专利名称：一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质分离材料的制备方法和应用，具体涉及一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法与应用。
背景技术：
基因重组蛋白的应用越来越广泛，重组蛋白的分离在一定程度上限制了其在我国各个领域应用的深度和广度。亲和-膜过滤分离新技术根据目标蛋白的生物化学特性，将亲和配基偶联到水溶性大分子基质上，在溶液状态下亲和载体特异性吸附目标蛋白形成分子团簇，其微粒尺寸远大于其它杂质成分，在膜分离过程中可以实现分子团簇与杂质的高效分离，因此，亲和-膜过滤分离兼具生物亲和的特异性和膜分离的快速、易放大。Mattiasson最初提出了亲和-膜过滤法分离蛋白质的可行性，并成功地利用热致死细菌^cc/2arawwy;c^cw^^^细胞膜上残基作为亲和配基，分离纯化了刀豆蛋白。此后，有关亲和-膜过滤分离蛋白质的研究包括用m-氨基苯甲脒偶联高分子聚合物实现分子量接近的胰岛素和糜蛋白酶的分离；用N-丙烯酰-m-氨基苯甲脒与丙烯酰胺的聚合物分离尿激酶；用生物素化脂质体纯化抗生素蛋白avidin;用偶联染料Cibacron Blue的琼脂糖实现人血清白蛋白与溶菌酶的相互分离；用高取代染料sephmose回收牛血清白蛋白等。由于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的分子量相近，单独运用超滤的方法很难将二者完全分离开来，中国专利ZL200410027191.7应用所合成的可溶性亲和载体，在超滤膜分离体系中通过吸附目标分子、清洗杂蛋白、洗脱目标分子获得纯化的胰蛋白酶。结果表明，用配基为PAB的亲和载体纯化胰蛋白酶，'获得胰蛋白酶纯化倍数达到93倍，回收80%以上。
虽然从提出亲和-膜过滤分离技术至今已有20多年，但是，至今未见产业化应用。究其原因，其一，亲和配基仅仅针对某一个或几个特定的蛋白质，难以形成规模化的分离纯化方法；其二，这些亲和配基与目标蛋白间的作用力弱，需要多级膜分离才能达到理想的分离效率；其三，在专利"水溶性亲和超滤载体的制备方法"(专利号ZL200410027191.7)中载体的环氧反应效率低，载体环氧取代度仅0.3mmol/g左右，降低了载体材料的分离效率
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足之处，提供一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法与应用。本发明选择水溶性基质材料，偶联与基因重组蛋白中组氨酸标记有强亲和作用的亲和配基和金属离子，制备出亲和-膜过滤分离载体材料，并应用于基因重组蛋白的膜分离纯化，蛋白回收率高。
本发明目的通过以下技术方案来实现一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法，包括以下步骤
(1) 水溶性载体基质的碱活化将水溶性载体基质溶解于碱溶液中，形成混合溶液，其中，水溶性载体基质的重量百分数的2 6%，反应后得到碱活化载体；
(2) 碱活化载体的环氧活化向碱活化载体中加入环氧氯丙垸，组成反应体系，将反
应体系在超声场中反应2 5h，反应温度为30。C 50。C，得环氧活化载体；
G)环氧活化载体与亲和配基的偶联将亲和配体与环氧活化载体溶液以体积比1:1 3:1进行反应，反应温度为30'C 5(TC，反应时间为2 5h，得偶联亚氨基二乙酸的载体；(4)偶联亲和配基的载体与金属离子的耦合将金属离子溶液与偶联亚氨基二乙酸的载体溶液以体积比1:1 3:1进行反应，反应温度为2(TC 4(TC，反应时间为2 4h，得到本发明的亲和-膜过滤载体。
