IgE抗原性序列及分支多聚抗原肽的制备方法

专利名称：IgE抗原性序列及分支多聚抗原肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫技术领域的抗原性序列及分支多聚抗原肽的制备方 法，具体是一种IgE抗原性序列及分支多聚抗原肽的制备方法。
背景技术：
免疫球蛋白IgE在哮喘、季节性过敏性鼻炎以及其它过敏性疾病的发生发展 中起着关键的介导作用。当变应原初次进入机体后，选择性诱导变应原特异性B 细胞产生IgE抗体应答，而血清中游离的IgE可在不结合抗原的情况下通过其Fc 片段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力Fc e RI受体片段结合使机体处 于致敏状态。机体再次接触变应原后，多价变应原与致敏细胞表面两个或者两个 以上相邻的IgE抗体结合，使细胞膜表面的Fc e RI受体片段发生交联，触发致敏 细胞脱颗粒，释放及合成生物活性介质，从而引起局部或者全身过敏反应，症状 重者可导致过敏性休克，危及生命。临床上常见的I型超敏反应性疾病可分为全 身性过敏反应和局部过敏反应，前者包括药物过敏性休克，如青霉素、头孢菌素、 链霉素过敏等，以及血清过敏性休克，如抗血清治疗；后者包括呼吸道过敏反应、 消化道和皮肤过敏反应，如花粉、尘螨、真菌过敏，食物导致的过敏性胃肠炎， 荨麻疹，特应性皮炎等。
目前针对I型超敏反应的治疗方法主要为脱敏治疗和相应的生物活性介质的 拮抗治疗。如采用变应原皮肤实验检测出机体对之敏感的变应原，然后以此纯化 的变应原小剂量、长间隔、反复多次皮下注射脱敏。但可让机体致敏的变应原种 类较多，变应原纯化以及使用复杂，并且在临床使用上具有一定的危险性，曾有 文献报导在使用特异性变应原进行脱敏治疗时诱发出新的过敏发应，甚至引起死 亡。而且脱敏治疗周期长，不同实验室来源的变应原难以标准化，査找特异性变 应原的检测费用以及接受脱敏治疗的治疗费用较高，繁琐的皮下注射脱敏治疗对 病人会造成一定的痛苦，因而病人对此疗法的接受度较低。对于生物活性介质的 拮抗治疗，使用最普遍的是皮质类固醇类药物，其作用机理为常规抗炎和抑制炎性蛋白基因的转录，如细胞因子、酶和黏附分子。然而，皮质类固醇类药物的缺 点是其有全身效应。肥大细胞和嗜碱性粒细胞的抑制剂如抗组胺和白三烯药物， 可以封闭它们的特异性受体，也在频繁使用。另外一个常见药物是色甘酸钠，一 种肥大细胞稳定剂，对干草热和哮喘有较好的作用。但上述的不依赖于变应原的 治疗药物仅仅是减轻过敏症状而不会从根本上治愈或疗效持久地改善变态反应 疾病。作为变态反应性疾病的关键分子，IgE在正常血清中的含量极少，约为 150ng/ml，在血清中的半衰期约为3天，但如果与肥大细胞或者嗜碱性粒细胞表 面的相应受体结合则可维持稳定数周至数月之久。在变态反应性疾病的患者血清 中，IgE可上升十倍，而在某些寄生虫感染时或超敏反应发生时则可增加到1000 倍于正常浓度。人lgE重链全长428个氨基酸，含有4个恒定结构域Cel、 Ce2、 Ce3和Ce4。经过重组IgE片段、嵌合IgE、位点导向突变IgE、与IgE Fc结构域 相关的合成肽、以及用这些肽和模拟表位肽诱导产生抗体等手段所进行的抑制实 验证实，在人IgE抗体中与髙亲和力受体以及低亲和力受体结合的位点位于C e 3 结构域，这个位点具有接触残基散布在4个表面环结构中，而这些环就不对称分 布在C e 3、 C e 4构型骨架以及C e 2—C e 3连接处。
由于IgE在变态反应性疾病的发生发展环节中的重要作用，目前已经成为抗 变态反应性疾病治疗的一个新的靶点和研究热点。大致分为两个方向， 一是针对 IgE分子的被动免疫策略，另一个方向是与IgE分子C e 3结构域相关的主动免疫策 略，两者都取得了较好的效果。前者是采用经典的单克隆抗体制备技术，用人IgE 免疫小鼠，达到一定抗体滴度后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，产生可分泌抗 人IgE单克隆抗体的永生化杂交瘤细胞。通过去除抗体中可引起人体内免疫应答 的鼠源部分，然后嫁接这些可以与人IgE抗体特异性结合的轻链残基到人IgGl骨 架上将这种杂交瘤细胞所分泌的抗人IgE单克隆抗体人源化。