专利名称：五肽类似物,其制备及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗肿瘤活性的五肽衍生物，其制备方法，含它们 的药物组合物及它们在治疗癌症中的用途。
背景技术：
多肽类化合物具有结构新颖，活性显著，作用专一的特点，其生
物活性主要集中于抗胂瘤和抗真菌方面。Dolastatin 15是源自西印 度洋软体动物海兔Z o7a力e77a awn'c"/ar/a的一个线性天然多肽，经 美国国家癌症研究所(NCI)筛选发现具有很强的抑制细胞生长的活性， 对多种恶性胂瘤细胞有抑制作用。作用机制的初步探讨发现，其可作 用于微管蛋白，抑制有丝分裂，阻断细胞周期。因此有必要寻找新的 具有抗肿瘤活性的多肽化合物。 发明目的
本发明的目的是寻找新的具有抗肿瘤活性的多肽化合物或其先导 化合物。
发明筒述
本发明人经研究现已发现式(I)的五肽类似物
X-Y-Z-L-M-N ( I)
或其立体异构体具有良好的抗肿瘤活性，因此式(I)五肽类似物或其 立体异构体可作为药物用于治疗癌症。
本发明涉及式(I)五肽衍生物或其立体异构体，
X-Y-Z-L-M-N ( I)
其中
X为L-或D-a-型-N-端单烷基或双烷基取代的亲脂性氨基酸，四 氢异喹啉-3-羧酸，3, 4-二氢异喹啉-3-羧酸，烷基为C「Cs的直链或 支链或C3-C7元环状烷基，亲脂性氨基酸选自Gly、 Ala、 Val、 Leu、Nle、 Ile、 Pro、 Tle、 MeVal等；
Y为L-或D-a-型亲脂性天然或非天然氨基酸，如Gly、 Ala、 Val、 Leu、 Nle、 Ile、 Pro、 Tle、 MeVal等；
Z为L-或D-cc-型N-端单烷基取代的亲脂性氨基酸，烷基为d-C5 的直链或支链或C3-C7元环状烷基，亲脂性氨基酸为Gly、 Ala、 Val、 Leu、 Nle、 Ile、 Pro、 Tle、 MeVal等；
L和M为下列L-或D-a-型氨基酸中的任意两个或部分自身组合 N原子在四~七元环上的氨基酸，3， 4-二氢异喹啉-3-羧酸，四氢异 喹啉-3-羧酸，反式或顺式-4-取代-脯氨酸，取代基为幾基、卣素、硝 基、氨基、C广Cs直链或支链烷基、C3-C7环烷基、d-Cs烷氧基、氨基、 C「Cs酰胺基、二(C「Cs直链或支链烷基)胺基、C3-C7环烷胺基、含氧、 辟u、氮原子的(:3-(:7环烷胺基；
N为脂肪胺或芳香胺衍生物，取代或未取代的肼或籽。
本发明涉及含至少一个式(I)五肽衍生物或其立体异构体，及药 用栽体或赋形剂的药物组合物。
X-Y-Z-L-M-N ( I)
其中
X为L-或D-a-型-N-端单烷基或双烷基取代的亲脂性氨基酸，四 氢异喹啉-3-羧酸，3， 4-二氢异喹啉-3-羧酸，烷基为d-Cs的直链或 支链或C3-C7元环状烷基；亲脂性氨基酸为Gly、 Ala、 Val、 Leu、 Nle、 Ile、 Pro、 Tle、 MeVal等；
Y为L-或D-a-型亲脂性天然或非天然氨基酸，Gly、 Ala、 Val、 Leu、 Nle、 Ile、 Pro、 Tle、 MeVal等；
Z为L-或D-ct-型N-端单烷基取代的亲脂性氨基酸，烷基为C「Cs 的直链或支链、C3-C7元环状烷基，亲脂性氨基酸为Gly、 Ala、 Val、 Leu、 Nle、 Ile、 Pro、 Tle、 MeVal等；
L和M为下列L-或D-ct-型氨基酸中的任意两个或部分自身组合 N原子在四 七元环上的氨基酸，3， 4-二氢异喹啉-3-羧酸，四氢异 喹啉-3-羧酸，反式或顺式-4-取代-脯氨酸，取代基为羟基、卣素、硝基、氨基、C「Cs直链或支链烷基、C3-G环烷基、d-Cs烷氧基、氨基、
C厂Cs跣胺基、二(c厂u直链或支链烷基)胺基、c3-c 环烷胺基、含氧、
硫、氮原子的C3-C7环烷胺基；
N为脂肪胺或芳香胺衍生物，取代或未取代的肼或J!f。 本发明还涉及制备式I五肽衍生物或其立体异构体的方法，其包
括
1) 将化合物Boc-L-OH与M-OP在DMF, DCM， TEA, DIC-HOBt中 反应，其中L， M如权利要求2中定义，P为d-s烷基，生成Boc-L-M-OP;
2) 将l)中所得产物在盐酸/二氧六环中脱去氨基保护基，生成 L-M-0P;
3) 将2 )中产物L-M-0P与Boc-Z-0H在DMF, DCM， TEA, DIC-隨t 中反应，生成Boc-Z-L-M-0P，所得产物如2)中所述进行反应，生成 脱去氨基保护基的Z -L-M-OP;
4) 将3 )中产物Z-L-M-0P与Boc-Y-0H在DMF， DCM, TEA， DIC-HOBt 中反应，生成Boc-Y-Z-L-M-0P;
5) 将4)中产物Boc-Y-Z-L-M-0P在氢氧化钠/甲醇溶液中皂化， 然后用柠檬酸酸化，生成Boc-Y-Z-L-M-OH;
6) 将5 )中产物Boc-Y-Z-L-M-OH与N-NHR在DCM， DIC-HOBt中 反应，生成Boc-Y-Z-L-M- N;
7) 将6 )中产物Boc-Y-Z-L-M-N如2 )中所述进行反应，生成脱 去氨基保护基的Y-Z-L-M-N;
8) 将7)中产物与X-0H在DCM, TEA, DEPC中反应，生成式I X十Z-L-M-N。
本发明还涉及式(I)五肽类似物或其立体异构体在制备用于治疗 癌症的药物中的用途。涉及的肿瘤细胞如成纤维细胞MRC5CV1、膀胱 癌细胞T24、鼠白血病细胞L1210、鼠白血病细胞P388、人肺癌细胞 A549、人结肠癌细胞HT29、人结肠癌细胞L0V0、猴肾成纤维细胞CV1、 人乳腺癌细胞MCF7、人恶性胶质瘤/星形细胞瘤细胞U373、人卵巢癌 细胞HEY、表皮样瘤细胞系KB、黑素瘤细胞B16、 MDA-MB-435乳腺癌细胞、HeLa S3子宫颈癌细胞、人红白血病细胞K562、人卵巢癌细胞 0VCA2780、人胃印戒癌细胞Kato-III等 发明详述
