专利名称：抗人前列腺特异性膜抗原胞外区单链抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程抗体，涉及一种抗人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区的 人源性单链抗体及其在前列腺癌诊断和治疗药物开发中的应用。
背景技术：
前列腺癌是当今严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，对于它的早期诊断和治疗， 尤其是转移、复发灶的早期诊断和治疗是人们难以攻克的医学难题。随着肿瘤免疫学和分 子生物学的不断发展，尤其是噬菌体表面展示技术的不断完善，为前列腺癌的早期诊断和 根治带来了新的机遇。目前，抗前列腺癌抗体在国外正在进行临床试验，这些抗体基本上都 是人源化的鼠源性抗体。尽管人源化可以在很大程度上减少鼠源性抗体的免疫原性，但不 可能彻底去除其免疫原性，因而在临床治疗中不可避免地会导致中和抗体的出现从而降低 其治疗价值。从前列腺癌患者构建的人源性单链抗体库中直接筛选高亲和力的单链抗体无 疑成为前列腺癌的早期诊断、导向治疗药物研究的重要手段。
发明内容
本发明的目的是利用噬菌体抗体库技术筛选一种人前列腺特异性膜抗原(PSMA) 胞外区特异性人源性单链抗体。本发明的另一个目的是上述单链抗体在前列腺癌早期诊断和导向治疗中的应用。 利用该特异性人源性单链抗体可以特异性的检测人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的表达水 平，作为诊断前列腺癌的一个标准；同时利用该人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异 性人源性单链抗体作为生物载体，结合优化的抗肿瘤药物靶向输送到前列腺癌细胞，定向 杀灭癌细胞，在前列腺癌的治疗中发挥重要作用。本发明采用噬菌体表面展示技术，从前列腺癌患者外周血单个核细胞提取mRNA 并从中扩增出人的全套抗体可变区基因，然后装配成单链抗体基因片段并克隆到噬粒载体 并转化大肠杆菌构建成一个大库容量的人源性单链抗体库。然后用重组人前列腺特异性膜 抗原(PSMA)胞外区进行筛选得到其特异性的高亲和力抗体。该抗体可在大肠杆菌中可溶 性表达，该抗体的氨基酸序列如下LPVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSffHSSNAI
AWHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNWGDGIPDRF
SGSSSGAERYLIISSLQSEDEADYYCQTffGTGIH
VVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLQ
SGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMHffVR
QAPGKGLEWVAVMSYDGNNKYYADSVKGRFTIS
RDNSKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCARDLDIAA
RFHYCAMDVWGQGTAVTVSS
该氨基酸序列被命名为SEQ ID NO1O
本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体的重链可 变区基因编码124个氨基酸，序列如下EVQLLQSGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFS NYA
MHffVRQAPGKGLEffVAVMSYDGNNKYYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCAR
DLDIAARFHYCAMDVWGQGTAVTVSS
该氨基酸序列被命名为SEQ IDNO2。 本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体的轻链可 变区基因编码112个氨基酸，序列如下L PVLTQSPSASASLGASVKLTC TLSSffHSSN A I
AffHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNffGDGIPDR F
SGSSSGAERYLI ISSLQSEDEADYYCQTffGTG I H
VVFGGGTKLTVL
该氨基酸序列被命名为SEQ ID NO :3。
本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体由X753个核苷酸核且成，其序列如下
CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAG
CTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACT
GCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACA
ACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGT
TACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACC
TGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGG
CGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGC
TGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA
GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGC
AAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGC
AGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT
ATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGA
GATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGG
GACTGCGGTCACCGTCTCCTCA
本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体:重链可变区由372个核苷酸组成，其序列如下
GAGGTGCAGCTGCTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAG
ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCG
CCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATA
ATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCC
AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATA
TTACTGTGCGAGA GATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGT
CTGGGGCCAAGGGACTGCGGTCACCGTCTCCTCA
本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体重链可变 区由GHV3-30，IGHD6-6和IGHJ6基因重排后形成的具有单一开放读框的功能性可变区基 因。其中CDR3的核苷酸序列为GAT CTG GAT ATA GCA GCT CGT TTC，氨基酸序列为DLD I A A R F，由IGHD6-6和该抗体特有的序列组成。本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体轻链可变 区由339个核苷酸组成，其序列如下CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAGCTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACTGCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACAACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGTTACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACCTGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGC本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体轻链可变 区由IGLV4-69和IGLJ3基因片段重排后形成的具有单一开放读框的功能性可变区基因。其 中CDR3的核苷酸序列为CAG ACC TGG GGC ACT GGC ATT，氨基酸序列为Q TW G T G I。本发明的抗人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区的人源性单链抗体可在前列腺 癌诊断和治疗药物开发中应用。噬菌体抗体库技术无需经过杂交瘤技术，甚至无需经过免疫过程即可直接获得特 异性的高亲和力抗体分子。单链抗体具有分子量小，穿透性强，半衰期短的优势，是理想的 肿瘤复发和远处转移的诊断试剂，也可以为导向药物治疗提供导向作用。而将筛选到的单 链抗体改造成全抗体后就会具有半衰期长，可直接介导补体及细胞免疫(ADCC)杀伤肿瘤 作用。因此，本发明中的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体在前 列腺癌的早期诊断和导向治疗中具有重要的价值。本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体可在噬菌 体表面呈现表达，也可以在大肠杆菌中可溶性表达。经蛋白电泳和Western blot证实，IPTG 诱导后表达的可溶性单链抗体分子量约为30kD。经ELISA和流式细胞仪分析表明该抗体 与重组人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区蛋白的亲和力为Kd = 0. 2nM ；该抗体不仅可 以结合重组的PSMA胞外区，而且可以结合表面表达PSMA的NEK293细胞及前列腺癌细胞系 LNCaP。这为利用该抗体进行前列腺癌影像诊断和导向治疗奠定了基础。
图1是本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体的 纯化；泳道1 :Marker ；泳道2 流穿液；泳道3 第一遍洗涤；泳道4 第二遍洗涤；泳道5 纯化的单链抗体。图2是本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体与 重组人PSMA胞外区亲和力测定。图3是本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体与细胞表面表达的天然PSMA结合活性的鉴定；A 只用抗V5-APC染NEK293细胞；B 用本发明的单链抗体和抗V5-APC染NEK293 细胞；C 只用抗V5-APC染PSMA转染的NEK293细胞；D 用本发明的单链抗体和抗V5-APC 染PSMA转染的NEK293细胞；E 只用抗V5-APC染LNCaP细胞；F 用本发明的单链抗体和抗 V5-APC 染 LNCaP 细胞。