由于该单克隆抗体 所识别的人IgE部位位于高亲和力和低亲和力受体结合区域，与之结合所产生的 封闭效应可消除人IgE抗体与受体结合的能力，并由此而有效的下调嗜碱性粒细 胞表面Fc e RI受体的表达和组胺的释放。治疗中度至严重变态反应性哮喘的抗 IgE单克隆抗体omalizumab现已经FDA批准上市，并在临床使用中取得了较好的疗 效，但不足之处在于该进口试剂治疗费用昂贵，大部分患者每个月都需要给药， 治疗效果不持久。与IgE分子C e 3结构域相关的主动免疫策略则结合了抗IgE单克隆抗体的特 异性封闭与疫苗治疗的持久性两个优点，人工合成或者用基因工程菌表达人IgE 中C e 3结构域相关序列免疫机体，使机体打破对IgE的免疫耐受，主动产生抗IgE 抗体。对于有些疫苗的研究开发，相应的完整抗原不易获得或完整抗原具有很大 毒副作用，这时可以考虑开发亚单位疫苗甚至表位疫苗。进行B细胞表位预测可 以帮助研究者尽快找到具有相同或相似抗原特异性与免疫保护作用，却不再具有 完整蛋白毒性的抗原片段。Stanworth等人采用Ce4区域的肽疫苗，Hellman L 通过细菌表达C e 2 C e 3区域的重组蛋白成功地抑制了家兔的皮肤过敏反应； F. Kricek等人使用抗人IgE单克隆抗体BSW17，采用噬菌体展示技术筛选6 15个 氨基酸序列的随机肽库，得到两个高亲和力的配体肽序列，经化学合成后偶联到 帽贝锁眼血蓝质上，并以此免疫家兔，能诱导出抗人IgE多克隆抗体。在恒河猴 上的进一步实验证明，该肽诱发的抗体可以阻断过敏原引起的皮肤过敏反应。 Chang Yi Wang等人根据以往的研究和B细胞表位预测结果筛选出一条C e 3区内 413 435位氨基酸序列的肽段，通过各种修饰方法，如偶联到KLH、 Th细胞表位 肽以及在肽段两端加上半胱氨酸而构成环肽模拟IgE分子Fc段的loop结构，并以 此作为免疫原免疫猪、狗和BALB/C小鼠，在免疫期内IgE抗体的滴度逐渐下降， 并在免疫后保持着相对较低的水平，并如抗IgE单克隆抗体一样，有效的减少IgE. 抗体与Fc e RI受体的结合，IgE抗体致敏细胞内组胺的释放以及PCA反应，并能产 生抗IgE单克隆抗体治疗所不能达到的持久性。尽管将IgEC e相关肽主动免疫策 略用于治疗变态反应性疾病尚有风险，如在体内诱导致敏抗体的可能性、IgE抗 体减少后机体内该类抗体承担的保护性作用也相应减少等等。
经对现有技术的文献检索发现，C Y Wang等人在国际专利WO 99/672193 第27页提及，表位肽由于自身单独使用免疫原性极弱或无免疫原性，因此不 能诱发有效的免疫应答， 一般来说需要与大分子载体蛋白偶联形成全抗原来使 用，这就不可避免会有可能诱发出除了针对该表位以外的其他无关抗体。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种IgE抗原性序列及分支 多聚抗原肽的制备方法。本发明得到的分支多聚抗原肽可解决单独使用抗原表 位线性肽免疫原性不强的缺点，可在免疫动物体内有效引起针对人IgE重链C
5e 3结构域的抗体应答。
本发明是通过以下技术方案实现的
本发明涉及一种IgE抗原性序列，该序列具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸 序列。
所述IgE抗原性序列位于IgE重链C e 3结构域上。
本发明还涉及一种分支多聚抗原肽的制备方法，包括步骤如下 步骤一，利用SEQ ID NO. 1所示的多肽序列，采用Fmoc固相肽合成法合成 以赖氨酸为支架的八分支多聚抗原肽，收集冻干后备用； 步骤二，用HPLC法纯化步骤一得到的分支多聚抗原肽； 步骤三，对分支多聚抗原肽进行免疫原性验证。
步骤一中，所述合成具体为利用赖氨酸有两个活性一NH2的特性来结合 另一个氨基酸的-C00H，经过四次赖氨酸之间的分枝状连接得到八分支的赖氨 酸骨架，以此赖氨酸骨架为核心周围共价连接八个包含SEQ ID NO. 1所示的 多肽序列的线性抗原肽段，进而得到分支多聚抗原肽。
本发明针对目前缺乏高效特异性IgE抗体的现状，筛选出一段人IgE重链 C e 3结构域上的如SEQ ID NO. 1所示的抗原序列；采用Fmoc固相肽合成法合 成了以赖氨酸为支架的包含SEQ ID NO. 1多肽序列的线性抗原肽段的八分支 多聚抗原肽。