在本发明中使用的缩写具有下面的含义
Ala —丙氨酸，
Gly —甘氨酸，
lie -异亮氨酸，
Leu -亮氨酸，
Val —缬氨酸，
MeVal -甲基缬氨酸，
Phe —苯丙氨酸，
Pro -脯氨酸，
BA —苯甲胺，
BEA —苯乙胺，
DEA — 二乙胺，
DCHA — 二环己胺，
Mpl -吗啡啉，
Prd -旅咬，
TEA —三乙胺，
Thp -四氢吡咯，
DCM — 二氯甲烷，
DMF - 二甲基甲酰胺，
DIC — 二异丙基碳二亚胺，
HOBt - 1-羟基苯并三唑，
Boc -叔丁氧羰基，
DEPC —氰基磷酸二乙酯，
THF -四氢呋喃。
术语t;卜5烷基"指含l-5个碳原子的直链或支链烷基，如甲基， 乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基。本发明所用术语义(I)五肽类似物立体异构体"是指其相应
的D-或L-立体构型。
根据本发明，式(I)五肽类似物或其立体异构体可按本领域已 知方法、文献方法或下面所示的反应路线1制备
反应路线1
Boc-Z^OH + M-OP -!——Boc-Z-M-OP——"-^Z-M-OP
Boc-MeVal-OH
Boc-MeVal-Z-M-OP
MeVal-Z-M"OP
Boc-Y-OH
N-NH，
X-OH
Boc-Y-MeVal-Z-M-OP-115——》^Boc-Y-MeVal-Z-M OH
Boe-Y-MeVal-Z-M-N
X-Y-MeVal-Z-M-N
Y-MeVal-Z-M-N
i. DMF^MJAAJ3IC-HOBt ii. 4N HCl/l,4"Dioxane iii. 1N NaOH/MeOH
iv. DCMJ3IC-HOBt v. DCMJAA^DEPC
在反应路线1中，化合物Boc-L-0H ( L如上定义)与M-0P ( M如 上定义，P为CH烷基，其可选自甲基，乙基，异丙基，丁基，仲丁基， 异丁基，叔丁基，优选甲基和乙基)在DCM, DMF, TEA, DIC-HOBt中 反应，生成Boc-L-M-OP (其中L, M， P如上定义)。将Boc-L-M-0P 经4摩尔盐酸/二氧六环脱保护基，生成Z-M-0P。将L-M-0P与Boc-Z-OH 在DCM, DMF, TEA, DIC-H0Bt中反应，生成Boc-Z-L-M-OP。将 Boc-Z-L-M-OP经4摩尔盐酸/二氧六环脱保护基，生成Z-L-M-0P。将 Z-L-M-OP与Boc-Y-OH在DCM， DMF， TEA, DIC-H0Bt中反应，生成 Boc-Y-Z-L-M-OP。将Boc-Y-Z-L-M-OP经1摩尔氪氧化钠/甲醇急化， 生成Boc-Y- Z-L-M-0H。将Boc-Y-Z-L-M-OH与N-NHR在DCM， DIC-HOBt 中反应，生成Boc-Y-Z-L-M-N。将Boc-Y-Z-L-M-N经4摩尔盐酸/二氧 六环脱保护基，生成Y-Z-L-M-N。将Y-Z-L-M-N与X-OH在DCM， TEA, DEPC中反应生成X-Y-Z-L-M-N。
9根据本发明，式(I)五肽类似物的立体异构体包括D-和/或L-构型。
根据本发明，式(I)五肽类似物及其立体异构体在人癌症细胞筛 选中显示较好的抑制细胞生长的活性。
本发明涉及含有作为活性成分的有效剂量的至少一种式(I)五肽 类似物和/或其立体异构体以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。 通常本发明药物组合物含有0. 1~90%的式(I)五肽类似物和/或其立 体异构体。药物組合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时， 如果需要，可将式(I)五肽类似物和/或其立体异构体与一种或多种 固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用 形式或剂量形式。
本发明式(I)五肽类似物及其立体异构体或含有它的药物组合物 可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、 皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、 胶嚢、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、 脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、 緩释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成 片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子，如稀 释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、乳糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、硫酸 钓、氯化钠、尿素、碳酸钓、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润 剂与轱合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、 糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、 紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干燥淀 粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钓、聚 氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维 素等；崩解抑制剂，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等； 吸收促进剂，如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，如滑石粉、二 氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可 以将片剂进一步制成包衣片，如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域 公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄
糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、 高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、 米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基 磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可 以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二 醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。 为了将给药单元制成胶嚢，将有效成分式I五肽衍生物或其立体异构 体与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬胶嚢或软胶 嚢中。也可将有效成分式I五肽衍生物或其立体异构体制成微嚢剂， 混悬于水性介质中制成混悬剂，亦可装入硬胶嚢中或制成注射剂应用。 为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混 悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，如水、乙醇、聚乙二醇、1， 3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山 梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中 添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、 緩冲剂、pH调节剂等。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、 矫味剂、甜味剂或其它材料。
实施例
下面的实例及生物活性实验用来进一步说明本发明，但这并不意
味着对本发明的任何限制。
实施例化合物熔点由RY-1型熔点仪测定，温度未经校正；1HNMR 图谱由Bruker ARX 400型或US Varian Unity Inova 600型核磁仪 测定；FAB质谱由Zabspect高分辨磁质谱仪测定；元素分析由Carlo Erba 1106型元素分析仪测定；紫外光谱由UV-260紫外可见分光光度计测定；红外光谱由Magna IRTM 550红外仪测定。实施例制备所用反 应试剂均为商品化产品。
非天然氨基酸的制备
N， N-五亚甲基-L-缬氨酸盐酸盐(HC1.PMI-L-Val)的制备 L-缬氨酸甲酯盐酸盐3. 35克(20mmol)，加入叔丁醇300毫升， 溶解，加入三乙胺8. 35毫升(60mmol),混浊，加入1， 5-二溴戊烷 3. 0亳升(22mmol)后，补加叔丁醇100亳升，油浴45"C， 36小时。 浓缩，加入二氯甲烷20亳升，滤除固体。滤液分别用饱和碳酸氢钠、 饱和氯化钠洗一次，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，浓 缩，得棕黄色油状物，加入10毫升盐酸乙醇，溶解，浓缩，用无水乙 醇-无水乙醚重结晶，室温放置，析出针状结晶1.7克，in.p. 137~139 匸。加入4mol/L盐酸溶液，回流4小时，浓缩得白色固体，得约1.4 克，m. p. 222- 225"C, MS: [M+H]+=186。
N， N-六亚甲基胺甲跣-L-亮氨酸(證-L-Leu)的制备 L-亮氨酸甲酯盐酸盐7. 26克(40mmol)，加入二氯甲烷50毫升， 溶解，冷却至-10X:,搅拌加入吡咬8毫升(lOOmmol),滴加氯甲酸 苯酯6. 50克(41.5mmol) /20亳升二氯甲烷，搅拌1小时后，倾入冰 水中，分出有机相，水相用二氯甲烷提取两次(15亳升x2)，合并 有机相，以饱和氯化钠洗两次(20亳升x2)，无水硫酸钠干燥后， 减压蒸干，得无色油状物，加入六亚甲基亚胺32毫升(280mmo1)、 三乙胺80毫升(575mmol)和氯仿20亳升，50- 55t:撹拌反应2小时， 减压浓缩，加入乙酸乙酯40亳升和水40毫升，乙酸乙酯层分别用1 摩尔盐酸(20毫升x2 )、饱和碳酸氢钠溶液30毫升和饱和氯化钠溶 液洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，得无色油状物，加入甲醇80亳升和2 摩尔氲氧化钠溶液50亳升，室温搅拌90分钟，以2摩尔盐酸调pH 至8.0，减压浓缩至40亳升，乙醚萃取(20亳升x2),水相在冷却 条件下用浓盐酸酸化至pH2 3,析出白色颗粒状晶体，滤集千燥，用 乙酸乙酯-环己烷重结晶，得7.4克(72%), m.p. 92~94.5*C, MS:[M+H]+=242。