具体实施例方式下面对本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体的 实施例进行详细说明。实施例(一)淋巴细胞的分离收集50位前列腺癌患者的外周血共500ml，加入等体积的淋巴细胞分离液离心分 层，2500g，10min。小心吸取中层淋巴细胞，离心，2500g，lOmin。弃上清，用lmlTrizol/5ml 外周血裂解淋巴细胞，至溶液彻底透明为止。-80°C保存。(二)RNA 的提取取_70°C保存的淋巴细胞裂解液融化至室温，加入0. 2ml氯仿/mlTrizol，votex振 荡15s，室温静置3min，12000g，5min。吸上层清亮水相，注意勿混入中层蛋白及DNA层。加 Λ 0. 5ml 异丙醇 /ml Trizol，颠倒混勻，_20°C沉淀 30_60min，12000g 离心 IOmin0 保留沉 淀，70%的乙醇洗涤一遍，空气中晾干，DEPC水溶解沉淀RNA。(三)mRNA的纯化纯化步骤为本领域的惯常技术，按(美国OMEGA)试剂盒说明书进行.(四)反转录取13yg mRNA于70°C保温lOmin，使其打开二级结构，然后迅速置于冰上，按说明 书依次加入各试剂，随机6聚体进行反转录。室温静置IOmin使引物延伸，然后42°C 60mi 进行反转录，最后95°C 5min灭活反转录酶，冰浴5min，-20°C保存。(五)全套可变区基因扩增将反转录产物分成3份作为模板进行第一轮PCR，将VH、VL、VK的3’端引物分 别混合后与5’端各引物分别进行扩增。反应条件为94°C 5min热启动，94°C Imin变性， 55 0C Imin退火，72°C Imin延伸，共35cycles。最后进一步延伸7min。反应体系为100μ1。 将第一轮PCR的产物VH混合，VL和VK以1 2混合，分别作电泳纯化回收，100倍稀释后 作为第二轮PCR反应的模板进行第二轮PCR反应引入更长的保护序列及重叠延伸序列，条 件为:94°C 5min热启动，94°C Imin变性，55°C Imin退火，72°C Imin延伸，共25循环。反应 体系为100 μ 1。(六)scFv(单链抗体)片断的随机拼接及扩增将VH、VL和VK基因片断分别行2%的琼脂糖凝胶电泳分离、回收，然后按 VH VK VL Llinker = 3 2 1 3的比例混合进行重叠延伸以装配scFv片断， 条件为94°C Imin变性，55°C Imin退火，72°C Imin延伸，共7个循环。将重叠延伸产物行 1 100稀释，以此作模板，以VL 5’端和VH 3’端的保护序列为引物扩增scFv片断，PCR 反应条件是94°C 5min热启动，94°C Imin变性，65°C Imin退火，72°C Imin延伸，10个循环后，再将退火温度降到58°C后进行15个循环。PCR产物即为单链抗体基因片断，用1.5%的 琼脂糖凝胶回收。(七)scFv与噬粒载体的连接及单链抗体库的制备1.电转化感受态的制备从M9平板上挑取TGl单克隆摇菌过夜，1 100转接于500ml LB，振摇2. 5h，OD6tltl 的值在0. 5-0. 6之间，离心收菌，3000rpm, IOmin0用等体积的冰冷ImM的HEPES洗涤两遍， 3000rpm, lOmin，用1/10体积的冰冷10%甘油洗涤两遍，4000rpm，lOmin，用与沉淀等体积 的冰冷10%甘油重悬沉淀，每管50μ 1于-80°c保存。注感受态制备均在0-4°C进行。2.单链抗体库的制备将上述纯化的单链抗体基因片段用Sfi I/Not I酶切，并与经相同酶切开的噬粒 载体PCANTAB5E连接。将连接产物于70°C孵育IOmin灭活T4DNA连接酶，然后电转化大肠 杆菌TGl。将转化后的细菌涂布到含葡萄糖和100mg/L氨苄的2YT平板上，30°C培养过 夜，次日用含15%甘油的2YT将克隆刮下来冻存到-80°C保存。3.抗体库的噬菌体表面呈现接种3X IOiq的细菌抗体库于1500ml 2YTGA(2YT+1 %葡萄糖+amp)中，37°C振摇 至0D600 = 0. 5。取150ml (0D600 = 0. 1的细菌浓度是8 X IO7)用辅助性噬菌体M13K07以 20 1的比例于37°C静置水浴30min进行感染。然后3300g，IOmin室温离心，弃上清，将细 菌沉淀再分别接到30°C预热的1500ml的2YTGAK(2YT+1 %葡萄糖+amp+kan)中，30°C振摇 过夜(应达到12小时)。次日，IOmin离心(4°C )，收上清。在上清中加入1/5体积的PEG/ NaCl (20%的PEG6000，2. 5M的NaCl)，混勻，4°C静置1小时以上沉淀噬菌体。然后IOOOOrpm 于4°C离心15min，收集噬菌体沉淀并重悬于5ml PBS中。IOOOOrpm再次离心15min，取上 清(沉淀为残留的细菌碎片及PEG)，放于4°C备筛库用。同时取Iul倍比稀释进行滴度分 析。(八)噬菌体抗体库滴度测定从M9培养基上挑取TGl单克隆于5ml 2YT，振摇过夜。取0. 5ml过夜菌接种于50ml 2YT (100ml三角烧瓶)中，37°C振摇至0D600 = 0. 2。将噬菌体抗体库做十倍倍比稀释，从 各个稀释度各取10 μ 1加入到200 μ 1 0D600 = 0. 2的TGl中，混勻，37°C水浴30min。将这 200 μ 1细菌和噬菌体的混合液涂布到含氨苄的2ΤΥ琼脂平板上。倒置放于37°C，第二天根 据克隆数计算噬菌体库的滴度。(九)辅助性噬菌体M13K07的制备从M9培养基上挑取TGl单克隆于5ml 2YT，振摇过夜。取0. 5ml过夜菌接种于 50ml2YT (100ml三角烧瓶)中，37°C振摇至0D600 = 0. 2。将M13K07十倍倍比稀释，从各 个稀释度各取10 μ 1加入到200 μ 1 0D600 = 0. 2的TGl中，混勻，37°C水浴30min。将这 200 μ 1细菌和噬菌体的混合液加入到3ml不烫手的上层琼脂胶中，稍微晃一下，立即倒入 37°C预热的用2TY配制的琼脂平板上。倒置放于37°C，第二天可出现噬斑。挑取单个噬斑 接种于3-4ml 0D600 = 0. 5的TGl中(制备方法同前，即前一晚从M9上挑克隆，摇菌过夜， 第二天1 100转接于50ml 2YT中，振摇约2-2. 5小时)，37°C振摇2小时。将这3_4ml 感染了 M13K07的TGl接种于500ml 2YT中，37°C振摇1小时。加入卡那(50-70 μ g/ml)， 继续于37°C振摇8-16小时，IOOOOrpm,离心15min，收上清。上清中加入1/5体积的PEG/NaCl(20%&PEG6000，2. 5M 的 NaCl)，混勻，4°C静置 1 小时以上，lOOOOrpm，离心 15min。用 20ml含15%甘油的PBS重悬噬菌体，lOOOOrpm，离心15-20min，收集上清(沉淀为细菌碎片 及PEG)。噬菌体溶液经0. 