专利名称：传染性胰腺坏死重组vp2蛋白抗原及纯化方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物制剂，本发明还涉及这种生物制剂的制备方法。具体地说是一种鱼传染性胰 腺坏死重组VP2蛋白抗原及制备方法。
(二)
背景技术：
传染性胰腺坏死是由传染性胰腺坏死病病毒(Infectious pancreas necrosis vims, IPNV)引起鲑科鱼类 的一种高度传染性和急性病毒性疾病，典型症状为游动异常，病鱼体色深暗，腹部膨胀，眼球突出，皮下、 肝胰腺等内脏实质器官出血坏死，高致病力毒株对两月龄的幼鱼致死率高达恥％，感染后幸存的鱼终生带 毒，通过粪便和精卵排出病原，成为潜在的传染源。因该病流行范围广，发病和致死率高，给我国和世界 各国鲑鳟养殖业带来重大的经济损失。
传染性胰腺坏死的传统诊断方法常根据流行病学和主要症状表现作为初步诊断的依据。但由于传染性 造血组织坏死病毒和艾特韦病毒也能引起皮下出血和内脏器官出血坏死，在流行病学和症状上很难区别， 因此必须依靠病毒分离和血清学实验才能最后确诊。
自从1960年Wolf首次报道了鲑鳟幼鱼传染性胰腺坏死以来，世界各国对IPNV.诊断技术进行了大量 研究，已建立了病毒分离(Isolation of Virus IV)、荧光抗体技术(Fluorescent An他ody Test FAT)、病毒 中和试验(Virus Neutralization VN)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)和 多聚酶链式反应(Poly Chain Reaction PCR)等方法。根据流行病学、主要症状和病理变化可对IPN进行 初步诊断，若与鱼的传染性造血组织坏死和艾特韦病毒引起的病毒性出血败血症相区分，还需在实验室确 诊。
快速准确的疫病诊断是防治传染性胰腺坏死的重要前提。而目前还没有行之有效的防治方法。在诊断 和检测上对可疑病料进行病毒分离与鉴定是此病最为直观的诊断方法，但是分离病毒需要一定的条件和相 当常的时间，因此，此种诊断方法存在费时、费力不能快速诊断的弊端；本病快速诊断方法最常应用的是 血清学试验、荧光抗体试验和酶联免疫吸附试验等。而血清学方法诊断的准确性依赖于诊断抗原及抗体的 特异性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以克服传染性胰腺坏死传统诊断抗原所存在的排毒、散毒的潜在危险， 可作为一种疾病检测的诊断抗原的传染性胰腺坏死重组VP2蛋白抗原；本发明的目的还在于提供一种传染 性胰腺坏死重组VP2蛋白抗原的纯化方法。
本发明的内容是从IPNV病毒液中进行病毒核酸(RNA)提取，以IPNV VP2基因的下游引物P2进行病 毒基因组cDNA的合成，再利用IPNVVP2基因的上、下游引物，进行VP2基因的扩增，将扩增得到的IPNV VP2基因克隆到原核表达载体质粒pET30b中，并在大肠杆菌BL21菌株中进行表达得到传染性胰腺坏死重 组VP2蛋白抗原，其命名为pET30b-IPNV VP2/ BL21 (Escherichia coli BL21 a w他recombinant plasmid of Infectious pancreas necrosis virus VP2 gene)。它是保藏在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO: M209002,保藏日期2009年1月6日。
IPNV VP2基因cDNA序列为GCTATGGCAAGTACGACCCCGAA 上、下游引物序列分别
PI 5 'Ggatcc a GAGCGACACATCTTAAAACAAGAGAC 3' P2 5' CtcgagTTCGGGGTCGTACTTGCCATAG 3'。
本发明的传染性胰腺坏死重组VP2蛋白抗原的纯化方法
1. 融合蛋白的大量表达
(1) 将PET30b-IPNV VP2/ BL21接种于10mL含有Kana'LB培养基中，37。C振荡培养过夜；
(2) 按1:50转接2raL过夜培养物于100 mL含100 u g/mL的Kana^B培养液中，于37。C振荡培养4 h 左右,0D6oo值达到0.6时，取出l mL样品供电泳分析。
(3) 加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，于37。C继续培养至0D6。。值达到1. 0时终止培养，取出1 mL样 品供电泳分析。
2. 融合蛋白的纯化
(1) 向1.5cmX7.5cm层析柱中加入lmlNi、NTA凝胶介质，20ml去离子水洗柱后，再用20mlBuffer A溶液洗柱。
(2) 将100ml菌液经8000 rpm离心20min，去上清，沉淀的菌体用10ml冷的菌体裂解液I快速悬起， 加溶菌酶(10mg/ml) 10ul混匀,冰浴30min，超生裂解30min。
