专利名称：从红活麻中提取的新型免疫抑制剂及提取方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医用化学药物，具体涉及免疫抑制剂和其分离提取方法及其应用。
背景技术：
自身免疫性疾病是机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所 引起的疾病，患者血清中可检测出高滴度的自身抗休，病因还不清楚，可能与 遗传、感染、药物及环境因素有关，病程长且反复交替出现。自身免疫性疾病 主要包括器官特异性自身免疫病和系统性自身免疫性疾病。前者包括慢性淋巴 性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡
性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血肾炎综合征(goodpasture syndrome)、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎等；后者包括系统性 红斑狼疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎、硬皮病、结节性多动脉炎、 Wegener肉芽肿病等。
类风湿关节炎是一种以侵蚀骨和软骨组织为主，并造成关节对称性破坏为 主要症状的的慢性炎症性自身免疫性疾病。传统的治疗手段主要集中在使用镇 痛抗炎药和免疫抑制剂上，如非甾体抗炎药、糖皮质激素类药等。然而，这些 药严重的副作用限制了其应用。近年来，随着对类风湿关节炎发病机制的认识 深入到组织、细胞以及分子水平，产生了大量的生物治疗制剂，如各种单克隆抗体、抗细胞因子抗体、抗共刺激分子抗体等，虽然这些药在治疗类风湿关节 炎方面取得一定的成绩，但由于抗原性以及药物作用周期短，停药病情反复等 限制了其应用，因此，此类疾病尚无理想的有效药物。寻找针对此类疾病的理 想的有效药物成为当前一项重要任务。
树突状细胞(DC)作为主要的抗原递呈细胞，有研究表明其在RA的发
病及病情发展过程中起了重要作用。成熟DC通过向T细胞递呈特异性抗原诱 发T细胞活化增殖并产生免疫应答；半成熟DC和不成熟DC则由于缺乏共刺 激分子或者通过分泌IL-10等诱导T细胞失能或者分化为调节性T细胞，对自 身免疫性疾病的治疗中发挥重要作用。T-bet是DC产生IFN-Y及促进抗原特异 性Thl应答所必需的转录因子，而且也是刺激B细胞产生不同抗休亚型的特 异性介质。DC源性T-bet很可能是RA发病中所必需的关键转录因子，T-bet 通过DC发挥调控RA发病的作用。
调节性T细胞(Treg)是一类对机体免疫反应具有负调控作用的T细胞系， 关于Treg细胞如何诱导免疫耐受的作用机制尚未完全阐明，但诱导Treg细胞 产生被认为是治疗自身免疫性疾病的一种有效策略。CD4+CD25+Foxp3+T细胞 作为最主要的Treg细胞，在诱导和维持机体免疫耐受方面起了重要作用。转 录因子Foxp3是Treg细胞的特异性标志，研究表明Foxp3的表达与机体内环 境的免疫平衡和自身免疫性疾病的发生密切相关。
红活麻是荨麻科艾麻属珠芽艾麻植物^worte" ^/Z^/erafiSVez." Zwcg『"似.)的干燥根，我国湖北省恩施自治州出产红活麻。
发明内容
本发明的任务是提供一种新型免疫抑制剂，可用于类风湿关节炎等自身免疫性疾病的治疗。
本发明的另一个任务是提供这种新型免疫抑制剂的制备方法。 本发明的又一个任务是提供以本发明新型免疫抑制剂为活性成分的药物
组合物或药物制剂。
实现本发明的技术方案是
本发明提供新型免疫抑制剂具有以下式I所示的化学结构
本发明新型免疫抑制剂的化学名为1， 3-(6，， 6"， 7，， 7"-四甲氧基-8，，8"-
双香豆素)-丙酮，本专利申请中将其简称为红麻素。
本发明提供新型免疫抑制剂红麻素，是从民族药红活麻中提取分离得到，
红活麻是荨麻科艾麻属珠芽艾麻植物丄"/ orte" " Zmcc.,『"似.的
千燥根，我国湖北省恩施自治州出产红活麻。
本发明新型免疫抑制剂红麻素的提取分离方法包括以下步骤