N-叔丁氧羰基-N-甲基-L-缬氨酸(Boc-N-Me-L- Val)的制备 Boc-L-Val 4. 35克(20mmol)，加入无水THF/DMF ( 10: 1)的混 合溶液55亳升，溶解，加入碘甲烷10亳升(160,ol)，氬化钠固体 2.88克(50%， 60mmol)，油浴80t:， 24小时。浓缩，加入乙醚和水， 振摇分液，水相再用乙醚提取三次(40亳升x3)，乙醚层用无水疏 酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩，得黄色分界不明显的油状混合 物。加入THF40亳升，溶解，冰浴搅拌下，滴加lNNaOH 40亳升， 水浴30分钟后，室温反应12小时。浓缩除THF，加入乙醚萃取两次 (25毫升x2)，水相加入乙酸乙酯5毫升，于水浴搅拌下用柠檬酸 调pH 2,用乙酸乙酯萃取四次(50毫升x4)，合并乙酸乙酯层，无 水>^酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩，得黄色油状物4.2克(90%)， MS: [M+H]+=232。
N-乙酰基-N-甲基-L-缬氨酸(N-Ac-N-Me-L-Val)的制备 L-Val 11. 7克(0. l迈ol)，溶于2N NaOH 110毫升(0. 22mol) 溶液中，水浴搅拌下，滴加醋酐11.34毫升，温度控制在0 5t:,反 应40分钟。加入浓盐酸，调pH~2,析出白色固体12.7克(80%， 80mino1)。取出该固体3. 2克(20nuno1),加入无水THF/DMF ( 10: 1) 的混合溶液55毫升，溶解，加入碘甲烷10亳升(160nnno1),氲化钠 固体2.88克(50%， 60mmo1)，油浴80匸，24小时。浓缩，加入乙醚 和水，振摇分液，水相再用乙醚提取三次(40亳升x3),乙醚层用 无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩，得黄色分界不明显的油 状混合物。加入THF 40毫升，溶解，冰浴搅拌下，滴加IN Na0H 40 毫升，水浴30分钟后，室温反应12小时。浓缩除THF，加入乙醚萃 取两次(25毫升x2),水相加入乙酸乙酯5毫升，于冰浴撹拌下用 柠檬酸调pH-2，用乙酸乙酯萃取四次(50亳升x4)，合并乙酸乙酯 层，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩，得白色针状结晶2. 77 克(80%), in.p. 112-114"C, MS: [M+H]+=160。 N-甲基-L-脯氨酸(N-Me-L-Pro)的制备
13L-Prol. 0克(8. 68mmol)，溶于40毫升水，加入甲醛水溶液(37 ~ 40%)0. 7毫升(8. 68mmo1 )，钯炭0. 25克，通氬气450亳升(20mmo1 )。 吸氢完全后，将反应液加热至微沸，趁热过滤，浓缩滤液，无水乙醇-丙嗣重结晶，4X:冰箱过夜，得白色针状结晶1. 11克(99%), m. p. 109 ~ 112*C， MS: [M+H]+=130。
N, N-二甲基-L-缬氨酸(N， N-Me2-L-Val)的制备方法和途径 同N-甲基-L-脯氨酸。产品为白色针状结晶，m.p. 152~154X^, MS: [M+H]+=146。
N-叔丁氧羰基-四氬异喹啉-3 (R)-羧酸((R) -Boc-Tic)的制
备
L-Phe5. O克(33mmol),加入甲醛水溶液(37- 40%) 11. 5亳升 和浓盐酸38毫升，油浴90X:， 3小时后，再加入浓盐酸10毫升和甲 醛水溶液(37-40%) 5亳升，油浴95X:, 3小时。室温放置过夜，析 出固体。固体在水浴中用氨水/水(2: 3)溶解，浓盐酸调pH-9.0, 有白色固体析出，滤集固体5.72克(98.0%)。取该固体3.90克 (22mmo1)，水浴搅拌下加入二氧六环90亳升，水45亳升，1N NaOH 45亳升，溶解，加入叔丁氧酸酐5. 28克(24. 2mmo1),水浴1. 5小 时后，室温反应2.5小时。浓缩除二氧六环，乙醚提取两次(30毫升 x2)，水相冰浴搅拌下用稀硫酸氢钾溶液调pH~ 3，水相用乙酸乙酯 萃取三次(40毫升x3),合并有机相，饱和氯化钠洗一次，无水硫 酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩，得油状物。加入石油酸冰浴研 磨，得到白色固体5. 3克(87. 0%), m.p. 76~80"C, MS: [M+H]+=278。
N-叔丁氧羰基-顺式-4- (N-四亚甲基胺基)-N-千基-L-脯氨酰胺 (c!.^"Boc-Thp-L-Pro-BA)的制备
反式-4-羟基-L-脯氨酸5. 24克(40nimo1)，冰浴搅拌下加入二氧 六环80亳升，水40亳升，lNNaOH40亳升，溶解，加入叔丁氧酸酐 9. 5克(44mmo1)，水浴1小时后，室温反应6小时。浓缩至30亳升， 加入乙酸乙酯10毫升，冰浴搅拌下用柠檬酸调pH~2，水相用乙酸乙 酯萃取四次(40毫升x4),合并有机相，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩，得白色结晶。取出该结晶1. 15 克(5mmo1 )， 二氯甲烷溶解，水浴搅拌下，加入HOBt 0. 74亳克(5. 5nuno1) 的DMF溶液3. 72毫升，DIC0.87毫升(5，5咖o1)，冰浴30分钟后， 加入节胺O. 55亳升(5. O咖ol)。冰浴l小时后，室温反应10小时。 浓缩，加入乙酸乙酯10亳升，水洗一次，分別用10%柠檬酸、饱和碳 酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥3小时 滤除干燥剂，浓缩滤液，得白色固体1.54克(97%) ,m.p. 97~101 "C。取该白色固体O. 64克(2.0mmo1) , 二氯甲烷溶解，冰盐浴冷却， 加入甲磺酰氯O. 39亳升(4. Ommol)，三乙胺0. 56亳升(4. 4mmo1 )， 水盐浴30分钟。反应液(二氯甲烷)用饱和氯化钠洗后，无水硫酸钠 干燥3小时，浓缩，得白色固体O. 70克(88% ) , m.p. 151 ~ 156X:。 取该白色固体O. 1克(0.25mmo1),加入THF35毫升，溶解，加入四 氬吡咯82. 7微升(l.Ommol)，氲化钠50亳克，室温反应8小时。反 应液(二氯甲烷)用饱和碳酸氢钠、饱和氯化钠各洗两次，有机相用 无水硫酸钠干燥2小时。滤除干燥剂，浓缩，得黄色油状物。