(3) 4'C条件下，以8000rpm离心10min，弃上清；
(4) 将菌体沉淀用预冷15ml缓冲液II重新悬起，4'C, 8000rpm,离心10min,弃上清，重复4次， 所得沉淀即为粗提包涵体；
(5) 用8ml缓冲液ni溶解包涵体，4'C条件下，以12000rpm离心20min，弃上清；
(6) 用4ml PBS悬起包涵体沉淀混匀，以0.5ml/min的流速加入到Ni"-NTA柱中；收集流出液再依 次使用20ralBuffer A、 20mlBuffer B以0. 5ml/min的流速洗涤后收集流出液，SDS-PAGE电泳分析；
(7) 用含有80imnol/L咪唑的Buffer C 10ml进行洗涤，收集洗脱液，检测蛋白浓度，保存含有重组 蛋白的洗脱液，短期保存在4'C下保存，长期保存于-2(TC下保存。
随着现代分子免疫学和分子生物学等先进技术的开发利用，为新一代生物工程诊断试剂的研制开发 开辟了新途径。以基因工程、细胞工程等先进的技术手段获得的诊断抗原或抗体，其突出特点在于均一性 好，纯度高，特异性强、性能稳定，并易于保存和批量生产，由此建立诊断技术和方法易于国际标准化， 是未来疫病诊断发展的主要方向。同时，以生物技术生产的诊断抗原，可避免烦琐的细胞培养来制备大量 的抗原物质。
IPNV VP2蛋白含有病毒的主要抗原表位和中和抗体表位，分子质量为54kDa,是IPNV的主要衣壳蛋 白，占病毒粒子蛋白的62%,含有病毒主要抗原决定簇，由150个氨基酸多肽构成，并且这个多肽携带了 抗原决定簇，含有特异性抗原表位，能够诱导病毒中和抗体，能够激发较强的免疫应答，因此对外衣壳蛋 白VP2基因的进行克隆、表达及其表达产物纯化。其纯化的蛋白产物，无论是作为一种疾病的诊断抗原， 还是作为一种激发机体免疫应答的免疫制剂，均是极为有用的新型生物制剂。该制剂的进一步应用，将对 IPN的诊断与防治提供重要的物质基础。IPNV的检测和IPN早期准确的诊断在防治该病的流行上具有重要 作用，因此进一步完善这些检测方法，使之具有高度的特异性、敏感性，更加快速、简便，更适用于常规 大量样品的检测，将具有更重要的实际意义。利用分子生物学技术制备的重组IPNV VP2蛋白具有与天然的VP2蛋白相近的免疫生物学技术特性， 而且可以规模化生产，该项技术避免采取体外培养病毒抗原、差速离心和密度梯度离心纯化病毒的生产方 法，提高了工作效率，减少了非特异性反应。以此法生产的抗原，可避免以活病毒做抗原散播病毒的危险。
(四)
图1传染性胰腺坏死病毒VP2基因的RT-PCR扩增结果凝胶电泳图 l.DNA MarkerDL2000: 2. VP2基因PCR扩增产物(1095 bp) 图2重组质粒pMD18-T-VP2酶切、PCR鉴定结果
1. DNA Marker DL15000; 2. B柳HI单酶切；3. J力ol单酶切；4. 5a威I和双酶切；5. DNA MarkerDL2000; 6. PCR鉴定结果7. PCR阴性对照. 图3重组质粒PET30b-IPNV VP2酶切、PCR鉴定结果
1. DNA Marker DL15000; 2. BamHI单酶切；3. 单酶切；4.飽/zH I和双酶切；5. DNA
MarkerDL2000: 6. PCR鉴定结果；7. PCR阴性对照.
图4重组大肠杆菌pET30b-IPNV VP2/ BL21表达VP2蛋白SDS-PAGE及Western-blotting鉴定结果 重组菌pET30b-IPNV VP2/ BL21诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果丄protein marker (116kD 14. 4kD); 2. pET30b-IPNV VP2/ BL21未经IPGT诱导3. pET30b-IPNV VP2/ BL21经IPGT诱导 目的蛋白Western-blot鉴定结果.将蛋白转印NC膜，先后与兔抗IPNV血清和HRP标记羊抗兔IgG 作用，显色后观察结果4. protein marker (U6kD 14. 4kD) ;5. pET30b-證VP2/BL21未经IPGT 诱导Western blot结果未出现预期的反应带；6. pET30b-IPNV VP2/ BL21经IPGT诱导Western blot鉴定 出现预期大小的免疫反应带。
图5融合蛋白纯化的SDS-PAGE电泳图和Western-blotting图谱
重组菌pET30b-IPNV VP2/ BL21诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果.1 2..经亲和层析纯化的菌体蛋白；3 pET30b-IPNV VP2/ BL21经IPGT诱导后超声裂解沉淀;4. pET30b-IPNV VP2/ BL21经IPGT诱导后超声裂 解的上清；5. protein marker (116kD 14. 4kD)