步骤(1)所述的水溶性载体基质是葡聚糖，其分子量为1500000 3000000。步骤(1)所述的碱溶液包括NaOH或KOH的水溶液，浓度为0.1 0.3mol/L;所述的反应的温度为20 30°C;反应时间为20 40min。
步骤(2)所述的环氧氯丙垸占反应体系的体积百分数为2 6%,超声频率为35 130kHz，超声功率为200W 600W。
步骤(3)所述的亲和配体包括亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸或N， N， N-三羧甲基乙二胺。
步骤(3)所述的亲和配体的浓度为0.1 0.5mol/L，环氧活化载体溶液中载体的重量百分数为2 4%。
步骤(4)所述的金属离子溶液中金属离子的浓度为0.1 0.5mol/L，步骤(4)所述的金属离子包括Ci^+、 C(^+或N产，偶联亚氨基二乙酸的载体在偶联亚氨基二乙酸的载体溶液中的重量百分数为2 4%。
所述方法制备的亲和-膜过滤载体在分离基因重组蛋白中的应用。本发明方法制备的亲和-膜过滤载体分离基因重组蛋白的方法，包括如下步骤
将亲和-膜过滤载体溶液与组氨酸标记的基因重组蛋白溶液以体积比为2:1 4:1相混合，其中，亲和-膜过滤载体溶液中，亲和-膜过滤载体占2 4wt%，基因重组蛋白溶液中基因重组蛋白的浓度为1 3mg/mL;混合溶液在温度15 35°C、搅拌速度为100 200r/min下，反应0.5 1.5h，形成亲和-膜分离载体与基因重组蛋白的结合体，应用截留分子量为10万 30万的超滤膜分离截留结合体，在截留的结合体上用与其等体积的0.2 0.5mol/L的咪唑缓冲溶液从载体上洗脱基因重组蛋白，洗涤2 4次，再用截留分子量为10万 30万的超滤膜将基因重组蛋白与亲和-膜分离载体分离。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点和有益效果
1、 本发明所制备的水溶性亲和-膜过滤分离载体对基因重组蛋白的特异性吸附来自于亲和-膜过滤载体材料的金属离子和基因重组蛋白的组氨酸标记间的螯合作用。因而，本发明所制备的亲和-膜过滤载体材料可以实现一类基因工程产物(而不是一个或几个特定蛋白质)的下游分离纯化。
2、 金属离子和组氨酸标记间的螯合作用能力强，提高了亲和-膜过滤载体材料对基因重组蛋白的特异性吸附，具有很高的选择性，应用本发明方法所制备的水溶性亲和-膜过滤分离载体，蛋白质的回收率达到90%以上。
3、 本发明采用超声波强化碱活化载体的环氧活化反应，提高了水溶性载体的环氧取代度，载体环氧取代度最高可达1.5374mmol/g，提高了亲和-膜过滤载体材料的吸附能力。
具体实施例方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，在实施例中所用的基因重组蛋白为N-末端带有6个组氨酸标记的AxCesD， AxCesD是木醋杆菌UcWo6a"er xW咖w)中纤维素合成因子中的一个蛋白质亚基。但是，本发明所制备的水溶性亲和-膜过滤分离载体同样适用于分离其它带组氨酸标记的基因重组蛋白，且本发明的实施方式不限于此。实施例1
以分子量为150万的葡聚糖为水溶性载体基质，将0.2g水溶性载体基质溶解于浓度为0.3mol/L的NaOH溶液中，形成混合溶液，.水溶性载体基质用量为混合溶液重量的4%，在25'C反应30min，得碱活化载体。
向碱活化载体中加入0.3ml环氧氯丙垸，组成反应体系，环氧氯丙烷占反应体系的体积百分数为6%，在超声频率为130kHz、超声功率为300W的超声场中反应3h，反应温度为30°C，获得环氧取代度为1.5374mmol/g的环氧活化载体。将0.5mol/L的亚氨基二乙酸(IDA)溶液与0.2ml的环氧活化载体溶液以体积比1:1 在4(TC反应5h，其中环氧活化载体在环氧活化载体溶液中的重量百分数为4%，得偶联IDA 的载体。