a.称取洗过风干的红活麻，粉碎后用95%乙醇浸泡数次，浸泡次数通常
为5 — 8次，每次浸泡使溶剂没过药材，每次浸泡3 — 5天，取浸泡液减压回收后得到红活麻乙醇浸膏，将红活麻乙醇浸膏用水悬浮后依次用石油醚、水饱 和乙酸乙酯、水饱和正丁醇和水萃取，分别得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、 正丁醇浸膏和水浸膏；
b.将乙酸乙酯部位浸膏用有机溶剂完全溶解后上硅胶柱，用石油醚、乙 酸乙酯两种溶剂配制的不同极性的洗脱剂根据极性由小到大依次进行洗脱，洗 脱次序为石油醚、石油醚乙酸乙酯=50: 1、石油醚乙酸乙酯=10: 1、石 油醚乙酸乙酯=2: 1以及水饱和乙酸乙酯，其中在石油醚乙酸乙酯=2: 1 流份中析出淡黄色针状结晶，该淡黄色针状结晶即为本发明红麻素；
将石油醚乙酸乙酯=2:1流份的母液改用200-300目硅胶柱继续分离，以 石油醚乙酸乙酯=5: 1、石油醚乙酸乙酯=1: l和乙酸乙酯依次洗脱，在
石油醚乙酸乙酯=1:1流份中析出淡黄色针状结晶，该淡黄色针状结晶即为本
发明红麻素。
流程工艺图见附图1。 本发明新型免疫抑制剂红麻素的结构鉴定
应用红外光谱、质谱、核磁共振等光谱手段结合理化性质对从红活麻乙酸 乙酯部位浸膏中提取分离得到的本发明红麻素进行结构鉴定。
本发明红麻素的结构鉴定数据淡黄色针状结晶，365nm紫外下显蓝色荧 光，熔点149 151。C。 UV (MeOH): Xmax(logs) =346 (61.5), 210 (87.5), 225 (54.3)。 IR (KBr):vmax=3144.92, 2956.52, 1702.49， 1603.82, 1573.47, 1497.13, 1459.07, 1417.24， 1368.30, 1300.46, 1237.64, 1121.98, 1070.86， 967.33, 917.60, 865.98, 833.03, 594.63, 540.32， 516.91。 ESI-MS: m/z=466.8 。'H陽NMR (CDC13): 32.16 (4H， d，J:4Hz)， 3.94 (3H， s)， 4.09 (3H， s)， 6.27 (1H， d， 《/=8.0Hz)， 6.66 ( 1 Hs)， 7.60(1H， d， J^8Hz)。 13C-NMR(CDC13): (5160.6(C-2，，2")， 113.5(C-3，,3")， 143.8(C-6，，6"), 103.2(C-5，,5")， 144.6(C-4，,4，，)， 143.1(C-7，,7")， 134.5(C-8，,8")， 111.2(C-10，，10")， 142.5(C-9，,9")， 59.5 (6，，6"-OCH3)， 61.60(7，,7"-OCH3)， 30.9 (C-l， 3)， 207.0 (C-2)。
本发明红麻素的结构解析本发明红麻素为淡黄色针状结晶，并且在
365nm紫外灯下显蓝色荧光，结合晶体颜色，初步判断红麻素为具有共轭结构 的香豆素或者黄酮类。红外谱图显示本发明红麻素含有羰基、苯环、甲氧基等 基团。通过ESI-MS结合'H-NMR和^C-NMR数据，得到本发明红麻素分子 式为025112209。 W-NMR谱图显示有32.16 (s， 2H)，说明红麻素中有与不饱 和基团相连的亚甲基；33.94、 4.09(s， 3H)为甲氧基质子信号;36.27(d， 1H，J = 8Hz)、 7.60 (d， 1H， J二8Hz)为共轭双键的质子信号，这两个质子的化学位 移相差比较大，推断双键与其它基团存在共轭；36.66 (s， 1H)为苯环上的质 子。"C-NMR谱图显示有13个碳信号，其中330.9为亚甲基碳；.359.5、 61.6 为甲氧基碳；3103.2、 111.2、 113.5、 134.5、 142.5、 143.1、 143.8、 144.6为苯 环及双键上的碳信号；.3160.6为酯羰基碳信号；.3207.0为酮羰基碳信号。氢 谱及碳谱信号进一歩提示本发明红麻素中存在对称结构。HMBC中双键质子信 号36.27、 7.60都与酯羰基&160.6相关，说明双键与酯羰基直接相连，由此我 们初步判断Comp.l为香豆素类成分。HMBC还显示与双键相连的苯环碳信号 为&111.2。另外还可以知道与双键质子信号^7.60相连的碳信号为^144.6，与 ^6.27相连的碳信号为^113.5。 'H-NMR图谱中只有一个芳香质子信号r56.67， 说明苯环为五取代。