45 μ m滤膜过滤消毒后分装，冻存于_80°C，同时用噬斑的方法测 其滴度。(十)特异性抗体的筛选用5ml 50ug/ml的抗原(第一轮)包被25cm2培养瓶，4°C过夜(包被液为200mM 的碳酸氢钠缓冲液，PH9. 6)，第二轮以后包被的抗原浓度降低到5ml lOug/ml。PBST洗涤 后加入5ml含1 X IO14噬菌体的4% MPBS,脱色摇床上轻晃30min后室温水平放置90min以 上进行抗原抗体的结合。然后用PBS和PBST各洗20遍，最后将生长至对数生长期的IOml TGl加入培养瓶并于30°C水浴30min让结合于抗原的噬菌体感染TG1。被感染的TGl经离 心后涂布于15cm 2YTGA平板上，30°C过夜。再用辅助性噬菌体超感染的方法从被感染并扩 增了的TGl制备噬菌体，进行第二轮筛选。如此反复进行“吸附_洗脱_感染_繁殖”的筛 选过程共4轮。(十一)单克隆噬菌体抗体抗原结合活性的鉴定1.单克隆噬菌体抗体的制备从最后一轮筛选的板子上挑选单个克隆于装有2YTGA的96孔培养板中，37°C振摇 过夜，次日1 100转接于新的2YTGA中，37°C振摇2. 5小时，用M13K07以20 1的比例进 行超感染，3500转，离心lOmin，用200ul 2YTGAK重悬细菌沉淀，30°C振摇过夜。次日11000 转离心15min，取上清进行phage ELISA鉴定。2. Phage ELISA鉴定抗原抗体结合活性用PSMA于4°C过夜包被ELISA板，每孔50ul，浓度为lug/ml。次日用含5%脱脂奶 粉的PBS加满孔室温封闭2小时，PBST洗5遍，用含2%脱脂奶粉的PBS稀释抗体，将稀释 好的抗体室温放置30分钟。用PBST洗板6次然后加入抗体200ul，室温孵育2小时，PBST 洗板，6次。加入HRP标记的抗M13噬菌体的抗体200ul，稀释度为1 5000。室温孵育1 小时，PBST洗板8次后加TMB显色·(十二)可溶性单链抗体的表达阳性噬菌体需要感染HB2151才能进行可溶性表达。阳性克隆的噬菌体作10或 100倍倍比稀释后过0. 45的滤膜(过滤膜这一步是为了去除混杂在噬菌体里的TGl大肠杆 菌.TGl比HB2151有生长优势，所以要去掉它)，取稀释好的10 μ 1去感染200 μ 1对数生长 期的ΗΒ2151。方法如下生长于Μ9培养基上的ΗΒ2151单克隆于5ml2YTG中，次日1 100 转接于50ml 2YTG，37°C振摇至0D600 = 0. 5。加入10 μ 1经滤过的、倍比稀释过的噬菌体， 混勻，37°C水浴30min。铺涂有奈定酮酸和氨苄的2YTG琼脂板，37°C过夜。挑单克隆于5ml 2YTGA(含葡萄糖)中，37°C摇过夜。次日1 100转接于50ml含0. 1 %葡萄糖的2YTGA 中，37°C振摇至0D600 = 0. 9 (大约3小时40分)，加入IPTG至终浓度为ImM，30°C振摇过 夜，取上清做行聚丙烯酰氨凝胶电泳分析表达情况，用ELISA鉴定可溶性表达的单链抗体 的抗原结合活性。(十四)可溶性单链抗体的纯化由于单链抗体是与6个组氨酸的标签融合表达的，所以可溶性表达上清可以用镍 柱进行亲和纯化，具体步骤为用PBS平衡亲和柱，样品上柱，50mM的咪唑洗脱非特异的结合蛋白，500mM的咪唑洗脱下结合于镍柱上的单链抗体，用分子筛去除咪唑，缓冲液置换为 PBS0 (见图 1)(十五)可溶性单链抗体的亲和力鉴定用lug/m 1和0. 5ug/ml两种不同浓度的PSMA包被ELISA板，然后加入从lug/ml 到lpg/ml十倍倍比稀释的纯化过的单链抗体，然后加入抗V5-HRP抗体(单链抗体与V5标 签融合表达)，最后用TMB显示。根据ELISA读数绘制亲和力曲线，然后求出0D50时Iug/ ml和0. 5ug/ml PSMA对应的抗体浓度，分别记为[Ab](对应于lug/ml PSMA)和[Ab] ’ (对 应于0. 5ug/ml PSMA)，然后用公式Kd = 2[Ab]，-[Ab]计算单链抗体的亲和力。(见图2)(十六)可溶性抗体与细胞表面表达的天然PSMA结合活性的鉴定由于重组PSMA的构象可能不同于表达于前列腺癌细胞表面PSMA的天然构象，所 以具有与重组PSMA结合活性的scFv可能并不能结合表达于细胞表面的PSMA。因而为了 鉴定我们筛选到的单链抗体与天然表达于细胞表面PSMA的结合活性，我们用流式细胞技 术对该抗体与NEK293细胞，转染了 PSMA的NEK293细胞及前列腺癌细胞系LNCaP的结合活 生进行了比较。方法是将该抗体与上述三种细胞孵育1小时，对照组不加该抗体，然后用抗 V5-APC抗体染色，最后用流式细胞仪比较APC信号的强弱。(见图3A-F)
0108]需要说明的是，本发明提供的附图1是在凝胶成像仪下采集的图片，图3A-F是流 式细胞仪检测后自动生成的图片，为医学研究最清晰的图片。
0109]以上实施例中未作详细叙述部分属于本行业或相关行业的公知技术，采用的设备 是行业惯例设备。
0110]序列表
0111]USEQ ID :1ο
0112]序列
0113]LPVLTQSPSASASLGASVKLTC TLSSffHSSNAI
0114]AffHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNffGDGIPDRF
0115]SGSSSGAERYLIISSLQSEDEADYYCQTWGTGIH
0116]VVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLQ
0117]SGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFS NYAMHffVR
0118]QAPGKGLEWVAVMSYDGNNKYYADSVKGRFTIS
0119]RDNSKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCARDLDIAA
0120]RFHYCAMDVffGQGTAVTVSS
0121]由753个核苷酸组成，其序列如下
0122]CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAG
0123]CTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACT
0124]GCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACA
0125]ACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGT
0126]TACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACC
0127]TGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGG
0128]CGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGC
0129]TGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA
GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACTGCGGTCACCGTCTCCTCA2, SEQ ID NO 20序列EVQLLQSGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFS NYAMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGNNKYYADSVKGRFTISR DN SKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCARDLDlAARFHYCAMDVffGQGTAVTVSS由372个核苷酸组成，其序列如下GAGGTGCAGCTGCTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACTGCGGTCACCGTCTCCTCA本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体重链可变 区由GHV3-30，IGHD6-6和IGHJ6基因重排后形成的具有单一开放读框的功能性可变区基 因。其中CDR3的核苷酸序列为GAT CTG GAT ATA GCA GCT CGT TTC，氨基酸序列为D L D I A A R F，由IGHD6-6和该抗体特有的序列组成。
0151]3, SEQ ID NO 3
0152]序列
0153]LPVLTQSPSASASLGASVKLTC TLSSffHSSNAI
0154]AffHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNffGDGIPDRF
0155]SGSSSGAERYLIISSLQSEDEADYYCQTWGTGIH
0156]VVFGGGTKLTVL
0157]由339个核苷酸组成，其序列如下
0158]CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAG
0159]CTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACT
0160]GCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACA
0161]ACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGT
0162]TACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACC
0163]TGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGG
0164]C
0165]本发明的人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体轻链可变区由IGLV4-69和IGLJ3基因片段重排后形成的具有单一开放读框的功能性可变区基因。其 中CDR3的核苷酸序列为CAG ACC TGG GGC ACT GGC ATT，氨基酸序列为Q TW G T G I。
权利要求
一种抗人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区的人源性单链抗体，起特征在于该单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID；1该抗体的氨基酸序列如下L P V L T Q S P S A S A S L G A S V K L T C T L S S W H S S N A IA W H Q L R P E K G L R Y L M K V N S D G S H N W G D G I P D R FS G S S S G A E R Y L I I S S L Q S E D E A D Y Y C Q T W G T G I HV V F G G G T K L T V L G G G G S G G G G S G G G G S E V Q L L QS G G G V V R P G R S L R L S C A A S G F T F S N Y A M H W V RQ A P G K G L E W V A V M S Y D G N N K Y Y A D S V K G R F T I SR D N S K N T L Y L Q M S S L R A G D T A V Y Y C A R D L D I A AR F H Y C A M D V W G Q G T A V T V S S
2.根据权利要求1所述的抗人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区的人源性单链抗体， 其特征在于该抗体的重链可变区按技术序列为SEQ ID NO :2，序列如下EVQLLQSGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCARDLDIAARFHYCAMDVWGQGTAVTVSS
