专利名称：：一种超声波处理胆汁的方法
技术领域：
：本发明涉及一种胆汁的处理方法，尤其是一种超声波处理胆汁的方法。
背景技术：
：胆红素(bilirubin)通常指胆红素IXa，它是绝大多数哺乳动物体内血红素分解代谢的终产物。胆红素在葡萄糖醛酸基移换酶的催化下转化为结合胆红素(主要是胆红素双葡萄糖醛酸苷)。胆红素结构以线性和类卟啉构型，其所表现出来的性质不相一致，特别是大量结合态胆红素氢键的存在，给胆红素的提取带来了一定难度。目前，生产过程中大多不经过处理而直接进行提取，即浪费时间、人力物力，提取率也较低。
实用新型内容为了解决
背景技术：
中的问题，本发明目的是提供一种超声波处理胆汁的方法，该超声波提取法优点是提取时间短、温度较低、收率高。本发明的技术方案是该超声波处理胆汁的方法包括下列步骤首先用不锈钢刀子破胆，防止胆红素遇到金属离子易被氧化先用不锈钢刀子，将胆汁放入烧杯中，采用200目的滤布过滤，检测胆汁中胆红素的含量，即为胆汁中胆红素的初始含量；然后将滤液放在超声波药品处理机内利用超声波处理，超声波输出功率为320士20W，超声波处理的频率为68KHz72KHz，超声波处理的时间为15min25min，超声波处理的温度为25°C35°C，最后检测处理后胆汁中胆红素的上述的超声波功率为320W，超声波频率为72kHz，超声波处理温度为30。C，超声波处理时间为20min。本发明具有如下有益效果超声波具有较强的空化作用使物质不断的运动，超声波次级效应，如机械震动乳化、扩散、击碎、化学效应等，也能加速提取成分的扩散、释放并与溶剂充分混合而利于提取。由于氢键的形成和破坏所需的活化能也小，加之其形成的空间条件较易出现，所以在物质不断运动情况下，氢键可以不断形成和断裂。超声波提取法最大的优点是提取时间短、温度较低、收率高。因此实验选取超声波法辅助提取胆红素。实验通过对超声波提取工艺参数进行研究，优化出一套提取率较高的工艺技术。通过试验可知超声波频率和超声处理时间对胆红素提取率影响最大，经超声波处理后胆汁中胆红素的含量提高15%，通过实验研究证明超声波处理能有效提高胆汁中胆红素的含量。附图1是胆红素测定的标准曲线；附图2不同超声频率与胆红素提取的关系曲线；附图3不同超声时间与胆红素提取的关系曲线；附图4不同超声温度与胆红素提取的关系曲线。具体实施例方式下面结合实验对本发明作进一步说明-下列实验中主要试剂见表l。主要试剂表1<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>实验方法试剂的配制(1)重氮化溶液A的配制准确称取l.Og无水对氨基苯磺酸，加入去离子水适量，在水浴中加热使其充分溶解，放冷，加入15mLHCL，采用去离子水定容至1000mL，于4。C冰箱中保存。(2)重氮化溶液B的配制-准确称取0.5gNaN02，采用去离子水定容至100mL，得到0.5%的NaN02溶液，于4。C冰箱中保存。(3)重氮化溶液的配制-吸取试剂A10mL，加入试剂BO.3mL，混合而成。此试剂临用前配制，3h内有效。检测方法-(1)标准曲线的绘制胆红素标准曲线绘制精密称取标准品10.0mg，用二氯甲烷溶于lOOmL棕色容量瓶中。取10.0mL于50mL棕色容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，每lmL溶液相当于0.02mg胆红素。准确吸取胆红素标准液OmL、l.OmL、2.OmL、3.OmL、4.OmL、5.OmL于具塞试管中，分别加入人95%乙醇9.OmL、8.OmL、7.OmL、6.OmL、5.OmL、4.OmL，再各加重氮化试剂1.OmL，摇匀，于室温暗处静置lh，用722分光光度计在波长为520mn处测定光密度，并以光密度为纵坐标，所含胆红素浓度添加横坐标(mg/mL)，作出标准曲线。(2)胆汁中胆红素的测定.-将新鲜的胆汁置于试管中并在水浴上微热，取10.OmL放入lOOmL棕色容量瓶中，用氯仿、乙醇混合液(4:6)稀释至刻度，取l.OmL放入具塞试管中，力口8inL乙醇及1.0mL重氮化试齐iJ，摇匀，于室温暗处静置lh，用722分光光度计在波长为520nm处测定吸光度，由测定的吸光度从标准曲线上查得胆红素的毫克数，然后按下式计算胆汁中胆红素的含量(g/mL)。