酸序列(SEQ IDNO :2)。图1 列出的氨基酸序列基于单字母密码，而序列表列出的氨基酸序列基于三字母密码。图2表明了用于证实所述截短AT96蛋白对抗pl7抗体反应的蛋白质印迹结果。在 15%聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，所述蛋白转移到硝酸纤维素膜上。使用直接抗pl7氨基末 端部分的纯化小鼠单克隆抗体(MBS-3)检测所述蛋白。所述膜使用DAB(二氨基联苯胺) 作为底物，使用HRP结合的抗小鼠抗体显影。A)和C)pl7(17KDa) ；B)使用还原谷胱甘肽洗 脱后的AT96-GST(53KDa) ；D)使用凝血蛋白酶切除后的AT96 (IlKDa)。图3显示了 pl7和AT96之间进行的竞争性ELISA测试结果，其用于评估所述蛋白 对MBS-3抗体的亲和力。MBS-3抗体与pl7和AT96蛋白之间的结合率通过使用免疫复合物 溶液进行固相ELISA试验以检测pl7来间接计算。AT96(A)显示与全长pl7 ( ■)相同的 mAb亲和力。图4显示了有关AT96结合Raji细胞上表达的pl7受体以及蛋白-受体相互作用 中和的实验结果。A)Raji细胞与无关蛋白(GST)孵育；B) Raji细胞与AT96 (50ng)孵育；C) Raji细胞与AT96(50ng)孵育，其中存在用能够模拟pl7氨基末端部分的肽(AT20)(1 50) 免疫的小鼠血清，并包含小鼠中和抗P17抗体；D) Raji细胞与AT96(50ng)在用能够模拟 P17羧基末端部分的肽(CT18)(1 50)免疫的小鼠血清存在下孵育。图5显示了第一次免疫后35天对AT96和pl7的体液应答。所显示的抗体应答来 自如下免疫3次的小鼠组(A)使用AT96，剂量1 ( · )、5( ■)和25( ▲ ) μ g/小鼠，或者 使用P17(B)剂量1(·)、5(·)和25(A)yg/小鼠。Γ)未免疫小鼠。各血清集合用 ELISA试验重复分析3次。图6显示了 pl7和AT96的淋巴细胞增生性活性之间的比较。培养从用pl7或 AT96免疫的小鼠脾脏提取的细胞，并用一种或另一种蛋白再刺激7天，以评估该蛋白诱导 特异性T淋巴细胞克隆扩展的能力。向所述小鼠施用3次连续剂量(25 μ g/小鼠)的与 Freund' s不完全佐剂联合的pl7 (中间条)、AT96 (右条)或PBS (左条)。最后一次加强 抗原注射后2个月，处死所述小鼠并移除脾脏用于细胞增殖研究。细胞在pl7或AT96存在 或不存在的条件下培养。以氚标记胸腺嘧啶核苷的引入为基础评估增殖。所述数据代表使 用来自不同动物的细胞进行的5次实验。图7显示了涉及小鼠⑶8+T细胞对AT96应答的特异性扩展的结果。所述小鼠接 受了 3次剂量的与Freimd’ s不完全佐剂结合的25 μ g/小鼠的AT96。最后一次加强注射 后2个月，处死所述小鼠，在AT96作为所述加强抗原不存在(A)或存在(B)的情况下脾脏细胞培养7天。所述细胞使用FITC缀合的抗CD8单克隆抗体标记。在A和B中作图的区 域包括的细胞以密度和大小代表淋巴细胞群。所述数据使用CellQuest程序分析并已表示 为点坐标图。所述AT96刺激的培养物中CD8+T细胞(C)的比例如右上角所示。图8涉及pl7刺激后通过Raji细胞中的蛋白质印迹评估MAP激酶和pAKT的磷酸 化指数。鉴定Raji细胞中的磷酸化ERK1/2 (A)和pAKT⑶MAPs，所述Raji细胞未经pl7处 理(1 道)或经过增加浓度的 100ng/ml (2 道)、200ng/ml (3 道)、500ng/ml (4 道)UOOOng/ ml (5道)、2000ng/ml (6道)的ρ 17处理5分钟时间。