目的蛋白Western-blot鉴定结果.将蛋白转印NC膜，先后与兔抗IPNV血清和HRP标记羊抗兔IgG
作用，显色后观察结果6. pET30b-IPNV VP2/BL21未经IPGT诱导Western blot结果未出现预期的
反应带；7. pET30b-IPNV VP2/ BL21经IPGT诱导经亲和层析纯化的菌体蛋白Western blot鉴定出现预
期大小的免疫反应带。
图6发明产品的具体制作工艺流程图
(五)
具体实施例方式
从繁殖IPNV病毒的细胞培养液中进行病毒核酸(RNA)提取，以IPNV VP2基因的下游引物P2进行病 毒基因组cDNA的合成，再使用IPNVVP2基因的上、下游引物，进行VP2基因的扩增，将扩增后的IPNVVP2 基因克隆到原核表达载体质粒pET30b中，并在大肠杆菌BL21菌株中进行表达，根据载体的特点，本实验 选用IPTG诱导融合蛋白的表达，表达产物在经SDS-PAGE分析和免疫印记(Western-blot)检测抗原活性 之后，融合蛋白的纯化利用原核表达载体pET30b所表达的重组蛋白带有6个连续组氨酸残基，可结合在 Ni-NTA柱上，又因咪唑可竞争地结合在Ni-NTA柱上而将重组蛋白置换下来，为重组融合蛋白的提取纯化 提供了一种有效方法。
权利要求
1.一种传染性胰腺坏死重组VP2蛋白抗原，其特征是它是从传染性胰腺坏病毒细胞培养液中进行病毒核酸(RNA)提取，以IPNV VP2基因的下游引物P2进行病毒基因组cDNA的合成，再利用IPNV VP2基因的上、下游引物，进行VP2基因的扩增，将扩增得到的IPNV VP2基因克隆到原核表达载体质粒pET30b中，并在大肠杆菌BL21菌株中进行表达得到传染性胰腺坏死重组VP2蛋白抗原。
2. 根据权利要求1所述的传染性胰腺坏死重组VP2蛋白抗原，其特征是VP2蛋白基因序列为GCTATGGCAAGTACGACCCCGAA引物序列为Pl 5 'GgatecaGAGCGACACATCTTAAAACAAGAGAC 3'，P2 5' CtcgagTTCGGGGTCGTACTTGCCATAG 3'。
3. —种传染性胰腺坏死重组VP2蛋白抗原的纯化方法，其特征是融合蛋白的大量表达(1) 将PET30b-IPNV VP2/ BL21接种于10mL含有Kana'LB培养基中，37。C振荡培养过夜；(2) 按1:50转接2mL过夜培养物于100 mL含100 w g/mL的Kana'LB培养液中，于37'C振荡培养4 h 左右,ODeo。值达到0. 6时，取出1 mL样品供电泳分析。(3) 加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,于37'C继续培养至00600值达到1. 0时终止培养，取出1 mL样 品供电泳分析。融合蛋白的纯化(1) 向L5cmX7.5cm层析柱中加入lralNi2+-NTA凝胶介质，20ml去离子水洗柱后，再用20mlBuffer A溶液洗柱。(2) 将100ml菌液经8000 rpm离心20min，去上清，沉淀的菌体用10ml冷的菌体裂解液I快速悬起， 加溶菌酶(10mg/ml) 10ul混匀,冰浴30min,超生裂解30min。(3) 4。C条件下，以8000rpm离心10min,弃上清;(4) 将菌体沉淀用预冷15ml缓冲液II重新悬起，4'C, 8000rpm，离心lOmin，弃上清，重复4次，所得沉淀即为粗提包涵体；(5) 用8ml缓冲液ni溶解包涵体，4'C条件下，以12000rpm离心20min，弃上清；(6) 用4ml PBS悬起包涵体沉淀混匀，以0.5ml/min的流速加入到Ni、NTA柱中；收集流出液再依 次使用20mlBuffer A、 20mlBuffer B以0. 5ml/min的流速洗涤后收集流出液，SDS-PAGE电泳分析；(7) 用含有80ramol/L咪唑的Buffer C 10ml进行洗涤，收集洗脱液，检测蛋白浓度，保存含有重组 蛋白的洗脱液，短期保存在4'C下保存，长期保存于-20'C下保存。
全文摘要
本发明提供的是一种传染性胰腺坏死重组VP2蛋白抗原及纯化方法。从传染性胰腺坏病毒细胞培养液中进行病毒核酸(RNA)提取，以IPNV VP2基因的下游引物P2进行病毒基因组cDNA的合成，再利用IPNV VP2基因的上、下游引物，进行VP2基因的扩增，将扩增得到的IPNV VP2基因克隆到原核表达载体质粒pET30b中，并在大肠杆菌BL21菌株中进行表达得到传染性胰腺坏死重组VP2蛋白抗原。该抗原可以克服传染性胰腺坏死传统诊断方法中的抗原所存在的排毒、散毒的潜在危险，可作为一种疾病监测的诊断抗原。
文档编号C07K14/005GK101580541SQ20091007126
公开日2009年11月18日 申请日期2009年1月14日 优先权日2009年1月14日
发明者乔薪瑗, 敏 刘, 唐丽杰, 李一经, 葛俊伟 申请人:东北农业大学