N-叔丁氧羰基-顺式-4- (N-二乙基胺基)-N-千基-L-脯氨酰胺 (cirBoc-Dea-L-Pro-BA ):方法和途径同N-叔丁氧羰基-顺式-4-(N -四亚甲基胺基)-N-千基-L-脯氨酰胺。产品为油状物。
N-叔丁氧羰基-顺式-4- ( l-吗啉基)-N-千基-L-脯氨酰胺 ("5"Boc-Mpl-L-Pro-BA):方法和途径同N-叔丁氧羰基-顺式-4-(N -四亚甲基胺基)-N-千基-L-脯氨酰胺。产品为油状物。
N-叔丁氧羰基-顺式-4- (N -五亚甲基胺基)-N-千基-L-脯氨酰 胺(cj'^Boc-Prd-L-Pro-BA):方法和途径同N-叔丁氧羰基-顺式-4-(N-四亚甲基胺基)-N-千基-L-脯氨酰胺。产品为油状物。
实施例1 : Me2Val-Val-MeVa1-Tic-Pro-NHCH2C6H5 (QPP-024) 的制备
将L-脯氨酸甲酯盐酸盐3. 32克(20mmo1),溶于20亳升二氯甲 烷中，冰浴搅拌下加入三乙胺2. 78毫升(20mmo1) , 10分钟后，加入Boc- ( R)-四氬异喹啉-3-羧酸5. 54克(20mmol )，溶解。加入,t 2. 84克(21mmol)的DMF溶液6ml，冰浴10分钟后，加入DIC 3. 3 毫升(21迈mo1)。继续保持冰浴2小时后，室温反应12小时。浓缩， 加入乙酸乙酯50亳升，水洗一次后，分别用10%柠檬酸、饱和碳酸氬 钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥3小时。滤 除干燥剂，浓缩滤液，得黄色油状物7.3克。经硅胶柱层析(乙酸乙 酯-石油醚，1: l,Rf=0. 62),得到白色结晶5. 34克(68. 8%, 13. 8,ol )。 取该结晶3. 25克(lOmmol),加入4N HCl/二氧六环约20毫升，溶 解，室温搅拌1小时。浓缩，得黄色油状液体。二氯甲烷溶解，水浴 搅拌下，加入三乙胺1. 39亳升(lOnnnol) ， 10分钟后，加入Boc-N-甲基-L-缬氨酸2. 30克(lOmmol )，溶解。加入HOBt 1. 49克(llmmol) 的DMF溶液3亳升，冰浴10分钟，加入DIC 1. 73亳升(lOmmol)。 冰浴2小时后，室温反应12小时。浓缩，加入乙酸乙醋40毫升，水 洗后，分别用10%柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙 酸乙酯层用无水硫酸钠干燥3小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得黄色 油状物。加入石油醚20毫升，冰浴条件下研磨，得类白色固体2.51 克(50%, 5mmo1)。加入4N HCl/二氧六环约20毫升，溶解后，室温 搅拌1小时。浓缩，得黄色粘稠状液体。
所得三肽1.60克(3.2mmo1) ， 二氯甲烷5毫升溶解，冰浴搅拌 下加入三乙胺0. 45毫升(3. 2mmo1) , 10分钟后，加入Boc-L-缬氨酸 0.70克(3. 2mmo1)，溶解。H0Bt 0.45克(3. 36mmo1)用少量DMF 溶解后，加入反应液中。冰浴10分钟后，加入DIC 0.53毫升 (3.36mmo1)。水浴2小时后，室温反应7小时。浓缩，加入乙酸乙 酯10亳升，水洗一次后，分别用10%柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯 化钠各洗三次，乙酸乙醋层用无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，浓缩滤 液，得黄色油状物1.5克(86.2%, 2. 75mmo1)。加入甲醇溶解，水浴 搅拌下逐滴加入2NNa0H2.8毫升(5.6mmo1)，水浴反应30分钟后， 保持反应液pH9 10,室温反应3小时。浓缩，加入乙酸和饱和碳酸 氢钠，振摇分液，水相再用乙醚提取一次，于冰浴搅拌下加入柠檬酸调pH ~4,用乙酸乙酯萃取三次(25毫升x3)，合并乙酸乙酯层， 饱和氯化钠洗后，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，浓缩，得黄色油状 物1. 08克(2. 05mmo1)。
所得四肽黄色油状物0. 216g (0.41mmo1) , 二氯甲烷10毫升溶 解，冰浴搅拌下，加入HOBt 60毫克(0.451mmo1)的DMF溶液0.3 亳升，DIC 71微升，冰浴30分钟后，加入笨乙胺51.7微升。冰浴l 小时后，室温反应ll小时。浓缩，加入乙酸乙酯10亳升，水洗后， 分别用10%柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸乙酯 层用无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得黄色油状物 0. 22克(0. 35mmo1)。加入4N HCl/二氧六环约5毫升，溶解，室温 搅拌1小时。浓缩，得黄色油状液体O. 22克(0. 35nnno1)。