胆汁中胆红素的含量—示准曲线上査得的毫克数X10/1000原料预处理将猪胆用去离子水洗净血污等，用不锈钢剪子从猪胆的光滑面剪开，将胆汁倒入烧杯中，用200目的纱布过滤，去除胆汁中的杂质以及一部分脂肪，然后水浴上40摄氏度微热10分钟。实验内容与结果分析胆红素标准曲线胆红素标准曲线的实验数据如表3。胆红素测定的标准曲线表3<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表3可得拟合后胆红素标准曲线的回归方程/=0.0907x-0.0927，R2=0.9998，所做曲线相关性良好，以胆红素含量为纵坐标，0D值为横坐标，绘制标准曲线，胆红素标准曲线见图l，此曲线即作为胆红素定量分析的依据。超声波法处理胆汁工艺条件优化的实验与分析影响超声波辅助提取的因素包括功率、频率、作用温度、作用时间。因此，实验中选取功率、频率、处理时间、处理温度四个因素进行单因素分析。本试验以胆汁中胆红素含量为指标，采用单因素试验确定提取的条件范围。每个试验设置三个平行样，采用SAS8.2统计系统进行One-Way-ANOVA单因素方差分析以及Duncan分析。(1)超声波输出功率对胆红素含量的影响准确称取两份50mL预处理后的胆汁，将超声波输出功率分别设定在强(320±20)W、弱(220±20)W两个水平(一般工业用超声波提取只选取这两个功率)，频率设定为70KHz，处理温度为2(TC，超声处理时间为20min，每个实验水平进行三次重复实验，测定胆红素含量，实验结果分别用y^y2、y3表示，实验结果见表4。采用SAS8.2统计系统对实验结果进行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析，研究不同超声波功率对胆红素提取率的影响，确定最适超声波功率的范围。超声波输出功率对超声波提取胆红素的影响表4超声波输出功率Y1y2y3/w320±200.4240.4260.428220±200.3720.3690.374超声波输出功率分别为强(320±20)W、弱(220±20)W两个水平，其余条件均一致，研究确定超声波输出功率的变化对胆红素含量的影响；由表4可知，在超声波输出功率为320W左右时，胆红素含量远远高于超声波输出功率为220W时的含量。随着超声波输出功率的增大，胆红素含量逐渐提高，分析认为，超声波功率增大时有利于液体中空穴的形成，空化现象更剧烈，从而产生更多的空化泡，使氢键破裂，胆红素溶出速率增加；当输出功率过小时，超声强度没有达到空化阀声压，很难产生空化作用，物质作用不剧烈，氢键不易断裂，导致胆红素溶出较少。根据次试验结果，本实验确定将超声波输出功率320士20W作为固定化因素，进行下一步工艺条件的优化。(2)超声波频率对胆红素含量的影响准确称取八份50mL处理后的胆汁，将超声波频率分别设定在24KHz、30KHz、46KHz、52KHz、68KHz、70KHz、72KHz、74KHz八个水平，超声功率为320W，处理温度为20。C，超声处理时间20min，每个实验水平进行三次重复实验，测定胆红素含量，实验结果分别用y1、y2、/表示，平均胆红素含量用Y表示，实验结果见表5。采用SAS8.2统计系统对实验结果进行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析，研究不同超声波频率对胆红素含量的影响，确定最适超声波频率的范围。根据所得数据绘制出超声频率与胆红素含量的关系曲线图2。不同超声波处理频率的方差分析及Duncan多重比较标记结果表5处理频率y'y2y3平均值y变异来源SourceSSdfMSF值Pr>F5%水平74KHz0.3910.3880.3950.391处理间0.119570.0171106<A72KHz0.4810.4840.4810.482处理内0.0001610.0001B70KHz0.4380.4400.4410.440总变异230細C68KHz0.3820.3860.3790.3820.11971D52KHz0.3460.3390.3420.342E46KHz0.3230.3240.3210.323F28KHz0.2820.2840.2790.282G24KHz0.2630.2550.2720.263H在表5超声波处理频率八点三次重复的因素分析中，F值为1106，P值〈0.0001，说明不同超声波处理频率对胆红素提取有显著差异，采用SAS8.2统计系统对其进行相关性分析，相关系数R=0.86754;由表可知在24KHz-72KHz胆汁中胆红素溶出量不断上升，在72KHz时胆红素的含量最高，当超过72KHz时呈下降趋势。