专利名称：：银杏内生真菌菌株发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离的化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种化合物，特别是一种银杏内生真菌菌株C/w"om/"mg/o6owm发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离到的化合物，该化合物为一个新的化合物，虾卵brineshrimp致死生测显示非常高细胞毒活性。
背景技术：
：癌症一直是不能攻克的世界难题，从天然产物中寻找抗癌活性成分是解决这个世界难题的有效途径之一。银杏是最古老的高等植物之一，是我国的特有植物，因为其所富含的各种活性成分，尤其是黄酮类化合物而被作为传统的中药以及开发成现代保健品。根据"基因水平传递假设"以及"共生理论"，与银杏共生的内生真菌可能会产生与银杏相同或者类似的化学成分。98株银杏内生真菌化学成分的初探结果显示部分内生真菌具有和银杏相同和相似的化学成分，如三萜和黄酮类化合物，内生菌C7zaeto脂'wmg/o6owm发酵物的系统预试也显示其能产生三萜黄酮类和生物碱类物质，而多数这些物质都是生理活性物质，例如抗癌活性。因此对菌株C7^eto附/w附g/o6os"m进行了次生代谢化学成分研究，为从银杏内生菌中寻找抗癌活性物质提供科学依据。
发明内容本发明的目的在于，提供一种银杏内生真菌菌株Cte"o脂'腦g/o6w謡发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离的新化合物，该化合物具有抗癌活性，可作为制备抗癌药物被应用。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案一种银杏内生真菌菌株Oz"etom/簡g/o6ow附发酵液的乙酸乙酯萃取物4中分离的化合物，特征在于，其结构式为-该化合物的名称为chaetomugilinD，分子式为c23H27o6ci，分子量为435。经申请人所进行的鉴定以及生物活性试验证明，该化合物对虾卵brineshrimp有很高的细胞毒活性，能够用于制备抗癌药物的应用。图1是6^eto肌'"y7^7oZ7as鹏发酵液的乙酸乙酯萃取物化学成分提取分离流程图2是标题化合物chaetomugilinD的关键HMBC和^」HCOSY特征关系；图3-图12是标题化合物的结构鉴定图，其中图3是标题化合物^丽R，图4是标题化合物13CNMR，图5和图6是标题化合物HMBC;图7是标题化合物H-HCOSY;图8是标题化合物HMQC，图9是标题化合物HSQC;图IO、11，12是标题化合物HMBC。以下结合附图对本发明作进一步的详细描述。具体实施例方式本发明为一种银杏内生真菌菌株Ow"o柳'wmg/o6ow附发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离得到具有抗癌活性的新化合物，寄主植物银杏(fo'/^^W7o&)，来源于山东省临沂市。虾卵致死试验是在德国哥廷根大学完成。上述材料均为公开的生物材料。分离鉴定菌种以及扩大发酵所用的培养基配方分别为PDA培养基，用于培养和分离纯化真菌，其配方为马铃薯汁1000ml，5葡萄糖20g，琼脂20g，灭菌30min。改良培养基，用于扩大液体发酵，其配方为CaCl2:0.5g，KH2P04:0.lg，KC1:0.05g，MgS04*7H20:0.lg，蔗糖20.0g，蛋白胨15.0g,1000ml的&0，pH为6.0。马铃薯汁的制备方法是，土豆去皮，切片，称200g放如入1000ml自来水中煮沸30min，双层纱布过滤，滤液补水至1000ml。主要利用的试剂为石油醚(60_90°C)，二氯甲烷，环己垸，丙酮，甲醇等，均为分析纯。银杏内生真菌菌株C/^etofm'M附g/o6仍"附发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离的化合物，其分离过程如下1.菌种的发酵和发酵液的浓縮吸取C7weto/m'"mg/o6osww的菌悬液lml，加入到1000ml装有200ml液体培养基(CaCl2:0.5g,KH2P04:0.lg，KC1:0.05g，MgS047H20:0.lg，glucose:20.0g，p印tone:15.0g，H20:1000ml,pH=6.0)的三角瓶中，在转速150rpm，28-C下培养5天，结束发酵，过滤得到发酵液30L和菌丝体，菌丝体在5(TC下烘干，平均菌重4.6g/L。滤液共30L，甩等体积的乙酸乙酯萃取3次，浓缩有机相，得到发酵液乙酸乙酯提取浸膏2.83g;3.粗提物的活性预试海虾致死试验因为是最为研究人员所信赖的细胞毒性筛选方法而广为使用，具体方法为将30个经过挑选的虾卵放入装有0.2ml人造海水的培养槽(直径为1.8cm，深2cm)中，用5^1的DMSO溶解20吗发酵液乙酸乙酯提取物加入到培养槽中，对照只加入等量的DMSO，然后在黑暗环境，室温下培养。24小时后，在显微镜下统计每个培养槽中的虾卵死亡数，用下列公式计算致死率M。M=[(A-B-N)/(G-N)]100,其中A为24小时后的平均死亡数，B为24小时后对照里面的平均死亡数，N为在药物加入之前死亡的虾卵数，G为总的用于测试的虾卵数。4.化合物的分离纯化参见图1,发酵液乙酸乙酯提取浸膏通过硅胶柱层析、凝胶柱层析、反相柱层析分离提取其中的化学成分，常压柱层析采用湿法装柱和硅胶拌样上柱，根据薄层展开情况选择洗脱溶剂系统，反相柱层析采用加压装置，凝胶柱层析选用SephadexLH-20,采用甲醇以及甲醇-二氯甲垸洗脱。