上述四肽酰胺0. 11克(0. 175mmo1) ， 二氯甲烷5亳升溶解，冰 盐浴搅拌下加入三乙胺60. 9微升(0.44mmo1) ， 10分钟后，加入N， N-二甲基缬氨酸25. 4毫克(0. 175mmo1 )， DEPC 40. 0微升(0. 26mmo1 )。 水盐浴l小时后，室温反应24小时。浓缩，加入二氯甲烷10亳升， 水洗，分别用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗两次，二氯甲烷层用无 水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得淡黄色油状液体。 MS: [M+H]+=703，纯度85%。
实施例2: Me2Val-Val-MeVal-Pro-ThpPro-NHCH2C6H5( QPP-018 ) 的制备
将L-脯氨酸甲酯盐酸盐2. 48克(15mmo1)，溶于20亳升二氯甲 烷中，水浴搅拌下加入Boc-甲基缬氨酸二环己胺盐6. 18克(15mmo1)， 溶解。10分钟后，加入HOBt 2. 23克(17. 5mmo1)的DMF溶液3ml， 冰浴10分钟后，加入DIC 2. 60亳升(17. 5mmo1)。继续保持冰浴2 小时后，室温反应12小时。浓缩，加入乙酸乙酯50亳升，水洗一次 后，分别用10%柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙酸 乙酯层用无水硫酸钠干燥3小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得淡黄色 油状物。经硅胶柱层析(乙酸乙醋-石油醚，1: 1, Rf=0.50)，得到白色固体2. 46克(48%， 7. 2mmo1)。加入4N HCl/二氧六环约15亳 升，溶解，室温搅拌1小时。浓缩，得白色固体。二氯甲烷溶解，冰 浴搅拌下，加入三乙胺O. 98亳升(7. Ommol), 10分钟后，加入Boc-L-缬氨酸1. 52克(7. Ommol)，溶解。加入H0Bt 1. 04克(7. 7,ol) 的DMF溶液3亳升，冰浴10分钟，加入DIC 1. 22亳升(7. 7mmo1)。 冰浴2小时后，室温反应12小时。浓缩，加入乙酸乙酯20亳升，水 洗后，分别用10%柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠各洗三次，乙 酸乙酯层用无水硫酸钠干燥3小时。滤除干燥剂，浓缩滤液，得淡黄 色油状物3. 06克(6. 94mmo1)。加入4N HCl/二氧六环约20亳升， 溶解后，室温搅拌1小时。浓缩，得黄色油状液体。加入甲醇溶解， 水浴搅拌下逐滴加入2N Na0H 6. 94毫升(13. 88mmo1)，冰浴反应30 分钟后，保持反应液pH9 10,室温反应5小时。加入柠檬酸调pH ~ 7，浓缩，加入乙酸乙酯5毫升，水相于冰浴搅拌下加入柠檬酸调pH ~ 4,用乙酸乙酯萃取三次(25毫升x3)，合并乙酸乙酯层，饱和氯化 钠洗后，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，浓缩，得淡黄色油状物2.30 克(5.39mmo1)。
所得三肽O. 11克(0. 25mmo1) ， 二氯甲烷5毫升溶解，水浴搅拌 下加入三乙胺69. 6微升(0. 25mmo1) ， 10分钟后，加入80。-顺式-4-(N， N-四亚甲基胺基)-L-脯氨酸-千酰胺93. 7毫克(0. 25mmo1), 溶解。H0Bt 37. 1微克(0. 275mmo1)用少量DMF溶解后，加入反应液 中。水浴10分钟后，加入DIC 43. 3微升(0. 275mmo1)。水浴2小时 后，室温反应7小时。浓缩，加入二氯甲烷10亳升，水洗一次后，分 别用饱和碳酸氬钠和饱和氯化钠各洗三次，二氯甲烷层用无水硫酸钠 干燥。滤除干燥剂，浓缩滤液，得黄色油状物。加入4N HCl/二氧六 环约20毫升，溶解后，室温搅拌l小时。浓缩，得淡黄色油状液体。
所得四肽酰胺淡黄色油状物40亳克(0. 059mmo1) , 二氯甲烷10 亳升溶解，水盐浴搅拌下，加入三乙胺41.0微升(0. 35mmo1) , 10 分钟后，加入N, N-二甲基缬氨酸8. 6亳克(0. 295mmo1) ， DEPC 27 微升(0. 177nuno1)。冰盐浴l小时后，室温反应24小时。浓缩，加入二氯甲烷5毫升，水洗，分别用饱和碳酸氬钠和饱和氯化钠各洗三 次，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓缩滤液， 得淡黄色油状液体。MS: [M+H]+=710，纯度80%。
依据与实施例1或实施例2相同或相似的方法制备得到了以下化 合物
PMI-Val- Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph ( QPP-OOl)分子量680纯度85% PMI-Val-Ala-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph ( QPP-002)分子量652纯度90% PMI-Val-Leu-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph ( QPP-003)分子量694纯度85% PMI-Val-Ile-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph (QPP-004) 分子量694纯度85% HIM-Leu-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2CH2Ph ( QPP-005)分子量766纯度80% HIM_Leu-Ala-MeVal-Pro-Pro-匿H2CH2Ph ( QPP-006)分子量738纯度80% HIM-Leu-Leu-MeVal-Pro-Pro-NHCH2CH2Ph ( QPP-007)分子量780纯度90% HIM^Leu—Ile—MeVal—Pro—Pro-NHCH2CH2Ph ( QPP-008) 分子量780纯度95%