将0.5mol/L的CuS04溶液与2ml的偶联IDA的载体溶液以体积比1:1在40'C反应2h， 其中偶联IDA的载体在偶联IDA的载体溶液中的重量百分数为4%,得到水溶性亲和-膜 过滤载体。
将2ml的载体重量百分数为2%的亲和-膜过滤载体溶液与AxCesD浓度为l.Omg/mL 的蛋白质溶液按体积比为2:1相混合，在15'C、搅拌速度150r/min下反应1.5h后，用截 留分子量为30万的超滤膜截留亲和-膜过滤载体与AxCesD的结合体，再用与截留液等体 积的2ml的、浓度为0.2mol/L的咪唑溶液从结合体上洗脱AxCesD 2次，经截留分子量为 30万的超滤膜过滤后，在透过液中可回收91.20%的AxCesD，截留液中的亲和-膜过滤载 体可以重复使用。 实施例2
以分子量为200万的葡聚糖为水溶性载体基质，将0.2g水溶性载体基质溶解于5mL 浓度为0.2mol/L的NaOH溶液中，形成混合溶液，水溶性载体基质用量为混合溶液重量 的4%，在3(TC活化30min，得碱活化载体。
向碱活化载体中加入0.21111环氧氯丙垸，组成反应体系，环氧氯丙烷占反应体系的体 积百分数为4%，在超声频率为35kHz、超声功率为200W的超声场中反应5h，反应温度 为40°C，获得环氧取代度为1.4375mmol/g的环氧活化载体。
将0.3mol/L次氮基三乙酸(NTA)溶液与lml的环氧活化载体溶液以体积比2:1在 3(TC反应4h，其中环氧活化载体在环氧活化载体溶液中的重量百分数为3%，得偶联NTA 的载体。
将0.3mol/L的NiS04溶液与2ml的偶联NTA的载体溶液以体积比2:1在30。C反应4h， 其中偶联NTA的载体在偶联NTA的载体溶液中的重量百分数为3%，得到亲和-膜过滤载 体。
将4ml载体重量百分数为3%的亲和-膜过滤载体溶液与AxCesD浓度为3.0mg/mL的 的蛋白质溶液按体积比为4:1相混合，在35。C、搅拌速度200r/min下反应lh后，用截留 分子量为10万的超滤膜截留亲和-膜过滤载体与AxCesD的结合体，再用与截留液等体积 的5ml、浓度为0.4mol/L的咪唑溶液从结合体上洗脱AxCesD 3次，经截留分子量为10 万的超滤膜过滤后，在透过液中可回收94.45%的AxCesD，截留液中的亲和-膜过滤载体可以重复使用。 实施例3
以分子量为300万的葡聚糖为水溶性载体基质，将O.lg水溶性载体基质溶解于浓度为 0.1mol/L的NaOH溶液中，形成混合溶液，水溶性载体基质用量为混合溶液重量的2%， 在20 °C活化20min，得碱活化载体。
向碱活化载体中加入0.1ml环氧氯丙烷，组成反应体系，环氧氯丙烷占反应体系的体 积百分数为2%，在超声频率为100kHz、超声功率为600W的超声场中反应2h，反应温度 为50°C，获得环氧取代度为0.9375mmol/g的环氧活化载体。
将0.1mol/LN， N， N-三羧甲基乙二胺(TED)溶液与lml的环氧活化载体溶液以体 积比3:1在50'C反应2h，其中环氧活化载体在环氧活化载体溶液中的重量百分数为为2%， 得偶联TED的载体。
将0.1mol/L的CoS04溶液与lml的偶联TED的载体溶液以体积比3:1在20。C反应3h， 其中偶联TED的载体在偶联TED的载体溶液中的重量百分数为2%，得到亲和-膜过滤载 体。
将3ml的载体重量百分数为4%的亲和-膜过滤载体溶液与AxCesD浓度为2.0mg/mL 的蛋白质溶液按体积比为3:1相混合，在25"C、搅拌速度100r/min下反应0.5h后，用截 留分子量为20万的超滤膜截留亲和-膜过滤载体与AxCesD的结合体，再用与截留液等体 积4ml的、浓度为0.5mol/L的咪唑溶液从结合体上洗脱AxCesD 4次，经截留分子量为20 万的超滤膜过滤后，在透过液中可回收92.15%的AxCesD，截留液中的亲和-膜过滤载体 可以重复使用。
权利要求