本发明具有如下的有益效果本发明得到的分支多聚抗原肽能够用于IgE 抗体制备，可克服单独使用抗原表位线性肽免疫原性不强的缺点，可在免疫动 物体内有效引起针对人IgE重链C e 3结构域的抗体应答，且抗体特异性强， 不会产生其他无关抗体。
具体实施例方式
以下实例将结合附图
对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案 为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于 下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
6步骤一，利用SEQ ID NO. 1所示的多肽序列，采用Fmoc固相肽合成法合成 以赖氨酸为支架的八分支多聚抗原肽，收集冻干后备用
采用Kolaskar-Tongaonkar的抗原性分析方法和DNA Star软件包中 的Protean模块，对人IgE免疫球蛋白重链C e 3区域的柔顺性、抗原性、 二级结构、亲水区域、蛋白质表面可及性指数等抗原表位参数以及抗原 表位指数进行了综合分析。根据软件分析结果，在人IgE免疫球蛋白重 链Ce3氨基酸区段中抗原指数》1.0204，亲水性指数)O，氨基酸的 表面可能性指数^1，其内部或附近具有柔性结构。我们从符合这些条 件的氨基酸区段选出靠近羧基端的如SEQ ID NO. l所示的氨基酸 序列，以该序列作为抗原序列。利用SEQIDN0.1所示的多肽序列，采用 Fmoc固相肽合成法合成以赖氨酸为支架的八分支多聚抗原肽，即利用 赖氨酸有两个活性氨基即a —丽2和e -NH2的特性来结合另一个氨基酸 的-C00H，经过四次赖氨酸之间的分枝状连接即得到八分支的赖氨酸骨 架，以此赖氨酸骨架为核心周围共价连接八个包含如SEQ ID NO. l所示的 多肽序列的线性抗原肽段。
固相合成步骤如下
(1) 将替代度为0. 2mraol/g的PAC-PEG-PS树脂0. 5g采用二甲基甲酰胺浸 泡30分钟进行活化，采用对称酸酐法将己经活化的树脂进行第一个氨基酸的连 接；
(2) 称取待连接的赖氨酸195mg，加入1.5ml 二氯甲烷和3滴二甲基甲酰 胺使之溶解，加入以氮甲基比鉻烷酮为溶剂的IM的二环己基碳化二亚胺275ml， 200转/分钟磁力搅拌，25'C下反应15分钟，反应完毕，过滤除去沉淀，然后蒸 发掉过滤液中的溶剂，得到对称酐；
(3) 用二甲基甲酰胺滴加于得到的对称酐中，待对称酐溶解后，再加入到 活化的树脂中，摇动1分钟，然后加入以二甲基甲酰胺为溶剂的 . 1M二甲基氨 基吡啶460ixl，摇动反应90min，吹去反应液，用10ml 二甲基甲酰胺洗涤三次， 吹干，其余氨基酸的连接采用原位活化法，将连接有赖氨酸的树脂放入反应瓶中， 加入50ml以二甲基甲酰胺为溶剂的体积分数为30 %的哌啶溶液反应15分钟， 以脱去9-芴甲氧羰基保护基团；
7(4) 取2.0mrao1的保护氨基酸，用以二甲基甲酰胺为溶剂的1M的二异丙基 乙胺5ml溶解，加入以二甲基甲酰胺为溶剂的4.0mrao1的0-苯并三氮唑-N, N， N' ， N'-四甲基脲四氟硼酸酯和4.0mmo1的1-羟基苯并三唑，预反应15分钟 20分钟，然后和氨基酸树脂一起反应2小时，吹去反应液，使用50ml的二甲基 甲酰胺冲洗三次，吹干，其中，按照上述方法先用赖氨酸连接三次，得到八分支 多聚赖氨酸骨架，将此支架上的赖氨酸作为合成肽的C端第一个氨基酸，依次进 行其余氨基酸的偶联；
(5) 将已合成好全部氨基酸序列的树脂放入裂解容器中，按照三氟乙酸 水为95: 5的体积比配制切割试剂，使用时按25ral切割试剂与lg树脂反应的比 例进行切割，反应时间为2小时；将反应液快速倒入150ml乙醚中，收集沉淀， 所用乙醚需预先放在-2(TC低温冰箱中冷却；将沉淀重新加蒸馏水溶解，再转移 到冻干机中冻干；多抗原肽的脱盐步骤如下称取G-25凝胶15g，溶胀后装柱， 装好后的柱子先用蒸馏水50ml进行平衡，平衡好后，每次上样3ml -5ml，用蒸 馏水进行洗脱，用核酸蛋白检测仪检测220nm处紫外吸收，按峰收集组分，将第 一个峰的组分收集，冻干后备用。