通过评估总MAPs (C)进行蛋白量的 检测。图9显示了 ΑΤ96刺激后通过Raji细胞中蛋白质印迹评估获得的MAP激酶磷酸化 指数的结果。鉴定Raji细胞中的磷酸化ERK1/2㈧MAPs，所述Raji细胞未经AT96处理(1 道)或经过增加浓度的 100ng/ml (2 道)、200ng/ml (3 道)、500ng/ml (4 道)U000ng/ml (5 道)、2000ng/ml(6道)的AT96处理5分钟时间。通过评估总MAPs (B)进行蛋白量的检测。实施例1使用能够结合pl7中和表位的抗pl7抗体识别AT96使用免疫酶(ELISA)和蛋白质印迹试验评估AT96对能够结合pl7中和表位的抗 P17抗体的应答(图2)。为证实与细胞受体相互作用的功能表位的构象保留在AT96蛋白中，建立竞争性 ELISA试验以评估AT96在溶液中与MBS-3单克隆抗体相互作用的比例，所述MBS-3单克隆 抗体识别P17的功能部分并抑制pl7/受体相互作用[1]。然后液相中AT96作为MBS-3与 孔中(固相)存在的P17之间结合的竞争者的活性与pl7用作自身竞争者的活性相比较。所述纯化的抗体与增加浓度的AT96或pl7蛋白孵育，然后所获得的免疫复合物 用于MBS-3对固定于固相(在板孔底部)的野生型pl7的结合活性的ELISA测定。源自 BHlO病毒株的重组pl7以100 μ 1 PBS中1 μ g/ml的浓度加入到用于免疫酶测定的聚苯乙 烯板的每个孔中，所述板在室温下孵育过夜。抗原包被的板作为检测板；而未包被的板作 为反应板。为最小化所述蛋白的非特异性吸收，向检测板的每个孔中加入包含2% BSA的 200 μ IPBS (测定缓冲液)。反应和检测板都在37°C孵育1小时。所述板使用包含0.1% tween 20的PBS (洗涤缓冲液)洗涤。向反应板的每个孔加入100 μ 1适当稀释的MBS-3 抗Ρ17单克隆抗体，以及100 μ 1浓度在0. 1到25 μ g/ml测定缓冲液范围内的AT96，或仅 仅100 μ 1测定缓冲液。在室温孵育2小时后，从反应板的孔中转移100 μ 1等分量到检测 板的孔中。检测板在室温孵育2小时，然后用洗涤缓冲液洗涤4次。通过加入HRP缀合的 抗小鼠抗体检测结合于固相的MBS-3单克隆抗体。从图3可知，MBS-3抗体对ΑΤ96的亲和力与其对全长ρ 17蛋白的亲和力相同，证 实MBS-3抗体识别的氨基末端表位的三维结构完全地保留下来，且在本发明的截短ΑΤ96蛋 白中所述表位暴露出来。ΑΤ96蛋白，因完整保留功能性和免疫原性表位，一旦接种到生物体 中，应该能够诱导显著的细胞介导的和体液的抗P 17免疫应答。在此语境中，体液应答意 为产生中和ρ17生物学活性的抗体，所述抗体经设计用于阻断ρ17和ρ17受体之间的相互 作用。实施例2ΑΤ96与ρ17受体之间的相互作用以及所述相互作用的中和
材料与方法MM :AT96结合pl7细胞受体的能力在来自Raji细胞系的细胞上测定，即高度表 达P17受体的Burkitt's淋巴瘤细胞。所述细胞在包含10% FCS (小牛血清)、100U/ml青 霉素、50 μ g链霉素和ImM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(Gibco BRL)中培养。AT96与牛物素缀合所述AT96蛋白与生物素缀合以允许通过共价结合荧光链霉 亲和素使用荧光法检测。所述蛋白通过透析膜(3500kDa截断，Pierce)对pH 8. 0的氯化 钠/碳酸氢钠溶液进行缓冲液交换。