专利名称：可抑制剪式g:a错配核酸双链解旋的钌配合物及制备方法
技术领域：
本发明涉及金属配合物，具体涉及一种可抑制剪式G:A错配核酸双链解旋的钌配合物及 其制备方法和应用。
背景技术：
对于任何有机体的生存来说，维持基因信息的完整表达是非常重要的。具有G:C和A:T Watson-Crick碱基配对的DNA双股螺旋是遗传信息储存、表达和稳定传递的重要载体。为了 使遗传信息准确地传给下一代，DNA复制必须具有极高的精确性。然而，人类基因大约含109 碱基对，任何对DNA物理或化学的破坏都会影响双螺旋结构的完整性，导致在DNA复制过程 中的碱基错配。如果这些错误不能被及时修复，其结果将导致子系DNA发生诱变，从而引发 致命的癌症或基因病。在这种情况下，开发可以抑制错配DNA复制从而抑制癌细胞繁殖的实 验体系具有很重要的意义。
研究表明在所有的错配碱基配对中，剪式G:A错配是最难识别的。它和正常配对碱基有 相似的稳定性。到目前为止，这种错配的特异性识别还未见报道。
DNA由两条互补的单链通过碱基间的氢键维持双螺旋构型。由于氢键是次级键，可以通 过提高溶液的温度使DNA的两条链完全解离而发生热变性。DNA由双链解离为单链的过程可 以通过其在260 nm的特征吸收值的变化观察到。随着DNA的解旋，该处特征吸收值会逐渐 增大。
我们课题组曾经合成了几个具有大环平面插入配体的钴(ni)的配合物并研究了它们与 含剪式G:A错配DNA的作用，结果表明这些配合物以插入方式与DNA作用，随着温度的升高， DNA链发生解旋(Eur. J. Inorg. Chem., 2005， 314广3148 ; J. Inorg. Biochem, 2009, 103. 827 832)，因而不能抑制剪式G:A错配DNA复制。
发明内容
本发明旨在提供一种可抑制剪式G:A错配核酸双链解旋的钌配合物及其制备方法和应用。
本发明提供的一种可抑制剪式G:A错配核酸双链解旋的钌配合物，它含有三个双齿含N 大环平面配体，其中主配体的头部宽度为三个苯环。该钌配合物结构式如下
3本发明钌配合物的制备方法，包括以下步骤-
1)、 RuCl3 3仏0和邻菲咯啉以摩尔比1:2加入到双颈瓶中，在双排管上抽真空-充氮气-抽真空，循环三次；用注射器注入重蒸的DMF后，加热至15(TC，搅拌反应7_9小时，降至 室温，加入过量丙酮，O'C放置过夜，析出墨绿色结晶，抽滤，用冰水洗涤，真空干燥得到前 体Ru(phen)2Cl2;
2) 、将Ru(phen)2Clz和邻菲咯啉二酮以1:1. 5溶于甲醇和水的比例为2:1的混合溶剂中， 氮气保护回馏反应5小时，冷却，加入过量的高氯酸钠饱和溶液，静置过夜，产生桔黄色结 晶，抽滤，水、乙醚洗涤，真空干燥，得到前体[Ru(phen)2(phendione)](C104)2;
3) 、将[Ru(phen)2(phendione)] (C1(X)2溶于乙腈中，加入2-3倍摩尔量的邻位双氨取代的 稠环化合物，氮气保护，加热回馏5-8小时，冷却后过滤，滤液中加入过量乙醚，析出沉淀， 抽滤真空干燥得到钌配合物的高氯酸盐；
4) 、将钌配合物的高氯酸盐溶于丙酮中，加入过量的饱和氯化四丁基铵丙酮溶液，析出 沉淀，即为水溶性的钌配合物。
步骤3)中所述的邻位双氨取代的稠环化合物是9， IO-二氨基菲或I, 2-二氨基蒽醌。 钌配合物抑制剪式G:A错配核酸双链解旋的测试先将钉配合物溶于生理条件缓冲体系， 然后加入到含剪式G:A错配的核酸体系中，从KTC逐渐升温至60'C，测定体系的吸收值以及 光散射强度的变化。结果表明即使在60'C时DNA双链也不解旋，而且温度越高越稳定。说 明本发明钌配合物能够稳定含剪式G:A错配的DNA双链结构，抑制该DNA复制，可以应用于 制备抗癌药物。
图1 (a)和图1 (b)分别为配合物1和作为对照的解链抗癌药物BLMAs对含剪式G:A错配的 十聚寡核苷酸d(CCGAATGAGG)2热变性的影响；
图2配合物1、配合物1与含剪式G:A错配DNA作用后的混合体系随温度变化的共振散射谱。其中，Rl为单独配合物的共振散射谱随温度的变化；R2为配合物与错配核酸混合体系 的共振散射谱随温度的变化。
图3含剪式G:A错配DNA分别与配合物1、平阳霉素作用后随温度变化的共振散射谱。 Rl为平阳霉素与错配DNA作用体系的的共振散射随温度的变化；R2为平阳霉素与错配DNA混
合体系中再加入配合物后体系的共振散射随温度的变化。