经与文献资料对比，发现本发明红麻素的'H-NMR和^C-NMR图谱数据与Liu等报道的化合物7-0-[4，-0 (3",4"- dihydroxycinnamyl)-P-D- gluco pyranosyl] - 6- methoxycoumarin类似，说明红麻素与报道的化合物可能具有相 似的骨架结构。不同点在于'H-NMR显示红麻素有两个甲氧基信号&3.94、 4.09，而报道文献里的化合物显示的是一个甲氧基和一个羟基信号，同时本发 明红麻素还多一个亚甲基质子信号氾.16; "C-NMR证实了本发明红麻素比文 献报道的化合物多一个甲氧基信号抓1.6、 一个亚甲基信号M0.9和一个羰基信 号氾07.0。由此我们推测本发明红麻素与报道化合物的区别可能是香豆素母核 结构中的7位取代基为甲氧基，8位通过亚甲基和羰基相连形成对称结构。
本发明红麻素中与苯环质子相连的碳信号为&103.2，这个质子信号在 HMBC中分别与&144.6、 111.2、 143.8、 134.5、 143.1和142.5相关，而HMBC 显示与甲氧基氢信号氾.94相关的苯环碳信号为M43.8，说明苯环质子位于与甲 氧基相连的碳C-6和与双键相连的碳C-10之间，即香豆素母核的5位上，同 时还说明苯环6位被甲氧基&3.94取代。HMBC显示亚甲基和羰基直接相连， 根据HMBC中只显示甲氧基质子M.09与&134.5相关，推测香豆素母核7位 连接甲氧基。结合前面确定的本发明红麻素的分子式可知，中间的连接基团是 丙酮，而不是丙二酮。以上推导过程证实了根据报道化合物结构推测本发明红 麻素结构的正确性。
结合ESI-MS和13C-NMR中碳信号个数，我们得出本发明红麻素的结构 为对称的1,3-(6，，6",7，,7"-四甲氧基-8，,8"-双香豆素)-丙酮。根据Scifmder检索， 红麻素未见报道，为一新化合物。
本发明新型免疫抑制剂红麻素的药效学实验
实验用细胞为BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞，骨髓来源树突状细胞，应用红细胞裂解液分离得到。
(1)本发明新型免疫抑制剂红麻素对BALB/c小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的
作用
取正常BALB/c小鼠制备脾细胞悬液，台盼兰计数，调整细胞浓度为lx106 mL-"。设溶媒组、阳性组(环孢霉素A，5mg-L")和lgmL-1、 O.lgmL-1禾B O.OlgmL-1 抑制剂组。细胞悬液接种于96孔板内，并加入相应浓度的药物，将96孔板置 于37'C、体积分数5XC02培养箱培养48h，每孔加入20|iL质量浓度为5g丄" 的MTT，混匀后再培养4h，离心去上清，加入150iiL的二甲亚砜，充分混匀 溶解后于酶标仪492nm处测定每孔的吸光度值，计算淋巴细胞增殖抑制率。 抑制率=(溶媒对照组OD值 一 药物组OD值)/ (溶媒对照组OD值 一 空 白对照组OD值)。(结果见附图2)
(2)本发明新型免疫抑制剂红麻素对脾脏淋巴细胞内转录因子Foxp3表达的 影响
a. 脾脏淋巴细胞的分离和培养
脾脏淋巴细胞的分离同上所述，将分离得到的淋巴细胞按一定量加入到24 孔板中，同时根据板子布局加入相应量的不同浓度的免疫抑制剂及对照物，并 加入10pL (浓度5pg/mL)的anti-CD3抗体作为刺激剂，将24孔板置于37°C 、 5%C02培养箱中培养72h。
b. 胞内转录因子Foxp3表达的测定 根据Foxp3试剂盒方法进行