752纯度90% 724纯度90% 766纯度90%
HIM-Leu-Va卜MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph ( QPP-009 )分子量 画-Leu-Ala_MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph (QPP-010)分子量 HIM-Leu-Leu-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph (QTP-011)分子量 HIM-Leu-lie-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph ( QTP-012 ) 分子量766纯度90% Ac-N-MeVal-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph ( QPP-013)分子量668纯度95% Boc-MeVa卜Va卜MeVal-Pro-Pro-羅H2Ph ( QPP-014)分子量726纯度95% HCl.MeVal-Val-MeVal-Pro-Pro-N腦2Ph ( QPP-015)分子量762.5纯度95% Me2Val-Val-MeVa1-Pro-Tic-匿H2Ph ( QPP-016 ) 分子量702纯度80% Me2Val-Va卜MeVa卜Pro-DeaPro-NHCH2Ph ( QPP-017)分子量711纯度85% Me2Val-Va卜MeVa1-Pro-ThpPro-NHCH2Ph ( QPP-018)分子量709纯度85%C Me2Val-Va卜MeVal-Pro-MplPro-NHCH2Ph ( QPP-019)分子量725纯度80% Me2Val-Va卜MeVa卜Pro-PrdPro-NHCH2Ph ( QPP-020)分子量707纯度82% N-MePro-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph ( QPP-021)分子量624纯度95% N-MePro-Va卜MeVal-Pro-DeaPro-N腦2Ph ( QPP-022) 分子量695纯度80% N-MePro-Va卜MeVa1-Pro-ThpPro-NHCH2Ph ( QPP-023 ) 分子量693纯度80% Me2Val-Va1—MeVa卜Tic—Pro-匿H2C6H5 ( QPP-024)分子量702纯度.-95%
19其余各化合物可依据上述方法和途径制备而成。
实施例3: MTT显色法检测体外抗癌活性。 肿瘤细胞悬液的制备
取传代培养72小时的K562、 0VCA2780、 Kato-III细胞抹，用0. 4% 台盼兰与细胞悬液l: 1 (50^1加50^1)混匀，立即按白细胞计数法 计数活细胞数，每亳升的活细胞数=计数值x5000。然后用10%小牛血 清RPMI1640液将细胞浓度调整到3. 125><105个/毫升，备用。
加样培养
在无菌条件下，向96孔细胞培养板中每孔加入以调整好的3. 125 乂105个/毫升K啦细胞悬液80^1和已设定好的本发明化合物浓度 20nl,每个化合物浓度设3~6个复孔，然后置37X:, 5%C02，饱和湿 度孵温箱中培养48小时，加0. 25%MTT液20jil/孔，继续培养4小时， 然后加入1096SDS100nl/孔，置孵温箱培养过夜。
0D值测定
将上述含有培养物加入SDS在孵温箱中培养过夜的96孔板置多孔 扫描分光光度计Multiskan MCC/340 MKII中，选用单波长570nm测 定0D值，计算OD值的百分率及化合物IC50。
0D值(％):给化合组0D/溶剂对照组OD xioo% ICs。值是以化合物浓度对OD百分率的对数值做线性回归后得出的。化合物号_OD值(x扭)__
K562 OVCA2780 Kato—III
QPP--0010.8063 :!O.0609*0.5713^0.0040*0.9523 :JO.0327*
QPP--0021..3020=80.00350.6473:10,.05911.0975^0.,0542
QPP--0031..0557:80.08790.3513 JO,,07350.9887劝.,0139
QPP--0041..3570氛07310.6927".,03981.1170^.0165
QPP--0050..937004060.4080.00890.8840劝.0056
QPP--0060..967004790.3886 :JO.00550.9007 JO.0193
QPP--0070.,8667 JO.01880.4223 iO.01960.8440^0.0271
QPP--0080.,8967劝.02110.4303 a.00970.8583艰0323
QPP--0090.,9517巧.02910.6267劝.01100.9720^0.0426
QPP--0100.9483 iO.01530.569302750.9853礼0133
QPP--Oil0.,7923 JO.07920.624707131.0207劝.0753
QPP--0120.,8380^0.02880.6267:10.02041.0793 iO.0392
QPP--0130.7953^0.0110*0.6572力.1308*=0.9670 A0118*