图4配合物2对含剪式G:A错配的十聚寡核苷酸d(CCGAATGAGG)2热变性的影响。 图5配合物2与含剪式G:A错配DNA作用后的体系随温度变化的共振散射谱。
具体实施例方式
实施例1-2为配合物制备实施例；实施例3-4为钌配合物抑制剪式G:A错配核酸双链解 旋的测试实施例。 实施例l
步骤一称取RuCl3 3H20 (0. 78 g, 2. 98 mmol)和phen (1. 2 g， 6 ranol)加入到双颈瓶 中，在双排管上抽真空-充氮气-抽真空，循环三次。用注射器注入重蒸的函F后，加热至150°C， 搅拌反应约8小时，降至室温，加入150ml丙酮，Ot:放置过夜。抽滤，用冰水洗涤，真空 干燥得到墨绿色固体-(phen)2RUCl2。
步骤二称取-(Phen)2RuCl2 0.27 g,邻菲咯啉二酮0.21 mg溶于14 ml甲醇水 (2:1)的混合溶剂中，氮气保护回馏反应5小时，冷却，加入过量高氯酸钠饱和溶液，静 置过夜，产生桔黄色结晶，抽滤，水、乙醚洗涤各1次，真空干燥，得到 [(phen) 2Ru (phendione) ] C104。
步骤三称取[(phen) 2Ru (phendione) ]C104 0. 87g溶于乙腈中，加入9， 10-二氨基菲0. 42g， 氮气保护，加热回馏5小时，冷却后过滤，滤液中加入过量乙醚，析出沉淀，抽滤，真空干 燥得到钌配合物1的高氯酸盐。
步骤四将钌配合物l的高氯酸盐溶于丙酮中，加入过量饱和的氯化四丁基铵丙酮溶液， 得到水溶性的终产物钌配合物1。
'H NMR (DMSO-d6) : 9. 97 (dd' 2H) ， 9. 65 (dd, 2H), 8. 98 (dd, 2H) ， 8. 80 (dd, 4H) ， 8. 42 (S, 4 H), 8. 30(dd，2H)， 8. 23 (dd, 2H), 8. ll(dd'加，8.04(m,2H), 7. 98 (m, 4H), 7. 82~7. 78 ((m, 4 H)
实施例2:
用l， 2-二氨基蒽醌代替9， 10-二氨基菲，其余同实施例l，得到钌配合物2。 'H NMR (DMSO-d6) : 9. 69 (d， 1H) ， 9. 62 (d, 1H), 8. 83 8. 79 (m， 4H) ， 8. 42 (S, 4H) ， 8. 31 (m， 3H)， 8.28(dd,2H), 8. 25 (dd'1H), 8, 08 (m, 2H) ， 8. 04(ra, 1H)， 7.99(m,2H)，7. 94 (m, 1H) ， 7. 78~7. 84 (m, 4H) ， 7. 47 (d， 1H)' 6. 78 ((d， 1H)
实施例3:钌配合物1抑制剪式G:A错配核酸双链解旋的测试
一、 溶液配置
(1) 磷酸缓冲液配置
称取0. 7 g Na2HP04, 0. 6 g NaH2P04， 1. 2 g NaCl溶于800 ml去离子水中，定容至1000 ml,测定pH值为7.0，分装后高压灭菌备用。
(2) 配合物溶液的配置 用缓冲溶液配制配合物溶液10—4M备用。
(3) 寡聚DNA溶液的配置
100 OD商用寡聚核苷酸用0.5ml磷酸缓冲液溶解，9(TC恒温数分钟后缓慢降温得到双 链寡聚DNA溶液。1 H NMR上9. 7 ppm的活泼氢共振信号和31P剛R上0. 37 ppm、 0. 11 ppm处 的两个低场信号证明了剪式G:A错配得存在。用260 nm处的紫外吸收值计算寡核苷酸浓度。
二、 抑制剪式G:A错配核酸双链解旋的测试
l(T M配合物与寡聚DNA以1:1室温反应30 min，做下面两种测试
(1) 紫外吸收光谱做DNA热变性实验。每个温度恒温IO min后测试。 在pH7.0的磷酸缓冲液中，随着温度升高，含剪式G:A错配的寡核苷酸d(CCGAATGAGG)2
由双链解旋为单链，在4(TC己完全解旋。而与配合物1作用30 min后做该DNA的热变性实 验，发现随着温度的升高，DNA链不仅没有解旋，而且温度越高越稳定，甚至在60'C时还没 有解旋的迹象(图la)。
传统的抗癌试剂平阳霉素是一种使DNA解链的试剂，它对DNA热变性的影响正好相反(图 lb)，在2(TC时错配核酸已大部分解旋。该实施例说明配合物1可以稳定错配DNA双螺旋使 其不易解旋，从而抑制错配DNA的进一步复制以及癌细胞的分裂增值。有望用于源于该错配 引起的疾病的治疗。
(2) 共振光散射实验