然后所述蛋白在4°C与生物素琥珀酰亚胺酯(BioSPA) 反应3小时，并进一步对包含0. 2M氯化钠的PBS (磷酸缓冲盐溶液)透析过夜。结合与中和试验使用细胞荧光测定法测定血清阻断AT96结合pl7受体(pl7R) 的能力，所述血清采集自用模拟Pl7氨基末端部分的称为AT20(序列表中SEQ ID NO 7)的 肽免疫的动物。AT20免疫动物的血清经PBS(1 50)稀释后与生物素化的AT96(50ng)在 4°C孵育20分钟。Raji细胞使用FcR阻断试剂(Miltenyi Biotech)在4°C处理15分钟， 离心，然后重悬于预先与AT96孵育的血清。来自用模拟pl7羧基末端部分的称为CT18的 肽免疫的动物的血清用作对照。然后所述细胞用PBS洗涤，并在冰上与IOOng缀合APC或 PE Cy5. 5荧光染料的链霉亲和素(Becton Dickinson)孵育。使用FACSCalibur仪器进行 所述样品的细胞荧光分析，使用CellQuest Pro程序(Becton Dickinson)分析数据。合成肽:AT20合成肽由P17蛋白的氨基酸位点9和28之间的20个氨基末端氨 基酸(SEQ ID NO 7)组成。而CT18合成肽由pl7的氨基酸位点115和132之间的18个 羧基末端氨基酸(SEQ ID NO 8)组成。这些肽以游离形式合成，然后缀合到来自Primm的 KLH(锁孔帽贝血蓝蛋白)载体。免疫步骤使用经Freund，s完全佐剂乳化的AT20-KLH或CT18-KLH以1、5、和 25μ g/小鼠的剂量通过腹腔途径免疫C57BL/6小鼠并间隔15天连续2次，使用相同剂量的 不完全佐剂中的免疫原加强。通过ELISA进行免疫动物血清中抗AT20和抗CT18抗体的检 测。ELISA 通过ELISA试验测定免疫小鼠血清中抗AT20和抗CT18抗体的存在。 ELISA板(Nunc)的孔使用IOOng AT96蛋白在PBS中室温下包被过夜。使用洗涤缓冲液 (PBS+0. 1 % tween)洗涤2次后，加入100 μ 1测定缓冲液(PBS+2% BSA)并在37°C孵育1小 时。洗涤4次后，向每个孔转入100 μ 1待测血清的梯度稀释液(从1 100到1 3200)。 在37°C孵育1小时后，进行4次洗涤，加入100 μ 1/孔HRP缀合的抗小鼠抗体的1 1000 稀释液。在37°C孵育1小时后，进行4次洗涤，加入100μ1四甲基联苯胺底物。每孔使用 100 μ 1 2Ν硫酸中止显色反应。结果迄今为止所阐明的实验已允许建立ΑΤ96蛋白氨基末端部分的完整性，假设为允 许Ρ17与其细胞受体相互作用的区域。因此，ΑΤ96应该能够如野生型ρ17蛋白一样与细胞 膜上的受体相互作用。根据实验，这已通过测定ΑΤ96与在表面高密度表达ρ17受体的Raji细胞系B细 胞的结合进行评估。所述细胞与生物素缀合的ΑΤ96蛋白孵育30分钟。数次洗涤后，通过 加入荧光链霉亲和素(与APC或PE Cy5. 5荧光染料缀合)检测生物素化的AT96与细胞表 面的结合。
图4显示无关生物素化蛋白不与Raji细胞结合(图4A)。相反，AT96能够结合 Raji细胞膜上的细胞受体(图4B)。实际上，细胞荧光分析显示，B中代表AT96标记的荧 光细胞的直方图，比A中不能结合Raji细胞表面的分子标记的细胞的直方图具有更高的光 密度对数等级。如预期一样，在整个细胞群体中可检测到AT96结合。类似地，还评估了指向特异性氨基末端中和表位的称为AT20[2]的抗体阻断pl7 与细胞受体体外相互作用的能力。