I于24孔板内分别加入500pL的细胞悬液和500pL的RPMI-1640培养 液，根据实验分组加入高、低浓度的红麻素和对照物，同时加入5^(5pg/mL)的anti-CD3抗体作为剌激剂，于培养箱中培养72h。
II取培养后细胞悬液500pL，分别加入FITC标记anti-CD4抗体 0.125i!g/孔和PE标记anti-CD25 0.06iig/孔，4。C避光孵育30min。
III离心去上清后，用流式缓冲液1.5mL洗涤2次，加lmL固定破膜液 重悬细胞，4T:避光孵育25min。(固定破膜液将固定破膜浓縮液和固定破膜 稀释液按1: 3比例混匀)
IV离心去上清，2mL破膜缓冲液洗涤2次，之后用10(^L破膜缓冲液 悬浮，加入2^iL的Fc受体阻断剂，4'C孵育15min。(破膜缓冲液将10x破 膜缓冲液以蒸馏水稀释成lx缓冲液)
V直接加入PE-Cy5标记的Foxp3抗体和同型对照抗体Rat IgG2a 2.5pL， 4。C避光孵育30min。
VI离心去上清后用1.5mL的破膜缓冲液洗涤两次，最后用500pL流式 缓冲液悬浮，于流式细胞仪FACSort上检测细胞表型及胞内转录因子Foxp3。 (结果见附图3， 4)
(3)新型免疫抑制剂红麻素对骨髓树突状细胞(DC)内转录因子T-bet表 达的影响
a.骨髓DC的分离、培养
分离BALB/c小鼠胫骨骨髓，过无菌尼龙网去除杂质，PBS清洗，即可获 得骨髓细胞悬液；以淋巴细胞分层液分离细胞，清洗后，取3"07细胞加入含 10%胎牛血清的RPMI1640液，置于37t:， 5%二氧化碳培养箱内培养过夜； 次日弃上清液和悬浮细胞，清洗并加入RPMI1640完全培养液(含20ng/mL GM-CSF和20ng/mLIL-4)以及不同浓度的红麻素，于37。C、 5%二氧化碳培养箱内培养；至第7天收获细胞。
b. 骨髓DC表型鉴定
将上述DC悬浮于含5%FCS的PBS液中，于200pL的lx106 / ml细胞 悬液中分别加入FITC标记抗小鼠CDl 1 、抗小鼠CD86和抗小鼠MHC-II (I-Ad) 单克隆抗体。4。C孵育30min后，以PBS离心洗2次，重新悬于0.4mL的PBS 液后，采用流式细胞仪检测树突状细胞表型。(结果见附图5)
c. 骨髓DC T-bet mRNA转录水平分析
取上述收获DC细胞按照Trizol试剂盒说明书要求，提取DC内总RNA。 I在树突状细胞中加入lmL Trizol试剂，反复吹打；匀浆液室温放置
5min，加入0.2mL氯仿，涡旋震荡15s后，于室温放置15min后，4。C ， 12000 r/ rim
离心15min。
II将水相转移到一个新的离心管中，加入lmL异丙醇，翻转摇匀。室温 放置10min后，4°C， 12000r/min离心15min。
III弃上清液后加入lmL75。/。乙醇，反复吹打悬浮，4°C， 10000r/min离心 5min。
IV弃上清，并无菌风干RNA沉淀(至少5-10min)，不要使RNA沉淀完 全千燥，因为这样会大大降低RNA的溶解性。加入30pL RNase-free水并反复 吹打，是RNA完全溶解，55-6(TC水浴lOmin。
V取少量RNA液于石英管中，以RNase-free水为空白对照，在紫外分光
光度计测量其浓度。
取上述RNA溶液进行RT-PCR，方法如下
I取0.2mLPCR管，分别加入lO(aLDEPC水、lpLOligodT引物(0.5吗/jiL)和lj^L总RNA，短暂离心混匀，于7(TC下加热5min裂解RNA模版二级结构。
II取出PCR管，立即冰浴lmin以上，短暂离心使其沉到管底。在冰浴 中依次加入
5x反应缓冲液 dNTPs (IOjiM) R腦in (50U/(iL)
5joL 3jjL 0.5jiL
M _ MLVRT(200U/pL) 1 (iL
Free水 25|xL 混匀后于42。C水浴加热60min， 95。C加热10min，除掉M—MLV逆转录 酶，CDNA样品放置于4t:待用。
III PCR过程取出PCR管，取0.2mlPCR管，依次加入(总反应体系25pL)
■Free水 10xTaq Buffer DNTPs(10uM) 引物1 引物2
MgCl(25mM)
Taq酶
cDNA