多次柱层析最后得到化合物。硅胶柱2.83g发酵液乙酸乙酯提取浸膏千法拌样(100-200目)5.6g,50g硅胶(200-300目)，用二氯甲烷_甲醇=100:0，二氯甲烷-甲醇=50:1，二氯甲垸-甲醇=30:1，二氯甲垸-甲醇=20:1，二氯甲垸-甲醇=10:1梯度洗脱，每份洗脱液为100ml，减压蒸馏浓縮，薄板检测，相似合并；得到A-E五个组分，其中B组分显示较强的细胞毒活性，所以在活性追踪下进行连续两次凝胶SephadexLH-20柱层析,洗脱剂分别为(二氯甲烷-甲醇=6:4)和(甲醇)。得到活性组分B2-3，继续硅胶柱层析，以环己烷-丙酮=10:1洗脱得到活性组分B2-3-c，然后继续用反相RP-Cw柱层析纯化，以水-甲醇(30%，45%，50%，55%)洗脱得到化合物。将此化合物做薄层层析，经紫外，碘和硫酸-乙醇显色为单一斑点，三种溶剂系统展开均为单一斑点，可初步认定为单一化合物。5.化合物的鉴定对分离到的化合物做质谱，碳谱，氢谱，以及二维核磁共振。化合物chaetomugilinD为黄色的粘胶状，可溶解于氯仿，甲醇，丙酮，乙酸乙酯，比旋光度为[a]。2。-21°(c=0.04，MeOH)。由核磁共振谱数据(见表1，图3-12)和高分辨质谱得出分子式为C23H2706C1，分子量为435，查阅参考文献，然后综合分析得到的数据，并结合文献对照分析化合物的可能结构类型，最后根据物理特性和谱学特征确定标题化合物结构为命名为chaetomugilinD，结构经过多个数据库查新，发现国内外尚没有此化合物的报道，可确定此化合物为新的化合物。表l:化合物chaetomugilinD的NMR特征(500MHz,CDC13)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>6.化合物的细胞毒活性测定按上面粗提物抗癌活性测定方法，纯化合物的测试浓度为10ug/ml，即用5u1DMSO溶解2ug发酵液乙酸乙酯提取物加入到培养槽中，结果得到24小时后的平均死致死率为75.2%综上所述，从银杏内生真菌菌株6^"0啦'咖W"OS"/Z7发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离到的化合物，具有很强的抗癌活性。海虾致死试验结果为在浓度为10ug/ml下，24小时后的平均死致死率为75.2%。该化合物为一种新的化合物，其分子式为C23H2706C1，分子量为435。命名为chaetomugilinD。权利要求1.一种银杏内生真菌菌株Chaetomiumglobosum发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离的化合物，其特征在于，该化合物的结构式为该化合物的名称为chaetomugilinD，分子式为C23H27O6Cl，分子量为435。2.权利要求1所述银杏内生真菌菌株CA3e&啦'wz^7o力osi/yz7发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离的化合物的分离方法，其特征在于，按如下步骤进行1)菌种的发酵和发酵液的浓縮吸取银杏内生真菌菌株Ow"o聰'wmg/o6osww的菌悬液lml，加入到1000ml装有200ml液体培养基的三角瓶中，在转速150rpm，28。C下培养5天，结束发酵，过滤得到发酵液30L和菌丝体，菌丝体在5(TC下烘干，平均菌重4.6g/L;2)粗提物的制备滤液共30L，用等体^^的乙酸乙酯萃取3次，浓縮有机相，得到发酵液乙酸乙酯提取浸膏2.83g;3)化合物的分离纯化发酵液乙酸乙酯提取浸膏通过硅胶柱层析、凝胶柱层析、反相柱层析分离提取其中的化学成分，常压柱层析采用湿法装柱和硅胶拌样上柱，根据薄层展开情况选择洗脱溶剂系统，反相柱层析采用加压装置，凝胶柱层析选用SephadexLH-20，采用甲醇以及甲醇-二氯甲烷洗脱，多次柱层析最后得到化合物chaetomugilinD。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的液体培养基的配方为:CaCl2:0.5g，KH2P04:O.lg，KC1:0.05g，MgS04.7H20:O.lg,glucose:20.0g，peptone:15.0g，H20:1000ml，pH=6.0。4.权利要求1所述的银杏内生真菌菌株CA3e^^^^oZ^s咖发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离的化合物用于制备抗癌药物的应用。全文摘要本发明公开了一种银杏内生真菌菌株Chaetomiumglobosum发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离的化合物，该化合物的结构式为，如右。命名为chaetomugilinD，分子式为C<sub>23</sub>H<sub>27</sub>O<sub>6</sub>Cl，分子量为435。经申请人所进行的鉴定以及细胞毒活性试验证明，该化合物对虾卵brineshrimp有很高的细胞毒活性，能够用于制备抗癌药物的应用。文档编号C07D493/00GK101481379SQ200910020820公开日2009年7月15日申请日期2009年1月7日优先权日2009年1月7日发明者张雅梅,张鞍灵,秦建春,高锦明申请人:西北农林科技大学