1、一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法，其特征在于，包括以下步骤(1)水溶性载体基质的碱活化将水溶性载体基质溶解于碱溶液中，形成混合溶液，其中，水溶性载体基质的重量百分数的2～6％，反应后得到碱活化载体；(2)碱活化载体的环氧活化向碱活化载体中加入环氧氯丙烷，组成反应体系，将反应体系在超声场中反应2～5h，反应温度为30℃～50℃，得环氧活化载体；(3)环氧活化载体与亲和配基的偶联将亲和配体与环氧活化载体溶液以体积比1∶1～3∶1进行反应，反应温度为30℃～50℃，反应时间为2～5h，得偶联亚氨基二乙酸的载体；(4)偶联亲和配基的载体与金属离子的耦合将金属离子溶液与偶联亚氨基二乙酸的载体溶液以体积比1∶1～3∶1进行反应，反应温度为20℃～40℃，反应时间为2～4h，得到本发明的亲和-膜过滤载体。
2、 根据权利要求l的一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法，其特征在于，步骤(1)所述的水溶性载体基质是葡聚糖，其分子量为1500000 3000000。
3、 根据权利要求l的一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法，其特征在于，步骤(1)所述的碱溶液包括NaOH或KOH的水溶液，浓度为0.1 0.3mol/L;所述的反应的温度为20 30°C;反应时间为20 40min。
4、 根据权利要求l的一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法，其特征在于，步骤(2)所述的环氧氯丙垸占反应体系的体积百分数为2 6%，超声频率为35 130kHz，超声功率为200W 600W。
5、 根据权利要求l的一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法，其特征在于，步骤G)所述的亲和配体包括亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸或N, N, N-三羧甲基乙二胺。
6、 .根据权利要求1的一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法，其特征在于，步骤(3)所述的亲和配体的浓度为0.1 0.5mol/L，环氧活化载体溶液中载体的重量百分数为2 4%。
7、 根据权利要求l的一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法，其特征在于，步骤(4)所述的金属离子溶液中金属离子的浓度为0.1 0.5mol/L，步骤(4)所述的金属离子包括012+、 Cc^+或N严，偶联亚氨基二乙酸的载体在偶联亚氨基二乙酸的载体溶液中的重量百分数为2 4%。
8、 一种权利要求1所述方法制备的亲和-膜过滤载体在分离基因重组蛋白中的应用。
全文摘要
本发明涉及涉及一种分离基因重组蛋白的亲和-膜过滤载体的制法与应用。在超声场中对碱活化的水溶性载体基质进行环氧活化后，与亲和配基偶联，再与金属离子螯合，获得水溶性亲和-膜过滤载体。采用本发明制备水溶性亲和-膜过滤载体时载体的环氧活化取代度最高可达1.5374mmol/g，金属离子和组氨酸标记间的螯合作用能力强，提高了亲和-膜过滤载体材料对基因重组蛋白的特异性吸附，具有很高的选择性，采用本发明方法分离带组氨酸标记的基因重组蛋白的回收率达90％以上。
文档编号C07K1/34GK101633687SQ20091004223
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月28日 优先权日2009年8月28日
发明者琳 李, 胡松青, 玮 赵 申请人:华南理工大学