PCR反应条件95°C 360s; 延伸55s;最后72。C延伸600s，
17pL 0.5^L
每个循环为94。C变性60s， 62。C退火55s， 72°C 34个循环，置于-2(TC冰箱保存待用。
13IV凝胶电泳分析取10mL 10xTBE加入卯mL水，稀释为lxTBE;称取 0.375g琼脂糖，加入25mLTBE，微波加热至溶液澄清，加入lpLGoldView，
振摇均匀，倒入凝胶制备槽内，待其自然凝固；拔出梳子，将凝胶放在电泳槽 屮，加TBE缓冲液直至高出胶面2 5mm，应避免气泡。点样，加样量为lOpL; 电泳电压70伏，指使剂距离点样点1/2 2/3凝胶长度时停止电泳，在JS-380A 凝胶成像系统上观察实验结果。(结果见附图6)
关于类风湿关节炎的发病机制到目前尚未完全阐明，普遍认为机体内环境 紊乱是导致产生自身免疫性疾病的重要诱因，即机体在清除外界细菌或病毒是 发生异常，产生对自身抗原如关节特异性抗原II型胶原、软骨蛋白HCgp-39 及蛋白聚糖或者某些非自身抗原如热休克蛋白Hsp等的特异性免疫反应，导致 全身性器官发生病变，即自身免疫性疾病。其中T细胞尤其是CD4+T细胞过 度活化在自身免疫性疾病的诱发及发展过程中起了重要作用。通常情况下，表 达特异性TCR的T细胞仅占T细胞总数的1/104 1/105，极少量的T细胞在受 到抗原递呈细胞(主要为树突状细胞)递呈的抗原-MHC复合物的剌激和粘附 因子等的协同刺激下，发生活化，并在细胞因子的共剌激下完全活化，然后通 过克隆扩增并分化成不同的效应性T细胞，发挥自身免疫作用。病理状态下， 效应T细胞过度增殖，主要分化为Thl及Thl7类效应细胞，Th2和Treg细胞 受到抑制，体内免疫平衡受到破环，导致自身免疫性疾病的发生。
CD4+CD25+T细胞(Treg)是一类对机体具有免疫负调控作用的细胞亚群。 尽管Treg细胞如何诱导免疫耐受的作用机制不甚明确，但促进Treg细胞增殖 被认为是诱导免疫耐受的一种有效策略。本发明从诱导表达Foxp3+Treg细胞 方面对本发明提供的新型免疫抑制剂的免疫调节作用进行深入研究，发现其可提高外周脾脏淋巴细胞中Foxp3表达，并通过促进Treg细胞增殖达到免疫抑 制作用。
为了进一步探讨本发明新型免疫抑制剂红麻素促进Treg细胞分化诱导免 疫耐受的可能机制，本发明还以骨髓树突状细胞(DC)表型及胞内转录因子T-bet为靶点，观察抑制剂对DC的作用。DC作为主要的抗原递呈细胞，有研究 表明其在RA的发病及病情发展过程中起了重要作用。根据DC表型及分泌的 细胞因子可分为成熟DC、半成熟DC和不成熟DC。成熟DC通过向T细胞递 呈特异性抗原诱发T细胞活化增殖并产生免疫应答；半成熟DC和不成熟DC 则由于缺乏共剌激分子或者通过分泌IL-10等诱导T细胞失能或者分化为调节 性T细胞，从而诱导免疫耐受。T-bet是DC产生IFN-Y及促进抗原特异性Thl 应答所必需的转录因子，而且也是刺激B细胞产生不同抗体亚型的特异性介 质。DC分泌炎性介质及刺激初始T细胞的作用都会因T-bet基因的缺乏而受 到抑制等研究事实，推测DC源性T-bet很可能是RA发病中所必需的关键转 录因子，T-bet通过DC发挥调控RA发病的作用。本发明提供的新型免疫抑制 剂红麻素通过抑制DC信号传导分子T-bet的表达，诱导不成熟DC的产生， 进而使T细胞发生免疫失能或者分化为Treg细胞，抑制自身免疫性疾病的发 生。
本发明提供的新型免疫抑制剂红麻素是具有特异性促进Treg细胞分化增 殖，抑制DCT-bet转录因子表达，诱导DC不成熟的免疫抑制剂，由于其特异 性作用于与诱3免疫耐受相关细胞，副作用小，因此对于治疗自身免疫性疾病 如类风湿关节炎等的治疗具有重要意义。
本发明从红活麻乙酸乙酯浸膏中提取分离得到具有免疫抑制作用，特别是具有诱导特异性免疫耐受作用的新双香豆素类化合物——1， 3- (6，， 6"， 7，， 7"-四甲氧基-8'， 8"-双香豆素)-丙酮，本发明中将其简称为红麻素，实验研 究证明红麻素通过抑制T淋巴细胞增殖、降低树突状细胞(DC)胞内转录 因子T-bet表达、诱导不成熟DC以及增加表达Foxp3调节性T细胞数量，产 生诱导免疫耐受或者使失衡的免疫系统达到新的平衡的作用，可作为一种免疫 抑制剂，用于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗。