激发狭缝宽度2.5 nm发射狭缝宽度2.5 nm扫描范围250 nm 800 nm。 在pH 7. 0的磷酸缓冲液中，随着温度从l(TC升高到60°C，单独配合物和单独错配DNA 的共振散射峰强度都很弱，基本不变，而配合物与错配DNA的混合体系在508 nm处的共振 散射峰明显增强。表明随着温度的升高，配合物与错配DNA作用增强，生成的配合物-错配 DNA的缔合物增多，共振散射峰强度增大。进一步证明了配合物可以稳定核酸的双链结构， 抑制DNA的进一步复制。
将解链试剂平阳霉素与该错配核酸混合30 min，测试体系从10 35X:的共振散射。结果表明体系的共振散射峰强度很弱且基本不变，这是由于在l(TC时BLMA5已经使得错配核酸有 部分解旋。这时在该体系中加入配合物1，再测定此时三元混合体系的共振散射，发现体系 在508 nm处的共振散射峰明显增强，并且随着温度升高，共振散射峰强度进一步增大，说明 生成的配合物-错配DNA的缔合物增多。这一结果表明配合物不仅可以稳定错配核酸的双链结 构，还有促使两条单链形成双链的能力。
实施例4:钌配合物2抑制剪式G:A错配核酸双链解旋的测试
用钌配合物2代替实施例3中的钌配合物1。钌配合物2抑制剪式G:A错配核酸双链解 旋的测试结果见图4和图5。
权利要求
1、一种可抑制剪式G:A错配核酸双链解旋的钌配合物，其特征在于，它的结构式为式中-R为 id="icf0002" file="A2009100754860002C2.tif" wi="48" he="23" top= "76" left = "51" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>
2、 如权利要求l所述的钌配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1) 、用三氯化钌和邻菲咯啉在DMF中制备Ru(phen)2Cl2;2) 、用Ru(phen)2Cl2和邻菲咯啉二酮制备[Ru(phen)2(phendione)] (C104)2;3) 、将[Ru(phen)2(phendione)](C104)2溶于乙腈中，加入2-3倍摩尔量的邻位双氨取代的 稠环化合物，氮气保护，加热回馏5-8小时，冷却后过滤，滤液中加入过量乙醚，析出沉淀， 抽滤真空干燥得到钌配合物的高氯酸盐；4) 、将钌配合物的高氯酸盐溶于丙酮中，加入过量的饱和氯化四丁基铵丙酮溶液，析出 沉淀，即为水溶性的钌配合物。
3、 如权利要求2所述的钌配合物的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的邻位双氨 取代的稠环化合物是9， 10-二氨基菲或l， 2-二氨基蒽醌。
4、 如权利要求1所述的钌配合物在制备抗癌药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种可抑制剪式G:A错配核酸双链解旋的钌配合物，它含有三个双齿含N大环平面配体，其中主配体的头部宽度为三个苯环。其制备步骤包括用三氯化钌和邻菲咯啉制备Ru(phen)<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>；用Ru(phen)<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>和邻菲咯啉二酮制备[Ru(phen)<sub>2</sub>(phendione)](ClO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>；将[Ru(phen)<sub>2</sub>(phendione)](ClO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>溶于乙腈中，加入邻位双氨取代的稠环化合物，氮气保护，加热回馏，冷却后过滤，析出沉淀，真空干燥得到钌配合物的高氯酸盐；进一步制得水溶性的钌配合物。本发明钌配合物能够稳定含剪式G:A错配的DNA双链结构，抑制该DNA复制，可以应用于制备抗癌药物。
文档编号C07F15/00GK101659680SQ20091007548
公开日2010年3月3日 申请日期2009年9月18日 优先权日2009年9月18日
发明者窦春娇, 陈绘丽, 巍 高 申请人:山西大学