QPP--0140.7613 JO.01510.5230巧.00820.9377巧.0457
QPP--0150.6933 =0.02150.5853 100400.8610 :!O.0101
QPP--0161.,0653^0.01800.6413^0.00931.0007巧.0250
QPP--0170.7290 a.03600.4953 :tO.01990.83500240
QPP--0180.6743W.0290*0.6423^0.0475*0.73270121*
QPP--0191..3343巧.02810.6980劝.05441.1840 A0225
QPP--0201..253307650.6560:10.01051.2130 iO.0216
QPP--0250.6713^.03220.480301270.6340旬.0248
*: p <0. 05，显示抑制胂瘤细胞生长的活性。
权利要求
1.式(I)五肽类似物或其立体异构体X-Y-Z-L-M-N(I)其中X为L-或D-α-型-N-端单烷基或双烷基取代的亲脂性氨基酸，四氢异喹啉-3-羧酸，3，4-二氢异喹啉-3-羧酸，烷基为C1-C5的直链或支链或C3-C7元环状烷基，亲脂性氨基酸选自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Y为L-或D-α-型亲脂性天然或非天然氨基酸，如Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Z为L-或D-α-型N-端单烷基取代的亲脂性氨基酸，烷基为C1-C5的直链或支链或C3-C7元环状烷基，亲脂性氨基酸为Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；L和M为下列L-或D-α-型氨基酸中的任意两个或部分自身组合N原子在四～七元环上的氨基酸，3，4-二氢异喹啉-3-羧酸，四氢异喹啉-3-羧酸，反式或顺式-4-取代-脯氨酸，取代基为羟基、卤素、硝基、氨基、C1-C6直链或支链烷基、C3-C7环烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基、二(C1-C6直链或支链烷基)胺基、C3-C7环烷胺基、含氧、硫、氮原子的C3-C7环烷胺基；N为脂肪胺或芳香胺衍生物，取代或未取代的肼或肟。
2. 根据权利要求l的化合物，其中X为L-或D-a-型-N-端单烷基或双烷基取代的亲脂性氨基酸，四 氢异喹啉-3-羧酸，3, 4-二氢异喹啉-3-羧酸，烷基为C广Cs的直链或 支链，或为C3-C7元环状烷基；亲脂性氨基酸为Gly、 Ala、 Val、 Leu、 Nle、 Ile、 Pro、 Tle、 MeVal等；Y为L-或D-a-型亲脂性天然或非天然氨基酸，且选自Gly、 Ala、 Val、 Leu、 Nle、 Ile、 Pro、 Tle、 MeVal等；Z为L-或D-a-型N-端单烷基取代的亲脂性氨基酸，烷基为C广Cs 的直链或支链、C3-C7元环状烷基，亲脂性氨基酸为Gly、 Ala、 Val、 Leu、 Nle、 Ile、 Pro、 Tle、 MeVal等；L和M为下列L-或D-ct-型氨基酸中的任意两个或部分自身组合 N原子在四~七元环上的氨基酸，3， 4-二氬异喹啉-3-羧酸，四氲异 喹啉-3-羧酸，反式或顺式-4-取代-脯氨酸，取代基为羟基、卣素、硝 基、氨基、d-Cs直链或支链烷基、C厂C7环烷基、d-Cs烷氧基、氨基、 d-Cs酰胺基、二 ( C广C6直链或支链烷基)胺基、C3-C7环烷胺基、含氧、 硫、氮原子的Cg-C7环烷胺基；N为脂肪胺或芳香胺衍生物，取代或未取代肼或將。
3.式(I)五肽类似物或其立体异构体衍生物的制备方法，其包括1) 将化合物Boc-L-0H与M-0P在DMF， DCM， TEA, DIC-丽t中 反应，其中L， M如权利要求2中定义，P为CH烷基，生成Boc-L-M-0P;2) 将1)中所得产物在盐酸/二氧六环中脱去氨基保护基，生成 L-M-0P;3) 将2 )中产物L-M-0P与Boc-Z-0H在DMF， DCM, TEA, DIC-H0Bt 中反应，生成Boc-Z-L-M-0P,所得产物如2)中所述进行反应，生成 脱去氨基保护基的Z -L-M-0P;4) 将3 )中产物Z-L-M-0P与Boc-Y-0H在DMF， DCM, TEA, DIC-H0Bt 中反应，生成Boc-Y-Z-L-M-0P。5) 将4)中产物Boc-Y-Z-L-M-0P在氢氧化钠/甲醇溶液中皂化， 然后用柠檬酸酸化，生成Boc-Y-Z-L-M-0H;6) 将5)中产物Boc-Y-Z-L-M-0H与N-N服在DCM, DIC-H0Bt中 反应，生成Boc-Y-Z-L-M- N;7) 将6 )中产物Boc-Y-Z-L-M-N如2 )中所述进行反应，生成脱 去氨基保护基的Y-Z-L-M-N;8) 将7)中产物与X-0H在DCM, TEA, DEPC中反应，生成式IX-Y-Z-L-M-N;
4. 一种药物组合物，其包括至少一种式(I)五肽类似物或其立 体异构体及药用载体或赋形剂。
5. 式(I)五肽类似物在制备用于治疗癌症药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及具有抗肿瘤活性的五肽衍生物，其制备方法，含它们的药物组合物及它们在治疗癌症中的用途。
文档编号C07K7/00GK101525374SQ20091000549
公开日2009年9月9日 申请日期2002年7月10日 优先权日2002年7月10日
发明者刘克良, 孟庆国, 梁远军, 赵修南, 郄建坤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所