图1为新型免疫抑制剂红麻素的提取分离纯化工艺流程图，图中A1 A5、
B1 B 3分别代表相对应洗脱剂的流份；
图2为MTT法测定新型免疫抑制剂红麻素对淋巴细胞增殖的影响；
图3为FACS测定新型免疫抑制剂红麻素对转录因子Foxp3表达的影响，
图中(A)溶媒对照组；(B)阳性对照组(TGF-(3); (C)红麻素低浓度组 (l吗/mL); (D)红麻素高浓度组(10吗/mL); 图4为新型免疫抑制剂红麻素对转录因子Foxp3表达提高率的影响； 图5为FACS测定新型免疫抑制剂红麻素对DC表面抗原分子CD1 lc, CD86
和MHCII表达的影响，图中(A)溶媒对照组；(B)红麻素高浓度组(lpg/mL);
(C)红麻素低浓度组(10iag/mL);
图6为新型免疫抑制剂红麻素对DC转录因子T-bet表达的影响，图中(1)
Marker; (2)红麻素高浓度组(10吗/mL); (3)红麻素低浓度组(l吗/mL); (4)溶
媒对照组。
具体实施例方式
实施例1.红活麻乙酸乙酯部位的提取分离称取洗过风干的红活麻，粉碎后用95%乙醇浸泡数次(5~8次)，每次浸
泡使溶剂没过药材，每次浸泡3 5天，取浸泡液减压回收后得到红活麻乙醇
浸膏，将红活麻乙醇浸膏用水悬浮后依次用石油醚、水饱和乙酸乙酯、水饱和 正丁醇和水萃取，分别得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏和水浸膏。 本实施例使用的红活麻来源于我国湖北省恩施自治州。
实施例2.新型免疫抑制剂红麻素的提取分离
a. 将乙酸乙酯部位浸膏用有机溶剂完全溶解后上硅胶柱，用石油醚、乙酸 乙酯两种溶剂配制的不同极性的洗脱剂根据极性由小到大依次进行洗脱，洗脱
次序为石油醚、石油醚乙酸乙酯=50: 1、石油醚乙酸乙酯=10: 1、石油 醚乙酸乙酯二2: 1以及水饱和乙酸乙酯，其中在石油醚乙酸乙酯=2: 1部
分流份中析出淡黄色针状结晶，其母液改用200 300目硅胶柱继续分离，以石
油醚乙酸乙酯=5: 1、石油醚乙酸乙酯=1: l和乙酸乙酯分别洗脱，在石 油醚乙酸乙酯=1: 1流份中也有淡黄色针晶析出。这些针晶即为本发明红麻
b. 新型免疫抑制剂的结构鉴定应用红外光谱、质谱、核磁共振等光谱 手段结合理化性质对从红活麻乙酸乙酯部位中提取分离得到的化合物1进行 结构鉴定
化合物l的结构鉴定数据淡黄色针状结晶，紫外下显蓝色荧光，熔点
149~151°C。 UV (MeOH):人max(logs) =346 (61.5), 210 (87.5), 225 (54.3)。 IR (KBr):vmax=344.92， 2956.52， 1702.49, 1603.82, 1573.47, 1497.13, 1459.07, 1417.24, 1368.30， 1300.46， 1237.64, ]121.98, 1070.86, 967.33, 917.60， 865.98, 833.03,594.63,540.32,516.91。 ESI-MS: m/z=466.8。 'H-NMR (CDC13): 32.16(4H， d，《/=4Hz)， 3.94 (3H， s)， 4.09 (3H， s)， 6.27 (1H， d，^8.0Hz)， 6.66 (1H， s)， 7.60 (1H， d，J:8.0Hz)。'3C-NMR(CDCl3): (5160.6(C画2，，2")， 113.5 (C-3，,3")， 143.8(C陽 6，,6"), 103.2(05,,5"), 144.6(C-4，,4，，) ， 143.1(C-7,，7") ， 134.5 (C-8,，8"), 111.2(C-10，,10")， 142.5(C-9,，9")， 59.5(6，,6"-OCH3)， 61.6 (7，，7，，-OCH3 )， 30.9 (C-l， 3)， 207.0 (C-2)。