这是由于当超声波的频率大于72KHz时，振动波形产生了变化，由横波转为纵波，在纵波条件下振动方向与波的传播方向一致不易产生空化作用，不利于胆红素的溶出。根据此实验结果，将超声波处理频率的范围确定在68KHz、70KHz、72KHz三个水平为正交试验范围值。(3)超声波处理时间对得率的影响准确称取七份50mL处理后的胆汁，将超声波处理时间分别设定在lmin、5min、10min、15min、20min、25min、30min七个水平，超声输出功率为320W，频率为70KHz，处理温度为20°C，为减小引入的误差，每个实验做三个平行样，测定胆汁中胆红素的含量，实验结果分别用y1、y2、73表示，平均胆红素的含量用Y表示，见表6。采用SAS8.2统计系统对实验结果进行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析，研究不同超声波处理时间对胆红素含量的影响，确定最适超声波处理时间的范围。根据所得数据绘制出超声时间与胆红素含量的关系曲线，见图3。不同超声波处理时间的方差分析及Duncan多重比较标记结果表6<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在表6超声波处理时间七点三次重复的因素分析中，F值为1482，P值〈0.0001，说明不同超声波处理时间对胆红素提取有显著差异，采用SAS8.2统计系统对其进行相关性分析，相关系数R-0.8215;由图3可以看出，在Omin-20min时间时，胆红素含量呈上升趋势，这是由于作用时间与物质作用不剧烈程度成正比，氢键断裂不断增加，胆红素也随之不断的溶出；在20min时胆红素的含量最高，但是超过25min后由于作用时间较长，与空气中的氧接触时间较长，胆红素已被部分氧化，胆红素含量又呈现下降趋势。根据实验结果，将超声波处理时间的范围确定在15min、20min、25min三个水平为正交试验范围值。(4)超声波处理温度对得率的影响准确称取6份50mL处理后的胆汁，将超声波处理时间分别设定在20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45。C六个水平，超声输出功率为320W，超声波频率为70KHz,超声处理时间为20min，为减小引入的误差，每个实验做三个平行样，测定胆汁中胆红素的含量，实验结果分别用y1、y2、/表示，平均胆红素的含量用Y表示，见表7。采用SAS8.2统计系统对实验结果进行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析，研究不同超声波处理温度对胆红素含量的影响，确定最适超声波处理温度的范围。根据所得数据绘制出超声温度与胆红素含量的关系曲线，见图4。不同超声波处理温度的方差分析及Duncan多重比较标记结果表7<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在表7超声波处理温度六点三次重复的因素分析中，F值为2063，P值<0.0001，说明不同超声波处理时间对胆红素提取率有显著差异，采用SAS8.2统计系统对其进行相关性分析，相关系数R二O.7994;由图4可以看出，在2(TC-3(TC时胆红素的溶出量不断提高，分析认为，这是布朗运动原理，温度越高物质的运动越剧烈，氢键也随之断裂，达到3(TC时胆红素的含量最高，但是超过35'C后由于作用温度较高，胆红素易被氧化，因此，含量呈下降趋势。根据实验结果，将超声波处理温度的范围确定在25°C，30°C，35'C三个水平为正交试验范围值。多因素交叉组合试验根据超声频率，超声时间，超声温度等单因素实验所确定的最佳范围值，采用正交试验U(33)方法，以胆红素提高量为指标，进行多因素交叉组合试验。实验因素水平设计及结果见表8、表9。因素水平表表8<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>根据表9试验结果，采用SAS8.2统计分析系统进行数据处理，通过方差分析，结果表明模型的F值为66.14，P值为0.0150，大于在0.05水平上的F值(见表IO)。