AT96蛋白与用复制pl7氨基末端表位序列(AT20)的肽 免疫的动物血清孵育，或者与用能够模拟P17羧基末端序列且不存在于AT96中的肽免疫的 动物血清孵育。然后使用荧光链霉亲和素作为荧光示踪剂检测AT96/pl7受体相互作用。从 已进行的实验可知，AT96与野生型pl7 —样，关于其对特异性受体的结合活性，被指向氨基 末端部分的抗体中和(图4C)，而不能被指向羧基末端部分的抗体中和(图4D)。这些数据 证实如下假说，P17与其受体之间的相互作用以高度特异性方式存在，很有可能通过其氨基 末端。实施例3诱导抗AT96的免疫应答最近，已证明pl7作为抗原能够在动物模型中诱导中和及细胞介导的体液免疫应 答[2]。另外，pl7能够作为体外加强抗原，诱导从事先用病毒蛋白免疫的动物提取的T淋 巴细胞的增殖。3. 1诱导体液应答免疫步骤通过平行使用全长pl7和本发明的截短AT96蛋白进行的本研究获得的 数据指出后者也能够诱导中和体液应答。所述免疫如下进行用不同剂量的P 17和AT96 在Freimd’ s不完全佐剂存在下施用免疫30只9周龄小鼠。每组由5只小鼠组成，通过腹 腔途径以1、5、和25yg/小鼠施用pl7或AT96蛋白。随后，用相同剂量的免疫原间隔15天 进行2次连续的加强注射。通过对小鼠接种PBS和Freimd’ s不完全佐剂准备阴性对照。 免疫小鼠在免疫后0、10、24、35天取血样。用pl7和AT96对Balb/小鼠的免疫日程表在下面表1中列出。表 权利要求
一种截短蛋白，AT96，由HIV 1全长p17蛋白氨基酸序列的1到96残基组成，所述截短AT96蛋白具有下列免疫学特性(i)其能够结合抗p17抗体，所述抗p17抗体能够抑制p17/p17受体(p17R)相互作用，且结合亲和力与所述抗体和全长p17蛋白之间存在的结合亲和力基本相同；(ii)其能够结合p17受体；(iii)其能够引起中和p17/p17受体相互作用的抗p17体液免疫应答，且其能够在所施用对象体内引起细胞介导的免疫应答；其中所述截短AT96蛋白基本上缺少对全长p17蛋白具有的细胞激酶磷酸化的抑制活性。
2.根据权利要求1所述的截短AT96蛋白，其中激酶磷酸化抑制通过评估Raji细胞中 ERK 1/2和pAKT的磷酸化进行检测。
3.根据权利要求1或2所述的截短蛋白，其具有SEQID NO 2的氨基酸序列。
4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的截短蛋白用作药物。
5.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的截短蛋白用作药物，所述药物能够引起 中和HIV pl7蛋白的生物学活性的免疫应答。
6.根据权利要求5所述的截短蛋白，其中所述药物适合用于治疗或防止HIV感染。
7.—种核酸，其编码根据权利要求1到3中任一权利要求所述的截短蛋白。
8.根据权利要求7所述的核酸，其具有SEQID NO :1的核苷酸序列。
9.药用组合物，其包含药学上有效量的根据权利要求1到3中任一权利要求所述的截 短蛋白。
10.根据权利要求9所述的组合物，为免疫原性或疫苗组合物。
全文摘要
本发明涉及HIV-1p17蛋白的一种截短形式，称为AT96，其由全长p17蛋白的1到96残基组成，以及对应的核酸序列。所述截短的AT96蛋白具有与全长p17蛋白相同的免疫学特性，但同时没有HIV-1p17蛋白的典型有害生物活性。
文档编号C07K14/16GK101969998SQ200880128186
公开日2011年2月9日 申请日期2008年12月16日 优先权日2008年1月15日
发明者G·梅里齐 申请人:梅迪斯蒂研究及生产股份有限公司