红麻素的结构解析过程红麻素为淡黄色针状结晶，并且在365nm紫外 灯下显蓝色荧光，结合晶体颜色，初步判断红麻素为具有共轭结构的香豆素或 者黄酮类。红外谱图显示红麻素含有羰基、苯环、甲氧基等基团。通过ESI-MS 结合'H-NMR和^C-NMR数据，得到红麻素分子式为C25H2209。 'H-NMR谱 图显示有c52.16 (s， 2H)，说明红麻素中有与不饱和基团相连的亚甲基；33.94、 4.09 (s， 3H)为甲氧基质子信号;浙.27(d， 1H， /= 8Hz)、 7.60 (d， 1H， = 8设) 为共轭双键的质子信号，这两个质子的化学位移相差比较大，推断双键与其它 基团存在共轭；36.66 (s， 1H)为苯环上的质子。^C-NMR谱图显示有13个 碳信号，其中M0.9为亚甲基碳；.359.5、 61.6为甲氧基碳；3103.2、 111.2、 113.5、 134.5、 142.5、 143.1、 143.8、 144.6为苯环及双键上的碳信号;.3160.6为酯羰 基碳信号；.3207.0为酮羰基碳信号。氢谱及碳谱信号进一步提示红麻素中存在 对称结构。HMBC中双键质子信号36.27、 7.60都与酯羰基^160.6相关，说明 双键与酯羰基直接相连，由此我们初步判断红麻素为香豆素类成分。HMBC 还显示与双键相连的苯环碳信号为&111.2。另外还可以知道与双键质子信号 ^7.60相连的碳信号为^144.6，与&6.27相连的碳信号为c^113.5。 )H-NMR图 谱中只有一个芳香质子信号^.67，说明苯环为五取代。
经与文献资料对比，发现红麻素的'H-NMR和UC-NMR图谱数据与Liu等报道的化合物7-O-[4，-0- (3",4"- dihydroxycinnamyl)-卩-D- gluco pyranosyl]-6- methoxycoumarin类似，说明红麻素与报道化合物可能具有相似的骨架结构。 不同点在于'H-NMR显示化合物1有两个甲氧基信号&3.94、 4.09，而报道
文献里的化合物显示的是一个甲氧基和一个羟基信号，同时红麻素还多一个亚 甲基质子信号氾.16; "C-NMR证实了红麻素比文献报道的化合物多一个甲氧 基信号r561.6、 一个亚甲基信号&0.9和一个羰基信号3207.0。由此我们推测红 麻素与报道化合物的区别可能是香豆素母核结构中的7位取代基为甲氧基，8 位通过亚甲基和羰基相连形成对称结构。
红麻素中与苯环质子相连的碳信号为&103.2，这个质子信号在HMBC中 分别与&144.6、 111.2、 143.8、 134.5、 143.1禾tU42.5相关，而HMBC显示与 甲氧基氢信号M.94相关的苯环碳信号为3143.8，说明苯环质子位于与甲氧基相 连的碳C-6和与双键相连的碳C-10之间，即香豆素母核的5位上，同时还说 明苯环6位被甲氧基&3.94取代。HMBC显示亚甲基和羰基直接相连，根据 HMBC中只显示甲氧基质子M.09与&134.5相关，推测香豆素母核7位连接甲 氧基。结合前面确定的红麻素的分子式可知，中间的连接基团是丙酮，而不是 丙二酮。以上推导过程证实了根据报道化合物结构推测红麻素结构的正确性。
结合ESI-MS和i3C-NMR中碳信号个数，我们得出红麻素的结构为对称 的1,3-(6，,6",7，,7"-四甲氧基-8',8"-双香豆素)-丙酮。根据Scifmder检索，红麻 素未见报道，为一新化合物。
实施例3本发明免疫抑制剂红麻素不同剂型的制备 对含有本发明中红麻素的免疫抑制剂的剂量形式没有明确的限制，根据临 床实际情况可以制成各种类型的口服或者肠道外制剂。为适应临床治疗自身免疫性疾病的需要，本发明还为新型免疫抑制剂提供了可用于临床的相适应的剂型。
1. 红麻素的分离纯化称取洗过风干的红活麻，粉碎后用95%乙醇浸泡
数次(5 8次)，每次浸泡使溶剂没过药材，每次浸泡3 5天，取浸泡液减 压回收后得到红活麻乙醇浸膏，将红活麻乙醇浸膏用水悬浮后依次用石油醚、 水饱和乙酸乙酯、水饱和正丁醇和水萃取，分别得到四个部位浸膏。将乙酸乙 酯浸膏用甲醇完全溶解后上硅胶柱，用石油醚、乙酸乙酯两种溶剂根据极性由