3.根据权利要求1所述的抗人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区的人源性单链抗体， 其特征在于该抗体的轻链可变区按技术序列为SEQ ID NO :3，序列如下LPVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSWHSSNA IAWHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNWGDGIPDR FSGSSSGAERYLIISSLQSEDEADYYCQTWGTG I HVVFGGGTKLTVL
4.根据权利要求1所述的抗人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区的人源性单链抗体， 其特征在于所述人源性单链抗体由X753个核苷酸组成，其序列如下 CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAG CTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACT GCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACA ACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGT TACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACC TGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGG CGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGC TGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGC AAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGC AGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGA GATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGG GACTGCGGTCACCGTCTCCTCA
5.根据权利要求1所述的抗人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区的人源性单链抗体， 其特征在于所述人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体重链可变 区由372个核苷酸组成，其序列如下GAGGTGCAGCTGCTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACTGCGGTCACCGTCTCCTCA
6.根据权利要求1所述的抗人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区的人源性单链抗体， 其特征在于所述人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体重链可变 区由GHV3-30，IGHD6-6和IGHJ6基因重排后形成的具有单一开放读框的功能性可变区基 因；其中CDR3的核苷酸序列为GAT CTG GAT ATA GCA GCT CGTTTC，氨基酸序列为DLDI A A R F，由IGHD6-6和该抗体特有的序列组成。
7.根据权利要求1所述的抗人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区的人源性单链抗体， 其特征在于所述人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体轻链可变 区由339个核苷酸组成，其序列如下CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAGCTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACTGCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACAACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGTTACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACCTGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGC
8.根据权利要求1所述的抗人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区的人源性单链抗体， 其特征在于所述人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区特异性人源性单链抗体轻链可变 区由IGLV4-69和IGLJ3基因片段重排后形成的具有单一开放读框的功能性可变区基因；其 中CDR3的核苷酸序列为CAG ACC TGG GGC ACT GGC ATT，氨基酸序列为Q T W G T G I。
9.根据权利要求1所述的抗人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区的人源性单链抗体 在前列腺癌诊断和治疗药物开发中的应用。全文摘要
本发明的抗人前列腺特异性膜抗原(PSMA)胞外区单链抗体是采用噬菌体展示技术，以前列腺癌患者的外周血单个核细胞为原料构建的大库容量的单链抗体库通过先松弛后严谨的筛选富集得到的。该抗体可在大肠杆菌中可溶性表达，与前列腺特异性膜抗原胞外区的亲和力达到Kd＝0.2nM。该抗体不仅可以结合重组的PSMA胞外区，而且可以结合表面表达PSMA的NEK293细胞及前列腺癌细胞系LNCaP。这为利用该抗体进行前列腺癌影像诊断和导向治疗奠定了基础。
文档编号C07K16/28GK101891818SQ20091002093
公开日2010年11月24日 申请日期2009年1月16日 优先权日2009年1月16日
发明者温伟红, 秦卫军, 董青川, 赵爱志 申请人:中国人民解放军第四军医大学