由此可知，模型有效，实验结果是可靠的。A因素F值为174.92，P值为0.0057，大于在0.01水平上的F统计量的值，因此，因素A(超声波频率)对试验的影响极显著；B因素F值为l.16，P值为0.4636，小于在0.05水平上的F统计量的值，因此因素B(超声波温度)对试验的影响不显著；C因素F值为22.35，P值为0.042，大于在0.05水平上的F统计量的值，因此，因素C(超声波时间)对试验的影响显著。方差分析表表io<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>7B0.00013320.0000661.160.4636C0.00256320.00128122.350.0420误差0.0001146720.000057总和0.0228688由上表IO，可以说明个因素对实验的影响大小。比较F值大小Fa>Fc>Fb，F值越大，影响作用越大，各因素对实验的影响程度大小的次序为A〉OB。最佳工艺参数的确定，对A，C因素进行多重比较多重比较SSR及LSR值表表11秩次矩K23SSR0.056.0906.0900.0114.0014.00LSR0.050.026550.026550.010.061040.06104超声频率多重比较表12A因素A2A,平均值0.15670.08870.0417显著性(0.05)bC显著性(0.01)ABBC由表12可以看出，A因素K3-K2=0.068>LSR001=0.06104所以A2，A3差异极显著，因此As最好。超声时间多重比较表13c因素C2C3C,平均值0.11900.08830.0797显著性(0.05)AbBe显著性(0.01)AABABC由表13可以看出，C因素K2-K3=0.0307〉LSR。.。5=0.02655所以C2、C3差异显著，因此C2最好。经多重比较分析后，最佳的超声波提取工艺为AAC2，gfi为超声波频率为72KHz，超声波处理温度为30°C，超声波处理时间20min。取最佳组合进行经验证试验，结果胆红素平均提取率提高15%。胆汁中的胆红素大部分为结合胆红素，主要是胆红素双葡萄糖醛酸苷，有大量结合态胆红素的氢键存在。用超声波处理猪胆汁，可破坏结合胆红素中的氢键，有利于胆红素溶出和提取。本试验以猪胆汁为原料，对超声波功率、超声波频率、超声温度、超声时间等四个因素对胆汁中胆红素含量的影响进行研究。在单因素数据的基础上，应用正交组合试验和SAS统计系统对超声波处理胆汁的工艺条件进行优化，优化后的工艺参数为超声波功率为强功率320W，超声波频率为72kHz，超声波处理温度为30°C，超声波处理时间20min。通过试验可知超声波频率和超声处理时间对胆红素提取率影响最大，经超声波处理后胆汁中胆红素的含量提高15%，通过实验研究证明超声波处理能有效提高胆汁中胆红素的含量。本发明所用的超声波药品处理机是采用济宁金百特电子有限公司的，型号为JBT。权利要求1、一种超声波处理胆汁的方法，包括下列步骤首先用不锈钢刀子破胆，将胆汁放入烧杯中，采用200目的滤布过滤，滤液40摄氏度水浴上热10分，然后将滤液放在超声波药品处理机内利用超声波处理，超声波输出功率为320±20W，超声波处理的频率为68KHz～72KHz，超声波处理的时间为15min～25min，超声波处理的温度为25℃～35℃，最后检测处理后胆汁中胆红素的含量。2、根据权利要求1所述的超声波处理胆汁的方法，其特征在于:超声波功率为320W，超声波频率为72kHz，超声波处理温度为30。C，超声波处理时间为20min。全文摘要本发明涉及一种超声波处理胆汁的方法。该方法包括下列步骤首先用不锈钢刀子破胆，将胆汁放入烧杯中，采用200目的滤布过滤，滤液40摄氏度水浴上热10分，然后将滤液放在超声波药品处理机内利用超声波处理，超声波输出功率为320±20W，超声波处理的频率为68kHz～72kHz，超声波处理的时间为15min～25min，超声波处理的温度为25℃～35℃，最后检测处理后胆汁中胆红素的含量。该超声波提取法优点是提取时间短、温度较低、收率高。文档编号C07D207/44GK101624363SQ200910071989公开日2010年1月13日申请日期2009年5月11日优先权日2009年5月11日发明者刘妍妍,张丽萍,曹荣安,李良玉,李艳青,李雷刚,楠杨,建贾申请人:张丽萍