步骤二，用HPLC法纯化步骤一得到的分支多聚抗原肽
使用Beckman公司半制备HPLC，柱子采用waters公司的径向加压色谱柱， 内径X柱长为25mmX100mm，粒径为15ixm，洗脱系统为A液体积分数为5% 的乙腈溶液，体积比为O. 1%的三氟乙酸作为溶剂；B液体积分数为95%乙腈溶 液，体积比为O. 1%的三氟乙酸作为溶剂。
手动进样，每次进样lml，流速4ml/min，线性梯度，45min内，B液从5%升 到50% ，然后5min内升到95腿液，做最后洗脱；220nm处检测紫外吸收，按峰 收集组分，用于质谱检测。将分子量检测正确的组分收集、冻干，成为需要的纯 品，备用。冻干纯品采用激光解析质谱鉴定多肽，数据分析软件为G2025A Software A. 02. 01，方法严格按照操作手册进行，检测合成多肽的分子量。
步骤三，对分支多聚抗原肽进行免疫原性验证
按照常规皮下免疫方法对新西兰大白兔和BALB/C小鼠进行了包含该序列抗 原肽的免疫原性的验证。ELISA方法检测动物免疫血清结果表明，该肽具有较强 的免疫原性，经过该肽免疫的新西兰大白兔和BALB/C小鼠可以产生针对人IgE的抗体，经过ELISA检测，两种动物血清中抗人IgE抗体滴度均可达11600。采 用包含此抗原肽的八分支多聚抗原肽免疫新西兰大白兔和BALB/C小鼠等动物， 可以用于制备抗人IgE的多克隆抗体和单克隆抗体。本发明得到的分支多聚抗原 肽可解决单独使用抗原表位线性肽免疫原性不强的缺点，可在免疫动物体内有效 引起针对人IgE重链C e 3结构域的抗体应答。序列表<110>上海交通大学<120> IgE抗原性序列及分支多聚抗原肽的制备方法 <160> 1 <210〉 1 〈211〉 14 <212〉 PRT<213>智人种(ife历o幼w'e/2.) <220><221> C—region <222〉 (1)…(14) <400> 1Glu Thr Tyr Gin Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg 1 5 10
权利要求
1、一种IgE抗原性序列，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2、 根据权利要求l所述的IgE抗原性序列，其特征是，所述IgE抗原性序 列位于IgE重链C e 3结构域上。
3、 一种分支多聚抗原肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 步骤一，利用SEQ ID NO. 1所示的多肽序列，采用Fmoc固相肽合成法合成以赖氨酸为支架的八分支多聚抗原肽，收集冻干后备用； 步骤二，用HPLC法纯化步骤一得到的分支多聚抗原肽； 步骤三，对分支多聚抗原肽进行免疫原性验证。
4、根据权利要求3所述的分支多聚抗原肽的制备方法，其特征是，步骤 一中，所述合成具体为利用赖氨酸有两个活性一NH2的特性来结合另一个氨 基酸的-C00H，经过四次赖氨酸之间的分枝状连接即得到八分支的赖氨酸骨架， 以此赖氨酸骨架为核心周围共价连接八个包含SEQ ID N0.1所示的多肽序列 的线性抗原肽段，进而得到分支多聚抗原肽。
全文摘要
一种免疫技术领域的IgE抗原性序列及分支多聚抗原肽的制备方法，其中，IgE抗原性序列具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；一种分支多聚抗原肽的制备方法，包括如下步骤利用SEQ ID NO.1所示的多肽序列，采用Fmoc固相肽合成法合成以赖氨酸为支架的八分支多聚抗原肽，收集冻干后备用；用HPLC法纯化步骤一得到的分支多聚抗原肽；对分支多聚抗原肽进行免疫原性验证。本发明得到的分支多聚抗原肽可解决单独使用抗原表位线性肽免疫原性不强的缺点，可在免疫动物体内有效引起针对人IgE重链Cε3结构域的抗体应答。
文档编号C07K14/00GK101503460SQ20091004747
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月12日 优先权日2009年3月12日
发明者崔大祥, 浩 杨 申请人:上海交通大学