小到大依次进行洗脱，洗脱次序为石油醚、石油醚乙酸乙酯=50: 1、石油 醚乙酸乙酯=10: 1、石油醚乙酸乙酯=2: 1以及乙酸乙酯，其中在石油
醚乙酸乙酯=2: 1部分流份中析出淡黄色针状结晶，其母液改h 200 300 口
硅胶柱继续分离，以石油醚乙酸乙酯=5: 1、石油醚乙酸乙酯=1: l和乙
酸乙酯分别洗脱，在石油醚乙酸乙酯=1: 1流份中也有化合物淡黄色针晶析 出。这些针晶即为本发明红麻素。
2. 片剂的制备方法
(1)取分离提取得到的红麻素2g过80目筛后与淀粉250g混匀，加淀粉浆制 成软材；(2)过14目筛制粒，于70 8(TC干燥后过12目筛整粒；(3)加入干 淀粉50g和硬脂酸镁5g混匀压片即得，可制得1000片(每片含化合物2mg)。 建议的使用方法成人口服每日三次，每次2片、
3. 混悬剂的制备方法(1)将上述制得的红麻素加甘油在乳钵中研磨成 细腻糊状；(2)将羧甲基纤维素钠用蒸馏水制成胶浆，在搅拌下缓慢加入乳钵 中研匀，加蒸馏水至全量，搅匀，即得混悬剂。
权利要求
1.具有以下式I结构式的化合物。
2. 权利要求1所述化合物的制备方法，包括以下步骤a. 称取洗过风干的红活麻，粉碎后用95%乙醇浸泡5 — 8次，每次浸泡 使溶剂没过药材，每次浸泡3 — 5天，取浸泡液减压回收后得到红活麻乙醇浸 膏，将红活麻乙醇浸膏用水悬浮后依次用石油醚、水饱和乙酸乙酯、水饱和正 丁醇和水萃取，分别得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏和水浸膏；b. 将乙酸乙酯浸膏用甲醇完全溶解后上硅胶柱，用石油醚、乙酸乙酯两 种溶剂配制的不同极性的洗脱剂根据极性由小到大依次进行洗脱，洗脱次序 为石油醚、石油醚乙酸乙酯=50:1、石油醚乙酸乙酯=10:1、石油醚乙酸 乙酯=2:1以及水饱和乙酸乙酯，其中在石油醚乙酸乙酯=2:1流份中析出的 淡黄色针状结晶为权利要求1所述化合物。
3. 权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，将权利要求2所得的石油醚乙酸乙酯=2:1流份的母液改用200~300目硅胶柱继续分离，以石油 醚乙酸乙酯=5:1、石油醚乙酸乙酯=1:1和乙酸乙酯依次分别洗脱，在石油 醚乙酸乙酯=1:1流份中析出的淡黄色针晶为本发明权利要求1所述化合物。
4 .权利要求1所述化合物在制备免疫抑制剂中的应用。
5 .权利要求1所述化合物在制备用于治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
6 .权利要求1所述化合物在制备用于治疗类风湿关节炎药物中的应用。
7 . —种免疫抑制药物，其特征在于，含有有效量的作为活性成分的权利 要求l所述的化合物。
8 . —种作为免疫抑制剂的药物制剂，其特征在于，含有有效量的作为活 性成分的权利要求1所述的化合物和药剂学上可接受的载体、添加剂和/或赋 型剂。
9.根据权利要求8所述的免疫抑制剂，其特征在于，它是以权利要求l 所述的化合物为活性成分按常规方法制成的片剂或混悬剂。
全文摘要
本发明从红活麻乙酸乙酯浸膏中提取分离得到具有免疫抑制作用，特别是具有诱导特异性免疫耐受作用的新双香豆素类化合物—1，3-(6’，6”，7’，7”-四甲氧基-8’，8”-双香豆素)-丙酮，该化合物通过抑制T淋巴细胞增殖、降低树突状细胞(DC)胞内转录因子T-bet表达、诱导不成熟DC以及增加表达Foxp3调节性T细胞数量，产生诱导免疫耐受或者使失衡的免疫系统达到新的平衡的作用，可作为一种免疫抑制剂，用于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗。
文档编号C07D311/00GK101585823SQ20091006244
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月9日 优先权日2009年6月9日
发明者明 向, 苏志强, 陈新民 申请人:华中科技大学;珠海润都民彤制药有限公司